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CN113215021B - 一株产尿素细菌菌株及其在烟草栽培中的应用 - Google Patents

一株产尿素细菌菌株及其在烟草栽培中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产尿素细菌菌株及其在烟草栽培中的应用，该菌株为短短芽孢杆菌Brevibacillus brevis；保藏名称为短短芽孢杆菌Brevibacillus brevis PE01菌株；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2020年11月27日；保藏编号:CCTCC NO.M 2020783。本发明利用PE01菌株制备的微生物肥料在烟草栽培中可以替代30％化学肥料而不影响烟叶产量。本发明的利用PE01菌株制备的微生物肥料，具有使用成本低、环保安全、无残留、对人畜安全的特点。

Description

一株产尿素细菌菌株及其在烟草栽培中的应用
技术领域
本发明涉及生物肥料技术领域，特别涉及一株产尿素细菌菌株及其在烟草栽培中的应用。
背景技术
尿素是目前国际上农业生产中应用最广泛、施用量最大的氮肥品种，约占50％的世界氮肥生产及消费市场。然而，长期过量施用氮肥导致土壤结构恶化、氮肥利用率低，还会出现过量的氮肥以氨挥发、反硝化、淋洗等途径大量流失，既造成巨大的经济损失，又给生态环境和人类健康带来严重的危害(Nosengo，2003)。生物源尿素主要来自哺乳动物、两栖动物以及水生浮游生物、鱼类、异养细菌等(Solomon et al，2010)，海洋沉积物中的尿素主要是细菌产生的(Pedersen et al.，1993)。Escherichia coli、Fragilartacrotonensis、Micrococcus denitrificans、Sporosarcina ureae等细菌可产生尿素(Perozich et al.，1998)。
本发明人在前期工作中发现，利用产尿素细菌做成的微生物肥料不仅可以促进烤烟的生长，对烟叶品质提升效果也相当显著；尽管其促生机制尚不清楚，利用产尿素细菌替代化学肥料在烤烟栽培中有重要的应用价值。相对于来自土壤、水体等其它生境的细菌，植物内生菌在根际土壤和植物体内的定殖更有优势。为此，本发明人从烟草内生菌中筛选高产尿素的细菌，为开发针对烟草种植的微生物菌剂及其应用奠定基础。本发明人发现从烟草内生菌中分离到的短短芽孢杆菌(Brevibacillus brives)PE01菌株高产尿素，利用PE01菌株制备的菌剂提升烟叶产量显著，而该细菌的产尿素特性及其在烟草栽培中的应用未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之不足，本发明的目的是提供一株成本低、环保 安全的产尿素细菌菌株及其在烟草栽培中的应用。
本发明的技术方案如下：本发明提供了如下技术方案：本发明的一株产尿素细菌菌株，该菌株为短短芽孢杆菌Brevibacillus brevis；保藏名称为短短芽孢杆菌Brevibacillus brevis PE01菌株；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2020年11月27日；保藏编号:CCTCC NO.M 2020783。
进一步地，所述的短短芽孢杆菌Brevibacillus brevis PE01菌株为革兰氏阳性菌。
该菌株在4-45℃的温度范围内生长，最适生长温度32℃；在pH 6.0-10.0的范围内生长，最适生长pH为7.2；耐受NaCl的最高浓度为6.5％(W/V)，利用引物5’-GGT TAC CTTGTT ACG ACT T-3’，5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’经PCR扩增该菌株的16S rRNA基因，获得的序列提交到GeneBank公共数据库，其序列号为JF899267，此序列是鉴定该菌株的分子特征依据。
本发明所述的产尿素细菌菌株制备的产尿素细菌菌剂。
进一步地，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)所述的产尿素细菌的发酵培养物；
(b)所述的产尿素细菌细胞的超声裂解上清；
(c)所述的产尿素细菌细胞的超声裂解沉淀。
本发明所述的产尿素细菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)PE01菌株试管斜面种子培养：将该菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，32℃下培养3天后获得斜面种子；
(2)PE01菌株液体种子培养：将斜面种子接种到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，35℃，165rpm条件下摇床培养3天获得液体种子；
(3)PE01菌株发酵罐大量培养：将液体种子按5％(V/V)的比例接入发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在1000升发酵罐中的培养条件控制在：温度32℃，搅拌速度150rpm，发酵时间72小时，获得产尿素细菌菌剂。
进一步地，在步骤(1)中，在常规的牛肉膏蛋白胨培养基上，32℃下培养2天，菌落直径1.5-4.5mm，淡黄色；细胞圆杆状，宽0.6-0.9μm，长1.5-3.5μm，能形成芽孢。
本发明所述的产尿素细菌Brevibacillus brevis PE01菌株在制备微生物肥料中的应用。
本发明所述的产尿素细菌Brevibacillus brevis PE01菌株微生物肥料在烟草栽培中替代化学肥料的应用。
本发明的有益效果在于：
1、利用PE01菌株制备的微生物肥料在烟草栽培中可以替代30％化学肥料而不影响烟叶产量。
2、利用PE01菌株制备的微生物肥料，具有使用成本低、无残留、对人畜安全的特点。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是对本发明保护范围的限定。
本发明的一株产尿素细菌菌株，该菌株为短短芽孢杆菌Brevibacillus brevis；保藏名称为短短芽孢杆菌Brevibacillus brevis PE01菌株；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2020年11月27日；保藏编号:CCTCC NO.M2020783。
所述的短短芽孢杆菌Brevibacillus brevis PE01菌株为革兰氏阳性菌。
该菌株在4-45℃的温度范围内生长，最适生长温度32℃；在pH 6.0-10.0的范围内生长，最适生长pH为7.2；耐受NaCl的最高浓度为6.5％(W/V)，利用引物5’-GGT TAC CTTGTT ACG ACT T-3’，5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’经PCR扩增该菌株的16S rRNA基因，获得的序列提交到GeneBank公共数据库，其序列号为JF899267，此序列是鉴定该菌株的分子特征依据。
本发明所述的产尿素细菌菌株制备的产尿素细菌菌剂。
其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)所述的产尿素细菌的发酵培养物；
(b)所述的产尿素细菌细胞的超声裂解上清；
(c)所述的产尿素细菌细胞的超声裂解沉淀。
本发明所述的产尿素细菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)PE01菌株试管斜面种子培养：将该菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，32℃下培养3天后获得斜面种子；在常规的牛肉膏蛋白胨培养基上，32℃下培养2天，菌落直径1.5-4.5mm，淡黄色；细胞圆杆状，宽0.6-0.9μm，长1.5-3.5μm，能形成芽孢。
(2)PE01菌株液体种子培养：将斜面种子接种到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，35℃，165rpm条件下摇床培养3天获得液体种子；
(3)PE01菌株发酵罐大量培养：将液体种子按5％(V/V)的比例接入发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在1000升发酵罐中的培养条件控制在：温度32℃，搅拌速度150rpm，发酵时间72小时，获得产尿素细菌菌剂。
本发明所述的产尿素细菌Brevibacillus brevis PE01菌株在制备微生物肥料中的应用。
本发明所述的产尿素细菌Brevibacillus brevis PE01菌株微生物肥料在烟草栽培中替代化学肥料的应用。
实施例1
下面结合实施例对本发明作进一步的详述。实施例中的微生物肥料，按微生物发酵常规方法及微生物肥料制备常规方法制成。
1.PE01菌株产尿素能力测定
尿素含量标准曲线绘制：分别配制质量浓度为20mg/L，50mg/L，100mg/L，200mg/L，300mg/L的尿素水溶液。在棕色比色管中加入5.4ml混合试剂(混合试剂配方：120mg氨基硫脲，125mg Ce(SO4)2·2(NH4)2SO4，55ml浓硫酸，46ml 85％磷酸，380mg 4-安替比林，用去离子水定容至1000ml)，在比色管中分别加入100μL各浓度的尿素水溶液，再加入540μL质量浓度为1.2％的二乙酰一肟水溶液，混匀后100℃水浴8min，之后20℃水浴冷却5min，然后用分光光度计测定溶液在525nm下的吸光度，绘制尿素浓度与吸光度间的标准曲线并，求得尿素浓度与吸光度间的换算公式。
PE01菌株培养液尿素含量测定：将1433菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、150rpm培养2天，将培养液于8000rpm下离心10min，取上清液用于尿素含量测定。取5.4ml复合试剂于棕色比色管中，加入100μl上清液和540μl 1.2％二乙酰一肟水溶液，混匀后100℃水浴8min，之后20℃水浴冷却5min，然后用分光光度计测定溶液在525nm下的吸光度，根据尿素浓度与吸光度间的换算公式求得上清液中的尿素含量；以等体积的牛肉膏蛋白胨液体培养基为对照。
测定结果：根据标准曲线获得尿素浓度(y)与吸光度(x)间的线性关系公式为y＝2672.4x+2.1596(r＝0.9943)。根据此公式，对照牛肉膏蛋白胨培养基中的尿素含量为0，而PE01菌株培养液中的尿素含量为415.35mg/l。
2.本发明的PE01菌株的培养及微生物肥料制备
PE01菌株试管斜面种子培养：将该菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，32℃下培养3天后获得斜面种子。
PE0菌株液体种子培养：将斜面种子接种到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，35℃，165rpm条件下摇床培养3天获得液体种子。
PE01菌株发酵罐大量培养：将液体种子按5％(V/V)的比例接入发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在1000升发酵罐中的培养条件控制在：温度32℃，搅拌速度150rpm，发酵时间72小时。
PE0菌株微生物肥料的制备：经发酵罐培养获得的微生物菌体及其代谢物与适量的硅藻土混合后在65℃以下烘干或晾干至水分含量小于5％，粉碎后制成。需保证PE01菌株在菌剂中的活菌数含量在3×109个/克以上。
3.本发明的微生物肥料替代化学肥料对烤烟农艺性状影响的温室试验
3.1供试肥料及用量，烟草品种
PE01菌株微生物肥料(活菌数含量＝3.5×109个/克，按本发明上述方法制备)，5公斤/亩；烟草专用复合肥(N:P:K＝12:12:24)，纯氮7kg/亩，折合5.8g/株。试验用烟草品种为K326。
3.2试验处理
T1：100％烟草专用肥(纯氮5.8g/株)；
T2：PE01菌株微生物肥料(4.2g/株)+50％烟草专用肥(纯氮2.9g/株)；
T3：PE01菌株微生物肥料(4.2g/株)+70％烟草专用肥(纯氮4.1g/株)；
T4：PE01菌株微生物肥料(4.2g/株)+90％烟草专用肥(纯氮5.2g/株)。
3.3试验方法
在花盆中将肥料与土壤混合均匀后移栽烟苗，每处理5个重复，在温室中随机排列摆放，定期按需要浇水。于烟叶成熟期测量各处理烟株的主要农艺性状，包括：茎高、茎围、叶片数、指定叶(长、宽)。
3.4结果
在温室条件下，测试了PE01菌株微生物肥料在5公斤/亩用量下替代50％(T2)、30％(T3)和10％(T4)烟草专用肥时对烟叶主要农艺性状的影响。结果(表1)显示，在试验的4个处理中，N4的农艺性状最好，茎高、茎围、叶片数、指定叶的数据均显著高于其它处理；处理N2的农艺性状最好最差，各农艺性状值显著低于其它3个处理；N3和N1的农艺性状无显著差异。以上结果说明利用PE01菌株微生物肥料不仅能替代10％烟草专用肥，且促进烟株生长效果显著；PE01菌株微生物肥料在替代30％烟草专用肥时不影响烟叶产量；PE01菌株微生物肥料在替代50％烟草专用肥时对烟叶产量有负面影响。PE01菌株微生物肥料替氮试验中各处理农艺性状比较如表1所示：
表1PE01菌株微生物肥料替氮试验中各处理农艺性状比较
Figure GDA0003114283770000061
注：同一列中，数据后字母相同的表示这些处理无显著差异，反之，差异显著。
4.本发明的微生物肥料替代化学肥料对烤烟农艺性状影响的大田试验
4.1试验地点
云南省宁洱县磨黑镇。
4.2供试肥料及用量，烟草品种
PE01菌株微生物肥料(活菌数含量＝3.5×109个/克，按本发明上述方法制备)，5公斤/亩；烟草专用复合肥(N:P:K＝12:12:24)，纯氮7kg/亩。试验用烟草品种为K326。
4.3试验处理
以当地常规施肥(纯氮7kg/亩)为对照，设置不同的纯氮施肥量和不同的PE01菌株微生物肥料使用量，随机区组排列，3次重复，每个小区不少于50株，处理设置如下：
T1：100％烟草专用肥(纯氮7kg/亩)；
T2：PE01菌株微生物肥料(5kg/亩，50倍液)+50％烟草专用肥(纯氮3.5kg/亩)；
T3：PE01菌株微生物肥料(5kg/亩，50倍液)+70％烟草专用肥(纯氮4.9kg/亩)；
T4：PE01菌株微生物肥料(5kg/亩，50倍液)+90％烟草专用肥(纯氮6.3kg/亩)；
4.4施肥方法
按当地优质烟生产规范要求挖穴，在各处理的穴中按200公斤/亩的用量施入同一株有机肥，之后按各处理的要求用量施入烟草专用肥。对需要施用PE01菌株微生物肥料的处理，按相应剂量兑水稀释后浇于有机肥上。烤烟生长过程中的管理按按常规方法进行。
4.5农艺性状调查
于封顶期对各处理进行农艺性状调查，每个处理随机选取烟株30株，测量其茎高、茎围、叶片数、指定叶(长、宽)。
4.6结果与分析
封顶期农艺性状调查如表2所示：
表2封顶期农艺性状调查
Figure GDA0003114283770000071
Figure GDA0003114283770000081
注：同一列中，数据后字母相同的表示这些处理无显著差异，反之，差异显著。
表2显示了用PE01菌株微生物肥料在5kg/亩用量下分别替代10％(T4)、30％(T3)和50％(T2)烟草专用肥时各处理封顶期的农艺性状调查结果。在这4个处理中：T4的各农艺性状最好，说明在PE01菌株微生物肥料不仅能替代10％烟草专用肥，且促进烟株生长效果显著；T3和T4处理的各农艺性状无显著差异，说明PE01菌株微生物肥料在替代30％烟草专用肥时不影响烟叶产量；T2效果最差，各农艺性状数值菌显著低于T1，说明PE01菌株微生物肥料在替代50％烟草专用肥时对烟叶产量有负面影响。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一株产尿素细菌菌株，其特征在于：该菌株为短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）；保藏名称为短短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）PE01菌株；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉大学；保藏日期：2020年12月12日；保藏编号: CCTCCNO.M 2020783。
2.权利要求1所述的产尿素细菌菌株制备的产尿素细菌菌剂。
3.根据权利要求2所述的产尿素细菌菌剂，其活性成分为如下（a）（b）（c）中的至少一种：
（a）权利要求1所述的产尿素细菌的发酵培养物；
（b）权利要求1所述的产尿素细菌细胞的超声裂解上清；
（c）权利要求1所述的产尿素细菌细胞的超声裂解沉淀。
4.权利要求2所述的产尿素细菌菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）PE01菌株试管斜面种子培养：将该菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，32℃下培养3天后获得斜面种子；
（2）PE01菌株液体种子培养：将斜面种子接种到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，35℃，165 rpm条件下摇床培养3天获得液体种子；
（3）PE01菌株发酵罐大量培养：将液体种子按5％（V/V）的比例接入发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在1000升发酵罐中的培养条件控制在：温度32℃，搅拌速度150 rpm，发酵时间72小时，获得产尿素细菌菌剂。
5.根据权利要求4所述的产尿素细菌菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤（1）中，在常规的牛肉膏蛋白胨培养基上，32℃下培养2天，菌落直径1.5-4.5 mm，淡黄色；细胞圆杆状，宽0.6-0.9 μm，长1.5-3.5 μm，能形成芽孢。
6.权利要求1所述的产尿素细菌（Brevibacillus brevis） PE01菌株在制备微生物肥料中的应用。
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