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CN113195527A - Tcr和肽 - Google Patents

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CN113195527A
CN113195527A CN201980072905.0A CN201980072905A CN113195527A CN 113195527 A CN113195527 A CN 113195527A CN 201980072905 A CN201980072905 A CN 201980072905A CN 113195527 A CN113195527 A CN 113195527A
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CN
China
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seq
amino acid
variant
acid sequence
sequence identity
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Application number
CN201980072905.0A
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M.C.博尼尼
E.鲁吉罗
Z.I.马格纳尼
F.西塞里
E.卡内瓦尔
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Ospedale San Raffaele SRL
Original Assignee
Ospedale San Raffaele SRL
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Publication date
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Abstract

T细胞受体(TCR)，其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的Wilms肿瘤1蛋白(WT1)肽。

Description

TCR和肽
发明领域
本发明涉及T细胞受体(TCR)，其结合由主要的组织相容性复合物呈递时的源自Wilms肿瘤1蛋白(WT1)的肽。在这方面，本发明涉及特异性识别WT1肽的互补决定区(CDR)。本发明进一步涉及源自WT1的免疫原性肽。
发明背景
T细胞受体(TCR)基因疗法基于将高亲合力肿瘤特异性TCR基因遗传转移到T淋巴细胞中，从而使得能够特异性靶向期望的肿瘤相关抗原并且导致较小的毒性和更特异且有效的疗法。此种方法已在临床试验中显示出希望。限制TCR基因疗法用于癌症临床治疗的主要障碍之一是缺乏肿瘤特异性T细胞和相应的TCR。因此，肿瘤特异性TCR的低可用性仍然是一个开放的问题，其限制基于TCR的免疫治疗方法的广泛利用。
大部分肿瘤相关抗原(TAA)是自身抗原，因此，由于中枢和外周耐受性，对此类分子特异的T细胞被破坏或无反应化。尽管这样，在同种异体造血干细胞移植(allo-HSCT)之后，在健康的供体和患者中，尤其是在受血液恶性影响的患者中，已经观察到天然存在的肿瘤特异性T细胞，在所述同种异体造血干细胞移植中肿瘤特异性淋巴细胞的频率已经与疾病消退相关联(Kapp,M.et al.Bone Marrow Transplantation 43,399–410(2009)；和Tyler,E.M.et al.Blood 121,308–317(2013))。
要由免疫治疗方法靶向的肿瘤抗原的选择仍然是一个争论的问题。理想的TAA在肿瘤细胞上高表达，而在健康组织中以最小程度表达。
Wilms肿瘤1(Wilms tumor 1，WT1)是一种编码锌指转录因子的细胞内蛋白，所述锌指转录因子在细胞生长和分化中起着重要作用(Yang,L.et al.Leukemia 21,868-876(2007))。WT1在多种血液和实体瘤中广泛表达，而在各种健康组织(例如性腺，子宫，肾，间皮，不同组织中的祖细胞)上显示有限表达。最近的证据表明WT1在白血病发生(leukemogenesis)和肿瘤发生(tumorigenesis)中的作用。
数项正在进行的临床试验依赖于用WT1肽接种疫苗后细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的产生。然而，尽管认识到WT1可用于免疫疗法，但限于有限数量的HLA等位基因的少数WT1表位目前用于疫苗接种目的(Di Stasi,A.et al.Front.Immunol.(2015))。一种此类表位是WT1 126-134表位(RMFPNAPYL；SEQ ID NO:71)，其被由HLA-A*0201等位基因编码的MHC呈递(即表位是HLA-A*0201限制的)。
由于具有HLA-A*0201单体型的主要组织相容性复合物(MHC)在绝大多数(60％)高加索人群中表达，因此HLA-A*0201限制性表位和相应的TCR受到关注。因此，由于可以广泛应用利用此类TCR的免疫疗法，靶向HLA-A*0201限制性WT1表位的TCR是特别有利的。
已经单独或与其他肿瘤抗原结合在数项试验中广泛研究了WT1 126-134表位。然而，最近的报道突出强调了对该特定表位的加工的主要担忧，所述加工可能损害其用于免疫疗法目的的用途。值得注意的是，与标准蛋白酶体相比，免疫蛋白酶体更有效加工WT1126-134表位(Jaigirdar,A.et al.J Immunother.39(3):105-16(2016))，这导致内源表达WT1的许多HLA-A*0201肿瘤细胞系或原发性白血病细胞的较差识别。
因此，仍然需要新的WT1表位，特别是由具有普遍的HLA单体型(例如HLA-A*0201)的MHC呈递的表位。
已经鉴定出的一种天然加工的HLA-A*0201限制性表位是WT1 37-45，其具有氨基酸序列VLDFAPPGA(SEQ ID NO:72，参见例如Smithgall et al 2001；Blood 98(11Part 1):121a)。然而，已经报道了对此肽序列特异性的很少的TCR氨基酸序列，特别是CDR序列(Schmitt,T.M.et al.(2017)Nat Biotechnol 35:1188-1195)。
因此，仍然需要新的WT1表位，特别是那些限于常见的HLA等位基因的表位，并且需要能够结合WT1表位的新的TCR。
发明概述
我们已经鉴定出新的TCR，其结合由MHC时呈递时的WT1肽。此外，我们已经确定TCR的氨基酸序列，包括其CDR区的氨基酸序列，所述CDR区负责对WT1的结合特异性。此外，我们已经证明表达根据本发明的TCR的T细胞特异性靶向并杀死过表达WT1蛋白的细胞。另外，已经显示了本发明的TCR限于由高加索人群中常见的HLA I类和II类等位基因编码的MHC，例如HLA-A*0201,HLA-B*38:01,HLA-C*03:03或HLA-C*07:02。
一方面，本发明提供了T细胞受体(TCR)，其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时Wilms肿瘤1蛋白(WT1)肽，其中所述TCR：
(i)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CASGGGADGLTF(SEQ ID NO:25)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASGRGDTEAFF(SEQ IDNO:30)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(ii)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAMRTGGGADGLTF(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSEAGLSYEQYF(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(iii)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CILSTRVWAGSYQLTF(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CATGQATQETQYF(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(iv)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAVIGGTDSWGKLQF(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSQEEGAVYGYTF(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(v)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAVIGGTDSWGKLQF(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CATSREGLAADTQYF(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(vi)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CVVPRGLSTDSWGKLQF(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CATSREGLAADTQYF(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(vii)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CVVPRGLSTDSWGKLQF(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSQEEGAVYGYTF(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(viii)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAAPNDYKLSF(SEQ ID NO:93)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSSGLAFYEQYF(SEQ ID NO:98)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(ix)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAAPNDYKLSF(SEQ ID NO:93)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSQLSGRDSYEQYF(SEQ ID NO:104)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(x)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAVRDGGATNKLIF(SEQ ID NO:110)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSTLGGELFF(SEQ ID NO:120)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xi)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CLVGGYTGGFKTIF(SEQ ID NO:115)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSTLGGELFF(SEQ ID NO:120)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xii)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAVTLLSIEPSAGGYQKVTF(SEQ ID NO:126)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSLEGRAMPRDSHQETQYF(SEQ ID NO:136)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xiii)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAVTLLSIEPSAGGYQKVTF(SEQ ID NO:126)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CATSWGLNEQYF(SEQ ID NO:142)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xiv)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAATSRDDMRF(SEQ ID NO:131)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSLEGRAMPRDSHQETQYF(SEQ ID NO:136)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xv)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAATSRDDMRF(SEQ ID NO:131)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CATSWGLNEQYF(SEQID NO:142)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xvi)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CALPDKVIF(SEQ ID NO:148)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSVSAGSTGELFF(SEQID NO:158)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xvii)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAGLYATNKLIF(SEQ ID NO:153)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSVSAGSTGELFF(SEQ ID NO:158)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xviii)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAAPNDYKLSF(SEQ ID NO:93)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSTLGGELFF(SEQ ID NO:120)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xix)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAVRDGGATNKLIF(SEQ ID NO:110)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSSGLAFYEQYF(SEQ ID NO:98)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xx)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAVRDGGATNKLIF(SEQ ID NO:110)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSQLSGRDSYEQYF(SEQ ID NO:104)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xxi)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CLVGGYTGGFKTIF(SEQ ID NO:115)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSSGLAFYEQYF(SEQ ID NO:98)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xxii)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CLVGGYTGGFKTIF(SEQ ID NO:115)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSQLSGRDSYEQYF(SEQ ID NO:104)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
在一个实施方案中，TCR包含以下CDR序列：
(i)CDR1α-NSAFQY(SEQ ID NO:23)，
CDR2α-TYSSGN(SEQ ID NO:24)，
CDR3α-CASGGGADGLTF(SEQ ID NO:25)，
CDR1β-SGDLS(SEQ ID NO:28)，
CDR2β-YYNGEE(SEQ ID NO:29)，和
CDR3β-CASGRGDTEAFF(SEQ ID NO:30)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(ii)CDR1α-TSDQSYG(SEQ ID NO:1)，
CDR2α-QGSYDEQN(SEQ ID NO:2)，
CDR3α-CAMRTGGGADGLTF(SEQ ID NO:3)，
CDR1β-SNHLY(SEQ ID NO:6)，
CDR2β-FYNNEI(SEQ ID NO:7)，和
CDR3β-CASSEAGLSYEQYF(SEQ ID NO:8)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(iii)CDR1α-TISGTDY(SEQ ID NO:12)，
CDR2α-GLTSN(SEQ ID NO:13)，
CDR3α-CILSTRVWAGSYQLTF(SEQ ID NO:14)，
CDR1β-KGHDR(SEQ ID NO:17)，
CDR2β-SFDVKD(SEQ ID NO:18)，和
CDR3β-CATGQATQETQYF(SEQ ID NO:19)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(iv)CDR1α-DRGSQS(SEQ ID NO:34)，
CDR2α-IYSNGD(SEQ ID NO:35)，
CDR3α-CAVIGGTDSWGKLQF(SEQ ID NO:36)，
CDR1β-LGHNA(SEQ ID NO:39)，
CDR2β-YSLEER(SEQ ID NO:40)，和
CDR3β-CASSQEEGAVYGYTF(SEQ ID NO:41)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(v)CDR1α-DRGSQS(SEQ ID NO:34)，
CDR2α-IYSNGD(SEQ ID NO:35)，
CDR3α-CAVIGGTDSWGKLQF(SEQ ID NO:36)，
CDR1β-LNHNV(SEQ ID NO:50)，
CDR2β-YYDKDF(SEQ ID NO:51)，和
CDR3β-CATSREGLAADTQYF(SEQ ID NO:52)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(vi)CDR1α-NSASQS(SEQ ID NO:45)，
CDR2α-VYSSGN(SEQ ID NO:46)，
CDR3α-CVVPRGLSTDSWGKLQF(SEQ ID NO:47)，
CDR1β-LNHNV(SEQ ID NO:50)，
CDR2β-YYDKDF(SEQ ID NO:51)，和
CDR3β-CATSREGLAADTQYF(SEQ ID NO:52)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(vii)CDR1α–NSASQS(SEQ ID NO:45)，
CDR2α-VYSSGN(SEQ ID NO:46)，
CDR3α–CVVPRGLSTDSWGKLQF(SEQ ID NO:47)，
CDR1β-LGHNA(SEQ ID NO:39)，
CDR2β-YSLEER(SEQ ID NO:40)，和
CDR3β-CASSQEEGAVYGYTF(SEQ ID NO:41)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(viii)CDR1α–VSNAYN(SEQ ID NO:91)，
CDR2α-GSKP(SEQ ID NO:92)，
CDR3α–CAAPNDYKLSF(SEQ ID NO:93)，
CDR1β-SEHNR(SEQ ID NO:96)，
CDR2β-FQNEAQ(SEQ ID NO:97)，和
CDR3β-CASSSGLAFYEQYF(SEQ ID NO:98)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(ix)CDR1α–VSNAYN(SEQ ID NO:91)，
CDR2α-GSKP(SEQ ID NO:92)，
CDR3α–CAAPNDYKLSF(SEQ ID NO:93)，
CDR1β-SGHDN(SEQ ID NO:102)，
CDR2β-FVKESK(SEQ ID NO:103)，和
CDR3β-CASSQLSGRDSYEQYF(SEQ ID NO:104)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(x)CDR1α–VSGNPY(SEQ ID NO:108)，
CDR2α-YITGDNLV(SEQ ID NO:109)，
CDR3α–CAVRDGGATNKLIF(SEQ ID NO:110)，
CDR1β-MNHEY(SEQ ID NO:118)，
CDR2β-SMNVEV(SEQ ID NO:119)，和
CDR3β-CASSTLGGELFF(SEQ ID NO:120)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xi)CDR1α–NIATNDY(SEQ ID NO:113)，
CDR2α-GYKTK(SEQ ID NO:114)，
CDR3α–CLVGGYTGGFKTIF(SEQ ID NO:115)，
CDR1β-MNHEY(SEQ ID NO:118)，
CDR2β-SMNVEV(SEQ ID NO:119)，和
CDR3β-CASSTLGGELFF(SEQ ID NO:120)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xii)CDR1α–SSVSVY(SEQ ID NO:124)，
CDR2α-YLSGSTLV(SEQ ID NO:125)，
CDR3α–CAVTLLSIEPSAGGYQKVTF(SEQ ID NO:126)，
CDR1β-SEHNR(SEQ ID NO:134)，
CDR2β-FQNEAQ(SEQ ID NO:135)，和
CDR3β-CASSLEGRAMPRDSHQETQYF(SEQ ID NO:136)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xiii)CDR1α–SSVSVY(SEQ ID NO:124)，
CDR2α-YLSGSTLV(SEQ ID NO:125)，
CDR3α–CAVTLLSIEPSAGGYQKVTF(SEQ ID NO:126)，
CDR1β-LNHNV(SEQ ID NO:140)，
CDR2β-YYDKDF(SEQ ID NO:141)，和
CDR3β-CATSWGLNEQYF(SEQ ID NO:142)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xiv)CDR1α–DSASNY(SEQ ID NO:129)，
CDR2α-IRSNVGE(SEQ ID NO:130)，
CDR3α–CAATSRDDMRF(SEQ ID NO:131)，
CDR1β-SEHNR(SEQ ID NO:134)，
CDR2β-FQNEAQ(SEQ ID NO:135)，和
CDR3β-CASSLEGRAMPRDSHQETQYF(SEQ ID NO:136)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xv)CDR1α–DSASNY(SEQ ID NO:129)，
CDR2α-IRSNVGE(SEQ ID NO:130)，
CDR3α–CAATSRDDMRF(SEQ ID NO:131)，
CDR1β-LNHNV(SEQ ID NO:140)，
CDR2β-YYDKDF(SEQ ID NO:141)，和
CDR3β-CATSWGLNEQYF(SEQ ID NO:142)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xvi)CDR1α–TRDTTYY(SEQ ID NO:146)，
CDR2α-RNSFDEQN(SEQ ID NO:147)，
CDR3α–CALPDKVIF(SEQ ID NO:148)，
CDR1β-SGDLS(SEQ ID NO:156)，
CDR2β-YYNGEE(SEQ ID NO:157)，和
CDR3β-CASSVSAGSTGELFF(SEQ ID NO:158)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xvii)CDR1α–SIFNT(SEQ ID NO:151)，
CDR2α-LYKAGEL(SEQ ID NO:152)，
CDR3α–CAGLYATNKLIF(SEQ ID NO:153)，
CDR1β-SGDLS(SEQ ID NO:156)，
CDR2β-YYNGEE(SEQ ID NO:157)，和
CDR3β-CASSVSAGSTGELFF(SEQ ID NO:158)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xviii)CDR1α–VSNAYN(SEQ ID NO:91)，
CDR2α-GSKP(SEQ ID NO:92)，
CDR3α–CAAPNDYKLSF(SEQ ID NO:93)，
CDR1β-MNHEY(SEQ ID NO:118)，
CDR2β-SMNVEV(SEQ ID NO:119)，和
CDR3β-CASSTLGGELFF(SEQ ID NO:120)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xix)CDR1α–VSGNPY(SEQ ID NO:108)，
CDR2α-YITGDNLV(SEQ ID NO:109)，
CDR3α–CAVRDGGATNKLIF(SEQ ID NO:110)，
CDR1β-SEHNR(SEQ ID NO:96)，
CDR2β-FQNEAQ(SEQ ID NO:97)，和
CDR3β-CASSSGLAFYEQYF(SEQ ID NO:98)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xx)CDR1α–VSGNPY(SEQ ID NO:108)，
CDR2α-YITGDNLV(SEQ ID NO:109)，
CDR3α–CAVRDGGATNKLIF(SEQ ID NO:110)，
CDR1β-SGHDN(SEQ ID NO:102)，
CDR2β-FVKESK(SEQ ID NO:103)，和
CDR3β-CASSQLSGRDSYEQYF(SEQ ID NO:104)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xxi)CDR1α–NIATNDY(SEQ ID NO:113)，
CDR2α-GYKTK(SEQ ID NO:114)，
CDR3α–CLVGGYTGGFKTIF(SEQ ID NO:115)，
CDR1β-SEHNR(SEQ ID NO:96)，
CDR2β-FQNEAQ(SEQ ID NO:97)，和
CDR3β-CASSSGLAFYEQYF(SEQ ID NO:98)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xxii)CDR1α–NIATNDY(SEQ ID NO:113)，
CDR2α-GYKTK(SEQ ID NO:114)，
CDR3α–CLVGGYTGGFKTIF(SEQ ID NO:115)，
CDR1β-SGHDN(SEQ ID NO:102)，
CDR2β-FVKESK(SEQ ID NO:103)，和
CDR3β-CASSQLSGRDSYEQYF(SEQ ID NO:104)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；或
(xxiii)CDR1α-DRGSQS(SEQ ID NO:182)，
CDR2α-IYSNGD(SEQ ID NO:183)，
CDR3α-CASGGGADGLTF(SEQ ID NO:25)，
CDR1β-SGDLS(SEQ ID NO:28)，
CDR2β-YYNGEE(SEQ ID NO:29)，和
CDR3β-CASGRGDTEAFF(SEQ ID NO:30)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
在一个实施方案中，TCR包含：
(i)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(ii)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(iii)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(iv)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(v)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(vi)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(vii)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(viii)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(ix)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(x)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(xi)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(xii)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(xiii)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(xiv)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(xv)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(xvi)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(xvii)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(xviii)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(xix)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(xx)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(xxi)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(xxii)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；或(xxiii)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:185,190的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体。
在一个实施方案中，TCR包含：
(i)α链，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQID NO:203和SEQ ID NO:32,33和203的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(ii)α链，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQID NO:195和SEQ ID NO:10,11和195的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(iii)α链，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQID NO:197和SEQ ID NO:21,22和197的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(iv)α链，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44,SEQID NO:215和SEQ ID NO:43,44和215的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(v)α链，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQID NO:217和SEQ ID NO:54,55和217的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(vi)α链，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQID NO:217和SEQ ID NO:54,55和217的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(vii)α链，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44,SEQID NO:215和SEQ ID NO:43,44和215的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(viii)α链，其包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:100和101的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(ix)α链，其包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:106和107的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(x)α链，其包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:122,SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:122和123的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(xi)α链，其包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:122,SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:122和123的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(xii)α链，其包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:138,SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:138和139的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(xiii)α链，其包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:144,SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:144和145的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(xiv)α链，其包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:138,SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:138和139的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(xv)α链，其包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:144,SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:144和145的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(xvi)α链，其包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:160,SEQ ID NO:161和SEQ ID NO:160和161的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(xvii)α链，其包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:160,SEQ ID NO:161和SEQ ID NO:160和161的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(xviii)α链，其包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:122,SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:122和123的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(xix)α链，其包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:100和101的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(xx)α链，其包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:106和107的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(xxi)α链，其包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:100和101的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(xxii)α链，其包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组氨基酸序列：SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:106和107的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；或
(xxiii)(a)α链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:186,191,198,199,200,201,202和SEQ ID NO:186,191,198,199,200,201和202的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；和β链，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(b)α链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:186,191,198,199,200,201,202和SEQ ID NO:186,191,198,199,200,201和202的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；和β链，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；或
(c)α链，其包含选自下组的氨基酸序列：186,191,198,199,200,201,202和SEQ IDNO:186,191,198,199,200,201和202的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；和β链，其包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；
(xxiv)α链，其包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:10,11和195的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(xxv)α链，其包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:21,22和197的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(xxvi)α链，其包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:215和SEQ ID NO:43,44和215的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(xxvii)α链，其包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:54,SEQ IDNO:55,SEQ ID NO:217和SEQ ID NO:54,55和217的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；
(xxviii)α链，其包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:54,SEQ IDNO:55,SEQ ID NO:217和SEQ ID NO:54,55和217的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体；或
(xxix)α链，其包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:215和SEQ ID NO:43,44和215的与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％，优选至少75％序列同一性的变体
在一个实施方案中，本发明的TCR结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的Wilms肿瘤1蛋白(WT1)肽，其中WT1肽包含选自下组的氨基酸序列：GAQYRIHTHGVFRGI(SEQID NO:181),LLAAILDFLLLQDPA(SEQ ID NO:82)和CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO:87)和其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
在另一个方面，本发明提供了T细胞受体(TCR)，其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的Wilms肿瘤1蛋白(WT1)肽，其中WT1肽包含选自下组的氨基酸序列：GAQYRIHTHGVFRGI(SEQ ID NO:181),LLAAILDFLLLQDPA(SEQ ID NO:82)和CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO:87)和其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
在一个实施方案中，TCR结合MHC I和/或MHC II肽复合物。
在一实施方案中，TCR限于人白细胞抗原(HLA)等位基因。在一个实施方案中，TCR限于HLA-A，HLA-B或HLA-C等位基因。在一个实施方案中，TCR限于HLA-A*02:01,HLA-B*38:01,HLA-C*03:03或HLA-C*07:02。
在一个实施方案中，TCR限于HLA-A*02:01。在一个实施方案中，TCR限于HLA-B*38:01。在一个实施方案中，TCR限于HLA-C*03:03。在一个实施方案中，TCR限于HLA-C*07:02。
在一个实施方案中，本发明的TCR限于HLA-C等位基因。在一个实施方案中，本发明的TCR限于选自下组的HLA-C等位基因：HLA-C*07:01,HLA-C*03:04,HLA-C*04:01,HLA-C*05:01,HLA-C*06:02和HLA-C*07:02。
在一个实施方案中，TCR在α链/β链界面处包含一个或多个突变，使得当所述α链和β链在T细胞中表达时，降低所述链与内源TCRα和β链之间错配的频率。
在一个实施方案中，TCR在α链/β链界面处包含一个或多个突变，使得当α链和β链在T细胞中表达时，TCRα和β链的表达水平升高。
在一个实施方案中，一个或多个突变将半胱氨酸残基引入α链和β链中每个的恒定域中，其中所述半胱氨酸残基能够在所述α链和所述β链之间形成二硫键。
在一个实施方案中，一个或多个突变位于选自以下的氨基酸位置：Boulter,J.Met al.(2003)Protein Engineering 16:707-711的表1中公开的氨基酸位置。
在一个实施方案中，TCR包含一个或多个突变以除去一个或多个N-糖基化位点(参见例如Kuball,J et al.(2009)J Exp Med 206:463-75)。优选地，N-糖基化位点在TCR恒定域中。在一个实施方案中，突变是N-X-S/T基序中的氨基酸N被氨基酸Q取代。例如，取代可以发生在以下一个或多个位置处：TCR alpha恒定基因位置36、90或109；和/或TCR beta恒定基因位置85.6。优选地，取代在TCR alpha恒定基因的位置36处。
在一个实施方案中，TCR包含鼠源化恒定区。
在一个实施方案中，TCR是可溶性TCR。
在另一方面，本发明提供了分离的多核苷酸，其编码根据本发明的T细胞受体(TCR)的α链和/或根据本发明的TCR的β链。
在一个实施方案中，多核苷酸编码与β链连接的α链。
在一个实施方案中，分离的多核苷酸进一步编码一种或多种短干扰RNA(siRNA)或其他能够减少或阻止一种或多种内源TCR基因表达的试剂。
在另一方面，本发明提供了包含根据本发明的多核苷酸的载体。在一个实施方案中，载体包含编码一个或多个CD3链，CD8，自杀基因和/或选择标志物的多核苷酸。
在另一方面，本发明提供了包含本发明的TCR，本发明的多核苷酸或本发明的载体的细胞。
在一个实施方案中，细胞还包含编码一种或多种CD3链，CD8，自杀基因和/或选择标志物的载体。
在一个实施方案中，细胞是T细胞、淋巴细胞或干细胞，任选地其中所述T细胞、所述淋巴细胞或所述干细胞选自下组：CD4细胞、CD8细胞、幼稚T细胞、记忆干T细胞、中央记忆T细胞、双阴性T细胞、效应记忆T细胞、效应T细胞、Th0细胞、Tc0细胞、Th1细胞、Tc1细胞、Th2细胞Tc2细胞、Th17细胞、Th22细胞、gamma/delta T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、造血干细胞和多能干细胞。
在一个实施方案中，细胞是已经从受试者分离的T细胞。
在一个实施方案中，编码TCRα链的内源基因和/或编码TCRβ链的内源基因被破坏，优选使得不表达所述编码TCRα链的内源基因和/或所述编码TCRβ链的内源基因。在一个实施方案中，通过插入包含编码本发明TCR的多核苷酸序列的表达盒来破坏所述编码TCRα链的内源基因和/或所述编码TCRβ链的内源基因。在一个实施方案中，一个或多个编码MHC的内源基因被破坏，优选其中细胞是非同种异体反应性通用T细胞。在一个实施方案中，涉及持久性、扩增、活性、对耗竭/衰老/抑制信号的抗性、归巢能力或其他T细胞功能的内源基因被破坏，优选其中涉及持久性、扩增、活性、对耗竭/衰老/抑制信号的抗性、归巢能力或其他T细胞功能的内源基因选自下组：PD1,TIM3,LAG3,2B4,KLRG1,TGFbR,CD160,TIGIT,CTLA4和CD39。在一个实施方案中，通过表达盒的整合破坏涉及持久性，扩增，活性，对衰竭/衰老/抑制信号的抗性，归巢能力或其他T细胞功能的内源基因，其中表达盒包含编码本发明的TCR的多核苷酸序列。
在另一方面，本发明提供了制备细胞的方法，该方法包括以下步骤：在体外，离体或体内将本发明的载体引入细胞中，例如通过转染或转导进行。
在另一方面，本发明提供了制备细胞的方法，其包括体外，离体或体内用一种或多种本发明的载体转导细胞的步骤。
在一个实施方案中，用一种或多种载体转导的细胞选自下组：T细胞、淋巴细胞或干细胞，诸如造血干细胞或诱导多能干细胞(iPS)，任选地其中所述T细胞、所述淋巴细胞或所述干细胞可以选自下组下组：CD4细胞，CD8细胞，Th0细胞，Tc0细胞，Th1细胞，Tc1细胞，Th2细胞，Tc2细胞，Th17细胞，Th22细胞，gamma/delta T-细胞，自然杀伤(NK)细胞，自然杀伤T(NKT)细胞，双阴性T细胞，幼稚T细胞，记忆干T细胞，中央记忆T细胞，效应记忆T细胞，效应T细胞，细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞，造血干细胞和多能干细胞。
在一个实施方案中，方法包括T细胞编辑的步骤，其包括用人工核酸酶破坏编码TCRα链的内源基因和/或编码TCRβ链的内源基因，优选地，其中人工核酸酶选自下组：锌指核酸酶(ZFN)，转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas系统。
在一个实施方案中，方法包括T细胞编辑的步骤，其包括用人工核酸酶破坏编码TCRα链的内源基因和/或编码TCRβ链的内源基因，优选地，其中人工核酸酶选自下组：锌指核酸酶(ZFN)，转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas系统。
在一个实施方案中，该方法包括将表达盒靶向整合到由人工核酸酶破坏的编码TCRα链的内源基因和/或编码TCRβ链的内源基因的步骤，其中表达盒包含编码本发明的TCR的多核苷酸序列或本发明的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，该方法包括破坏一个或多个编码MHC的内源基因的步骤，优选地，其中通过方法制备的细胞是非同种异体反应性通用T细胞。
在一个实施方案中，该方法包括破坏一个或多个内源MHC基因的步骤，优选地，其中通过方法制备的细胞是非同种异体反应性通用T细胞。
在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：破坏一个或多个内源基因以修饰持久性、扩增、活性、对耗竭/衰老/抑制信号的抗性、归巢能力或其他T细胞功能，优选地，其中所述方法包括以下步骤：将表达盒靶向整合到由人工核酸酶破坏的内源性基因中，所述内源性基因涉及持久性、扩增、活性、对耗竭/衰老/抑制信号的抗性、归巢能力或其他T细胞功能，其中所述表达盒包含编码本发明的TCR的多核苷酸序列，优选其中内源基因选自下组：PD1,TIM3,LAG3,2B4,KLRG1,TGFbR,CD160,TIGIT,CTLA4和CD39。
另一方面，本发明提供本发明的细胞或通过本发明的方法制备的细胞，用于过继细胞转移，优选过继T细胞转移，任选地其中过继T细胞转移是同种异体过继T细胞转移，自体过继T细胞转移或通用的非同种异体反应性过继T细胞转移。
在另一方面，本发明提供了包含与非细胞底物，毒素和/或抗体缀合的本发明的TCR或其一部分的嵌合分子。在一个实施方案中，非细胞底物选自纳米颗粒，外泌体和其他非细胞底物。
在另一方面，本发明提供了本发明的TCR，本发明的分离的多核苷酸，本发明的载体，本发明的细胞，通过本发明的方法制备的细胞或本发明的嵌合分子，用于在疗法中使用。
在另一方面，本发明提供了本发明的TCR，本发明的分离的多核苷酸，本发明的载体，本发明的细胞，通过本发明的方法制备的细胞或本发明的嵌合分子，用于治疗和/或预防与WT1表达有关的疾病。
在另一方面，本发明提供了T细胞，其经遗传工程化改造(例如，遗传编辑)以修饰持久性、扩增、活性、对耗竭/衰老/抑制信号的抗性、归巢能力或其他T细胞功能，其中T细胞表达本发明的TCRα链和/或本发明的TCRβ链。
在另一方面，本发明提供了通过方案遗传工程化(例如，遗传编辑)的T细胞，所述方案包括将表达盒靶向整合到由人工核酸酶破坏的内源基因，所述内源基因涉及持久性、扩增、活性、对耗竭/衰老/抑制信号的抗性、归巢能力或其他T细胞功能，其中表达盒包含编码本发明的TCRα链和/或本发明的TCRβ链的多核苷酸序列。
在另一方面，本发明提供了用于治疗和/或预防与WT1表达有关的疾病的方法，其包括对有此需要的受试者施用本发明的TCR，本发明的分离的多核苷酸，本发明的载体，本发明的细胞，通过本发明的方法制备的细胞或本发明的嵌合分子。
在一个实施方案中，与WT1表达有关的疾病是增殖性疾病。优选地，增殖性疾病是血液恶性或实体瘤。优选地，血液恶性选自下组：急性髓样白血病(AML)、慢性髓样白血病(CML)、淋巴母细胞性白血病、骨髓发育不良综合征、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非何杰金淋巴瘤和何杰金淋巴瘤。优选地，实体瘤选自下组：肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、结肠癌、胆管上皮癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、滑膜肉瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肝癌、黑素瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肉瘤、尿路上皮癌、胆道癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、间皮瘤和结肠直肠癌。
在一个优选的实施方案中，与WT1表达有关的疾病是急性髓样白血病(AML)。
在另一个优选的实施方案中，与WT1表达有关的疾病是慢性髓样白血病(CML)。
在另一方面，本发明提供了分离的免疫原性WT1肽，其包含选自下组的氨基酸序列：GAQYRIHTHGVFRGI(SEQ ID NO:181),LLAAILDFLLLQDPA(SEQ ID NO:82)和CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO:87)，和其各自具有多达三个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
附图简述
图1
随时间评估4位健康供体中WT1特异性T细胞扩增。用WT1库-137(HD12，a)或WT1HLA-A*02:01库(HD13-HD15，b-d)重复刺激四个HD的外周血单个核细胞。通过测量用源自WT1蛋白的库脉冲的自体抗原呈递细胞(APC)共培养6小时中的IFNγ分泌和CD107a产生来评估抗原响应性T细胞的富集。在每个测试中，包括未刺激的T细胞，与加载有无关肽库的APC共培养的T细胞以及用佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate)(PMA)和离子霉素刺激的T细胞(未显示)作为对照。点图指示在单个时间点(a，b，d)或在整个培养时间范围(c)内IFNγ产生的细胞内染色和细胞表面上CD107a暴露的结果。HD，健康供体；WT1，Wilms肿瘤1；PMA，佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯；IFNγ，干扰素-γ；S，刺激。
图2
由从每个HD分离的扩增T淋巴细胞识别的WT1亚库和肽的鉴定。通过将T细胞与加载有24个亚库(SP；HD12)或11种肽(HD13和HD14)的APC共培养进行在从HD分离的T细胞中诱导免疫应答的肽的评估。此外，实验设置中包括阴性对照(未刺激的T细胞和与加载有无关肽库或无关肽的APC共培养的T细胞)和阳性对照(在PMA和离子霉素存在下培养的T细胞)(未显示)。通过细胞荧光分析评估IFNγ的分泌和CD107a的表达。报道了相对于T细胞与加载有亚库的APC的共培养物并且指示IFNγ和CD107a的表达的代表性点图。对于HD12中的亚库7和21(a，b)，HD13和HD14的肽13(c-e)观察到优势响应。HD，健康的供体；SP，亚库；WT1，Wilms肿瘤1；APC，抗原呈递细胞；PMA，佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯；IFNγ，干扰素-γ。
图3
通过用合并的肽进行的敏化产生的WT1反应性T细胞的表位特异性。为了验证WT1免疫原性肽，将从HD12扩增的T细胞在APC的存在下共培养6小时，所述APC加载有在定位网格的去卷积后鉴定的肽(a)和加载有至少一种无关肽作为阴性对照。另外，实验设置包括阴性对照(未刺激的T细胞)和阳性对照(在PMA和离子霉素存在下培养的T细胞)对照(未显示)。点图显示了对于每个HD，IFNγ的细胞内染色和表面CD107a的结果。对于与肽103共培养的T细胞而非对于无关的肽(b)，观察到CD107a和IFNγ阳性细胞的富集。WT1，Wilms肿瘤1；APC，抗原呈递细胞；PMA，2；佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯；IFNγ，干扰素-γ。
图4
在计算机上预测不同HD的HLA-肽结合。HD12-HD14的HLA分型结果(a)。报告了使用NetMHC4.0 pan算法进行的计算机预测的结果(b,HD12；c,HD13；d,HD14；e,HD15)。以灰色突出显示了通过算法鉴定为强结合剂的肽。HD，健康的供体；HLA，人白细胞抗原。
图5
鉴定的WT1免疫原性表位的HLA限制评估。为了确定HD12的HLA限制元件，我们将T细胞与不同抗原呈递性EBV-BLCL细胞系共培养，每个细胞系包含与HD12共享的感兴趣的特定HLA等位基因，并用肽103或用无关肽作为对照(a)脉冲。对于HD13和HD14，将WT1特异性T细胞与含有HLA-A*02:01限制元件的T2细胞共培养，并用肽13或用无关肽作为对照脉冲(分别为b和c)。作为读数，我们确定了CD107a标志物的表达和IFNγ的分泌。HD，健康的供体；WT1，Wilms肿瘤1；IFNγ，干扰素-γ；HLA，人类白细胞抗原；EBV，埃巴病毒；BLCL，B淋巴母细胞样细胞系。
图6
免疫原性肽是天然加工的。将从HD13(a)和HD14(b)中分离的T细胞与来自3位不同患者(表示为pAML#15,pAML#16.1；pAML#16.2)的原发性AML母细胞(blasts)共培养，所述原发性AML母细胞以高水平表达WT1并含有HLA-A*02:01限制元件。作为对照，我们包括母细胞与无关T细胞的共培养。我们评估了在不同的E:T比率下，与效应子(E)T细胞共培养6小时后，靶标(T)活细胞中胱天蛋白酶3(Cas3)表达的百分比。从原代母细胞与HD13和HD14 T细胞的共培养获得的Cas3值中减去在对照条件下获得的Cas3值。pAML，急性髓样白血病患者的原代母细胞；HD，健康的供体；HLA，人白细胞抗原；WT1，Wilms肿瘤1。
图7
WT1特异性TCR Vβ概况(profile)表征。对从HD分离出的WT1特异性T细胞染色，以便通过FACS分析定量确定TCRβ链可变区(Vβ)全集。结果指示在HD12和HD14中高度优势的Vβ基因的表达，而对于HD13，未检测到限定的Vβ的清楚富集。对于HD15，由于细胞适合度(fitness)降低，不可能进行Vβ免疫序型分析。TRBV，T细胞受体可变β链；HD，健康的供体；FACS，荧光激活细胞分选仪。
图8
WT1特异性TCR的克隆追踪。在培养时间段内，在不同时间点对HD RNA进行TCRαβ测序。测序结果指示存在HD12(a)，HD13(b)，HD14(c)和HD15(d)的优势克隆型。条形图描绘了在每个时间点鉴定的10个最有优势的CDR3氨基酸序列(例如S4对应于第四轮刺激后获得的测序结果)。对于每个条，从x轴开始，底部区段代表最有优势的CDR3序列。接下来的9个最有优势的序列堆叠在底部区段的上方，并通过向上降低频率进行排序。剩余序列在顶部区段中分组在一起。CDR3，互补决定区3；S，刺激；HD，健康的供体；S，刺激；HLA，人白细胞抗原；P，肽；RNA，核糖核酸。
图9
源自HD12的TCR的功能亲合力。在敲除内源性α和β链后，用编码从HD12分离的TCR的慢病毒载体转导来自3位不同健康供体的T细胞。a)通过在Vβ富集之前和之后的Vβ染色来评估HD12衍生的TCR的表达。b)HD12衍生的TCR的功能亲合力。我们将效应细胞与用NYESO-1肽作为对照或用降低浓度的肽103(40μg-0.4pg，如x轴上指示)脉冲的EBV细胞系共培养。共培养6小时后，结果显示了，在至少0.4μg的关联肽存在下HD12编辑的T细胞识别靶细胞的能力。未测量到无关肽的识别。作为读数，我们通过流式细胞术评估CD8T淋巴细胞上CD107a的表达。TCR，T细胞受体；HD，健康供体；PBMC，外周血单个核细胞；NYESO-1，纽约食管鳞状细胞癌1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1)。
图10
HD13衍生的TCR的功能验证。用编码HD13衍生的TCR的慢病毒载体转导来自1位健康供体的T细胞。a)从HD13分离的TCR对WT1库的识别。我们将效应细胞与用WT1库或无关库作为对照脉冲的T2细胞系共培养。另外，在实验设置中包括阴性(未刺激的T细胞)和阳性(在PMA和离子霉素存在下培养的T细胞)对照。共培养6小时后，用HD13衍生的TCR转导的T细胞特异性识别用WT1库脉冲的靶细胞，如通过测量CD8 T细胞上的IFNγ分泌评估的。b)在与用WT1衍生的SP1和14(两者均含有肽13)或SP 6作为阴性对照脉冲的T2细胞的共培养物中测试T细胞。结果显示了效应细胞特异性识别SP1和14的能力，如通过测量IFNγ分泌和CD8T细胞上CD107a的表达评估的。HD，健康的供体；TCR，T细胞受体；WT1，Wilms瘤1；SP，亚库；PMA，2；佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯。
图11
从HD14分离的TCR的功能验证。用编码HD14衍生的TCR(TRAV12-2*01WT和TRAV12-2*02WT)的慢病毒载体转导从一位健康供体分离的T细胞。a)HD14转移T细胞的转导效率表示为CD4和CD8 T淋巴细胞上的Vβ表达。b)HD14衍生的TCR对WT1库的识别。我们将效应细胞与用WT1库或无关库作为对照脉冲的T2细胞系进行共培养。共培养6小时后，结果显示，HD14转移T细胞特异性识别用WT1库脉冲的靶细胞的能力，如通过评估CD8 T细胞上的IFNγ分泌测量的。c)HD14衍生的T细胞识别含有肽13的特定SP。在与用WT1衍生的SP 1和14(均含有肽13)或SP 6作为阴性对照脉冲的T2细胞的共培养物中测试T细胞。结果显示了效应细胞特异性识别SP1和14的能力，如通过评估CD8 T细胞上CD107a的表达和IFNγ分泌评估的。HD，健康的供体；TCR，T细胞受体；WT1，Wilms瘤1；SP，亚库。
图12
源自HD14的TCR识别原发性AML母细胞。用编码HD14衍生的TCR(TRAV 12-2*02WT和TRAV 12-2*02mut)的慢病毒载体转导来自一位健康供体的TCR编辑的T细胞。a)通过CD4和CD8T细胞上的Vβ表达来评估HD14 TCR的转导效率。b)将用HD14 TCR TRAV 12-2*02WT,TRAV12-2*02mut或无关的TCR转导的经编辑的T细胞与表达高水平WT1和HLA-A02*01限制元件的患者衍生的原代AML母细胞共培养。为了评估母细胞的存活力，我们包括无T淋巴细胞的靶细胞条件。我们评估了在不同的E:T比率下与效应(E)T细胞共培养6小时后，靶(T)活细胞中胱天蛋白酶3(Cas3)表达的百分比(如图中指示)。从自原始母细胞与含有HD14衍生的TCR的T细胞共培养获得的Cas3值中减去在对照条件下获得的Cas3值(用无关的TCR转导的T细胞或者单独的母细胞)。pAML，急性髓样白血病患者的原代母细胞；HD，健康的供体；HLA，人类白细胞抗原；WT1，Wilms肿瘤1。
图13
通过dextramer染色鉴定WT1特异性T细胞。点图指示在T细胞分选(使用对WT1VLDFAPPGA肽特异性的APC标记的dextramer)和刺激后的不同时间点(患者1，a)或单一时间点(b，患者2和3)，Dextramer染色的结果。WT1，Wilms肿瘤1。
图14
图显示了富集的WT1特异性T细胞的TCR测序结果。通过TCRαβ测序表征从每位患者分离并根据WT1 dextramer染色的阳性进行分类的T细胞。测序结果指示患者1(a，b)，患者2(c)和患者3(d)的优势克隆型的存在。条形图描绘了为每个患者和每个TCR链鉴定的10个最具优势的CDR3氨基酸序列。对于每个条，从x轴开始，底部段代表最有优势的CDR序列。接下来的9个最有优势的序列堆叠在底部段的上方，并通过向上降低频率进行排序。剩余序列在顶部段中分组在一起。WT1，Wilms肿瘤1；CDR3，互补决定区3。
发明概述
如本文所用的，术语“包含”与“包括”或“含有”同义；并且是包含性的或开放性的，并且不排除其他未叙述的成员、要素或步骤。术语“包含”，还包括术语“由...组成”。
T细胞受体
在抗原加工过程中，抗原在细胞内被降解，然后被主要组织相容性复合物(MHC)分子携带到细胞表面。T细胞能够识别抗原呈递细胞表面上的此肽:MHC复合物。存在有MHC分子的两种不同的类别：MHC I和MHC II，每种类别将肽从不同的细胞区室递送到细胞表面。
T细胞受体(TCR)是一种可以在T细胞表面上找到的分子，其负责识别与MHC分子结合的抗原。天然存在的TCR异二聚体由约95％的T细胞中的alpha(α)和beta(β)链组成，而约5％的T细胞具有由gamma(γ)和delta(δ)链组成的TCR。
TCR与抗原和MHC的结合导致T淋巴细胞活化，在T淋巴细胞上通过由相关的酶、共受体和专门的辅助分子介导的一系列生化事件来表达TCR。
天然TCR的每条链都是免疫球蛋白超家族的成员，并拥有一个N端免疫球蛋白(Ig)可变(V)域、一个Ig恒定(C)域、跨膜/细胞跨膜区和一个C端的短胞质尾部。
TCRα链和β链两者的可变域均具有三个高变或互补决定区(CDR)。例如，TCRα链或β链包含氨基至羧基末端顺序的CDR1、CDR2和CDR3。通常，CDR3是负责识别加工抗原的主要CDR，尽管也已显示出α链的CDR1与抗原性肽的N端部分相互作用，而β链的CDR1与肽的C端部分相互作用。认为CDR2识别MHC分子。
TCR的恒定域可由短连接序列组成，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而在两条链之间形成连接。
本发明的TCR的α链可以具有由TRAC基因编码的恒定域。由TRAC基因编码的α链恒定域的氨基酸序列示例如下所示：
IQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
(SEQ ID NO:76)
本发明的TCR可以包含α链，所述α链包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的序列同一性，优选至少75％的序列同一性的其变体。
本发明的TCR的β链可以具有由TRBC1或TRBC2基因编码的恒定域。由TRBC1基因编码的β链恒定域的氨基酸序列示例如下所示：
DLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
(SEQ ID NO:77)
由TRBC2基因编码的β链恒定域的氨基酸序列示例如下所示：
DLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
(SEQ ID NO:78)
本发明的TCR可以包含β链，该β链包含SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:78的氨基酸序列或与其具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％的序列同一性，优选至少75％的序列同一性的SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78变体。
本发明的TCR可以在α和β链的每个上具有一个或多个另外的半胱氨酸残基，使得TCR可以在恒定域中包含两个或更多个二硫键。
可以基于编号约定来描述本文公开的TCR恒定域的突变，其中SEQ ID NO:76-78中每个的第一氨基酸被分配为位置2。
结构允许TCR与其他分子如CD3缔合，所述其他分子具有哺乳动物中三个不同的链(γ，δ和ε)和ζ链。这些辅助分子具有带负电的跨膜区域，并且对于将信号从TCR传播到细胞是至关重要的。CD3和ζ链与TCR一起形成称为T细胞受体复合物的TCR。
通过特异性共受体同时结合MHC分子增强来自T细胞复合物的信号。对于辅助T细胞，此共受体是CD4(对II类MHC特异性)；而对于细胞毒性T细胞，此共受体是CD8(对I类MHC特异性)。共受体允许抗原呈递细胞和T细胞之间的延长的结合，并在参与活化的T淋巴细胞的信号传导的细胞内募集必需的分子(例如，LCK)。
因此，如本文所用，术语“T细胞受体”(TCR)是指当由MHC分子呈递时能够识别肽的分子。分子可以是两条链α和β(或任选地γ和δ)的异二聚体或者它可以是单链TCR构建体。本发明的TCR可以是可溶性TCR，例如省略或改变一个或多个恒定域，本发明的TCR可以包含恒定域。
本发明还提供了来自此类T细胞受体的α链或β链。
本发明的TCR可以是杂交TCR，其包含衍生自超过一个物种的序列。例如，已经发现，鼠TCR在人T细胞中比人TCR更有效地表达。因此，TCR可包含人可变区和恒定区内的鼠序列。
该方法的缺点是鼠恒定序列可以触发免疫应答，导致转移的T细胞排斥。但是，用于使患者准备好过继T细胞疗法的调理疗法可以导致足够的免疫抑制，以允许植入表达鼠序列的T细胞。
在一个实施方案中，TCR包含一个或多个突变以除去一个或多个N-糖基化位点。优选地，N-糖基化位点在TCR恒定域中。在TCR恒定域中N-糖基化位点的缺失记载于Kuball,Jet al.(2009)J Exp Med 206:463-75。在一个实施方案中，一个或多个突变是N-X-S/T基序中的氨基酸N被氨基酸Q取代。例如，该取代可以在以下一个或多个位置：TCR alpha恒定基因位置36、90或109；和/或TCR beta恒定基因位置85.6。优选地，取代在TCR alpha恒定基因的位置36处。
互补决定区(CDR)
TCR中与主要组织相容性复合物(MHC)结合的抗原肽建立大部分接触的部分是互补决定区3(CDR3)，这对于每个T细胞克隆都是独特的。CDR3区是体细胞重排事件时产生的，所述体细胞重排事件在胸腺中发生并且涉及属于可变(V)、多样性(对于β和δ链为D)和连接(J)基因的非连续基因。此外，在每个TCR链基因的重排基因座处插入/缺失的随机核苷酸大大增加了高度可变的CDR3序列的多样性。因此，生物学样品中特定CDR3序列的频率指示特定T细胞群体的丰度。在健康的人类中，TCR全集的大多样性针对抗原呈递细胞表面上MHC分子呈递的多种外来抗原提供了广泛的保护。在这方面，值得注意的是，在胸腺中理论上最多可以生成1015个不同的TCR。
T细胞受体的多样性集中在CDR3上，并且该区域主要负责抗原识别。
本发明的TCR的CDR3区的序列可以选自下表1中列出的那些。TCR可包含CDR，其包含以下所述的CDR3α和CDR3β对或由以下所述的CDR3α和CDR3β对组成。
CDR可以例如包含给定序列的一个，两个或三个取代，添加或缺失，条件是当TCR保留结合由MHC分子呈递时的WT1肽的能力。
如本文所用，术语“蛋白质”包括单链多肽分子以及多重多肽复合物，其中个别组成多肽通过共价或非共价方式连接。如本文所用，术语“多肽”是指其中单体是氨基酸并且通过肽或二硫键连接在一起的聚合物。
变体、衍生物、类似物、同源物和片段
除了本文提到的特定蛋白质和多核苷酸之外，本发明还包括其变体，衍生物，类似物，同源物和片段的用途。
在本发明的上下文中，任何给定序列的变体是如下的序列，其中残基(无论是氨基酸残基还是核酸残基)的特定序列已经以如下的方式被修饰，使得所讨论的多肽或多核苷酸基本上保留至少一种其内在功能。变体序列可以通过天然存在的蛋白质中存在的至少一个残基的添加，缺失，取代，修饰，置换和/或变异而获得。
称为具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的本发明的变体氨基酸序列可以具有例如一个，两个或三个氨基酸取代，添加或缺失。
关于本发明的蛋白质或多肽，如本文所用的术语“衍生物”包括一个(或多个)氨基酸残基从或对序列的任何取代，变异，修饰，置换，缺失和/或添加，条件是所得蛋白质或多肽基本上保留至少一种其内源功能。
如本文所用，关于多肽或多核苷酸的术语“类似物”包括任何模拟物，即具有其模拟的多肽或多核苷酸的至少一种内源功能的化合物。
用于本发明的蛋白质还可以具有氨基酸残基的缺失，插入或取代，其产生沉默变化并产生功能上等同的蛋白质。只要保留内源功能，可以根据残基的极性，电荷，溶解性，疏水性，亲水性和/或两亲性质的相似性进行故意的氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且带有具有相似亲水性值的不带电荷的极性头基的氨基酸包括天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸。
取代可以涉及用氨基酸替换相似的氨基酸(保守取代)。相似的氨基酸是具有侧链部分的氨基酸，所述侧链部分具有分组在一起的相关特性，例如，如下所示：
(i)碱性侧链：赖氨酸(K)，精氨酸(R)，组氨酸(H)；
(ii)酸性侧链：天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；
(iii)不带电荷的极性侧链：天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)和酪氨酸(Y)；或者
(iv)非极性侧链：甘氨酸(G)，丙氨酸(A)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)，异亮氨酸(I)，脯氨酸(P)，苯丙氨酸(F)，甲硫氨酸(M)，色氨酸(W)和半胱氨酸(C)。
任何氨基酸变化都应保持TCR结合由MHC分子呈递的WT1肽的能力。
变体序列可包含氨基酸取代，添加，缺失和/或插入。该变化可以集中在一个或多个区域中，例如α或β链的恒定区，接头或框架区中，或者它们可以散布在整个TCR分子中。
可以例如根据下表进行保守的取代，添加或缺失。第二列中相同区块中的氨基酸，优选是第三列中同一行中的氨基酸可以彼此取代：
Figure BDA0003046036010000351
Figure BDA0003046036010000361
本发明还包括同源取代(例如，取代和置换在本文中均用于表示现有氨基酸残基与替代残基的互换)，例如同类取代，例如碱性取代为碱性，酸性取代为酸性，极性取代为极性等。也可以发生非同源取代，例如从一类残基到另一类残基，或备选涉及包括非天然氨基酸如鸟氨酸。
如本文所用，术语“变体”可以表示与野生型氨基酸序列或野生型核苷酸序列具有一定同源性的实体。术语“同源性”可以等同于“同一性”。
变体序列可以包括与主题序列可以至少50％，55％，65％，75％，85％或90％相同，优选至少95％，至少97％或至少99％相同的氨基酸序列。通常，变体将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。尽管也可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)考虑同源性，但是在本发明的上下文中，优选根据序列同一性表达同源性。
变体序列可以包括与主题序列可以至少40％，45％，50％，55％，65％，75％，85％或90％相同，优选地至少95％，至少97％或99％相同的核苷酸序列。尽管也可以根据相似性考虑同源性，但是在本发明的上下文中，优选根据序列同一性表达同源性。
优选地，提及与本文详述的任何一种SEQ ID NO具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述同一性百分比的序列。
同一性比较可以通过肉眼进行，或者更通常地，在容易获得的序列比较程序的帮助下进行。这些商品化的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的同源性或同一性百分比。
可以在连续序列上计算同源性百分比，即，一个序列与另一序列比对，并且一个序列中的每个氨基酸与另一序列中的对应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称为“无缺口的”比对。通常，仅在相对短数量的残基上进行此类无缺口的比对。
尽管这是一种非常简单且一致的方法，但是它没有考虑到，例如，在其他方面相同的序列对中，核苷酸序列中的一个插入或缺失可以导致以下密码子不对齐，因此进行全局比对时，潜在导致同源性百分比大大降低。因此，大多数序列比较方法被设计为产生最佳比对，该比对考虑了可能的插入和缺失而不会过度惩罚总体同源性得分。这是通过在序列比对中插入“缺口”以尝试使局部同源性最大化来实现的。
但是，这些更复杂的方法将“缺口罚分”分配给比对中出现的每个缺口，以便对于相同数目的相同氨基酸，以尽可能少的缺口(这反映了两个比较序列之间的更高相关性)进行序列比对会获得比具有许多缺口的序列比对更高的分数。通常使用“仿射缺口代价(Affine gap cost)”，其对于缺口的存在收取相对较高的代价，并对缺口中的每个后续残基收取较小的罚款。这是最常用的缺口评分系统。当然，高缺口罚分将产生具有较少缺口的优化比对。大多数比对程序允许修改缺口罚分。但是，在使用此类软件进行序列比较时，优选使用默认值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit软件包时，氨基酸序列的默认缺口罚分是针对缺口的-12和对于每个延伸的-4。
因此，最大同源性百分比的计算首先需要在考虑缺口罚分的情况下产生最佳比对。用于进行此类比对的合适的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit包(University ofWisconsin,U.S.A.；Devereux et al.(1984)Nucleic Acids Res.12:387)。可以进行序列比较的其他软件的示例包括但不限于BLAST包(参见Ausubel等(1999)同上-第18章)，FASTA(Atschul等(1990)J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比较工具套件。BLAST和FASTA均可用于离线和在线搜索(参见Ausubel等人(1999)，同上，第7-58至7-60页)。但是，对于某些应用程序，优选使用GCG Bestfit程序。另一种称为BLAST 2序列的工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol.Lett.(1999)174:247-50；FEMS Microbiol.Lett.(1999)177:187-8)。
尽管可以根据同一性来测量最终的同源性百分比，但比对过程本身通常不是基于全有或全无对比较。取而代之的是，通常使用缩放的相似性得分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离为每个成对比较分配得分。常用的此类矩阵的一个示例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序套件的默认矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公共默认值或自定义符号比较表(如果提供的话)(有关更多详细信息，参见用户手册)。对于某些应用程序，优选使用GCG包的公共默认值，或者在其他软件的情况下，使用默认矩阵，例如BLOSUM62。
一旦软件已经产生最佳比对，可以计算同源性百分比，优选地序列同一性百分比。软件通常将这作为序列比较的一部分进行，并生成数值结果。
“片段”也是变体，并且该术语通常是指功能上或例如在测定中感兴趣的多肽或多核苷酸的选定区域。因此，“片段”是指作为全长多肽或多核苷酸的一部分的氨基酸或核酸序列。
可以使用标准重组DNA技术如定点诱变来制备此类变体。在要进行插入的情况下，可以制备编码插入以及与插入位点任一侧的天然存在序列相对应的5’和3’侧翼区的合成DNA。侧翼区将含有与天然序列中的位点相对应的方便的限制性位点，从而可以用适当的酶切割该序列，并将合成的DNA连接到该切割中。然后根据本发明表达DNA以制备编码的蛋白质。这些方法仅说明了本领域已知的用于操作DNA序列的众多标准技术，并且也可以使用其他已知技术。
主要组织相容性复合物(MHC)分子
通常，TCR结合作为肽:MHC复合物的一部分的肽。
MHC分子可以是I类或II类MHC分子。该复合物可以在抗原呈递细胞如树突状细胞或B细胞，或任何其他细胞，包括癌细胞的表面上，或者它可以通过例如包被在珠或板上而被固定。
人白细胞抗原系统(HLA)是编码人类主要组织相容性复合物(MHC)的基因复合物的名称，并且包括HLA I类抗原(A，B和C)和HLA II类抗原(DP，DQ和DR)。HLA等位基因A，B和C呈递主要源自细胞内蛋白质，例如在细胞内表达的蛋白质的肽。这特别相关，因为WT1是一种细胞内蛋白。
在体内T细胞发育过程中，T细胞经历一个正向选择步骤以确保识别自身MHC，然后经过一个负向步骤以除去与呈现自身抗原的MHC结合太强的T细胞。结果，某些T细胞及其表达的TCR将仅识别由某些类型的MHC分子(即由特定HLA等位基因编码的那些)呈递的肽。这称为HLA限制。
感兴趣的一种HLA等位基因是HLA-A*0201，其在高加索裔群体中的大多数(>50％)中表达。因此，结合由HLA-A*0201编码的MHC呈递的WT1肽的TCR(即是HLA-A*0201限制性)是有利的，因为利用此类TCR的免疫疗法将适合治疗大部分高加索裔群体。
其他感兴趣的HLA等位基因是HLA-B*38:01,HLA-C*03:03和HLA-C*07:02。
感兴趣的其他等位基因是HLA-DPA1,HLA-DPB1,HLA-DQA1,HLA-DQB1,HLA-DRA和HLA-DRB1。这些是人类中六个主要的MHC II类基因。
在一个实施方案中，本发明的TCR是HLA-A*0201-,HLA-A*0101-,HLA-A*2402-,HLA-A*0301-,HLA-B*3501-或HLA-B*0702限制的。
本发明的TCR可以是HLA-A*02:01限制的。
一方面，在本发明的TCR包含含有CILSTRVWAGSYQLTF(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3α，以及含有CATGQATQETQYF(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3β的情况中，TCR是HLA-A*02:01限制的。
一方面，在本发明的TCR包含含有CASGGGADGLTF(SEQ ID NO:25)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3α，以及含有CASGRGDTEAFF(SEQ IDNO:30)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3β的情况中，TCR是HLA-A*02:01限制的。
一方面，在本发明的TCR包含含有CAAPNDYKLSF(SEQ ID NO:93)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3α，以及含有CASSSGLAFYEQYF(SEQ IDNO:98)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3β的情况中，TCR是HLA-A*02:01限制的。
一方面，在本发明的TCR包含含有CAAPNDYKLSF(SEQ ID NO:93)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3α，以及含有CASSQLSGRDSYEQYF(SEQID NO:104)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3β的情况中，TCR是HLA-A*02:01限制的。
一方面，在本发明的TCR包含含有CAVRDGGATNKLIF(SEQ ID NO:110)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3α，以及含有CASSTLGGELFF(SEQID NO:120)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3β中，TCR是HLA-A*02:01限制的。
一方面，在本发明的TCR包含含有CLVGGYTGGFKTIF(SEQ ID NO:115)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3α，以及含有CASSTLGGELFF(SEQID NO:120)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3β的情况中，TCR是HLA-A*02:01限制的。
一方面，在本发明的TCR包含含有CAVTLLSIEPSAGGYQKVTF(SEQ ID NO:126)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3α，以及含有CASSLEGRAMPRDSHQETQYF(SEQ ID NO:136)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3β的情况中，TCR是HLA-A*02:01限制的。
一方面，在本发明的TCR包含含有CAVTLLSIEPSAGGYQKVTF(SEQ ID NO:126)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3α，以及含有CATSWGLNEQYF(SEQ ID NO:142)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3β的情况中，TCR是HLA-A*02:01限制的。
一方面，在本发明的TCR包含含有CAATSRDDMRF(SEQ ID NO:131)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3α，以及含有CASSLEGRAMPRDSHQETQYF(SEQ ID NO:136)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3β的情况中，TCR是HLA-A*02:01限制的。
一方面，在本发明的TCR包含含有CAATSRDDMRF(SEQ ID NO:131)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3α，以及含有CATSWGLNEQYF(SEQ IDNO:142)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3β的情况中，TCR是HLA-A*02:01限制的。
一方面，在本发明的TCR包含含有CALPDKVIF(SEQ ID NO:148)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3α，以及含有CASSVSAGSTGELFF(SEQ IDNO:158)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3β的情况中，TCR是HLA-A*02:01限制的。
一方面，在本发明的TCR包含含有CAGLYATNKLIF(SEQ ID NO:153)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3α，以及含有CASSVSAGSTGELFF(SEQID NO:158)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3β的情况中，TCR是HLA-A*02:01限制的。
一方面，在本发明的TCR包含含有CAAPNDYKLSF(SEQ ID NO:93)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3α，以及含有CASSTLGGELFF(SEQ IDNO:120)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3β的情况中，TCR是HLA-A*02:01限制的。
一方面，在本发明的TCR包含含有CAVRDGGATNKLIF(SEQ ID NO:110)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3α，以及含有CASSSGLAFYEQYF(SEQID NO:98)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3β的情况中，TCR是HLA-A*02:01限制的。
一方面，在本发明的TCR包含含有CAVRDGGATNKLIF(SEQ ID NO:110)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3α，以及含有CASSQLSGRDSYEQYF(SEQ ID NO:104)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3β的情况中，TCR是HLA-A*02:01限制的。
一方面，在本发明的TCR包含含有CLVGGYTGGFKTIF(SEQ ID NO:115)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3α，以及含有CASSSGLAFYEQYF(SEQID NO:98)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3β的情况中，TCR是HLA-A*02:01限制的。
一方面，在本发明的TCR包含含有CLVGGYTGGFKTIF(SEQ ID NO:115)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3α，以及含有CASSQLSGRDSYEQYF(SEQ ID NO:104)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3β的情况中，TCR是HLA-A*02:01限制的。
在一个实施方案中，HLA-A*02:01限制性的本发明的TCR结合包含氨基酸序列LLAAILDFLLLQDPA(SEQ ID NO:82)或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的WT1肽。
一方面，本发明提供了一种TCR，其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的Wilms肿瘤1蛋白(WT1)肽，其中TCR包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CILSTRVWAGSYQLTF(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CATGQATQETQYF(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，其中TCR是HLA-A*0201限制的，并且其中WT1肽包含LLAAILDFLLLQDPA(SEQ IDNO:82)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体。
一方面，本发明提供了一种TCR，其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的Wilms肿瘤1蛋白(WT1)肽，其中TCR包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CASGGGADGLTF(SEQID NO:25)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASGRGDTEAFF(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，其中TCR是HLA-A*0201限制的，并且其中WT1肽包含LLAAILDFLLLQDPA(SEQ ID NO:82)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体。
另一个广泛表达的感兴趣的HLA等位基因是HLA-B*38:01。本发明的TCR可以是HLA-B*38:01限制的。
一方面，在本发明的TCR包含含有CAMRTGGGADGLTF(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3α，以及含有CASSEAGLSYEQYF(SEQID NO:8)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3β的情况中，TCR是HLA-B*38:01限制的。
一方面，本发明提供了一种TCR，其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的Wilms肿瘤1蛋白(WT1)肽，其中TCR包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAMRTGGGADGLTF(SEQID NO:3)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSEAGLSYEQYF(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，其中TCR是HLA-B*38:01限制的，并且其中WT1肽包含GAQYRIHTHGVFRGI(SEQ ID NO:181)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体。
另一个广泛表达的感兴趣的HLA等位基因是HLA-C*07:02。本发明的TCR可以是HLA-C*07:02限制的。
一方面，在本发明的TCR包含含有CAMRTGGGADGLTF(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3α，以及含有CASSEAGLSYEQYF(SEQID NO:8)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3β的情况中，TCR是HLA-C*07:02限制的。
一方面，本发明提供了一种TCR，其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的Wilms肿瘤1蛋白(WT1)肽，其中TCR包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAMRTGGGADGLTF(SEQID NO:3)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSEAGLSYEQYF(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，其中TCR是HLA-C*07:02限制的，并且其中WT1肽包含GAQYRIHTHGVFRGI(SEQ ID NO:181)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体。
另一个广泛表达的感兴趣的HLA等位基因是HLA-C*03:03。本发明的TCR可以是HLA-C*03:03限制的。
一方面，在本发明的TCR包含含有CASGGGADGLTF(SEQ ID NO:25)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3α，以及含有CASGRGDTEAFF(SEQ IDNO:30)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的CDR3β的情况中，TCR是HLA-C*03:03限制的。
一方面，本发明提供了一种TCR，其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的Wilms肿瘤1蛋白(WT1)肽，其中TCR包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CASGGGADGLTF(SEQID NO:25)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASGRGDTEAFF(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，其中TCR是HLA-C*03:03限制的，并且其中WT1肽包含LLAAILDFLLLQDPA(SEQ ID NO:82)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体。
在一个实施方案中，在本发明的TCR结合包含LLAAILDFLLLQDPA(SEQ ID NO:82)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的WT1肽结合的情况中，TCR是HLA-A*02:01限制的。
在一个实施方案中，在本发明的TCR结合包含GAQYRIHTHGVFRGI(SEQ ID NO:181)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的WT1肽结合的情况中，TCR是HLA-B*38:01限制的。
在一个实施方案中，在本发明的TCR结合包含GAQYRIHTHGVFRGI(SEQ ID NO:181)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的WT1肽结合的情况中，TCR是HLA-C*07:02限制的。
在一个实施方案中，在本发明的TCR结合包含LLAAILDFLLLQDPA(SEQ ID NO:82)的氨基酸序列或其具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的WT1肽结合的情况中，TCR是HLA-C*03:03限制的。
Wilms肿瘤1(WT1)蛋白
Wilms肿瘤1(WT1)是一种编码锌指转录因子的细胞内蛋白，所述锌指转录因子在细胞生长和分化中起着重要作用(Yang,L.et al.Leukemia 21,868-876(2007))。它在多种血液学肿瘤和实体瘤中广泛表达，而在其他组织(性腺，子宫，肾脏，间皮，不同组织的祖细胞)上显示有限的表达。最近的证据表明WT1在白血病发生和肿瘤发生中起作用。
WT1具有多种同等型，其中一些同等型是由编码WT1的mRNA转录物的可变剪接产生的。WT1同等型的完整氨基酸序列先前已公开(Gessler,M.et al.Nature；343(6260):774-778；(1990))。这种特定的同等型由575个氨基酸组成，并包括N端的前126个氨基酸，其是WT1的外显子5+和KTS+同等型中缺少的。
示例性的WT1蛋白具有在UniProt条目J3KNN9中列出的氨基酸序列。另一个示例WT1蛋白的氨基酸序列如下：
SRQRPHPGALRNPTACPLPHFPPSLPPTHSPTHPPRAGTAAQAPGPRRLLAAILDFLLLQDPASTCVPEPASQHTLRSGPGCLQQPEQQGVRDPGGIWAKLGAAEASAERLQGRRSRGASGSEPQQMGSDVRDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEEQCLSAFTVHFSGQFTGTAGACRYGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQLECMTWNQMNLGATLKGVAAGSSSSVKWTEGQSNHSTGYESDNHTTPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTSEKPFSCRWPSCQKKFARSDELVRHHNMHQRNMTKLQLAL
(SEQ ID NO:79)
WT1肽
如本文所用，术语肽是指通过肽键连接的多个氨基酸残基。如本文所定义，肽可以由小于约30，小于约25，小于约20，小于19，小于18，小于17，小于16，小于15，小于14，小于13，小于12，小于11，小于10，小于9，小于8，小于7，小于6或小于5个氨基酸残基的长度组成。优选地，肽的长度为约5至20个氨基酸，更优选地，肽的长度为约8至15个氨基酸残基。
本发明的TCR结合在由MHC呈递时的WT1肽。如本文所用，术语WT1肽应理解为是指包含衍生自WT1蛋白的氨基酸序列的肽。
例如，WT1肽可以包含WT1蛋白氨基酸序列的至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少16个，至少17个，至少18个，至少19个，至少20个或至少25个连续氨基酸残基。
WT1肽可以包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自GAQYRIHTHGVFRGI(SEQ ID NO:181),LLAAILDFLLLQDPA(SEQ ID NO:82)和CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO:87)或其各自具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体。
在一些实施方案中，对于结合由HLA-A*0201等位基因编码的MHC分子的WT1肽，可以优选在肽的2位处的氨基酸(即，自N末端起的第二个氨基酸)是亮氨酸或甲硫氨酸。尽管异亮氨酸，缬氨酸，丙氨酸和苏氨酸也可以是优选的。也可以优选9或10位的氨基酸是缬氨酸，亮氨酸或异亮氨酸，尽管丙氨酸，甲硫氨酸和苏氨酸也可以是优选的。Celis等人(Molecular Immunology,Vol.31,8,1994年12月,第1423-1430页)公开了其他HLA等位基因的优选的MHC结合基序。
本发明考虑了本文所述的WT1肽的多种用途。例如，可以将本文所述的WT1肽施用于受试者，例如，人受试者。本发明的WT1肽的施用可以引起针对表达或过表达WT1蛋白的细胞的免疫应答，即WT1肽是免疫原性的WT1肽。
因此，在另一方面，本发明提供了分离的免疫原性WT1肽，其包含选自GAQYRIHTHGVFRGI(SEQ ID NO:181),LLAAILDFLLLQDPA(SEQ ID NO:82)和CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO:87)及其各自具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的氨基酸序列。
本文所述的WT1肽，例如包含选自GAQYRIHTHGVFRGI(SEQ ID NO:181),LLAAILDFLLLQDPA(SEQ ID NO:82)和CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO:87)及其各自具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的氨基酸序列的WT1肽可用于筛选和/或鉴定与WT1细胞结合的新TCR序列。例如，可以用本发明中提到的WT1肽脉冲T2细胞，并与从供体分离的T细胞群体一起温育。在这种方法中，细胞因子例如CD107a和IFNγ的表达可以指示识别WT1肽的T细胞。
因此，一方面，本发明提供了一种T细胞受体(TCR)，其结合当由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的Wilms肿瘤1蛋白(WT1)肽，其中WT1肽包含选自GAQYRIHTHGVFRGI(SEQID NO:181),LLAAILDFLLLQDPA(SEQ ID NO:82)和CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO:87)及其各自具有多达三个氨基酸取代，添加或缺失的变体的氨基酸序列。
TCR序列
我们已经确定了与本文所述的WT1肽结合的TCR的氨基酸序列。特别地，我们已经确定了TCR CDR的氨基酸序列，其对于WT1肽的识别和结合是重要的。
一方面，本发明提供了一种TCR，其包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CILSTRVWAGSYQLTF(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CATGQATQETQYF(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，其结合由MHC呈递时包含LLAAILDFLLLQDPA(SEQ ID NO:82)氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的WT1肽。
一方面，本发明提供了一种TCR，其包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CASGGGADGLTF(SEQ ID NO:25)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASGRGDTEAFF(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，其结合由MHC呈递时包含LLAAILDFLLLQDPA(SEQ ID NO:82)氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的WT1肽。
一方面，本发明提供了一种TCR，其包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAMRTGGGADGLTF(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSEAGLSYEQYF(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，其结合由MHC呈递时包含GAQYRIHTHGVFRGI(SEQ ID NO:181)氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的WT1肽。
一方面，本发明提供了一种TCR，其包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAVIGGTDSWGKLQF(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSQEEGAVYGYTF(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，其结合由MHC呈递时包含CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO:87)氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的WT1肽。
一方面，本发明提供了一种TCR，其包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAVIGGTDSWGKLQF(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CATSREGLAADTQYF(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，其结合由MHC呈递时包含CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO:87)氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的WT1肽。
一方面，本发明提供了一种TCR，其包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CVVPRGLSTDSWGKLQF(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CATSREGLAADTQYF(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，其结合由MHC呈递时包含CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO:87)氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的WT1肽。
一方面，本发明提供了一种TCR，其包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CVVPRGLSTDSWGKLQF(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSQEEGAVYGYTF(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，其结合由MHC呈递时包含CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO:87)氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的WT1肽。
表1提供了本发明的示例TCR氨基酸序列。
表1
供体：HD12
Figure BDA0003046036010000481
Figure BDA0003046036010000491
供体：HD13
Figure BDA0003046036010000492
Figure BDA0003046036010000501
Figure BDA0003046036010000511
供体：HD14
Figure BDA0003046036010000512
Figure BDA0003046036010000521
Figure BDA0003046036010000531
Figure BDA0003046036010000541
供体：HD15
Figure BDA0003046036010000542
Figure BDA0003046036010000551
Figure BDA0003046036010000561
Figure BDA0003046036010000571
患者1
Figure BDA0003046036010000572
Figure BDA0003046036010000581
Figure BDA0003046036010000591
Figure BDA0003046036010000601
患者2
Figure BDA0003046036010000602
Figure BDA0003046036010000611
Figure BDA0003046036010000621
患者3
Figure BDA0003046036010000622
Figure BDA0003046036010000631
因此，本发明提供了分离的多肽，其片段，变体和同源物，所述分离的多肽包含一个或多个选自SEQ ID NO:1-55、91-161、182-191、194-203和214-217的氨基酸序列。
一方面，本发明提供了一种TCR，其包含选自表1的HD12-HD15α链序列的TCRα链序列和独立地选自表1的HD12-HD15β链序列的TCRβ链序列。
一方面，本发明提供了一种TCR，其包含选自表1的患者1，患者2或患者3的α链序列的TCRα链序列，以及独立地选自表1的患者1，患者2或患者3β链序列的TCRβ链序列。
在一个方面，本发明提供了一种TCR，其包括选自表1的HD12，HD13，HD14，HD15，患者1，患者2或患者3α链序列的TCRα链序列和独立选自表1的HD12，HD13，HD14，HD15，患者1，患者2或患者3β链序列的TCRβ链序列。
在替代实施方案中，表1中提及的完整TCRβ链的序列可以用下面的相应序列替换。
供体：HD12
Figure BDA0003046036010000641
在一些实施方案中，SEQ ID NO:10可以用SEQ ID NO:222替换。
供体：HD13
Figure BDA0003046036010000642
在一些实施方案中，SEQ ID NO:21可以用SEQ ID NO:222替换。
供体:HD14
Figure BDA0003046036010000651
在一些实施方案中，SEQ ID NO:32可以用SEQ ID NO:224替换。
供体:HD15
Figure BDA0003046036010000652
在一些实施方案中，SEQ ID NO:43可以用SEQ ID NO:225替换。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:54可以用SEQ ID NO:226替换。
患者1
Figure BDA0003046036010000653
Figure BDA0003046036010000661
在一些实施方案中，SEQ ID NO:100可以用SEQ ID NO:227替换。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:106可以用SEQ ID NO:228替换。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:122可以用SEQ ID NO:229替换。
患者2
Figure BDA0003046036010000662
Figure BDA0003046036010000671
在一些实施方案中，SEQ ID NO:138可以用SEQ ID NO:230替换。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:144可以用SEQ ID NO:231替换。
患者3
Figure BDA0003046036010000672
在一些实施方案中，SEQ ID NO:160可用SEQ ID NO:232代替。
减少的错配和改善的TCR表达
本发明的TCR可以在T细胞中表达以改变T细胞的抗原特异性。TCR转导的T细胞可表达至少两条TCRα和两条TCRβ链。内源性TCRα/β链形成自身耐受的受体，而引入的TCRα/β链形成对给定靶抗原具有限定特异性的受体。
但是，TCR基因疗法需要转移的TCR的充分表达。内源性TCR的存在可稀释转移的TCR，导致肿瘤特异性TCR的亚最佳表达。此外，内源性链和引入的链之间可以发生错配以形成新的受体，所述受体可显示出对自身抗原的出乎意料的特异性，并在转移到患者体内时引起自身免疫损伤。
因此，已经探索了几种策略来减少内源和引入的TCR链之间错配的风险。TCRα/β界面的突变是目前用于减少不想要的错配的一种策略。例如，在α和β链的恒定域中引入半胱氨酸允许形成二硫键并增强引入的链的配对，而减少与野生型链的错配。
因此，本发明的TCR可在α链/β链界面处包含一个或多个突变，使得当α链和β链在T细胞中表达时，所述链与内源TCRα和β链之间错配的频率降低。在一个实施方案中，一个或多个突变将半胱氨酸残基引入α链和β链中每个的恒定域中，其中半胱氨酸残基能够在α链和β链之间形成二硫键。
TCR的此类修饰描述于例如Boulter,J.M et al.(2003)Protein Engineering16:707-711和Kuball,L.et al.(2007)Blood109:2331-8。
在一个实施方案中，一种或多种突变位于选自Boulter,J.M et al.(2003)Protein Engineering 16:707-711的表1中公开的氨基酸位置。在一个实施方案中，一个或多个突变是以下一个或多个氨基酸被半胱氨酸取代：
Figure BDA0003046036010000681
在一个实施方案中，TCR包含以下突变组中的一个或多个：
(a)用半胱氨酸取代TCR alpha恒定基因第48位的苏氨酸；和/或用半胱氨酸取代TCR beta恒定基因第57位的丝氨酸；
(b)用半胱氨酸取代TCR alpha恒定基因第45位的苏氨酸；和/或用半胱氨酸取代TCR beta恒定基因77位的丝氨酸；
(c)用半胱氨酸取代TCR alpha恒定基因第61位的丝氨酸；和/或用半胱氨酸取代TCR beta恒定基因第57位的丝氨酸；
(d)用半胱氨酸取代TCR alpha恒定基因第50位的亮氨酸；和/或用半胱氨酸取代TCR beta恒定基因第57位的丝氨酸；
(e)用半胱氨酸取代TCR alpha恒定基因第10位的酪氨酸；和/或用半胱氨酸取代TCR beta恒定基因第17位的丝氨酸；
(f)用半胱氨酸取代TCR alpha恒定基因第15位的丝氨酸；和/或用半胱氨酸取代TCR beta恒定基因第13位的缬氨酸；
(g)用半胱氨酸取代TCR alpha恒定基因第15位的丝氨酸；和/或用半胱氨酸取代TCR beta恒定基因第15位的谷氨酸；
(h)用半胱氨酸取代TCR alpha恒定基因第45位的苏氨酸；和/或用半胱氨酸取代TCR beta恒定基因第59位的天冬氨酸；
(i)用半胱氨酸取代TCR alpha恒定基因第48位的亮氨酸12；和/或用半胱氨酸取代TCR beta恒定基因第17位的丝氨酸；
(j)用半胱氨酸取代TCR alpha恒定基因第61位的丝氨酸；和/或用半胱氨酸取代TCR beta恒定基因第79位的精氨酸；
(k)用半胱氨酸取代TCR alpha恒定基因第12位的亮氨酸；和/或用半胱氨酸取代TCR beta恒定基因第14位的苯丙氨酸；
(l)用半胱氨酸取代TCR alpha恒定基因第22位的缬氨酸；和/或用半胱氨酸取代TCR beta恒定基因第14位的苯丙氨酸；和/或
(m)用半胱氨酸取代TCR alpha恒定基因第43位的酪氨酸；和/或用半胱氨酸取代TCR beta恒定基因第63位的亮氨酸。
在一个优选的实施方案中，TCR包括用半胱氨酸取代TCR alpha恒定基因第48位的苏氨酸和/或用半胱氨酸取代TCR beta恒定基因第57位的丝氨酸。
减少错配的另一种策略依赖于引入编码siRNA的多核苷酸序列，添加到编码肿瘤特异性TCRα和/或β链的基因，并设计为限制内源TCR基因的表达(Okamoto S.Cancerresearch 69,9003-9011,2009)。
因此，编码本发明TCR的载体或多核苷酸可包含一种或多种siRNA或其他旨在限制或消除内源TCR基因表达的试剂。
还可以组合人工核酸酶，例如锌指核酸酶(ZFN)，转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)或CRISPR/Cas系统，设计为在靶向内源基因的恒定区，例如TCR基因(TRAC和/或TRBC)，以获得内源TCRα和/或β链基因的永久破坏，从而使肿瘤特异性TCR充分表达，从而降低或消除TCR错配的风险。称为TCR基因编辑的此过程证明在体外和体内均优于TCR基因转移(Provasi E.,Genovese P.,Nature Medicine May；18(5):807-15；2012；MastaglioS.et al.(2017)Blood130:606-618)。
因此，本发明的TCR可用于通过TCR破坏和肿瘤特异性TCR的遗传添加来编辑T细胞特异性。
另外，基因组编辑技术允许将表达盒定向整合到被人工核酸酶破坏的内源基因中，所述表达盒包含编码本发明TCR的多核苷酸以及任选地一个或多个启动子区域和/或其他表达控制序列(Lombardo A.,Nature biotechnology 25,1298-1306；2007)。
因此，可以使用本发明的TCR通过在基因组区域处靶向整合编码本发明的TCR的多核苷酸编辑T细胞特异性。人工核酸酶可以靶向整合。
因此，可以对细胞如T细胞进行遗传工程化改造以包含本发明的TCR。另外，可以通过基因破坏，例如通过例如CRISPR/Cas9获得的TRAC和/或TRBC破坏，或通过定向整合例如表达盒到内源基因(例如涉及抗原特异性，持久性，扩增，活性，对耗竭/衰老/抑制信号的抗性，归巢能力或其他T细胞功能的内源基因)中遗传编辑细胞，如T细胞。
开发用于增加转移的TCR表达并减少TCR错配的另一种策略是“鼠源化”，其被人TCRα和TCRβ恒定区(例如TRAC，TRBC1和TRBC2区)替换为其鼠对应物。TCR恒定区的鼠源化描述于例如Sommermeyer and Uckert J Immunol；2010(184:6223-6231)。因此，本发明的TCR可以是鼠源化的。
分离的多核苷酸
本发明涉及编码本发明的TCR或其部分，例如α链和/或β链，可变域或其部分的分离的多核苷酸。
分离的多核苷酸可以是双链或单链，并且可以是RNA或DNA。
本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸可编码相同的多肽。另外，应当理解，技术人员可以使用常规技术进行不影响由本发明的多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，添加或缺失以反映要表达本发明的多肽的任何特定宿主生物的密码子选择。
本文所述的多核苷酸可以通过本领域可用的任何方法进行修饰。可以进行此类修饰以增强本发明多核苷酸的体内活性或寿命。
诸如DNA多核苷酸的多核苷酸可以重组，合成或通过本领域技术人员可获得的任何方式产生。它们也可以通过标准技术克隆。
通常将使用重组手段，例如使用聚合酶链反应(PCR)克隆技术来产生更长的多核苷酸。这将涉及制备一对期望克隆的靶序列侧翼的引物(例如，约15至30个核苷酸)，使引物与从动物或人细胞获得的mRNA或cDNA接触，在导致期望区域扩增的条件下进行聚合酶链反应，分离扩增的片段(例如通过用琼脂糖凝胶纯化反应混合物)并回收扩增的DNA。可以设计引物以包含合适的限制酶识别位点，从而可以将扩增的DNA克隆到合适的载体中。
表2提供了编码根据本发明的TCR的核苷酸序列的实例。
表2
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因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包含一个或多个选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:56-70、162-180、192、193、204-213和218-221，或与其具有至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的其变体。
本发明还提供了一种TCR，其包含由选自下组的核苷酸序列编码的α链：SEQ IDNO:56,59,62,65,68,162,167,168,171,172,177,178,192,193,204,206,208-212,218和220及与其具有至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的其变体。
本发明还提供了一种TCR，其包含由选自下组的核苷酸序列编码的β链：SEQ IDNO:57,58,60,61,63,64,66,67,69,70,163,164,165,166,169,170,173,174,175,176,179,180,205,207,213,219和221及与其具有至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的序列同一性的其变体。
本发明进一步提供了衍生自表2中存在的序列的分离的多核苷酸序列。例如，本发明提供了编码根据本发明的TCR的可变区的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸包含SEQ ID No：56-70、162-180、192、193、204-213和218-221中任一项的核苷酸区段。
变体序列可以具有一个或多个碱基的添加，缺失或取代。如果变异涉及一个或多个添加或缺失，则它们可以以三个一组出现或可以是平衡的(即，对于每个缺失，一个添加)，以使该变异不引起序列的剩余部分的翻译的移码。
某些或所有变异在以下意义上可以是“沉默的”，即由于遗传密码的简并性，它们不影响编码蛋白质的序列。
如上文解释，一些或所有变体可以产生保守的氨基酸取代，添加或缺失。该变异可以集中在一个或多个区域中，例如编码α或β链的恒定区，接头或框架区的区域，或者它们可以分布在整个分子中。
变体序列应保留编码与WT1肽结合的TCR氨基酸序列的全部或部分的能力。
密码子优化
本发明中使用的多核苷酸可以是密码子优化的。密码子优化先前已经在WO 1999/41397和WO 2001/79518中进行了描述。不同的细胞在其特定密码子选择上存在不同。该密码子偏倚对应于特定tRNA在细胞类型中的相对丰度的偏倚。通过改变序列中的密码子，使其改编为与相应的tRNA的相对丰度匹配，可以增加表达。同样，可以通过有意选择已知相应的tRNA在特定细胞类型中罕见的密码子来减少表达。因此，可获得额外程度的翻译控制。
许多病毒(包括HIV和其他慢病毒)使用大量罕见密码子，并通过将它们更改为对应于常用的哺乳动物密码子，可以实现哺乳动物生产细胞中包装成分的增加的表达。密码子选择表在本领域中对于哺乳动物细胞以及多种其他生物体是已知的。
密码子优化还可以涉及除去mRNA的不稳定性基序和隐蔽的剪接位点。
载体
本发明提供了包含本文所述的多核苷酸的载体。
载体是一种允许或促进实体从一种环境转移到另一种环境的工具。根据本发明，并且举例来说，重组核酸技术中使用的一些载体允许将诸如核酸区段(例如异源DNA区段，例如异源Cdna区段)的实体转移至靶细胞中。载体可以用于在细胞内维持异源核酸(DNA或RNA)，促进包含核酸区段的载体的复制，或促进核酸区段编码的蛋白质的表达的目的。载体可以是非病毒或病毒的。用于重组核酸技术的载体的实例包括但不限于质粒，染色体，人工染色体和病毒。载体可以是单链或双链的。它可以是线性的，并且任选地，载体包含一个或多个同源臂。载体也可以是例如裸核酸(例如DNA)。以最简单的形式，载体本身可以是感兴趣的核苷酸。
用于本发明的载体可以是例如质粒或病毒载体，并且可以包括用于表达多核苷酸的启动子和任选地启动子的调节子。
可以使用本领域已知的多种技术，例如转化，转染和转导，将包含用于本发明的多核苷酸的载体引入细胞。几种技术是本领域已知的，例如用重组病毒载体，例如逆转录病毒，慢病毒，腺病毒，腺相关病毒，杆状病毒和单纯疱疹病毒载体，Sleeping Beauty载体的转导；核酸的直接注射和生物射弹转化。
非病毒递送系统包括但不限于DNA转染方法。在此，转染包括使用非病毒载体将基因递送至靶细胞的过程。典型的转染方法包括电穿孔，DNA生物弹射，脂质介导的转染，紧密的DNA介导的转染，脂质体，免疫脂质体，脂质转染，阳离子试剂介导的转染，阳离子面部两亲分子(cationic facial amphiphiles CFA)(Nature Biotechnology 1996 14；556)及其组合。
术语“转染”应理解为涵盖通过病毒和非病毒递送两者将多核苷酸递送至细胞。
另外，本发明可以采用基因靶向方案，例如DNA修饰剂的递送。
术语“载体”包括表达载体，即能够在体内或体外/离体表达的构建体，表达可以通过载体序列控制，或者例如在插入靶位点的情况下，表达可以由靶序列控制。载体可以整合或拴系到细胞的DNA。
病毒递送系统包括但不限于腺病毒载体，腺相关病毒(AAV)载体，疱疹病毒载体，逆转录病毒载体，慢病毒载体和杆状病毒载体。
逆转录病毒是具有与裂解病毒的生命周期不同生命周期的RNA病毒。在这方面，逆转录病毒是通过DNA中间体复制的感染性实体。当逆转录病毒感染细胞时，其基因组通过逆转录酶转换为DNA形式。DNA拷贝可充当模板，用于产生新的RNA基因组和病毒编码的蛋白，其对于感染性病毒颗粒装配是必需的。
存在有许多逆转录病毒，例如鼠白血病病毒(MLV)，人免疫缺陷病毒(HIV)，马传染性贫血病毒(EIAV)，小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)，劳斯肉瘤病毒(RSV)，Fujinami肉瘤病毒(FuSV)，Moloney鼠白血病病毒(Mo-MLV)，FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)，Moloney鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)，Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)，禽髓细胞瘤病病毒-29(MC29)和禽成红细胞增多病病毒(AEV)和所有其他逆转录病毒，包括慢病毒。
逆转录病毒的详细列表可以参见Coffin et al(“Retroviruses”1997ColdSpring Harbour Laboratory Press Eds:JM Coffin,SM Hughes,HE Varmus pp758-763)。
慢病毒也属于逆转录病毒家族，但是它们可以感染分裂细胞和非分裂细胞两者(Lewis et al(1992)EMBO J.3053-3058)。
载体可以能够将编码本文所述的WT1特异性TCR的核苷酸序列转移至细胞，例如T细胞，以使细胞表达WT1特异性TCR。优选地，载体将能够在T细胞中持续高水平表达，使得引入的TCR可以与内源TCR成功竞争有限的CD3分子库。
例如，在已经进行了修饰以表达本发明的TCR的细胞中，增加CD3分子的供应可以增加TCR的表达。因此，本发明的载体可以进一步包含一种或多种编码CD3-gamma,CD3-delta,CD3-epsilon和/或CD3-zeta的基因。在一个实施方案中，本发明的载体包含编码CD3-zeta的基因。载体可以包含编码CD8的基因。载体可以编码选择标志物或自杀基因，以增加遗传工程化细胞，例如本发明的细胞的安全性概况，或已经进行了修饰以表达本发明的TCR的细胞(Bonini,Science 1997,Ciceri,Bonini Lancet Oncol.2009,Oliveira etal.,STM2015)。本发明载体中包含的基因可以通过自切割序列，例如2A自切割序列连接。
或者，可以提供一种或多种编码CD3基因的单独载体，以与本发明的一种或多种本发明载体，例如一种或多种编码本发明TCR的载体同时，序贯或分开共转移到细胞中。
细胞
本发明涉及包含根据本发明的多核苷酸或载体的细胞。
细胞可以是T细胞，淋巴细胞或干细胞。T细胞，淋巴细胞或干细胞可以选自CD4细胞，CD8细胞，幼稚T细胞，记忆干T细胞，中央记忆T细胞，双阴性T细胞，效应记忆T细胞，效应T细胞，Th0细胞，Tc0细胞，Th1细胞，Tc1细胞，Th2细胞，Tc2细胞，Th17细胞，Th22细胞，gamma/delta T细胞，自然杀伤(NK)细胞，自然杀伤T(NKT)细胞，细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞，造血干细胞和多能干细胞。
可以选择细胞的类型以向本发明的细胞提供期望的且有利的体内持久性并提供期望的且有利的功能和特性。
可以已经从受试者分离细胞。
可以提供本发明的细胞用于过继细胞转移。如本文所用，术语“过继细胞转移”是指向患者施用细胞群。通常，细胞是从受试者中分离的T细胞，然后进行遗传修饰和体外培养，以便在施用于患者之前表达本发明的TCR。
过继性细胞转移可以是同种异体的或自体的。
通过“自体细胞转移”应理解，细胞的起始群体(然后，其根据本发明的方法转导，或用根据本发明的载体转导)从接受经转导的T细胞群体施用的受试者同一受试者获得。自体转移是有利的，因为它避免了与免疫学不相容性相关的问题，并且无论遗传匹配供体的可获得性如何都可用于受试者。
通过“同种异体细胞转移”应理解，细胞的起始群体(然后，其根据本发明的方法转导，或用根据本发明的载体转导)从接受经转导的T细胞群体施用的受试者不同的受试者获得。优选地，将供体与接受细胞施用的受试者遗传匹配，以使免疫学不相容的风险最小化。或者，供体可以是不匹配的并且与患者无关。
转导的细胞群体的合适剂量例如在治疗和/或预防上是有效的。待施用的剂量可以取决于受试者和待治疗的状况，并且可以由技术人员容易地确定。
细胞可以源自自受试者分离的T细胞。T细胞可以是从受试者分离的混合细胞群的一部分，例如外周血淋巴细胞(PBL)群体。可以通过本领域已知的方法活化PBL群体内的T细胞，例如使用抗CD3和/或抗CD28抗体或与抗CD3和/或抗CD28抗体缀合的细胞大小的珠。
T细胞可以是CD4+辅助T细胞或CD8+细胞毒性T细胞。该细胞可以在CD4+辅助T细胞/CD8+细胞毒性T细胞的混合群体中。多克隆活化，例如使用抗CD3抗体，任选地与抗CD28抗体组合，将触发CD4+和CD8+T细胞的增殖。
可以从接受遗传修饰的细胞过继转移的受试者中分离细胞。在这方面，可以通过从受试者分离T细胞，任选地活化T细胞，将TCR基因离体转移到细胞中来制备细胞。然后可以通过过继转移TCR转导的细胞来进行受试者的后续免疫治疗。如本文所用，该过程是指自体T细胞转移，即，将TCR转导的细胞施用于T细胞最初来源的同一受试者。
或者，可以从不同的受试者分离T细胞，使得其是同种异体的。T细胞可以与供体受试者分离。例如，如果受试者正在进行异体造血干细胞移植(Allo-HSCT)或实体器官移植或细胞移植或干细胞疗法，则细胞可源自器官，组织或细胞来源的供体。供体和接受治疗的受试者可以是兄弟姐妹。
或者，该细胞可以是或可以衍生自干细胞，例如造血干细胞(HSC)。由于干细胞不表达CD3分子，因此基因转移到HSC中不导致TCR在细胞表面表达。但是，当干细胞分化为迁移到胸腺的淋巴样前体时，CD3表达的启动导致导入的TCR在胸腺细胞中的表面表达。
这种方法的优势在于，一旦产生成熟的T细胞，它就仅表达引入的TCR而很少表达或不表达内源性TCR链，因为引入的TCR链的表达抑制内源性TCR基因区段的重排而形成功能性TCR alpha和beta基因。另一个益处是基因修饰的干细胞是具有期望抗原特异性的成熟T细胞的连续来源。因此，细胞可以是基因修饰的干细胞，优选基因修饰的造血干细胞，其在分化后产生表达本发明的TCR的T细胞。
本领域已知的其他方法可用于减少，限制，防止，沉默或消除本发明细胞或通过本发明方法制备的细胞中内源基因的表达。
如本文所用，术语“破坏”是指减少，限制，防止，沉默或消除基因的表达。本领域技术人员能够使用本领域已知的任何方法来破坏内源基因，例如，用于基因组编辑，基因沉默，基因敲低或基因敲除的任何合适方法。
例如，可以用人工核酸酶破坏内源基因。人工核酸酶是例如经工程化改造以选择性靶向特定多核苷酸序列(例如编码感兴趣的基因)并在所述多核苷酸序列中诱导双链断裂的人工限制性酶。通常，双链断裂(DSB)将通过易错的非同源末端连接(NHEJ)进行修复，从而导致形成无法表达内源基因的非功能性多核苷酸序列。
在一些实施方案中，人工核酸酶选自下组：锌指核酸酶(ZFN)，转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas(例如CRISPR/Cas9)。
制备本发明的细胞(例如T细胞)的方法可以包括将表达盒靶向整合到内源基因(例如内源TCRα链基因和/或内源TCRβ链基因)中的步骤。如本文所用，术语表达盒是指包含编码一个或多个感兴趣基因的一个或多个多核苷酸序列的多核苷酸序列(例如DNA多核苷酸序列)，使得所述感兴趣基因能够表达。内源序列可以促进从表达盒的表达，和/或表达盒内的转录控制序列可以促进表达。例如，表达盒可包含与表达控制序列，例如启动子或增强子序列可操作地连接的本发明的多核苷酸序列或编码本发明的TCR的多核苷酸序列。一个或多个感兴趣基因可以位于一组或多组限制位点之间。合适地，限制位点可以促进表达盒整合到例如载体，质粒或基因组DNA(例如宿主细胞基因组DNA)中。
例如，可以如下将本发明的表达盒从第一多核苷酸序列，例如在载体上转移到另一个：使用一种或多种合适的限制酶“切下”，例如切割表达盒，并且例如将表达盒“粘贴”，例如整合到第二多核苷酸序列中。
表达盒可以包含本发明的多核苷酸。表达盒可以包含编码一种或多种本发明的TCR的多核苷酸。表达盒可以进一步包含抗生素抗性基因或其他选择标志物基因，其允许鉴定已经成功将表达盒整合到其DNA中的细胞。可以将表达盒中包含的多核苷酸序列可操作地连接至表达控制序列，例如合适的启动子或增强子序列。本领域技术人员将能够选择合适的表达控制序列。
本发明还考虑了表达本发明TCR的细胞，该细胞已经进行了工程化改造以破坏一个或多个内源MHC基因。内源MHC基因的破坏可以减少或阻止工程化细胞表面上的MHC表达。因此，此类具有减少的MHC表达或没有MHC表达的工程化细胞将具有有限的在其细胞表面上呈递抗原的能力或不具有在其细胞表面上呈递抗原的能力。此类细胞对于过继性细胞转移特别有利，因为该细胞将是非同种异体反应性的，例如，细胞将不呈递可由接受过继性转移的细胞的受试者的免疫系统识别的抗原。因此，转移的细胞将不识别为“非自身”，并且可以避免对该细胞的不利的免疫反应。此类细胞称为“通用细胞”，因为它适合于过继转移到多种不同的宿主，而与HLA类型无关。
因此，本发明提供了制备表达本发明的TCR的非同种异体反应性通用T细胞的方法。本发明进一步提供了非同种异体反应性通用T细胞，其表达本发明的TCR。
本发明还考虑了已经进行了工程化改造以破坏一个或多个内源基因，从而将细胞修饰为增强细胞的有利特性，特征或功能和/或减少不期望的特性，特征或功能的细胞。例如，通过破坏内源细胞，可以改变持久性，扩增，活性，对耗竭/衰老/抑制信号的抗性，归巢能力或其他细胞功能。如在此上下文中使用，术语“修饰”是指相对于等同的未修改细胞，例如内源基因尚未被破坏的细胞，一个或多个特征的变化。例如，变化可以是相对于等同的未修饰细胞，细胞特征或功能的增加，增强或引入。或者，变化可以是相对于等同的未修饰细胞，细胞特征或功能的减少，抑制或消除。
可以将本发明的多核苷酸和载体转移到特定的T细胞亚组中，包括CD4和/或CD8，幼稚，记忆干T细胞，中枢记忆，效应记忆或效应细胞，或者在其他细胞亚组中，例如促进本发明细胞中的不同体内持续性长度和功能。
也可以将本发明的多核苷酸和载体转移到T细胞亚组中，例如幼稚，记忆干T细胞，中央记忆细胞，效应记忆细胞，效应物。
也可以将本发明的多核苷酸和载体转移到具有不同极化的T细胞亚组中，例如Th0/Tc0,Th1/Tc1,Th2/Tc2,Th17,Th22或其他，这取决于最适合于靶向特定的肿瘤类型的细胞因子背景。
此外，可以将编码本发明的TCR的抗原特异性区域的本发明多核苷酸和载体转移到其他细胞亚组中，包括gamma/delta T细胞，NK细胞，NKT细胞，细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞，造血干细胞或其他细胞，以获得治疗效果。
本发明进一步提供了制备细胞的方法，其包括用本发明的载体在体外或离体转导细胞的步骤。用载体转导细胞的各种方法是本领域已知的(参见例如Sambrook等)。
本发明还提供了通过诱导包含本发明的多核苷酸或载体的干细胞的分化来产生表达本发明TCR的T细胞的方法。
可以针对表现出特定表型或特征的细胞并且从不表现出该表型或特征或在较小程度表现出该表型或特征的其他细胞选择性纯化细胞群体。例如，可以从起始细胞群中纯化表达特定标志物(例如，CD3,CD4,CD8,CD25,CD127,CD152,CXCR3或CCR4)的细胞群体。或者/另外，可以纯化不表达另一种标志物的细胞群体。
通过“富集”某种类型的细胞的细胞群体，应理解的是，该类型的细胞的浓度在群体内增加。其他类型细胞的浓度可以伴随降低。
纯化或富集可导致细胞群体基本上没有其他类型细胞。
表达特定标志物(例如CD3,CD4,CD8,CD25,CD127,CD152,CXCR3或CCR4)的细胞群体可以通过使用与该标志物结合，优选与该标志物基本特异性结合的试剂实现纯化或富集。结合细胞标志物的试剂可以是抗体，例如与CD3，CD4，CD8，CD25，CD127，CD152，CXCR3或CCR4结合的抗体。
术语“抗体”是指能够结合选择的靶标的完整抗体或抗体片段，包括Fv，ScFv，F(ab')和F(ab')2，单克隆和多克隆抗体，工程化抗体，包括嵌合抗体，CDR移植抗体和人源化的抗体，以及使用噬菌体展示或备选技术产生的人工选择的抗体。
另外，经典抗体的备选也可以用于本发明中，例如“avibodies”,“avimers”,“anticalins”,“nanobodies”和“DARPins”。
可以标记与特异性标志物结合的试剂，以便使用本领域已知的多种技术中的任何一种可鉴定。该试剂可以是固有标记的，或者可以通过与其缀合标记物而进行修饰。通过“缀合”，应理解试剂和标记物是可操作地连接的。这意味着试剂和标记物以使两者能够基本上不受阻碍地实施其功能(例如结合标志物，允许荧光鉴定或允许置于磁场时分离)的方式连接在一起。合适的缀合方法在本领域中是公知的，并且本领域技术人员将可容易识别。
例如，标记物可以允许标记的试剂和与其结合的任何细胞从其环境中纯化(例如，可以用磁珠或亲和标签如抗生物素蛋白标记试剂)，得到检测或得到纯化和检测两者。适合用作标记物的可检测标记物包括荧光团(例如绿色，樱桃色，青色和橙色荧光蛋白)和肽标签(例如His标签，Myc标签，FLAG标签和HA标签)。
分离表达特定标志物的细胞群体的许多技术是本领域已知的。这些包括基于磁珠的分离技术(例如，基于闭合回路磁珠的分离)，流式细胞术，荧光激活细胞分选(FACS)，亲和标签纯化(例如，使用亲和柱或珠，例如生物素柱来分离抗生物素蛋白标记的试剂)和基于显微术的技术。
也可以使用不同技术的组合来进行分离，例如基于磁珠的分离步骤，然后通过流式细胞术针对一种或多种其他(阳性或阴性)标志物对所得细胞群体进行分类。
例如，可以使用
Figure BDA0003046036010000941
系统(Miltenyi)进行临床分级分离。这是基于闭合回路磁珠的分离技术的一个实例。
还设想可以使用染料排斥特性(例如，侧群体或罗丹明标记)或酶促活性(例如，ALDH活性)来富集HSC。
嵌合分子
在另一方面，本发明提供了一种嵌合分子，其包含与非细胞底物缀合的本发明的TCR，由本发明的多核苷酸编码的TCR或其部分。缀合可以是共价的或非共价的。
非细胞底物可以是纳米颗粒，外泌体或本领域已知的任何非细胞底物。
本发明的嵌合分子可以是可溶的。
在另一方面，本发明提供了一种嵌合分子，其包含与毒素或抗体缀合的本发明的TCR，由本发明的多核苷酸编码的TCR或其部分。
毒素或抗体可以具有细胞毒性。毒素可以是细胞毒性分子或化合物，例如放射性分子或化合物。嵌合分子的TCR部分可以赋予识别表达WT1蛋白或肽的细胞的能力。因此，嵌合分子可以特异性识别和/或结合表达WT1的肿瘤细胞。因此，本发明的嵌合分子可以提供细胞毒性毒素，抗体和/或化合物的WT1靶向性递送。
WT1相关疾病
WT1在多种血液肿瘤和实体瘤中广泛表达，而在各种健康组织(例如性腺，子宫，肾，间皮，不同组织中的祖细胞)中显示有限的表达。发明人已经鉴定并确定识别WT1肽的TCR的氨基酸序列。此外，他们已经证明表达根据本发明的TCR的T细胞靶向并杀死呈递WT1肽或过表达WT1蛋白的细胞。
因此，本发明提供了一种用于治疗和/或预防与WT1表达有关的疾病的方法，该方法包括将TCR，分离的多核苷酸，载体或细胞施用于有此需要的受试者的步骤。本发明还提供一种用于治疗和/或预防与WT1表达有关的疾病的方法，其包括将通过本发明的方法制备的细胞施用于有此需要的受试者的步骤。
本发明还提供了本发明的TCR，本发明的分离的多核苷酸，本发明的载体，本发明的细胞或通过本发明的方法制备细胞，用于治疗和/或预防与WT1表达有关的疾病。
术语“预防”是指避免，延迟，阻止或阻碍染上疾病。治疗可以例如预防或减少发展或染上与WT1表达有关的疾病的可能性。
如本文所用，“治疗”是指照顾患病的受试者，以改善，治愈或减轻疾病的症状，或以减轻，阻止或延迟疾病的发展。
该受试者可以是人类受试者。人类受试者可以是儿童。例如，儿童可以小于10岁的年龄，小于9岁的年龄，小于8岁的年龄，小于7岁的年龄，小于6岁的年龄，小于5岁的年龄，小于4岁的年龄，小于3岁的年龄或小于2岁的年龄。人类受试者可以是婴儿。
基于WT1的表达，先前可以已经确定受试者需要本发明的TCR，分离的多核苷酸，载体或细胞，或通过本发明的方法制备的细胞。例如，受试者可以具有相对于健康对照细胞群体表现出增加的WT1表达的细胞群体。可以使用本领域中已知的多种技术来确定WT1的表达，例如，定量RT-PCR可用于确定WT1 RNA转录物的量，其指示WT1蛋白表达。本领域技术人员还将理解，可以通过使用对WT1特异性的商品化抗体进行western印迹来确定WT1蛋白的表达。
也可以先前已经将受试者鉴定为在WT1基因中具有改变(例如，突变或缺失)。此类改变可以是遗传性的。因此，与WT1表达有关的疾病可以是遗传性疾病。与WT1表达相关的遗传性疾病的实例包括但不限于WAGR(Wilms肿瘤-无虹膜-生殖泌尿畸形-延缓)综合征，Denys-Drash综合征(DDS)，Frasier综合征(FS)，生殖泌尿异常(生殖和泌尿系统异常)综合征。
具有与WT1表达有关的遗传性疾病的受试者可以处于形成增殖性病症(例如癌症)的较高风险中。
与WT1表达有关的疾病可以是增殖性病症。
增殖性病症可以是血液系统恶性疾病或实体瘤。血液恶性疾病可以选自急性髓样白血病(AML)，慢性髓样白血病(CML)，成淋巴细胞性白血病，骨髓增生异常综合征(myelodisplastic syndrome)，淋巴瘤，多发性骨髓瘤，非何杰金淋巴瘤和何杰金淋巴瘤。
实体瘤可以选自下组：肺癌，乳腺癌，食道癌，胃癌，结肠癌，胆管癌，胰腺癌，卵巢癌，头颈癌，滑膜肉瘤，血管肉瘤，骨肉瘤，甲状腺癌，子宫内膜癌，神经母细胞瘤，横纹肌肉瘤，肝癌，黑素瘤，前列腺癌，肾癌，软组织肉瘤，尿路上皮癌，胆道癌，胶质母细胞瘤，间皮瘤，宫颈癌和结肠直肠癌。
与WT1表达有关的疾病可选自下组：急性髓样白血病(AML)，慢性髓样白血病(CML)，淋巴母细胞性白血病，骨髓增生异常综合征，淋巴瘤，多发性骨髓瘤，非何杰金淋巴瘤和何杰金淋巴瘤，肺癌，乳腺癌，食道癌，胃癌，结肠癌，胆管上皮癌，胰腺癌，卵巢癌，头颈癌，滑膜肉瘤，血管肉瘤，骨肉瘤，甲状腺癌，子宫内膜癌，神经母细胞瘤，横纹肌肉瘤，肝癌，黑素瘤，前列腺癌，肾癌，软组织肉瘤，尿路上皮癌，胆道癌，胶质母细胞瘤，间皮瘤，宫颈癌和结肠直肠癌。
药物组合物
可以用药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂配制本发明的TCR，本发明的多核苷酸，本发明的载体，本发明的细胞，通过本发明的方法制备的细胞，本发明的嵌合分子和本发明的混合细胞群以施用于受试者。合适的载体和稀释剂包括等渗盐溶液，例如磷酸盐缓冲盐水，并潜在含有人血清白蛋白。
细胞治疗产品的处理优选按照FACT-JACIE国际细胞治疗标准进行。
治疗方法
在另一方面，本发明提供了一种用于治疗和/或预防与WT1表达有关的疾病的方法，其包括对有此需要的受试者施用本发明的TCR，本发明的分离的多核苷酸，本发明的载体，本发明的细胞，通过本发明的方法制备的细胞，本发明的嵌合分子或本发明的混合细胞群体的步骤。
受试者可以是人类受试者。该受试者可以是非人类动物受试者。
受试者可以患有与WT1表达有关的疾病。受试者可以处于形成与WT1表达相关的疾病的风险中。先前可以已经确定该受试者处于形成与WT1表达有关的疾病的风险中。受试者可以具有形成与WT1相关的疾病的增加的风险。
可以通过遗传筛查和/或通过回顾受试者的家族史来确定增加的风险。受试者可以表达指示形成与WT1表达有关的疾病的增加的风险的遗传标志物。
适当地，本领域技术人员将意识到与形成与WT1相关的疾病的风险增加相关的遗传风险因素(例如遗传标志物)。技术人员可以能够使用本领域已知的任何合适的方法或技术来确定受试者是否具有形成与WT1表达有关的疾病的增加的风险。
该受试者先前可以已经接受与WT1表达有关的疾病的治疗。受试者可以正在缓解。受试者可以对化学疗法有抗性。受试者可以对抗WT1疗法有抗性。
在一个实施方案中，用于治疗和/或预防与WT1表达有关的疾病的方法包括对受试者施用化学疗法的步骤。可以与本发明的TCR，本发明的分离的多核苷酸，本发明的载体，根据本发明的细胞，通过本发明的方法制备的细胞或本发明的嵌合分子同时，序贯或分别对受试者施用化学疗法。
在另一方面，本发明提供了一种治疗和/或预防与WT1表达有关的疾病的方法，该方法包括施用混合细胞群体的步骤，其中该混合细胞群体包括各自表达本发明的不同TCR的多个细胞群体。
在另一方面，本发明提供了包括多个细胞群体的混合细胞群体，每个细胞群体表达本发明的不同TCR。
在另一方面，本发明提供了一种制备混合细胞群体的方法，所述混合细胞群包括各自表达本发明的不同TCR的多个细胞群体，其中所述方法包括用本发明的载体体外或离体转导细胞的步骤。
在另一方面，本发明提供了用于治疗和/或预防与WT1表达有关的疾病的混合细胞群体，其中混合细胞群体包含各自表达本发明的不同TCR的多个细胞群体。
例如，混合细胞群体可以包含表达本发明的第一TCR的第一细胞群体和表达本发明的第二TCR的第二细胞群体。例如，混合细胞群体可以包含表达本发明的第一TCR的第一细胞群体，表达本发明的第二TCR的第二细胞群体和表达本发明的第三TCR的第三细胞群体，等等。
混合细胞群中的每个细胞群体可以例如仅表达本发明的单个TCR。可以将混合细胞群体中细胞群体的内源TCR基因破坏或缺失。例如，可以将在混合细胞群体中细胞的内源TCR基因的表达破坏，例如通过使用人工核酸酶进行基因编辑。
在另一方面，本发明提供了本发明的TCR，本发明的分离的多核苷酸，本发明的载体，本发明的细胞，通过本发明的方法制备的细胞，本发明的嵌合分子，或本发明的混合细胞群体用于制备用于治疗与WT1表达有关的疾病的药物的用途。
人和兽医治疗均在本发明的范围内。
除非另有说明，否则本发明的实施将采用细胞生物学，分子生物学，组织学，免疫学，肿瘤学的常规技术，它们在本领域普通技术人员的能力范围内。在文献中解释此类技术。
参见例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989)MolecularCloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel,F.M.et al.(1995和定期补充)Current Protocols in Molecular Biology,第9,13和16章,John Wiley&Sons；Roe,B.,Crabtree,J.and Kahn,A.(1996)DNA Isolation andSequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；Polak,J.M.and McGee,J.O’D.(1990)In Situ Hybridization:Principles and Practice,Oxford University Press；Gait,M.J.(1984)Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press；和Lilley,D.M.and Dahlberg,J.E.(1992)Methods in Enzymology:DNA Structures PartA:Synthesis and Physical Analysis of DNA,Academic Press。这些中每篇通用教科书通过引用并入本文。
现在将通过非限制性实施例描述本发明的各种优选特征和实施方案。
实施例
实施例1
材料和方法
肽
采用由Gessler等人(Doubrovina,E.et al.Blood 120:1633–1646(2012))发表的WT1蛋白序列来设计用于刺激和分离WT1特异性T细胞的肽。该序列含有575个氨基酸，并且在WT1的(外显子5+，KTS+)同种型中缺少的N端中的前126个氨基酸。它由141个五肽组成，所述五肽跨越WT1蛋白的整个序列，每个与下一个重叠11个氨基酸。从Doubrovina等人所述的原始库开始，为了增加富集受限于经加工并且由不同HLA等位基因(以及特定由HLA-A*02:01限制元件)呈递的肽的WT1特异性T细胞的可能性，我们使用了3种不同的方案。
1.用WT1库-137进行刺激：
对于健康供体12(HD12)，用通过排除肽40、41、63、64获得的137个五肽的WT1库(表示为WT1库-137)刺激外周血单个核细胞(PBMC)，以避免分离对WT1 37-45表位(VLDFAPPGA(SEQ ID NO:72)，受限于HLA-A*02:01等位基因的免疫优势肽)和WT1 126-134表位(RMFPNAPYL(SEQ ID NO:71)，一种已经描述为由免疫蛋白酶体加工(Jaigirdar,A.et al.JImmunother.39(3):105-16(2016)并且由HLA-A*02:01等位基因呈递的免疫原性肽)特异性的T细胞。
2.用WT1-HLA-A*02:01库刺激：
对于HD13，HD14，HD15，用由已知可能受限于HLA-A*02:01等位基因的限定肽组成的库(Doubrovina,E.et al.Blood 120:1633–1646(2012))刺激PBMC。表3所示的选定肽以每个肽13.6μg/ml的浓度集合。这些肽根据已经用于上述WT1库(141个肽)的命名法(表示为WT1-HLA-A*02:01库)标记。我们没有在新的库肽中包括VLDFAPPGA(SEQ ID NO:72)(P40-41)和RMFPNAPYL(SEQ ID NO:71)(P63-64)。
3.用单个肽刺激：
也用单个肽(P91)刺激HD15的PBMC，该肽因其HLA限制(可能是HLA-A*02:01)，其天然加工和其在原代白血病母细胞上的表达而选择(如Doubrovina等报道)。
肽由PRIMM以验证的序列，70％的纯度，无菌性和不存在内毒素的规格合成。将这些肽等量混合在由137个肽组成的WT1库(WT1库137)中，每个肽的浓度为1μg/ml。此外，根据特定的作图矩阵，生成了24个亚库，每个亚库包含多达12个肽(每个肽4.17μg/ml)，以使每种肽仅包含在两个重叠的亚库中，如表4所示。
表3.WT1 HLA-A*02:01库中包含的肽。
Figure BDA0003046036010000991
Figure BDA0003046036010001001
表4.左图网格策略
SP1 SP2 SP3 SP4 SP5 SP6 SP7 SP8 SP9 SP10 SP11 SP12
SP13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
SP14 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
SP15 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
SP16 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48
SP17 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
SP18 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72
SP19 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84
SP20 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96
SP21 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108
SP22 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120
SP23 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132
SP24 133 134 135 136 137 138 139 140 141
外周血单个核细胞的分离
在知情同意后，从San Raffaele Hospital(OSR)的4位健康捐献者(HD)获得外周血。使用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)。
永生化的B细胞
使用CD19微珠(Miltenyi Biotec)从健康供体的PBMC中分离自体B细胞。用携带BCL-6/BCL-XL转基因(Kwakkenbos,M.J.et al.Nat.Med.Jan；16(1):123-(2010))和H/F假型(Lévy,C.et al.Molecular Therapy20 9,1699–1712,(2012)的慢病毒载体转导细胞，并在Iscove的改良Dulbecco培养基(IMDM)(Euroclone/Lonza)中培养，该培养基补充有10％胎牛血清(FBS；Carlo Erba)，1％青霉素-链霉素(Euroclone/Lonza)，2mM谷氨酰胺和50ng/ml IL21(Miltenyi Biotec)，每5天通过与经照射(80Gy)的表达CD40L的小鼠L细胞成纤维细胞(3T3-CD40L)以10:1的B-细胞:3T3-CD40L比率共培养再刺激B细胞。
细胞系
在均补充有1％青霉素-链霉素，2mM谷氨酰胺和10％FBS的IMDM(Euroclone/Lonza)中培养T2和EBV-BLCL细胞系。
白血病细胞
从OSR白血病生物库获得原代AML细胞，并根据WT1的表达(通过定量PCR确定)和HLA分型进行选择。在共培养实验中，白血病母细胞保存在X-VIVO 15(Euroclone/Lonza)培养基中，该培养基补充有5％HS，1％青霉素-链霉素，2mM谷氨酰胺，IL3和G-CSF(Peprotech；两者均为20ng/ml)。
HLA分型
在OSR的HLA实验室以高分辨率对健康的供体样品，埃巴病毒(EBV)-B淋巴母细胞样细胞系(BLCL)和原代白血病细胞进行分型。
流式细胞术
使用缀合有FITC-,PE-,PerCP-,APC-,PE-Cy7,APC Cy7-,Pacific Blue和Brillant Violet的针对人CD3，CD4，CD8，CD107a，干扰素(IFN)γ，肿瘤坏死因子(TNF)α，CD33，CD117，CD34，CD14，抗活性胱天蛋白酶3和HLA-A2的抗体。将细胞与抗体在4℃温育15分钟，并用含1％FBS的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。对于胱天蛋白酶3染色，将细胞在4℃温育1小时。使用Zombie Aqua Fixable Viability试剂盒(Biolegend)根据制造商的说明，对死细胞进行染色。使用以下细胞分析仪之一获取流式细胞术数据：BD Canto II流式细胞仪，BD LSRFortessa，Cytoflex S(Beckman Coulter)。通过Flow Jo软件(Tree star Inc)分析数据。为了在细胞内评估细胞因子的分泌和脱粒标志物的表达，根据制造商的说明使用Fix/Perm缓冲液组(Biolegend)。
WT1特异性T细胞的刺激，分离和扩增
将新鲜分离的PBMC重悬于补充有5％的人AB血清，1％的青霉素-链霉素，2mM的谷氨酰胺和1μg/ml的CD28单克隆抗体(BD Biosciences)的X-VIVO 15(Euroclone/Lonza)中，以密度107个细胞/ml接种，并用以下物质刺激：1)对于HD12为WT1库-137，2)对于HD13-HD14-HD15为WT1-HLA-A*02:01库，3)对于HD15为单肽(P91)。
对于用1)和2)进行的实验，在26-30小时后通过CD137表达分离抗原特异性T细胞。更具体地，将细胞用缀合有PE的CD137抗体染色，并使用抗PE微珠(Miltenyi Biotec)进行分选。使用CD3-微珠(Miltenyi Biotec)对CD137级份消减CD3细胞，照射30Gy，并且用作加载有肽的抗原呈递细胞(APC)，其与CD137+级份以100:1的比率(在可能时)或至少20:1和最终密度5×106细胞/ml共培养。使用补充有5％人AB血清，1％青霉素-链霉素，2mM谷氨酰胺，5ng/ml IL7，5ng/ml IL15和10ng/ml IL21的X-VIVO 15作为培养基。每2-3天更换包括细胞因子的培养基。
对于用3)进行的实验，用补充有5％人AB血清的RPMI(Euroclone/Lonza)中的P91表位刺激抗原特异性T细胞。6小时后，收集细胞，用PBS洗涤，用IFNγ捕获剂标记，并在37℃温育45分钟。然后，将细胞用PE标记的针对IFNγ的抗体染色，通过使用抗PE微珠富集，并使用MACS系统(Miltenyi Biotec)进行分离。将富集IFNγ的T细胞与照射30Gy的IFNγ-CD3-级分以100:1的比率共培养，并以5×106个细胞/ml的密度接种。使用补充有5％人AB血清，1％青霉素-链霉素，2mM谷氨酰胺，5ng/ml IL7，5ng/ml IL15和10ng/ml IL21的X-VIVO15作为培养基。每2-3天更换包括细胞因子的培养基。
约20天后，将T细胞沉淀并用于TCR测序分析。
再刺激扩增的抗原特异性T细胞
每7-14天用WT1脉冲的自体APC(PBMC CD3消减的细胞)再刺激最初使用方案1)或2)(如上所述)刺激的细胞。在最初的再刺激中，将细胞在2天前洗涤并铺在无细胞因子的培养基中。用30Gy照射APC，在补充有5％AB血清的X-VIVO 15中用肽库脉冲过夜，或在无血清的IMDM中在旋转器上至少3小时。将脉冲的APC与效应细胞在X-VIVO 15中共培养，该X-VIVO15补充有5％人AB血清，1％青霉素-链霉素，2mM谷氨酰胺，1μg/ml CD28单克隆抗体和IL7(5ng/ml)，IL15(5ng/ml)，IL21(10ng/ml)。
评估T细胞应答
通过对效应细胞与用期望抗原(WT1库-137或WT1-HLA*02:01库，WT1亚库或无关肽库作为对照)脉冲的自体APC(比率为至少1:1)进行6小时共培养来测量响应WT1库-137或WT1-HLA*A02:01库的T细胞百分比。将共培养物接种在补充有5％人AB血清，1％青霉素-链霉素，2mM谷氨酰胺并且补充有CD28单克隆抗体(1μg/ml)，高尔基终止蛋白(Golgi StopProtein)转运抑制剂(BD Biosciences；1μg/ml)和CD107a-FITC抗体(BD Biosciences；4μl/孔)的X-VIVO 15中以评估脱粒。然后将细胞固定，透化并在细胞内染色以确定分泌IFNγ并表达CD107a的CD3+CD8+或CD3+CD4+细胞的百分比。
免疫原性肽的定位
将使用WT1库-137富集的HD12的WT1特异性T细胞接种于不同的孔中，并与加载有每个WT1亚库之一的自体APC共培养。将使用WT1 HLA-A*02:01库富集的HD13和HD14的WT1特异性T细胞接种于不同的孔中，并与自体APC共培养，所述自体APC加载有WT1-HLA*A02:01库中包含的个别肽。对于HD15，由于降低的细胞性，未进行免疫原性肽的定位。
以至少1:1的效应子与靶标的比率接种每种共培养物。如先前描述通过FACS分析测量对每个亚库或肽的T细胞应答。对于HD12，定位网格的解卷积对于确定哪个共享的肽引发T细胞应答是必需的。一旦确定免疫原性表位，就用加载有个别肽的APC进一步刺激HD12，HD13，HD14的T细胞。
评估T细胞识别表达WT1的细胞的能力
用不同的实验程序测量T细胞识别靶细胞的WT1特异性和HLA限制性能力。对于HD13和HD14，确定表达胱天蛋白酶3的活靶细胞的百分比。将原代白血病母细胞和T细胞以效应子与靶标(E:T)的比率10:1,4:1,1:1,1:4和1:10温育6小时。作为阴性对照，将靶细胞与无关的T淋巴细胞一起培养。固定细胞，使用Fix/Perm缓冲液组(Biolegend)透化，并用与Pacific Blue(Biolegend)缀合的抗活性胱天蛋白酶-3抗体染色。用Zombie Aqua FixableViability试剂盒(Biolegend)染色后可见死细胞。
对于剩余的供体，由于扩增的WT1特异性T细胞的适合性降低，因此不可能进行这些功能性测定法。
IFNγ分泌性细胞的富集
为了富集从HD13扩增的对WT1特异性的T细胞，我们进行IFNγ捕获测定(MiltenyiBiotec)。简而言之，用免疫原性识别的表位刺激T细胞6小时。收获细胞，用PBS洗涤并用IFNγ捕获剂标记。在37℃温育45分钟后，将细胞用PE标记的针对IFNγ的抗体染色。然后，通过使用抗PE微珠富集IFNγ分泌性细胞，并使用MACS系统(Miltenyi Biotec)进行分离。使用以下段落中所述的方案扩增富含IFNγ的T细胞。
WT1特异性T细胞的扩增
在对自体APC进行几次再刺激后，为了进一步从HD12，HD13，HD14扩增WT1特异性T细胞，使用不同的方案。
对于HD12和HD13，如前所述使用快速扩增方案(REP)(Riddell,S.R.etal.Science 80(1992)；ME,D.,LT,N.,Westwood,J.,JR,W.&SA,R.Cancer J.(2000))。
对于HD14，用都用P13肽脉冲的源自3个不同供体(其中2个含有HLA-A*0201等位基因)的同种异体照射(30Gy)饲养细胞以及T2照射(100Gy)细胞刺激WT1扩增的T细胞(效应子:T2:饲养物比例＝1:5:1)。
T细胞克隆性评估
为了确定扩增的WT1特异性T细胞的克隆性，根据制造商的推荐使用IO Test BetaMark TCR V beta全集试剂盒(Beckman Coulter)。
TCR全集测序
在共培养时间框内的不同时间点收集WT1特异性T细胞，并通过使用ArcturusPico Pure RNA提取试剂盒(Life Technology)提取RNA。通过使用改良的RACE方法(Ruggiero,E.et al.Nat.Commun.6,8081(2015))扩增WT1特异性T细胞的互补决定区(CDR)3序列。通过使用Illumina MiSeq测序仪对样品进行测序，并使用MiXCR软件鉴定出CDR3克隆型(Bolotin,DA et al.Nature Methods 12,380–381(2015))。
慢病毒载体
对从HD12，HD13，HD14和HD15分离的TCRα和β链基因进行密码子优化，半胱氨酸修饰(Kuball,J.et al.(2007)Blood 109:2331-8)，并在双向启动子下克隆到慢病毒载体(LV)中(欧洲专利号1616012)。对于源自HD14的WT1特异性T细胞，MiXCR分析揭示在相同的CDR3区识别肽13的生成中存在3个可能的TRAV基因。因此，我们订购了3个含有以下基因之一的不同TCR构建体：TRAV12-3*01,TRAV12-2*01,TRAV12-2*02。对于含有TRAV12-2*01和TRAV12-2*02基因的TCR，我们测试了：1)密码子优化的半胱氨酸修饰的形式，以及2)进一步诱变以除去TCR alpha恒定域中的一个N-糖基化位点的密码子优化的半胱氨酸修饰的形式(Kuball,J et al.(2009)J Exp Med 206:463-75)。特别地，我们用氨基酸Q取代N-X-S/T基序中第36位的氨基酸N。
HD14衍生的TCR的命名如下：
TRAV 12-3*01-半胱氨酸修饰，密码子优化
TRAV12-2*01WT-半胱氨酸修饰，密码子优化
TRAV12-2*01mut-半胱氨酸修饰，密码子优化，诱变以除去N糖基化位点
TRAV12-2*02WT-半胱氨酸修饰，密码子优化
TRAV12-2*02mut-半胱氨酸修饰，密码子优化，诱变以除去N糖基化位点
对于每个TCR，将alpha链以反义方向克隆到最小人CMV启动子下，并且将β链以有义方向克隆到PGK启动子下。LV由具有整合酶能力的第三代构建体包装，并由水泡性口炎病毒(VSV)包膜进行假型化。
载体转导
为了用HD13-和HD14-TCR慢病毒载体进行转导，按照制造商的说明，活化从健康个体中分离的T淋巴细胞并且使用与针对CD3和CD28的抗体缀合的磁珠(ClinExVivo CD3/CD28；Invitrogen)分离。以1-2x106个细胞/ml的浓度接种细胞，并在补充有1％青霉素，1％链霉素，10％FBS和各5ng/ml IL-7和IL-15的IMDM中培养。为了进行转导，将T淋巴细胞以2.5×106个细胞/ml接种，并用LV感染24小时。之后，以106个细胞/ml培养T细胞并扩增。通过测量表达特定Vβ(HD13：无可用于Vβ的抗体；HD14：Vβ12)的CD3+T细胞的百分比来确定转导效率。
T淋巴细胞的TCR编辑
活化来自HD的PBMC并且使用与针对CD3和CD28的抗体缀合的磁珠(ClinExVivoCD3/CD28；Invitrogen)分选，并以1-2x106个细胞/ml的浓度接种于补充有1％青霉素，1％链霉素，5％FBS和各5ng/ml的IL-7和IL-15的X-VIVO15中。2天后，同时用RNP复合物(源自TRAC或TRBC引导物和Cas9蛋白的组合)对T细胞进行电穿孔。在第3天用编码HD12，HD13和HD14衍生的TCR的LV转导编辑的T淋巴细胞。6天后，将珠分离，并以1x106个细胞/ml的浓度接种细胞。14天后，通过测量表达特定Vβ(HD12：Vβ22；HD13：无可用于Vβ的抗体；HD14：Vβ12)的CD3+T细胞的百分比来确定转导效率。用MIX G(含有与FITC荧光染料缀合的抗Vβ22抗体–
Figure BDA0003046036010001051
Beta Mark试剂盒，Beckman Coulter)对HD12编辑的T细胞进行染色，并按照制造商的说明使用抗FITC微珠(Miltenyi Biotec)进行分选。
用工程化T淋巴细胞的功能测定法
在与以下项共培养时测量HD12，HD13和HD14工程化T细胞(通过TCR基因转移或TCR基因编辑)识别靶细胞的能力：(a)对于HD13和HD14 TCR，用肽库(WT1库或无关库)或亚库(1和14，均包含肽13，或用无关库)以效应子:靶物(T)比率1:1脉冲的T2细胞；(b)对于HD12TCR，用肽103或用无关肽作为对照脉冲的含有HLA-C*07:02等位基因的EBV细胞系；(c)对于HD14 TCR，根据HLA-A*0201等位基因和WT1抗原的表达(以不同的E:T比率，即50:1；5:1)选择原代AML母细胞。共培养6小时后，对于涉及T2细胞或EBV细胞系的测定法通过细胞荧光测定分析评估CD8+T淋巴细胞上CD107a表达和/或IFNγ分泌并且对于涉及原代AML母细胞的测定法通过评估活靶细胞上的活性Cas3表达测定响应细胞的百分比。
结果
从健康供体中产生功能性WT1-CTL。
我们使用137个十五肽库(WT1库-137)从HD12刺激PBMC，所述库不同于由Doubrovina等人描述的原始库，因为我们排除了肽40、41、63、64。排除这些肽以避免对WT137-45表位(VLDFAPPGA,SEQ ID NO:72)和WT1 126-134表位(RMFPNAPYL,SEQ ID NO:71)特异性的T细胞的分离。
此外，我们用WT1-HLA-A*02:01库刺激来自另外3个供体(HD13-HD15)的PBMC。26-30小时后，将CD137+T细胞分选并与CD137-群体共培养，进一步消减CD3部分，并以30Gy照射。
用加载有肽库的CD3-细胞代表的APC重复刺激细胞。通过细胞荧光测定分析评估WT1特异性T细胞随时间的扩增，以评估细胞因子释放(IFNγ，IL-2，TNF-α)和脱粒标志物(CD107a)的表达。作为阴性对照，用源自无关抗原的肽库刺激细胞。总体而言，我们观察到用WT1库刺激至少3次后CD8级份中肿瘤特异性T淋巴细胞的扩增(图1，a，b，c，d)。
对于HD15，在一个不同的实验中，我们使用单一肽(P91)刺激PBMC，并通过使用IFNγ捕获测定法富集WT1特异性T细胞。培养约20天后，将T细胞用于TCR测序分析。
引发T细胞应答的WT1表位的定位。
为了鉴定WT1库-137中的哪个十五肽在HD12中引发免疫应答，我们使用如由Doubrovina等人先前描述的定位网格策略。简而言之，将WT1重叠的十五肽细分为包含多达12个肽的24个亚库(SP)，其中由Doubrovina等人所述的141个肽中的每个肽独特地包含在两个相交的SP内。将富集的WT1特异性T细胞与用24个SP脉冲的经照射的APC(自体永生化B细胞)共培养6小时，并且我们通过流式细胞术测量IFNγ分泌和CD107a表达的百分比。该策略使得能够通过定位网格的解卷积来检测免疫原性肽。对于HD13和HD14，我们用WT1 HLA-A*02:01库中包含的各个个别肽刺激自体APC，并在与WT1特异性T细胞的6小时共培养实验中将它们用作靶细胞。对于HD15，富含WT1的T细胞在用WT1 HLA-A*02:01库刺激PBMC后起源，由于降低的细胞性，我们未进行免疫原性肽的定位。
我们观察到用亚库SP7和SP21刺激T细胞后，IFNγ的大量分泌和CD107a的表达(图2a，b)。对于用WT1库HLA-A*02:01刺激的HD13和HD14(图2c)，存在有对用P13肽脉冲的自体APC的稳健的免疫应答(对于HD13和HD14，分别为图2d，e)。
一旦对HD12鉴定出由WT1特异性T细胞识别的SP，就用CD3消减的PBMC刺激T淋巴细胞，该PBMC用在定位网格的解卷积后鉴定的特定肽脉冲(图3a；突出显示了鉴定的免疫原性肽)。
在逐步方法中，为了验证免疫原性的十五肽，我们在与自体照射的永生化B细胞的6小时共培养物中测试T细胞，所述永生化B细胞用引发免疫应答的15聚体和用至少一个无关的15聚体加载。对于肽103，观察到增加的CD107a表达和IFNγ分泌(图3b)。进一步使用所鉴定的免疫原性十五肽再刺激T细胞，以提供表位特异性群体的富集。对于HD13和HD14，用被识别的肽(P13)刺激的自体APC再刺激T细胞。
肽-MHC结合的计算机预测
为了对以CD8特异性T细胞的扩增为特征的每个HD预测确切结合九聚体及其HLA限制，我们使用了NetMHCpan 4.0服务器(Jurtz V.et al.(2017)The Journal ofImmunology)。结合预测仅对由HLA I类分子呈递的肽进行，所述HLA I类分子对9个氨基酸的肽具有强烈的偏爱。若％等级低于0.5％，则限定的肽会鉴定为强结合剂，并且若％等级在0.5％至2％之间，则鉴定为弱结合剂。
为了确定从HD12-HD15中含有的HLA等位基因，在Ospedale San Raffaele的HLA和嵌合性实验室(HLA and Chimerism Laboratory of Ospedale San Raffaele)中以高分辨率对每个个体的DNA进行了HLA分型(对于HLA-A，HLA-B，HLA-C等位基因)(图4a)。
对于HD12，鉴定出2种强结合剂：HLA-B*38:01等位基因或HLA-C*07:02等位基因上的肽YRIHTHGVF(SEQ ID NO:73)(加强的结合)(图4b)。
对于HD13和HD14，将肽LLAAILDFL(SEQ ID NO:74)鉴定为与HLA-A*02:01等位基因组合的强结合剂(图4c，d)；另外，对于HD14，当由HLA-C*03:03等位基因呈递时，证明肽AAILDFLLL(SEQ ID NO:75)是强结合剂(图4d)。
对于HD15，预测无强结合剂。
鉴定的WT1肽代表由不同HLA等位基因呈递的免疫原性肽
为了确定对每个分析的HD鉴定的抗原特异性T细胞的HLA限制，将T淋巴细胞与表达(或不表达)由HD含有的特定I类HLA等位基因的靶细胞共培养。
对于HD12，我们将用相关肽或无关肽脉冲的含有与HD共同的单一HLA等位基因的EBV-BLCL组作为靶标。结果显示与每个含有HLA-C*07:02等位基因并用WT1 P103肽脉冲的EBV-BLCL共培养时，表达CD107a和分泌IFNγ的细胞数量增加(图5a)。
对于用以前报道能够在由HLA-A*02:01等位基因呈递时引发免疫应答的肽库刺激的HD13和HD14，我们通过与用特定的免疫原性表位(P13)或无关的表位脉冲的T2细胞共培养直接进行功能验证。流式细胞术结果显示，在T淋巴细胞与用P13脉冲的T2细胞共培养后，表达CD107a标志物并分泌IFNγ的细胞百分比大大增加(图5，b，c)。
通过FACS评估肽的加工。
为了确定从HD13(图6a)和HD14(图6b)中分离的WT1扩增的T细胞识别天然加工的肽并杀死靶细胞的能力，我们评估了与T淋巴细胞共培养6小时后活的原代母细胞中的活性胱天蛋白酶3表达。作为靶细胞，我们使用了根据WT1抗原的高表达和HLA分型(HLA-A*02:01)选择的3名AML患者的原代细胞。作为对照，我们包括无关的效应细胞与用于HD13和HD14的相同白血病母细胞的共培养物。结果显示，HD13以及HD14 T细胞均识别原代白血病母细胞的能力，其中HD14在所使用的不同效应子与靶标比率显示更大的AML母细胞消除。
对于HD12，由于细胞群体的低细胞性，我们没有进行任何测试来验证识别肽的天然加工。
总体而言，源自HD13和HD14的WT1特异性T细胞识别表达WT1的靶细胞(白血病母细胞)的能力不仅指示所识别肽的天然加工，而且还指示其免疫原性。
WT1特异性T细胞的免疫概况分析。
为了表征新鉴定的WT1特异性TCR，我们进行了TCRVβ家族的流式细胞术和TCR测序两者。FACS结果指示HD12和14的特定的Vβ的流行性；对于HD13，优势Vβ的详尽的测定是不可能的，因为IO Test Beta Mark TCR V beta全集保证了V beta完整全集的75％的覆盖率(图7)。对于HD15 WT1特异性T细胞，由于低细胞性和降低的细胞适合性，未进行表达的Vβ家族的流式细胞术评估。WT1特异性T细胞的TCRαβ测序突出显示了HD12，HD13，HD14中对于这两个TCR链，一种CDR3克隆型随时间的优势增加(图8a-c)。对于HD15，我们在用WT1 HLA-A*02:01库刺激后和在用个别肽(P91)刺激，然后进行IFNγ富集后都观察到特定TCR链的明显扩增(图8d)。
新克隆的TCR的功能验证
将从HD12，HD13，HD14和HD15分离并识别受限于HLA I类等位基因的WT1表位的TCRα和β序列进一步修饰，以增加其表面表达并减少与内源TCR链的错配。对于HD14 TCR，我们进一步诱变受体，以增加它们的功能亲合力，如Kuball,J et al.(2009)J Exp Med 206:463-75所述。将获自HD12，HD13和HD14的TCR基因(如实施例1的材料和方法中所述产生的所有不同形式)克隆到双向慢病毒载体中，以促进两条TCR链在转导的淋巴细胞中的稳健且协调的表达。进行编码克隆的TCR的慢病毒载体的病毒生产。
用先前从HD12，HD13和HD14产生的慢病毒载体转导来自健康个体的T细胞。
对于HD12 TCR，如材料和方法部分所述(实例1)，对源自3个不同健康供体的活化T细胞进行编辑。在破坏内源TCR全集时，用编码特定TCRα和β链基因的LV转导T细胞。14天后，测量表达Vβ22的细胞的百分比来评估转导效率。根据细胞表面上的Vβ表达对转导的T细胞进行分类(图9a)。
通过与用NYESO-1肽作为阴性对照或用降低浓度(从40μg至0.4pg)肽103脉冲的含有HLA-C*07:02等位基因的EBV-细胞系共培养(E:T比例＝1:1)来评估HD12转导的经编辑的T细胞的功能亲合力。通过细胞荧光测定分析确定CD8 T细胞上CD107a的表达，评估TCR转导的T淋巴细胞识别靶细胞的能力。结果显示，即使在0.4μg的肽浓度下，HD12转导的编辑T细胞也特异性识别表达感兴趣的HLA等位基因的靶细胞(图9b)。
为了测试识别HLA-A*02:01限制性表位(肽13)的HD13和HD14衍生的TCR，用新产生的慢病毒载体转导从一个健康个体分离的活化T淋巴细胞。由于缺乏识别其特定Vβ的抗体，不能测量HD13的转导效率。通过评估CD4和CD8 T细胞上Vβ表达的百分比来测量HD14转导的T细胞(用TCR TRAV12-2*01WT或用TCR TRAV12-2*02WT)的转导效率(图11a)。
在两个不同的共培养实验中测试用HD13和HD14衍生的TCR转导的T细胞的功能亲合力。在第一个实验中，将HD13 TCR转移T细胞和HD14 TCR转移T细胞(含有TRAV12-2*01WT基因或含有TRAV12-2*02WT基因的细胞)与用WT1库或作为对照的无关库脉冲的T2细胞共培养。在第二个实验中，将HD13 TCR转移T细胞和HD14 TCR转移T细胞(含有TRAV12-2*01WT基因)与用亚库1和14(均含有肽13)和亚库6(作为阴性对照)脉冲的T2细胞共培养。作为读数，我们通过细胞荧光测定分析测量了CD8 T细胞上CD107a表达和/或IFNγ分泌。我们在用HD13衍生的TCR和HD14衍生的TCR转导的T细胞中都观察到对用WT1库脉冲的靶细胞的特异性识别(图10a和图11b)并且观察到亚库1和14的特异性识别(图10b和图11c)。此外，在来自一名健康供体的T细胞中的TCR编辑方法中使用HD14衍生的TCR(含有TRAV12-2*02WT基因或含有TRAV12-2*02mut基因的TCR)。14天后，通过测量表达Vβ12的细胞的百分比来评估转导效率(图12a)。
为了确定表达HD14衍生的TCR(TRAV12-2*02WT基因或TRAV12-2*02mut基因)的WT1编辑的T细胞杀死原代白血病母细胞的能力，我们评估了与T淋巴细胞共培养6小时后靶细胞中活性胱天蛋白酶3的表达。作为对照，我们包括无关的效应细胞与白血病母细胞的共培养和未与效应子一起培养的靶细胞。结果显示，HD14编辑的T细胞在使用的不同效应子与靶标比率时识别原代白血病母细胞的能力(图12b)。
讨论
通过遗传操作重定向T细胞针对由肿瘤细胞表达的抗原的特异性的可能性为癌症免疫治疗开辟了新的治疗窗口。特别地，最近通过CAR重定向T细胞获得的一系列令人印象深刻的临床结果(June et al.(2015)Science Translational Medicine 280-287)极大地提高了科学界，患者协会，制药公司和公众的期望。这种策略的充分利用在很大程度上取决于对相关肿瘤抗原特异的受体的鉴定。理想地，肿瘤抗原必须是由肿瘤细胞和健康组织差异表达的分子，具有高度免疫原性，并可能参与癌症的形成和/或进展。WT1是非常有吸引力的癌症免疫治疗靶标，在国家癌症研究所(National Cancer Institute)优先项目中的75种癌症抗原列表中排名第一(Cheever(2009)Clin.Cancer Res.15:5323–5337)。癌细胞比健康组织多10-1000倍过表达WT1(Inoue(1997)Blood 89:1405–1412)，并且它在许多不同的血液系统恶性疾病中过表达，包括急性髓样和淋巴母细胞性白血病和骨髓增生异常综合征，以及由几种实体瘤表达，如肺癌，乳腺癌，食道癌，胃癌，结肠癌，胆管上皮癌，胰腺癌，卵巢癌，头颈癌，滑膜肉瘤，血管肉瘤，骨肉瘤，甲状腺癌，子宫内膜癌，神经母细胞瘤，横纹肌肉瘤(Haruo Sugiyama(2010)Jpn.J.Clin.Oncol.40:377-387)。针对WT1的疫苗接种已在某些癌症患者中产生了客观的抗肿瘤响应(Van Driessche et al.(2012)Oncologist 17:250–259)。最近，在急性白血病患者中分离，扩增和过继转移WT1特异性T细胞的临床试验证明是安全的和介导的抗白血病活性(Chapuis et al.(2013)Sci Transl Med 5:174ra27)。
然而，迄今为止，针对WT1天然反应性的高亲合力T细胞的低频率已经限制该抗原在过继T细胞疗法中的充分利用。
WT1反应性T细胞和WT1特异性TCR的遗传序列的鉴定打开了几个新的治疗机会。
TCR遗传序列可以以其天然形式使用，或通过例如恒定TCR区的鼠源化或通过人TCR恒定区的半胱氨酸修饰以促进TCR链的正确配对或通过基因的密码子优化以修饰其表达水平来修饰。
天然或修饰的TCR基因可以在特定的T细胞亚组中转移，包括CD4和/或CD8，幼稚，记忆干T细胞，中央记忆，效应记忆或效应细胞，或在其他细胞亚组中转移，诸如以促进工程化细胞中体内的不同持续性长度和不同的功能。根据最适合于靶向每种可能肿瘤类型的细胞因子环境，TCR基因也可以在具有不同极化的T细胞亚组中转移，例如Th0/Tc0，Th1/Tc1，Th2/Tc2，Th17，Th22或其他。此外，这些基因或设计为包括TCR抗原特异性区域的嵌合基因可以在其他细胞亚组，包括gamma/delta T细胞，NK细胞，NKT细胞，造血干细胞或其他细胞中转移，以获得治疗效果。此外，涵盖设计成包括TCR的抗原特异性区域的天然或修饰的分子可以进行工程化改造或偶联至非细胞底物，例如纳米颗粒，外泌体或其他，或可以用作可溶性分子，单独或与其它分子如毒素或抗体偶联，从而利用其识别肿瘤细胞的能力，从而对细胞毒性化合物赋予肿瘤特异性。
新的TCR，如本文描述的TCR向T淋巴细胞中的遗传转移受到TCR生物学固有的某些限制。具体而言，肿瘤特异性α和βTCR链在已经在细胞表面上带有内源TCR的淋巴细胞中表达。因此，基因修饰的细胞表达至少两种不同的竞争与CD3复合物的结合的TCR，导致相互TCR稀释和降低的T细胞亲合力和抗肿瘤功效(Heemskerk,M.H.(2007)Blood 109:235-243)。此外，由于TCR是异二聚体，内源TCR的α和β链可能与转基因TCR的相应α和β链错配以产生新的杂合受体，具有无法预测且潜在有害的特异性(Bendle,G.M.(2010)NatureMedicine 16:565-570；van Loenen,M.M(2010)Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America 107:10972-10977)。代表在自体和同种异体背景两者中基于TCR基因转移的过继免疫疗法的主要问题的这些局限性可以通过几种策略来解决，所述策略具体地经设计以提高TCR表达并促进肿瘤特异性TCR链之间的正确配对。这些策略包括恒定区的鼠源化(Cohen C.J.(2006)Cancer Research 66:8878-8886)，肿瘤特异性TCR基因恒定区的半胱氨酸修饰(Kuball J.(2007)Blood 109:2331-2338)，或设计为限制内源TCR基因表达的siRNA的添加(Okamoto S(2009)Cancer Research 69:9003-9011)。我们小组证明，将设计为靶向内源TCR基因(TRAC和TRBC)恒定区的人工核酸酶，如锌指核酸酶(ZFN)，TALEN或CRISPR/Cas组合，有可能获得对内源TCRα和/或β链基因的永久破坏，因此允许完整表达肿瘤特异性TCR。称为TCR基因编辑的此过程证明在体外和体内均优于TCR基因转移(Provasi E.,Genovese P.(2012)Nature Medicine 18:807-15；Mastaglio S.et al.(2017)Blood 130:606-618)。另外，基因组编辑技术允许将包括肿瘤特异性TCR基因和启动子区域在内的基因盒靶向整合到由人工核酸酶破坏的内源基因中(Lombardo A.(2007)Nature Biotechnology 25:1298-1306)。
最后，基因组编辑技术允许单一细胞中多个基因的遗传破坏：因此可以设想，TCR基因编辑可以与靶细胞中其他基因的基于核酸酶的破坏相结合，目的是修饰WT1特异性细胞产品的持久性，扩增，活性，对耗竭/衰老/抑制信号的抗力，归巢能力或其他功能。因此，基于单一的抗原性特异性，我们可以设想一大批治疗方法，每种方法针对特定的肿瘤类型和肿瘤环境改编。
实施例2
材料和方法
从患者样品中分离WT1特异性T细胞
将根据赫尔辛基宣言在机构BioBank设施中收获并冷冻保存的3名经诊断为急性髓样白血病并进行了同种异体造血移植的患者(Pt)的骨髓抽吸样品在X-VIVO 15(Euroclone/Lonza)中融化，所述X-VIVO 15补充有人血清5％，青霉素/链霉素1％和谷氨酰胺1％。融化后数小时，将样品在补充有EDTA和10％胎牛血清的磷酸盐缓冲盐水(不含钙和镁)中洗涤，然后在具有50nM Dasatinib的50μl总体积中温育30分钟。温育后，无需洗涤，用加载有VLDFAPPGA(SEQ ID NO:72)(WT1)表位的HLA*0201限制性APC缀合的dextramer(ImmuDex)染色样品，并在冰上温育1.5h。
测试了2种不同的方法来分离WT1特异性T细胞：
1.使用BD FACS Aria细胞分选仪在1.5ml Eppendorf管中的反转录缓冲液(SmartScribe；Takara Clontech)中直接分选来自患者1的100个细胞。之后，将样品在65℃加热2分钟，然后在冰上5分钟，并进行TCRαβ基因特异性cDNA合成(Ruggiero E.et al.(2015)Nat.Commun.6:8081)。
2.根据制造商的说明，使用抗APC磁微珠(Miltenyi Biotec)对来自患者1、2和3的500000-2000000个细胞进行染色，并使用MACS系统(Miltenyi Biotec)进行阳性选择。然后将富含WT1 VLDFAPPGA(SEQ ID NO:72)特异性的阳性级分在用X-VIVO 15(Euroclone/Lonza)中的抗CD3和抗CD28单克隆抗体(1:2比率)预包被的U底孔中培养，所述X-VIVO 15补充有5％的人血清，1％的青霉素/链霉素，1％的谷氨酰胺，IL-2 60IU/ml，IL-7 5ng/ml和IL-15 5ng/ml。每3-4天更换培养基，并且若达到汇合，则细胞分开。
TCR全集测序
通过使用Arcturus Pico Pure RNA提取试剂盒(Life Technology)从患者1、2和3的WT1富集的T细胞中提取RNA。通过使用改良的RACE方法(Ruggiero E.et al.(2015)Nat.Commun.6:8081)扩增WT1特异性T细胞的互补决定区(CDR)3序列。通过使用IlluminaMiSeq测序仪对样品进行测序，并使用MiXCR软件鉴定出CDR3克隆型(Bolotin,DA et al.(2015)Nature Methods 12:380–381)。
结果
在所分析的每个个别患者中检测到WT1特异性的富集。对于患者1，抗VLDFAPPGA(SEQ ID NO:72)(WT1)富集发生在三个不同的刺激阶段(第一次刺激后2周和1个月，第二次刺激后1个月)，通过流式细胞术通过Dextramer染色检测(图13a)。对于患者2和患者3，检测到2个对WT1特异性的生长集落，每位患者为1个，如流式细胞术时通过APC缀合的Dextramer评估(图13b)。
WT1特异性T细胞的TCRαβ测序突出显示了在每位分析的患者中，对于这两种TCR链，限定的CDR3克隆型的优势增加(图14a-d)。
以上说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，所描述的发明的各种修改和变化对本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应过度限制于此类特定实施方案。实际上，用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在落入所附权利要求书的范围内，所述修改对于细胞生物学，免疫学，免疫疗法，分子生物学，肿瘤学或相关领域的技术人员来说是显而易见的。

Claims (33)

1.T细胞受体(TCR)，其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的Wilms肿瘤1蛋白(WT1)肽，其中所述TCR：
(i)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CASGGGADGLTF(SEQ ID NO:25)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASGRGDTEAFF(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(ii)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAMRTGGGADGLTF(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSEAGLSYEQYF(SEQ IDNO:8)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(iii)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CILSTRVWAGSYQLTF(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CATGQATQETQYF(SEQID NO:19)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(iv)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAVIGGTDSWGKLQF(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSQEEGAVYGYTF(SEQID NO:41)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(v)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAVIGGTDSWGKLQF(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CATSREGLAADTQYF(SEQID NO:52)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(vi)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CVVPRGLSTDSWGKLQF(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CATSREGLAADTQYF(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(vii)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CVVPRGLSTDSWGKLQF(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSQEEGAVYGYTF(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(viii)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAAPNDYKLSF(SEQ ID NO:93)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSSGLAFYEQYF(SEQ IDNO:98)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(ix)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAAPNDYKLSF(SEQ ID NO:93)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSQLSGRDSYEQYF(SEQ IDNO:104)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(x)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAVRDGGATNKLIF(SEQ ID NO:110)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSTLGGELFF(SEQ IDNO:120)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xi)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CLVGGYTGGFKTIF(SEQ ID NO:115)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSTLGGELFF(SEQ IDNO:120)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xii)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAVTLLSIEPSAGGYQKVTF(SEQ ID NO:126)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSLEGRAMPRDSHQETQYF(SEQ ID NO:136)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xiii)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAVTLLSIEPSAGGYQKVTF(SEQ ID NO:126)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CATSWGLNEQYF(SEQ ID NO:142)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xiv)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAATSRDDMRF(SEQ ID NO:131)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSLEGRAMPRDSHQETQYF(SEQ ID NO:136)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xv)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAATSRDDMRF(SEQ ID NO:131)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CATSWGLNEQYF(SEQ IDNO:142)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xvi)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CALPDKVIF(SEQ ID NO:148)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSVSAGSTGELFF(SEQ IDNO:158)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xvii)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAGLYATNKLIF(SEQ ID NO:153)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSVSAGSTGELFF(SEQID NO:158)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xviii)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAAPNDYKLSF(SEQ ID NO:93)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSTLGGELFF(SEQ IDNO:120)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xix)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAVRDGGATNKLIF(SEQ ID NO:110)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSSGLAFYEQYF(SEQ ID NO:98)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xx)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CAVRDGGATNKLIF(SEQ ID NO:110)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSQLSGRDSYEQYF(SEQ ID NO:104)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xxi)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CLVGGYTGGFKTIF(SEQ ID NO:115)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSSGLAFYEQYF(SEQ ID NO:98)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；或
(xxii)包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含CLVGGYTGGFKTIF(SEQ ID NO:115)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体，所述CDR3β包含CASSQLSGRDSYEQYF(SEQ ID NO:104)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
2.权利要求1的TCR，其包含以下CDR序列：
(i)CDR1α-NSAFQY(SEQ ID NO:23)，
CDR2α-TYSSGN(SEQ ID NO:24)，
CDR3α-CASGGGADGLTF(SEQ ID NO:25)，
CDR1β-SGDLS(SEQ ID NO:28)，
CDR2β-YYNGEE(SEQ ID NO:29)，和
CDR3β-CASGRGDTEAFF(SEQ ID NO:30)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(ii)CDR1α-TSDQSYG(SEQ ID NO:1)，
CDR2α-QGSYDEQN(SEQ ID NO:2)，
CDR3α-CAMRTGGGADGLTF(SEQ ID NO:3)，
CDR1β-SNHLY(SEQ ID NO:6)，
CDR2β-FYNNEI(SEQ ID NO:7)，和
CDR3β-CASSEAGLSYEQYF(SEQ ID NO:8)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(iii)CDR1α-TISGTDY(SEQ ID NO:12)，
CDR2α-GLTSN(SEQ ID NO:13)，
CDR3α-CILSTRVWAGSYQLTF(SEQ ID NO:14)，
CDR1β-KGHDR(SEQ ID NO:17)，
CDR2β-SFDVKD(SEQ ID NO:18)，和
CDR3β-CATGQATQETQYF(SEQ ID NO:19)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(iv)CDR1α-DRGSQS(SEQ ID NO:34)，
CDR2α-IYSNGD(SEQ ID NO:35)，
CDR3α-CAVIGGTDSWGKLQF(SEQ ID NO:36)，
CDR1β-LGHNA(SEQ ID NO:39)，
CDR2β-YSLEER(SEQ ID NO:40)，和
CDR3β-CASSQEEGAVYGYTF(SEQ ID NO:41)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(v)CDR1α-DRGSQS(SEQ ID NO:34)，
CDR2α-IYSNGD(SEQ ID NO:35)，
CDR3α-CAVIGGTDSWGKLQF(SEQ ID NO:36)，
CDR1β-LNHNV(SEQ ID NO:50)，
CDR2β-YYDKDF(SEQ ID NO:51)，和
CDR3β-CATSREGLAADTQYF(SEQ ID NO:52)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(vi)CDR1α-NSASQS(SEQ ID NO:45)，
CDR2α-VYSSGN(SEQ ID NO:46)，
CDR3α-CVVPRGLSTDSWGKLQF(SEQ ID NO:47)，
CDR1β-LNHNV(SEQ ID NO:50)，
CDR2β-YYDKDF(SEQ ID NO:51)，和
CDR3β-CATSREGLAADTQYF(SEQ ID NO:52)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(vii)CDR1α–NSASQS(SEQ ID NO:45)，
CDR2α-VYSSGN(SEQ ID NO:46)，
CDR3α–CVVPRGLSTDSWGKLQF(SEQ ID NO:47)，
CDR1β-LGHNA(SEQ ID NO:39)，
CDR2β-YSLEER(SEQ ID NO:40)，和
CDR3β-CASSQEEGAVYGYTF(SEQ ID NO:41)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(viii)CDR1α–VSNAYN(SEQ ID NO:91)，
CDR2α-GSKP(SEQ ID NO:92)，
CDR3α–CAAPNDYKLSF(SEQ ID NO:93)，
CDR1β-SEHNR(SEQ ID NO:96)，
CDR2β-FQNEAQ(SEQ ID NO:97)，和
CDR3β-CASSSGLAFYEQYF(SEQ ID NO:98)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(ix)CDR1α–VSNAYN(SEQ ID NO:91)，
CDR2α-GSKP(SEQ ID NO:92)，
CDR3α–CAAPNDYKLSF(SEQ ID NO:93)，
CDR1β-SGHDN(SEQ ID NO:102)，
CDR2β-FVKESK(SEQ ID NO:103)，和
CDR3β-CASSQLSGRDSYEQYF(SEQ ID NO:104)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(x)CDR1α–VSGNPY(SEQ ID NO:108)，
CDR2α-YITGDNLV(SEQ ID NO:109)，
CDR3α–CAVRDGGATNKLIF(SEQ ID NO:110)，
CDR1β-MNHEY(SEQ ID NO:118)，
CDR2β-SMNVEV(SEQ ID NO:119)，和
CDR3β-CASSTLGGELFF(SEQ ID NO:120)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xi)CDR1α–NIATNDY(SEQ ID NO:113)，
CDR2α-GYKTK(SEQ ID NO:114)，
CDR3α–CLVGGYTGGFKTIF(SEQ ID NO:115)，
CDR1β-MNHEY(SEQ ID NO:118)，
CDR2β-SMNVEV(SEQ ID NO:119)，和
CDR3β-CASSTLGGELFF(SEQ ID NO:120)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xii)CDR1α–SSVSVY(SEQ ID NO:124)，
CDR2α-YLSGSTLV(SEQ ID NO:125)，
CDR3α–CAVTLLSIEPSAGGYQKVTF(SEQ ID NO:126)，
CDR1β-SEHNR(SEQ ID NO:134)，
CDR2β-FQNEAQ(SEQ ID NO:135)，和
CDR3β-CASSLEGRAMPRDSHQETQYF(SEQ ID NO:136)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xiii)CDR1α–SSVSVY(SEQ ID NO:124)，
CDR2α-YLSGSTLV(SEQ ID NO:125)，
CDR3α–CAVTLLSIEPSAGGYQKVTF(SEQ ID NO:126)，
CDR1β-LNHNV(SEQ ID NO:140)，
CDR2β-YYDKDF(SEQ ID NO:141)，和
CDR3β-CATSWGLNEQYF(SEQ ID NO:142)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xiv)CDR1α–DSASNY(SEQ ID NO:129)，
CDR2α-IRSNVGE(SEQ ID NO:130)，
CDR3α–CAATSRDDMRF(SEQ ID NO:131)，
CDR1β-SEHNR(SEQ ID NO:134)，
CDR2β-FQNEAQ(SEQ ID NO:135)，和
CDR3β-CASSLEGRAMPRDSHQETQYF(SEQ ID NO:136)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xv)CDR1α–DSASNY(SEQ ID NO:129)，
CDR2α-IRSNVGE(SEQ ID NO:130)，
CDR3α–CAATSRDDMRF(SEQ ID NO:131)，
CDR1β-LNHNV(SEQ ID NO:140)，
CDR2β-YYDKDF(SEQ ID NO:141)，和
CDR3β-CATSWGLNEQYF(SEQ ID NO:142)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xvi)CDR1α–TRDTTYY(SEQ ID NO:146)，
CDR2α-RNSFDEQN(SEQ ID NO:147)，
CDR3α–CALPDKVIF(SEQ ID NO:148)，
CDR1β-SGDLS(SEQ ID NO:156)，
CDR2β-YYNGEE(SEQ ID NO:157)，和
CDR3β-CASSVSAGSTGELFF(SEQ ID NO:158)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xvii)CDR1α–SIFNT(SEQ ID NO:151)，
CDR2α-LYKAGEL(SEQ ID NO:152)，
CDR3α–CAGLYATNKLIF(SEQ ID NO:153)，
CDR1β-SGDLS(SEQ ID NO:156)，
CDR2β-YYNGEE(SEQ ID NO:157)，和
CDR3β-CASSVSAGSTGELFF(SEQ ID NO:158)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xviii)CDR1α–VSNAYN(SEQ ID NO:91)，
CDR2α-GSKP(SEQ ID NO:92)，
CDR3α–CAAPNDYKLSF(SEQ ID NO:93)，
CDR1β-MNHEY(SEQ ID NO:118)，
CDR2β-SMNVEV(SEQ ID NO:119)，和
CDR3β-CASSTLGGELFF(SEQ ID NO:120)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xix)CDR1α–VSGNPY(SEQ ID NO:108)，
CDR2α-YITGDNLV(SEQ ID NO:109)，
CDR3α–CAVRDGGATNKLIF(SEQ ID NO:110)，
CDR1β-SEHNR(SEQ ID NO:96)，
CDR2β-FQNEAQ(SEQ ID NO:97)，和
CDR3β-CASSSGLAFYEQYF(SEQ ID NO:98)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xx)CDR1α–VSGNPY(SEQ ID NO:108)，
CDR2α-YITGDNLV(SEQ ID NO:109)，
CDR3α–CAVRDGGATNKLIF(SEQ ID NO:110)，
CDR1β-SGHDN(SEQ ID NO:102)，
CDR2β-FVKESK(SEQ ID NO:103)，和
CDR3β-CASSQLSGRDSYEQYF(SEQ ID NO:104)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xxi)CDR1α–NIATNDY(SEQ ID NO:113)，
CDR2α-GYKTK(SEQ ID NO:114)，
CDR3α–CLVGGYTGGFKTIF(SEQ ID NO:115)，
CDR1β-SEHNR(SEQ ID NO:96)，
CDR2β-FQNEAQ(SEQ ID NO:97)，和
CDR3β-CASSSGLAFYEQYF(SEQ ID NO:98)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；
(xxii)CDR1α–NIATNDY(SEQ ID NO:113)，
CDR2α-GYKTK(SEQ ID NO:114)，
CDR3α–CLVGGYTGGFKTIF(SEQ ID NO:115)，
CDR1β-SGHDN(SEQ ID NO:102)，
CDR2β-FVKESK(SEQ ID NO:103)，和
CDR3β-CASSQLSGRDSYEQYF(SEQ ID NO:104)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体；或
(xxiii)CDR1α-DRGSQS(SEQ ID NO:182)，
CDR2α-IYSNGD(SEQ ID NO:183)，
CDR3α-CASGGGADGLTF(SEQ ID NO:25)，
CDR1β-SGDLS(SEQ ID NO:28)，
CDR2β-YYNGEE(SEQ ID NO:29)，和
CDR3β-CASGRGDTEAFF(SEQ ID NO:30)，
或其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
3.权利要求1或2的TCR，其包含：
(i)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(ii)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(iii)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(iv)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(v)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(vi)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(vii)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(viii)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(ix)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(x)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(xi)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(xii)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(xiii)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(xiv)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(xv)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(xvi)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(xvii)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(xviii)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(xix)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(xx)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(xxi)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(xxii)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(xxiii)α链可变域和β链可变域，所述α链可变域包含SEQ ID NO:185,190的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体，所述β链可变域包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体。
4.前述权利要求中任一项的TCR，其包含：
(i)α链，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:203和SEQ ID NO:32,33和203的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(ii)α链，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:10,11和195的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(iii)α链，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:21,22和197的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(iv)α链，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:215和SEQ ID NO:43,44和215的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(v)α链，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:217和SEQ ID NO:54,55和217的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(vi)α链，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:217和SEQ ID NO:54,55和217的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(vii)α链，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:215和SEQ ID NO:43,44和215的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(viii)α链，其包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:100和101的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(ix)α链，其包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:106和107的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(x)α链，其包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:122,SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:122和123的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(xi)α链，其包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:122,SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:122和123的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(xii)α链，其包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:138,SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:138和139的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(xiii)α链，其包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:144,SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:144和145的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(xiv)α链，其包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:138,SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:138和139的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(xv)α链，其包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:144,SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:144和145的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(xvi)α链，其包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:160,SEQ ID NO:161和SEQ ID NO:160和161的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(xvii)α链，其包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:160,SEQ ID NO:161和SEQ ID NO:160和161的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(xviii)α链，其包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:122,SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:122和123的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(xix)α链，其包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:100和101的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(xx)α链，其包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:106和107的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(xxi)α链，其包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:100和101的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(xxii)α链，其包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:106和107的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(xxiii)(a)α链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:186,191,198,199,200,201,202和SEQ ID NO:186,191,198,199,200,201和202的与其具有至少75％序列同一性的变体；和β链，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(b)α链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:186,191,198,199,200,201,202和SEQ ID NO:186,191,198,199,200,201和202的与其具有至少75％序列同一性的变体；和β链，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；或
(c)α链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:186,191,198,199,200,201,202和SEQ ID NO:186,191,198,199,200,201和202的与其具有至少75％序列同一性的变体；和β链，其包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；
(xxiv)α链，其包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:10,11和195的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(xxv)α链，其包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:21,22和197的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(xxvi)α链，其包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:215和SEQ ID NO:43,44和215的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(xxvii)α链，其包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:217和SEQ ID NO:54,55和217的与其具有至少75％序列同一性的变体；
(xxviii)α链，其包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:217和SEQ ID NO:54,55和217的与其具有至少75％序列同一性的变体；或
(xxix)α链，其包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列或与其具有至少75％序列同一性的其变体；和β链，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:215和SEQ ID NO:43,44和215的与其具有至少75％序列同一性的变体。
5.T细胞受体(TCR)，其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的Wilms肿瘤1蛋白(WT1)肽，其中所述WT1肽包含选自下组的氨基酸序列：GAQYRIHTHGVFRGI(SEQ ID NO:181),LLAAILDFLLLQDPA(SEQ ID NO:82)和CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO:87)和其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
6.前述权利要求中任一项的TCR，其结合MHC I和/或MHC II肽复合物。
7.前述权利要求中任一项的TCR，其限于人白细胞抗原(HLA)等位基因，优选其中所述TCR限于HLA-A、HLA-B或HLA-C等位基因，更优选其中所述TCR限于HLA-A*02:01,HLA-B*38:01,HLA-C*03:03或HLA-C*07:02。
8.根据以下项的TCR：
a.权利要求1-4中任一项的部分(ii)或(xxiv)，其限于HLA-B*38:01或HLA-C*07:02；
b.权利要求1-4中任一项的部分(iii)，(viii)-(xxii)或(xxv)，其限于HLA-A*02:01；或者
c.权利要求1-4中任一项的部分(i)或(xxiii)，其限于HLA-A*02:01或HLA-C*03:03。
9.前述权利要求中任一项的TCR，其在所述α链/β链界面处包含一个或多个突变，使得当所述α链和β链在T细胞中表达时，降低所述链与内源TCRα和β链之间错配的频率。
10.权利要求9的TCR，其中所述一个或多个突变将半胱氨酸残基引入所述α链和所述β链中每个的恒定区域中，其中所述半胱氨酸残基能够在所述α链和所述β链之间形成二硫键。
11.前述权利要求中任一项的TCR，其包含鼠源化恒定区。
12.前述权利要求中任一项的TCR，其中所述TCR是可溶性TCR。
13.分离的多核苷酸，其编码根据前述权利要求中任一项的T细胞受体(TCR)的α链和/或根据前述权利要求中任一项的TCR的β链。
14.权利要求13的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码与所述β链连接的所述α链。
15.权利要求13或14的分离的多核苷酸，其进一步编码一种或多种短干扰RNA(siRNA)或其他能够减少或阻止一种或多种内源TCR基因表达的试剂。
16.载体，其包含根据权利要求13-15中任一项的多核苷酸。
17.权利要求16的载体，其包含编码一个或多个CD3链、CD8、自杀基因和/或选择标志物的多核苷酸。
18.细胞，其包含根据权利要求1-11中任一项的TCR、根据权利要求13-15中任一项的多核苷酸或根据权利要求16或17的载体。
任选地，其中所述细胞进一步包含编码一个或多个CD3链、CD8、自杀基因和/或选择标志物的载体。
19.权利要求18的细胞，其中所述细胞是T细胞、淋巴细胞或干细胞，任选地其中所述T细胞、所述淋巴细胞或所述干细胞选自下组：CD4细胞、CD8细胞、幼稚T细胞、记忆干T细胞、中央记忆T细胞、双阴性T细胞、效应记忆T细胞、效应T细胞、Th0细胞、Tc0细胞、Th1细胞、Tc1细胞、Th2细胞、Tc2细胞、Th17细胞、Th22细胞、gamma/delta T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、造血干细胞和多能干细胞。
20.权利要求19的细胞，其中所述细胞是已经从受试者分离的T细胞。
21.权利要求18-20中任一项的细胞，其中编码TCRα链的内源基因和/或编码TCRβ链的内源基因被破坏，优选使得不表达所述编码TCRα链的内源基因和/或所述编码TCRβ链的内源基因，
任选地，其中通过插入包含编码权利要求1-11中任一项的TCR的多核苷酸序列的表达盒来破坏所述编码TCRα链的内源基因和/或所述编码TCRβ链的内源基因，
进一步任选地，其中一个或多个编码MHC的内源基因被破坏，
进一步任选地，其中涉及持久性、扩增、活性、对耗竭/衰老/抑制信号的抗性、归巢能力或其他T细胞功能的内源基因被破坏，优选地，其中所述涉及持久性、扩增、活性、对耗竭/衰老/抑制信号的抗性、归巢能力或其他T细胞功能的内源基因选自下组：PD1,TIM3,LAG3,2B4,KLRG1,TGFbR,CD160,TIGIT,CTLA4和CD39。
22.制备细胞的方法，所述方法包括以下步骤：在体外、离体或体内将根据权利要求16和/或17所述的载体引入细胞中，例如通过转染或转导进行。
23.权利要求22的方法，其包括T细胞编辑的步骤，其包括用人工核酸酶破坏编码TCRα链的内源基因和/或编码TCRβ链的内源基因，优选地其中所述人工核酸酶选自下组：锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas系统。
24.权利要求23的方法，其包括以下步骤：将表达盒靶向整合到由所述人工核酸酶破坏的所述编码TCRα链的内源基因和/或所述编码TCRβ链的内源基因，其中所述表达盒包含编码权利要求1-11中任一项的TCR的多核苷酸序列。
25.权利要求22-24中任一项的方法，其包括破坏一个或多个编码MHC的内源基因的步骤，优选地，其中通过所述方法制备的细胞是非同种异体反应性通用T细胞。
26.权利要求22-25中任一项的方法，其包括以下步骤：破坏一个或多个内源基因以修饰所述持久性、扩增、活性、对耗竭/衰老/抑制信号的抗性、归巢能力或其他T细胞功能，优选地，其中所述方法包括以下步骤：将表达盒靶向整合到由人工核酸酶破坏的内源基因中，所述内源基因涉及持久性、扩增、活性、对耗竭/衰老/抑制信号的抗性、归巢能力或其他T细胞功能，其中所述表达盒包含编码权利要求1-11中任一项的TCR的多核苷酸序列，优选地，其中所述内源基因选自下组：PD1,TIM3,LAG3,2B4,KLRG1,TGFbR,CD160,TIGIT,CTLA4和CD39。
27.权利要求18-21中任一项的细胞或通过权利要求22-26中任一项的方法制备的细胞，其用于过继细胞转移，优选过继T细胞转移，任选地其中所述过继T细胞转移是同种异体过继T细胞转移、自体过继T细胞转移或通用非同种异体反应性过继T细胞转移。
28.嵌合分子，其包含与非细胞底物、毒素和/或抗体缀合的权利要求1-11中任一项的TCR或其部分，任选地其中所述非细胞底物选自下组：纳米颗粒、外泌体和其他非细胞底物。
29.权利要求1-11中任一项的TCR、权利要求13-15中任一项的分离的多核苷酸、权利要求16或17的载体、权利要求18-21中任一项的细胞、通过权利要求22-26中任一项的方法制备的细胞、或权利要求28的嵌合分子，用于在治疗中使用。
30.权利要求1-11中任一项的TCR、权利要求13-15中任一项的分离的多核苷酸、权利要求16或17的载体、权利要求18-21中任一项的细胞、通过权利要求22-26中任一项的方法制备的细胞、或权利要求28的嵌合分子，其用于治疗和/或预防与WT1表达有关的疾病，任选地其中所述与WT1表达有关的疾病为增殖性病症，优选其中所述增殖性病症是血液恶性或实体瘤，优选其中所述血液恶性选自下组：急性髓样白血病(AML)、慢性髓样白血病(CML)、淋巴母细胞性白血病、骨髓发育不良综合征、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非何杰金淋巴瘤和何杰金淋巴瘤；或优选其中所述实体瘤选自下组：肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、结肠癌、胆管上皮癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、滑膜肉瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肝癌、黑素瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肉瘤、尿路上皮癌、胆道癌、胶质母细胞瘤、间皮瘤、宫颈癌和结肠直肠癌。
31.用于治疗和/或预防与WT1表达有关的疾病的方法，其包括对有此需要的受试者施用权利要求1-11中任一项的TCR、权利要求13-15中任一项的分离的多核苷酸、权利要求16或17的载体、权利要求18-21中任一项的细胞、通过权利要求22-26中任一项的方法制备的细胞、或权利要求28的嵌合分子的步骤。
32.权利要求31的方法，其中所述与WT1表达有关的疾病是增殖性疾病，优选其中所述增殖性疾病是血液恶性或实体瘤，优选其中所述血液恶性选自下组：急性髓样白血病(AML)、慢性髓样白血病(CML)、淋巴母细胞性白血病、骨髓发育不良综合征、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非何杰金淋巴瘤和何杰金淋巴瘤；或优选其中所述实体瘤选自下组：肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、结肠癌、胆管上皮癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、滑膜肉瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肝癌、黑素瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肉瘤、尿路上皮癌、胆道癌、胶质母细胞瘤、间皮瘤、宫颈癌和结肠直肠癌。
33.分离的免疫原性WT1肽，其包含选自下组的氨基酸序列：GAQYRIHTHGVFRGI(SEQ IDNO:181),LLAAILDFLLLQDPA(SEQ ID NO:82)和CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO:87)及其各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
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