CN113215034B - 一株能够缓解阿尔兹海默症并增加粪便乙酸含量的短双歧杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株能够缓解阿尔兹海默症并增加粪便乙酸含量的短双歧杆菌及其应用，属于微生物领域。本发明提供的短双歧杆菌CCFM1179能够显著改善阿尔兹海默症小鼠的认知和记忆障碍、降低阿尔兹海默症小鼠脑内Aβ1‑42的含量，提高阿尔兹海默症小鼠脑内脑源性神经营养因子和突触后密度蛋白的水平，提高阿尔兹海默症小鼠血清中5‑羟色胺的含量；并能够调节肠道菌群及其代谢物。本发明提供的短双歧杆菌CCFM1179可用于制备缓解痴呆、阿尔兹海默症、改善认知障碍的药物组合物，还可以作为微生态制剂应用于药品、发酵食品或保健品，具有非常广泛的应用前景。

Description

一株能够缓解阿尔兹海默症并增加粪便乙酸含量的短双歧杆 菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株能够缓解阿尔兹海默症并增加粪便乙酸含量的短双歧杆菌及其应用，属于微生物领域。

背景技术

阿尔兹海默症又称为老年性痴呆，是一种神经退行性疾病，临床表现为学习认知能力下降，逐渐丧失生活自理能力。阿尔兹海默症的临床特点是隐袭起病，进行性加重，发病10-20年因并发症而死亡。阿尔兹海默症患者占所有痴呆患者人数的60-80％，是最常见的痴呆类型。

关于阿尔兹海默症的发病机制，目前现代医学有十几种假说，研究较多的主要有胆碱能丢失学说、Tau蛋白过度磷酸化学说、氧化应激学说、β淀粉样蛋白毒性学说、炎症因子学说等。阿尔兹海默症最具特征的两大病理学变化是Aβ沉积形成的老年斑和细胞内异常磷酸化的Tau蛋白聚集引起的神经原纤维缠结。自1992年以来，淀粉样蛋白级联假说在解释阿尔兹海默症发病机制中发挥了重要作用。Aβ被认为是阿尔兹海默症发病机制的关键因素，其中Aβ1-42易形成纤维状淀粉样蛋白聚集体，被称为是老年斑的主要成分。

目前，全球约有5000万人饱受阿兹海默症的困扰，而且这一群体的数量预计还将继续增长。但是，阿茨海默症治疗药物的研发进展却一直相当缓慢。当前治疗阿尔兹海默症的方式包括药物治疗、免疫疗法以及膳食补充天然提取物治疗等方式。乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEI)是到目前为止，临床上使用最为广泛的阿尔兹海默症治疗药物。FDA批准用于治疗阿尔兹海默症的5种药物中除了美金刚属于NMDA受体拮抗药外，其余4种他克林(Tacrine)、多奈哌齐(Donepezil)、加兰他敏(Galanthamine)和卡巴拉汀(Rivastigmine)均属于乙酰胆碱酯酶抑制剂。在临床上，目前FDA批准的5种阿尔兹海默症治疗药物均属于对症治疗药物，影响疾病进程的药物仍处于初步研究阶段。此外，单一药物药效不显著，且神经性药物副作用较大。因此，探索在阿尔兹海默症发病早期进行干预的方法，以延缓疾病进程显得尤为重要，具有十分广阔的市场潜力。

“脑肠轴”是近年来提出的一个新概念，作为肠内细菌与大脑间的双向通信系统，主要通过神经途径、内分泌途径和免疫途径来调节大脑的功能以及行为。随着对“脑肠轴”研究的不断深入，发现益生菌可通过迷走神经、神经免疫系统、神经递质、微生物代谢产物等途径调节肠道菌群组成，从而缓解神经性疾病。临床试验已经证实通过益生菌、益生元以及粪菌移植治疗可以调节肠道菌群组成，有效改善啮齿动物的抑郁、自闭症等神经性疾病。目前，已知可用于防治神经性疾病的“精神益生菌”种类太匮乏；其次，肠道菌群的复杂性以及研究方法上的困难性，对于肠道菌群的临床研究较少，其参与机体代谢以及相互作用的机制尚未明确；因此，筛选出一种能够介导肠道菌群缓解阿尔兹海默症的益生菌，并深入挖掘其功能，开发更高保健价值的益生菌产品显得十分重要。此外，精神益生菌的开发也将为通过膳食干预缓解阿尔兹海默症开辟出新的途径和解决方案。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一株短双歧杆菌CCFM1179(Bifidobacteriumbreve)，于2021年3月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.61589。

本发明的菌株具有如下作用：

(1)改善哺乳动物学习及认知障碍；

(2)延缓哺乳动物阿尔兹海默症进程；

(3)介导脑肠轴调节肠道菌群及其代谢物的作用。

本发明的第二个目的是提供含有所述短双歧杆菌CCFM1179的组合物。

在一种实施方式中，所述组合物中短双歧杆菌长亚种的细胞数量≥1×10⁸CFU/g或1×10⁸CFU/mL。

在一种实施方式中，所述组合物为功能性食品或药物。

在一种实施方式中，所述功能性食品是由所述短双歧杆菌参与发酵制得。

在一种实施方式中，所述组合物为发酵食品，包括固态食品、液态食品或半固态食品。

在一种实施方式中，所述发酵食品的种类包括乳制品、豆制品或果蔬制品。

在一种实施方式中，所述乳制品包括发酵乳、风味发酵乳、发酵乳饮料等、奶油、乳酪、含乳饮料或乳粉；所述豆制品包括豆奶或豆乳粉；所述果蔬制品包括以白菜、白萝卜、黄瓜、甜菜、黄桃或杨梅制品中至少一种为原料制得的果蔬制品。

在一种实施方式中，所述药物还含有药学上可接受的载体。

在一种实施方式中，所述载体包括医学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。

在一种实施方式中，所述药物的剂型是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。

本发明还提供所述短双歧杆菌在制备缓解认知障碍、延缓阿尔兹海默症进程、调节肠道菌群的发酵食品、保健品中的应用。

在一种实施方式中，所述应用是将所述短双歧杆菌作为主要成分制备可摄入人体的食品或药品。

在一种实施方式中，所述延缓阿尔兹海默症进程包括(a)～(d)中的至少一种：

(a)降低哺乳动物脑内β-淀粉样多肽-42(Aβ1-42)沉积；

(b)提高哺乳动物脑内神经递质水平；

(c)提高哺乳动物脑内突触蛋白水平；

(d)提高哺乳动物血清中5-羟色胺(5-HT)的含量；

在一种实施方式中，所述肠道菌群包括但不限于嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansiamuciniphila)。

在一种实施方式中，所述哺乳动物包括但不限于人类。

本发明还提供一种含有所述短双歧杆菌CCFM1179的菌剂，所述菌剂为将含有短双歧杆菌CCFM1179的菌液干燥得到的粉剂。

在一种实施方式中，所述干燥是指真空冷冻干燥或其它菌液干燥工艺。

在一种实施方式中，所述菌剂中短双歧杆菌的细胞数量≥1×10⁸CFU/g。

本发明还提供了一种制备短双歧杆菌CCFM1179菌剂的方法，所述方法将短双歧杆菌CCFM1179按照以所述培养基的质量计2-4％的接种量接种培养基中，然后在温度35-39℃厌氧条件下培养24-48h，用pH为6.8-7.2磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用细胞保护剂重悬，使菌浓达到10¹⁰CFU/mL；接着，让该悬浮液在温度37℃厌氧条件下预培养50-70min，再在-15～-20℃预冻8-14h，最后进行真空冷冻干燥得到所述的发酵菌剂。

在一种实施方式中，所述培养基为含有0.05％L-半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基，pH为6.8±0.2。

在一种实施方式中，所述培养基在119-123℃灭菌15-25min。

在一种实施方式中，所述保护剂是由含有100g/L-150g/L脱脂奶粉、100g/L-150g/L麦芽糊精、140g/L-160g/L海藻糖的溶液制备的冻干保护剂。

本发明有益效果

本发明的短双歧杆菌CCFM1179生长特性较好，能显著改善阿尔兹海默症小鼠的认知和记忆障碍、降低阿尔兹海默症小鼠脑内Aβ1-42的含量、提高阿尔兹海默症小鼠脑内脑源性神经营养因子和突触后密度蛋白的水平，明显提高阿尔兹海默症小鼠血清中5-羟色胺的含量，提高阿尔兹海默症小鼠粪便中菌群代谢物乙酸水平，有效调节阿尔兹海默症小鼠肠道菌群的结构，改善肠道菌群的物种多样性程度，提高肠道有益菌嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)的相对丰度。因此，本发明所述的短双歧杆菌CCFM1179可用于制备缓解痴呆、阿尔兹海默症、改善认知障碍的药物组合物，还可以作为微生态制剂应用于药品、发酵食品或保健品，具有非常广泛的应用前景。

生物材料保藏

短双歧杆菌CCFM1179(Bifidobacterium breve)，分类命名为于Bifidobacteriumbreve，于2021年3月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.61589。

附图说明

图1为短双歧杆菌CCFM1179干预后，小鼠的行为学变化。(A)Y迷宫实验中自由交替百分比；(B)水迷宫实验中，各组小鼠逃避潜伏期；(C)水迷宫实验中，各组小鼠在原平台所在象限停留的时间比值；(D)小鼠在避暗实验记忆保持测试中的潜伏期；其中，与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。

图2为短双歧杆菌CCFM1179干预后，小鼠海马组织中β淀粉样蛋白(Aβ1-42)的含量。其中，与模型组相比，*P<0.05。

图3为短双歧杆菌CCFM1179干预后，小鼠海马组织中突触蛋白的含量变化。(A)脑源神经营养因子(BDNF)的含量；(B)突触后密度蛋白95(PSD95)的含量；其中，与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图4为短双歧杆菌CCFM1179干预后，小鼠血清中5-羟色胺(5-HT)的含量变化。其中，与模型组相比，*P<0.05。

图5为短双歧杆菌CCFM1179干预后，小鼠粪便中乙酸的浓度变化。其中，与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图6为短双歧杆菌CCFM1179干预后，小鼠粪便中菌群α多样性的变化。其中，与模型组相比，**P<0.01，***P<0.001。

图7为短双歧杆菌CCFM1179干预后，小鼠粪便中菌群β多样性的变化。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析，非参数多元方差分析(PERMANOVA)P<0.004。其中，相同颜色的圆点代表来自同一组的样本；在二维坐标轴中样本间距离越远，代表物种丰度差异越大。

图8为短双歧杆菌CCFM1179干预后，小鼠肠道中嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansiamuciniphila)相对丰度的变化。其中，与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。

具体实施方式

实施例1短双歧杆菌CCFM1179的筛选和鉴定

(一)菌株的分离筛选：

(1)使用一次性无菌取便器采集江苏省无锡市一名纯母乳喂养的10个月大的男性婴儿的粪便，将粪便样品在含有低聚果糖的MRS+质量百分数(0.05％-0.1％)半胱氨酸的培养基中，于厌氧培养箱(N₂:CO₂:H₂＝80:10:10)中富集12h；

(2)将粪便样品用无菌生理盐水进行梯度稀释后涂布于添加了无菌的100μg/mL莫匹罗星、50U/mL制霉菌素的MRS+质量百分数(0.05％-0.1％)L-半胱氨酸盐酸盐的固体平板上，培养24-48h；

(3)选取符合双歧杆菌基本形态的单菌落进行平板划线纯化，筛选分离出所选菌株；

(4)将上述单菌落培养于液体MRS+质量百分数(0.05％-0.1％)半胱氨酸培养液中培养24h后进行革兰氏染色，选取革兰氏阳性菌进行后续试验。

(二)双歧杆菌的初步鉴定：果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶测定法

(1)将步骤(一)所筛选得到的乳酸菌在液体MRS+质量百分数(0.05％-0.1％)半胱氨酸培养液中培养24h，然后取1mL培养物8000rpm离心2min；

(2)用含0.05％(质量百分数)半胱氨酸的pH6.5的0.05M KH₂PO₄溶液洗涤两次；

(3)重悬于200μL添加了0.25％(质量百分数)Triton X-100的上述磷酸盐缓冲液；

(4)添加50μL浓度为6mg/mL氟化钠和10mg/mL碘乙酸钠的混合液以及50μL浓度为80mg/mL的果糖-6-磷酸，37℃孵育1h；

(5)添加300μL浓度为0.139g/mL、pH 6.5的盐酸轻胺，并于室温放置10min；

(6)分别添加200μL 15％(质量百分数)的三氯乙酸和4M HCl；

(7)添加200μL含有5％(质量百分数)三氯化铁的0.1M HCl，若体系迅速变为红色，即为F6PPK阳性，可初步断定其为双歧杆菌。

(三)双歧杆菌的分子生物学鉴定

(1)取步骤(二)筛选出并且活化3代的菌体(培养12-48h)1mL用于菌种鉴定，6000r/min离心3min，弃上清得菌体。

(2)加入1mL无菌水吹打洗菌体后，10000r/min离心1min，弃上清得菌体，加入500μL无菌水重悬，作为菌液模板。

(3)16S rDNA PCR体系：

A.细菌16S rDNA，20μLPCR反应体系：

27F，0.5μL；1492R，0.5μL；Taq酶，1μL；模板，1μL；ddH20，8μL。

B.PCR条件：

94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃2min；72℃10min；step2-4 30×；12℃2min。

(3)制备1％琼脂糖凝胶，之后将PCR产物与10000×Loading buffer混合，上样量2μL，120V跑30min，然后进行凝胶成像；

(4)将16S rDNA的PCR产物进行测序分析，其测序结果为ATCCTAGGGGAGCGGCGTTCTGCAGAGCGGACGGGTCACCTTGACCGGGTCAGTCACACCGGCGGCCAGCAGGTCCTCGTAGGTGTCGGTGGCGGCGTTGAAGCCTTCGCCATCGGGCAGAGAACGAACCTTGTTGATCACCACGTCGCCGGACACGCCAGCATTCTCGGCAATCTGCTTGATCGGGGCTTCGATGGCGCGGAACACGATGGCGGCACCGGTAGCCTCTTCGCCGGTCAGGGAGGTGACGGCCTCAGCCTTCTCGGCCTTGGCAGCAGCCTGAACGAGGGCCACGCCACCGCCGGGCAGCAGGCCTTCCTCAATGGCGGCCTTGGCGTTACGCACGGCATCTTCGATGCGGTGCTTGCGCTCCTTGGCCTCGACCTCGGTGGCAGCGCCGACCTTGATGACAGCCACGCCGCCGGCCAGCTTGGCCAGACGCTCCTGCAGCTTCTCACGATCGTTAATCGGAA(如SEQ ID NO.1所示)，并将得到的序列结果使用BLAST在GenBank中进行搜索和相似性比对，选取测序结果鉴定为短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)的菌株，-80℃保藏备用。

(四)短双歧杆菌菌悬液的制备

将活化3代后的菌液以2％的接种量接种至1L液体MRS培养基中，振荡混匀后于厌氧培养箱中37℃培养24h。在8000g/min，4℃的条件下离心15min，去上清后，用含0.05％-0.1％L-半胱氨酸盐酸盐的无菌生理盐水清洗2次，同样以相同条件进行离心，去上清后，用30％的甘油进行保存，-80℃冰箱冻存一周。在进行动物实验前，将菌液以6000r/min离心5min，再用无菌生理盐水清洗两遍，用10％脱脂乳重悬菌液，震荡均匀后用平板倾注法测定初始和冻存一周后的活菌数量。MRS培养基的配方为：牛肉膏10g；胰蛋白胨10g；酵母粉5g；葡萄糖20g；无水乙酸钠5g；MgSO₄·7H₂O 0.1g；MnSO₄·H₂O 0.05g；柠檬酸氢二铵2g；K₂HPO₄·3H₂O 2.6g；吐温80 1mL；L-半胱氨酸盐酸盐0.8g；调节pH为6.8±0.2；定容至1L。高压灭菌115℃20min。

实验结果：初始活菌数为9.5×10⁹CFU/mL，1周后活菌数为7.6×10⁹CFU/mL，数量级并没有产生变化，说明将菌液冻存后不会对实验产生影响，可用于动物实验。

实施例2短双歧杆菌CCFM1179改善阿尔兹海默症小鼠的行为学指标

取7周龄雄性C57BL/6J小鼠32只，适应环境一周后，采用一次性脑部海马微注射Aβ1-42蛋白建立阿尔兹海默症的动物模型，造模后第3天，将动物分为四组：对照组(注射等体积的生理盐水)、模型组、药物干预组、CCFM1179干预组，每组含8只小鼠。动物分组及处理方法见表1。

表1动物实验分组及处理方法

脑部微注射Aβ1-42蛋白导致的AD小鼠模型：小鼠适应一周后，各组小鼠经异氟烷(诱导浓度3％，维持浓度1％)麻醉后，将小鼠头顶去毛，用75％酒精消毒后，固定于脑立体定位仪上。手术刀沿正中矢状方向划开一个切口，暴露头骨，医用棉签取双氧水擦拭颅骨以暴露其前囱的交错十字区，找到前囱位置，做好标记。参照小鼠脑立体定位图谱，于前囱后2.0mm，中线旁开1.8mm处打孔。5μL微量进样器自颅骨表面垂直向下进针2.0mm，注射样品量为1μL，进样速度为0.2μL/min。模型组、药物干预组、CCFM1179干预组注射寡聚肽Aβ1-42，浓度为2μg/μL，对照组注射等量无菌生理盐水。注射后，留针5min，后缓慢退针。缝合伤口后，按4万单位/只给予青霉素钠肌注，大约2-3天。整个过程无菌操作。

益生菌灌胃剂：取活化2代的双歧杆菌CCFM1179并于37℃下培养至24h，于4℃、8000r/min离心3min收集菌体，弃去上清并用10％灭菌脱脂乳液重悬菌体，使乳酸菌浓度达到5×10⁹CFU/mL。灌胃体积为0.2mL/只/天。

第五周开始，对所有小鼠进行行为学测试。包括Y迷宫实验、水迷宫实验、避暗实验。具体实施方法和结果如下：

(1)Y迷宫实验：

Y迷宫实验可同时观察动物的逃避条件反射能力和空间辨别能力，应用于评价动物的辨别性学习、工作记忆及参考记忆。Y迷宫实验包含两个阶段，第一个阶段为训练期：将小鼠放入Y型迷宫，在起始臂和其他臂中自由活动10min，训练结束后，小鼠被放回饲养笼，24小时后进行下一阶段的测试。第二个阶段为检测期：小鼠由中心点放入迷宫，在3个臂中自由活动8min。录像分析系统记录总进臂次数和连续进入三个不同臂的次数，并按公式计算交替百分比：交替百分比＝连续进入三个不同臂的次数/(总进臂次数-2)×100％。

实验结果如图1A所示，模型组小鼠在Y迷宫实验中自由交替百分比降低至48.41％,表现出辨别记忆障碍的行为特点；而灌胃CCFM1179能够显著改善以上行为障碍，效果与盐酸多奈哌齐药物干预组相当。

(2)水迷宫实验：

水迷宫实验强迫实验小鼠游泳，从而学习寻找隐藏在水中平台，进而测试实验动物对空间位置感和方向感(空间定位)的学习记忆能力，是开展行为学研究尤其是学习与记忆研究的首选经典实验。

水迷宫圆形池被划分为四个象限，水温保持23-25℃。在第0天进行水迷宫适应性训练，第1-5天进行定位巡航实验，每天4次。定位巡航实验时，将小鼠面向池壁从四个随机不同的入水点分别放入水池，记录小鼠从进入水中到找到水下隐蔽的平台并站立于其上所需时间(逃避潜伏期)和在此期间的运动总距离。若入水后60s小鼠未能找到隐藏的平台，则将用长棍将其轻轻引导至平台，并让其在平台上站立30s，逃避潜伏期记为60s。之后在第6天移掉平台，进行空间探索实验，记录60s内小鼠穿越原平台的次数以及原平台所在象限停留的时间及运动距离。

实验结果如图1B和1C所示，模型组小鼠在水迷宫实验中逃避潜伏期明显升高至51.06s，表明模型组小鼠空间记忆和学习记忆受损；灌胃CCFM1179能够显著改善以上行为障碍，使潜伏期降低至37.6s，此外，CCFM1179组小鼠在原平台所在象限的停留时间占总时长的百分比显著升高至68.21％(图1C)，且效果明显优于盐酸多奈哌齐药物干预组的50.68％。

(3)避暗实验：

水迷宫实验后小鼠休息1天，然后开展避暗试验，试验共历时2天。第1天为单次电击训练期，将小鼠放置在明亮箱体中，10s后，将明暗箱之间的门打开。多数品系的小鼠有很强的探究行为，喜暗恶光。因此，小鼠会很快进入暗箱。小鼠一旦完全进入暗箱中后，关闭通道门，开始电击(0.3mA，2s)；让小鼠在暗箱内停留10s(以使让动物形成箱与电击之间的关联)，将小鼠放回笼内。第2天为记忆保持测试期，将小鼠放置在明亮箱体中，中门打开，但不给电击。记录小鼠钻入暗箱时间，记为潜伏期。

实验结果如图1D所示，模型组小鼠钻入暗箱的潜伏期明显缩短至10.6s，表明小鼠记忆保持能力受损，而CCFM1179干预能使小鼠钻入暗箱的潜伏期显著延长至33.04s，缓解其记忆障碍，该效果优于药物组的14.67s。

实施例3CCFM1179降低阿尔兹海默症小鼠脑内Aβ蛋白沉积

小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。小鼠行为学实验结束后，隔天采用浓度为1％的戊巴比妥钠溶液对小鼠进行腹腔注射，使其麻醉，对小鼠进行处死，取小鼠脑组织，并于冰上分离海马组织。取一定质量的新鲜海马组织，加入9倍体积的无菌PBS缓冲液(相当于1g组织加9ml的匀浆液)，用组织匀浆器进行匀浆，组织液经过3000g、15min离心后取上清，用ELISA试剂盒检测海马中Aβ1-42的含量。

实验结果如图2所示，结果表明，短双歧杆菌CCFM1179干预能够显著降低模型小鼠海马组织中Aβ1-42蛋白的沉积，缓解效果与盐酸多奈哌齐药物干预组相当。

实施例4短双歧杆菌CCFM1179提高阿尔兹海默症小鼠脑内神经递质水平

取一定质量实施例3获得的脑组织，加入9倍体积的无菌PBS缓冲液(相当于1g组织加9ml的匀浆液)，用组织匀浆器进行匀浆，组织液经过3000g、15min离心后取上清，用ELISA试剂盒检测脑组织中脑源性神经营养因子BDNF的含量。

实验结果如图3A所示，结果表明，短双歧杆菌CCFM1179干预显著逆转了阿尔兹海默症模型小鼠大脑中BDNF水平的降低，BDNF的升高能够促进神经生成，减少患病大脑的炎症。

实施例5短双歧杆菌CCFM1179提高阿尔兹海默症小鼠脑内突触蛋白水平

取一定质量实施例3获得的脑组织，加入9倍体积的无菌PBS缓冲液(相当于1g组织加9ml的匀浆液)，用组织匀浆器进行匀浆，组织液经过3000g、15min离心后取上清，用ELISA试剂盒检测脑组织中突触后密度蛋白PSD-95的含量。

实验结果如图3B所示，结果表明，短双歧杆菌CCFM1179干预显著逆转了阿尔兹海默症模型小鼠大脑中PSD-95水平的降低，相对于模型组的1.325pg/mL提高至1.507pg/mL，且CCFM1179对大脑中PSD95的改善效果显著优于盐酸多奈哌齐的1.402pg/mL，与正常对照组相当。

实施例6短双歧杆菌CCFM1179能够提高阿尔兹海默症小鼠血清中5-HT的含量

小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。行为学实验结束处死小鼠后，将收集到的小鼠血液静置2h，3000×g离心15min后获得血清，用ELISA试剂盒检测血清中5-羟色胺(5-HT)的含量。外周组织中的5-HT对维持正常的肠道蠕动功能具有重要意义。外周组织的5-HT能够激动胃肠道平滑肌5-HT2受体，或作用于肠壁内神经节细胞5-HT4受体，引起胃肠道平滑肌收缩，使胃肠道张力增加，肠蠕动加快；外周组织5-HT的减少与便秘、胃肠道不适等疾病有直接的关联。

实验结果如图4所示，在阿尔茨海默症模型小鼠血清中，5-HT的水平显著下降至36.95pg/mL，表明肠道蠕动功能受损；短双歧杆菌CCFM1179干预后将血清中5-HT的水平显著提高至47.70pg/mL，不仅表现出较好的认知及记忆保护功能，还能恢复小鼠的正常肠道蠕动功能，而药物盐酸多奈哌齐干预效果不显著，未恢复至正常水平。

实施例7短双歧杆菌CCFM1179能够提高阿尔兹海默症小鼠粪便中乙酸的含量

小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。小鼠行为学实验结束后，收集小鼠粪便冻存于-80℃，用GC-MS的方法检测小鼠粪便中乙酸的含量。具体方法如下：取50mg小鼠粪便样品，加入500μL的饱和NaCl溶液中浸泡混匀；加入20μL 10％硫酸溶液酸化后，再加入800μL乙醚震荡，离心(13000rpm，15min，4℃)；取上层乙醚相，加0.25g无水硫酸钠干燥；充分震荡后静置30min，再次离心(13000rpm，15min，4℃)；吸取上清液加入气相小瓶中，进行气质分析。

GC-MS条件为：使用Rtx-Wax柱(柱长30m，内径25μm)；载气为He，流速为2mL/min；进样体积1μL，按7.5℃/min升温至140℃，然后按60℃/min升温至200℃保持3min,离子化温度为20℃；分析采用全扫描模式，通过外标法测得标准曲线，进而计算出乙酸的浓度。

实验结果如图5所示，模型组小鼠粪便中乙酸含量显著低于对照组，且具有统计学意义，短双歧杆菌CCFM1179干预使小鼠粪便中乙酸含量显著回升至18.187μmol/g，比模型组高6.787μmol/g，且比对照组乙酸含量高2.031μmol/g。

实施例8短双歧杆菌CCFM1179对阿尔兹海默症小鼠肠道菌群的调节作用

小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。小鼠行为学实验结束后，收集小鼠粪便。按照MP试剂盒的操作步骤提取小鼠粪便中细菌基因组；以小鼠粪便基因组为模板，以上游引物520F(5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′)、下游引物802R(5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′)为引物扩增16S rDNA的V3-V4区片段；将PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳进行纯化，按照QIAquick GelExtraction Kit胶回收试剂盒说明书进行目的条带胶回收；按照Qubit DNA3.0试剂盒检测样品DNA浓度，然后根据TurSeq DNA LT Sample Preparation Kit及其说明构建文库；最后按照MiSeq Regent Kit试剂盒的说明进行Illumina Miseq测序仪上机测序。测序完成后，在QIIME平台进行物种分类注释，在MicrobiomeAnalyst平台对数据进行表昏花，并计算样本的α多样性和β多样性。

菌群种内α-多样性用chao1指数和物种丰富度(Observed richness)来表征，结果如图6所示。短双歧杆菌CCFM1179能显著上调肠道菌群的α-多样性，改善肠道菌群的物种丰度程度。菌群的β-多样性用主坐标分析(PCoA)进行评估(图7)，结果表明阿尔兹海默症小鼠肠道菌群与正常小鼠存在显著差异，短双歧杆菌CCFM1179干预后其肠道菌群与模型组小鼠的菌群实现一定程度的分离，并有向正常小鼠菌群转化的趋势。

此外，阿尔兹海默症模型组小鼠粪便内嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansiamuciniphila)的肠道微生物丰度显著降低，短双歧杆菌CCFM1179的摄入可使其相对丰度显著回升3倍左右，而药物盐酸多奈哌齐对其丰度变化不显著。嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)的主要代谢产物为丙酸，其在肠道中的定殖与宿主的健康息息相关，它可以改善肥胖、糖尿病患者的炎症反应以及胰岛素抵抗和葡萄糖耐受等不良症状，还可以调节机体的免疫应答，维持体内代谢平衡。

实施例9利用本发明短双歧杆菌CCFM1179制造含该菌的发酵食品

选用新鲜蔬菜或水果洗净后榨汁，包括白菜、白萝卜、黄瓜、甜菜、黄桃、杨梅制品中的一种或上述多种的混合物为原料。对榨汁后的原料进行高温瞬间灭菌，在温度140℃下高温热杀菌2秒后，立即降温至37℃，再接入本发明的短双歧杆菌CCFM1179或含有该菌株的菌剂发酵剂，使短双歧杆菌CCFM1179浓度达到10⁶CFU/mL以上，在温度4℃下冷藏保存，于是得到含有本发明短双歧杆菌CCFM1179活菌的果蔬饮料。

利用本发明的短双歧杆菌CCFM1179作为发酵微生物生产发酵食品，所述发酵食品包括固态食品、液态食品、半固态食品。所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品，所述乳制品包括发酵乳制品(发酵乳、风味发酵乳、发酵乳饮料等)、奶油、乳酪、含乳饮料以及乳粉；所述豆制品包括豆奶、豆乳粉；所述果蔬制品包括白菜、白萝卜、黄瓜、甜菜、黄桃、杨梅制品。

按照实施例2～8所述的方法验证发酵食品对于改善阿尔兹海默症状的作用，结果显示，所述发酵食品对于改善阿尔兹海默症小鼠的认知和记忆障碍，降低阿尔兹海默症小鼠脑内Aβ1-42蛋白的含量，提高阿尔兹海默症小鼠脑内脑源性神经营养因子和突触后密度蛋白的水平、提高阿尔兹海默症小鼠血清中5-羟色胺的含量有辅助作用；该发酵食品能够提高阿尔兹海默症小鼠粪便中菌群代谢物乙酸水平，改善胃肠道蠕动功能，并能调节阿尔兹海默症小鼠肠道菌群的结构，改善肠道菌群的物种多样性程度，提高肠道有益菌嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)的相对丰度。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一株能够缓解阿尔兹海默症并增加粪便乙酸含量的短双歧杆菌及其应用

<130> BAA210490A

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 473

<212> DNA

<213> Bifidobacterium breve

<400> 1

atcctagggg agcggcgttc tgcagagcgg acgggtcacc ttgaccgggt cagtcacacc 60

ggcggccagc aggtcctcgt aggtgtcggt ggcggcgttg aagccttcgc catcgggcag 120

agaacgaacc ttgttgatca ccacgtcgcc ggacacgcca gcattctcgg caatctgctt 180

gatcggggct tcgatggcgc ggaacacgat ggcggcaccg gtagcctctt cgccggtcag 240

ggaggtgacg gcctcagcct tctcggcctt ggcagcagcc tgaacgaggg ccacgccacc 300

gccgggcagc aggccttcct caatggcggc cttggcgtta cgcacggcat cttcgatgcg 360

gtgcttgcgc tccttggcct cgacctcggt ggcagcgccg accttgatga cagccacgcc 420

gccggccagc ttggccagac gctcctgcag cttctcacga tcgttaatcg gaa 473

Claims (10)

1.短双歧杆菌(Bifidobacterium breve) CCFM1179，于2021年3月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:61589。

2.含有权利要求1所述短双歧杆菌CCFM1179的组合物，其特征在于，所述组合物中短双歧杆菌CCFM1179的细胞数量≥1×10⁸ CFU/g或1×10⁸ CFU/mL。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物为功能性食品或药物。

4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物为发酵食品；所述发酵食品为固态食品、液态食品或半固态食品。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述发酵食品为乳制品、豆制品或果蔬制品。

6.含有权利要求1所述的短双歧杆菌CCFM1179的菌剂，其特征在于，所述菌剂是将含有短双歧杆菌CCFM1179的菌液干燥得到的粉剂。

7.权利要求1所述的短双歧杆菌CCFM1179，或权利要求2~5任一所述的组合物，或权利要求6所述的菌剂在制备延缓阿尔兹海默症的药物中的应用，其特征在于，所述药物含有权利要求1所述的短双歧杆菌CCFM1179及药学上可接受的载体。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述载体为医学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述延缓阿尔兹海默症选自（a）~（d）中的至少一种：

（a）降低哺乳动物脑内β-淀粉样多肽-42沉积；

（b）提高哺乳动物脑内脑源性神经营养因子BDNF水平；

（c）提高哺乳动物脑内突触后密度蛋白水平；

（d）提高哺乳动物血清中5-羟色胺的含量。

10.权利要求1所述的短双歧杆菌CCFM1179，或权利要求2~5任一所述的组合物，或权利要求6所述的菌剂在制备调节肠道菌群的产品中的应用。

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