CN113174347B - 一株高产2-壬酮的乳酸乳球菌乳酸亚种及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高产2‑壬酮的乳酸乳球菌乳酸亚种及其应用，属于微生物学技术领域。所述的乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093具有下述性质：(1)菌株生长速率快，GM17培养基中6h进入生长稳定期，脱脂乳中发酵8h后活菌数增量达到1.81个数量级，适合工业发酵；(2)菌株产酸速率快，发酵脱脂乳8h完全凝乳并到达发酵终点，有利于凝乳和风味物质的产生；(3)菌株2‑壬酮产量高，8h可产334.63ng/100g。乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093用作发酵剂发酵食品，提升了发酵乳制品的果香味，具有非常广泛的应用前景。

Description

一株高产2-壬酮的乳酸乳球菌乳酸亚种及其应用

技术领域

本发明涉及一株乳酸乳球菌乳酸亚种及其应用，特别是涉及一株高产2-壬酮的乳酸乳球菌乳酸亚种及其在制备发酵乳中的应用，属于微生物学技术领域。

背景技术

发酵乳制品是以牛乳作为主要原料，经乳酸菌发酵或乳酸菌、酵母菌共同发酵制成的乳产品，凭借独特的口感与风味深受人们的喜爱，已经具有广阔的消费市场。研究表明，影响消费者购买发酵乳制品的主要因素包括风味、价格、可用性和品牌等，其中风味占比最重。因此，提升产品风味是目前优化发酵乳制品品质的重要手段。

目前，许多研究表明羰基化合物是促进发酵乳风味形成的一类重要物质，其中乙醛、双乙酰和乙偶姻是酸奶中主要的风味物质。另外，一些其他的羰基化合物对酸奶的风味也具有重要作用，如2-丁酮具有甜味及水果味，2-庚酮和2-壬酮也与酸奶中果香味密切相关。

乳酸乳球菌乳酸亚种是一种乳品工业中常用的发酵剂菌种，因其酸化和产香特性而广泛被应用于奶酪加工，近年来由于其优良的风味特性也逐渐被应用在其他发酵乳制品中，作为附属发酵剂从而改善产品风味。研究表明乳酸乳球菌乳酸亚种在发酵过程中能够生成2-壬酮，有利于提升发酵乳中果香味的强度。

因此，研究开发一种高产2-壬酮的乳酸乳球菌乳酸亚种，以其作为发酵剂应用于乳制品发酵，以提升发酵乳制品的果香风味，是本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

为提升发酵乳制品的果香风味，本发明提供了一株高产2-壬酮的乳酸乳球菌乳酸亚种及其应用，具体技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一株高产2-壬酮的乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)，该菌株是从我国四川阿坝地区采集的曲拉样品中筛选出的,于2019年10月16日保藏在位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.60808。

所述的乳酸乳球菌乳酸亚种具有下述发酵特性：

(1)菌株生长速率快，发酵脱脂乳8h活菌数增量能达到1.81个数量级；

(2)菌株产酸速率快，发酵脱脂乳8h凝乳并达到发酵终点；

(3)菌株产2-壬酮高，发酵8h后生成2-壬酮的含量为334.63ng/100g。

本发明的第二个目的是提供一种含有乳酸乳球菌乳酸亚种的发酵剂。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵剂为直投式发酵剂，所述直投发酵剂中乳酸乳球菌乳酸亚种活菌浓度不低于1×10⁹cfu/mL。

在本发明的一个实施方式中，所述直投发酵剂的具体制备方法如下：将乳酸乳球菌乳酸亚种接种于培养基中，培养至乳酸乳球菌乳酸亚种活菌浓度不低于1×10⁸cfu/mL，得到培养液；将培养液离心，获得菌体；将菌体用缓冲液清洗后，添加冻干保护剂重悬，调整活菌浓度不低于1×10⁹cfu/mL，得到菌悬液；对菌悬液进行真空冷冻干燥，冻干后即得直投式发酵剂。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基为GM17液体培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述直投式发酵剂的制备方法为将乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093接种于液体GM17培养基，于30℃下活化2至3代。

在本发明的一种实施方式中，培养液离心的条件为4000rpm下离心20min。

本发明的第三个目的是提供所述乳酸乳球菌乳酸亚种或所述发酵剂在制备食品方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述食品为发酵乳制品；所述发酵乳制品包括发酵乳、发酵乳饮料、发酵酪乳、酸奶油和乳酒。

本发明的第四个目的是提供一种发酵乳的制备方法，所述方法使用所述乳酸乳球菌乳酸亚种或所述发酵剂。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将牛乳经均质、巴氏杀菌后冷却，得到发酵原料；在发酵原料中接种所述乳酸乳球菌乳酸亚种或所述发酵剂进行发酵，得到发酵乳。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将牛乳在压力14MPa～21MPa、温度40℃～85℃的条件下均质后进行巴氏杀菌，得到杀菌后的牛乳；将杀菌后的牛乳冷却至30℃～40℃，得到发酵原料；在发酵原料中接种所述乳酸乳球菌乳酸亚种或所述发酵剂后于37℃下发酵8h，得到发酵乳；将发酵乳在4℃的条件下放置24h～48h，得到后熟后的发酵乳成品。

本发明的第五个目的是提供一种食品，所述食品含有上述乳酸乳球菌乳酸亚种或上述发酵剂。

在本发明的一个实施方式中，所述食品中的乳酸乳球菌乳酸亚种活菌数或发酵剂中的乳酸乳球菌乳酸亚种活菌数不低于1×10⁹cfu/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述食品为保健食品；或所述食品为使用所述乳酸乳球菌乳酸亚种或所述发酵剂生产得到的发酵乳、发酵酪乳、酸奶油或乳酒；或所述食品为使用所述乳酸乳球菌乳酸亚种或所述发酵剂生产得到的饮料或零食。

本发明的有益效果是：

1、本发明方法安全健康：本发明中应用的乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093是可用于食品的安全菌株。本发明的方法没有添加其他化学物质，安全健康。

2、本发明乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093能有效提高发酵乳中2-壬酮含量，有利于产品品质特性的提高。利用乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093发酵生产发酵乳时，在发酵8h后，发酵乳中2-壬酮的含量为334.63ng/100g，相比于乳酸乳球菌乳酸亚种CICC6246(发酵8h后，发酵乳中2-壬酮的含量为96.09ng/100g)和未发酵的脱脂乳(2-壬酮的含量为100.00ng/100g)，利用乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093发酵生产发酵乳，发酵8h后，发酵乳中2-壬酮含量分别提高了71.28％和70.12％。

生物材料保藏

一株乳酸乳球菌乳酸亚种，分类学命名为Lactococcus lactis subsp.lactis，已于2019年10月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:60808，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

图1为乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093在GM17固体培养基上的菌落图；

图2为乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093的革兰氏染色菌株在1000倍显微镜下的镜检图；

图3为乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093在脱脂乳发酵过程中生长情况图；

图4为乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093在脱脂乳发酵过程中产酸情况图；

图5为乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093在脱脂乳中发酵后乳糖的含量图；

图6为乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093在脱脂乳中发酵后主要羰基化合物类挥发性风味物质的含量图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

活菌数的检测方法：采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。

pH检测方法：采用pH计测量。

酸度检测方法：采用国标GB 431334-2010。

乳糖含量的检测：称取1g(精确到0.001g)发酵乳样品于10mL容量瓶中，加入70％(v/v)乙醇定容至刻度，混匀后4℃提取24h，11000g、4℃离心10min，取上清液进行衍生化，微孔滤膜过滤后采用高效液相色谱测定(外标法定量分析乳糖含量)。

液相色谱条件：选择Waters Sugar-PakⅠ糖柱(300×6.5mm)，柱温85℃，流动相超纯水，流速0.4mL/min，选择蒸发光散射检测器，进样体积10μL。根据标准品出峰时间进行物质定性，用峰面积外标法定量。

挥发性物质含量检测：GC-MS测发酵后酸奶中的挥发性物质含量。

气相色谱条件及升温程序：选择Rtx-WAX毛细管(30m×0.25mm，0.25mm)，进样口温度225℃，分流比10，载气(氦气)流速1mL/min。升温程序设置初始温度30℃，保持3min，以15℃/min升温至225℃，保持5min。

质谱条件：离子化方式EI，发射能量70eV，发射电流200μA，检测器电压1.4kV，离子源温度240℃，接口温度230℃，四级杆温度150℃，质量扫描范围m/z 30～500。将GC-MS得到的谱图，在NIST 2001标准谱库的检索及标准品比对进行物质定性，用峰面积归一化法定量。

实施例1：乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093菌株的分离及鉴定

1、分离

(1)制备合适的样品稀释梯度并培养

将-80℃冰箱中贮藏的四川阿坝曲拉甘油样品取出，置于冰上解冻。震荡混匀后取0.5mL样品加入4.5mL无菌生理盐水中，完成一次10倍稀释，振荡混匀后再从该稀释液中取出0.5mL稀释液加入4.5mL无菌生理盐水中，完成第二次10倍稀释，以此类推，直至稀释到10^-6，从每个梯度的稀释液中吸取100μL，均匀涂布于GM17固体培养基平板上，倒置，放于37℃厌氧下培养36h～48h，并及时观察。

(2)划线分离与纯化

将长出菌落的平板取出后，选取单菌落明显的梯度平板，挑取不同菌落形态的菌落，进行二次划线，直至纯化出所有单菌落。菌株CCFM1093在GM17固体培养基上的菌落照片如图1所示，菌落较小，白色，湿润，边缘整齐，菌落呈圆形。

(3)革兰氏染色和过氧化氢酶实验

挑取单菌落于载玻片上，经过涂片、干燥、固定、初染、水洗、媒染、水洗、脱色、复染、水洗、干燥后镜检，记录革兰氏染色结果，菌株CCFM1093的革兰氏染色镜检结果为紫色(如图2所示)，即为革兰氏阳性菌。挑取单菌落于载玻片上，加入3％过氧化氢溶液，观察有无气泡产生，并记录过氧化氢酶接触结果，实验结果表明菌株CCFM1093表现为过氧化氢酶阴性

(4)菌种保藏

将纯化完成后的每种菌株的单菌落挑入5mL液体GM17培养基中，置于37℃厌氧下静置培养20h～24h，吸取1mL菌液至保菌管中，6000rpm离心3min，倾去上清，加入1mL 30％无菌甘油溶液，重悬，置于-80℃保存。

2、鉴定

(1)16S rDNA序列扩增

吸取1mL菌液6000rpm离心3min，倾去上清，水洗两次，离心倾去上清液，获得菌泥，以此为模板，进行PCR扩增，流程如下：

1)扩增体系20μL：

其中模板量为1μL，双向引物各0.5μL，Taq酶MasterMix为10μL，ddH₂O为7μL。所用引物为27F：AGA GTT TGA TCC TGG CCT CA(SEQ ID No.1)和1492R：GGT TAC CTT GTT ACGACT T(SEQ ID No.2)。

2)扩增条件：

预变性：95℃3min

第一步变性：94℃1min

第二步退火：60℃30s

第三步延伸：72℃2min

循环次数：30次循环

第四步最后延伸：72℃5min

第五步保持：12℃10min

(2)琼脂糖凝胶电泳

称取1.2g琼脂糖加入锥形瓶中，加入80mL 1xTAE，微波间断式加热4min，至液体澄清透明，稍稍冷却，加入4μL核酸染料，摇匀，无气泡，倒入胶板槽中，冷却40min凝固后，置于电泳槽中，排气泡，依次加入PCR扩增产物，每个孔中加入2μL PCR扩增产物，120V 15min跑胶，结束后取出置于凝胶电泳成像仪中拍照保存，记录PCR成功样品的编号，将成功的PCR产物置于-20℃冰箱中保藏。

(3)测序与鉴定

将PCR成功的样品送到英潍捷基(上海)贸易有限公司进行检测，根据反馈的序列结果，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中进行BLAST检索，选取匹配度最高的菌株信息进行结果记录。经分析鉴定，本发明提供的菌株CCFM1093为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)。

3、保藏

将菌株CCFM1093于2019年10月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。

实施例2：乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093在脱脂乳中的发酵特性

1、乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093在脱脂乳中的生长特性

将-80℃保存的本发明乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093接种于GM17培养基中，在30℃下培养24h，传代培养2次，至10⁸～10⁹cfu/mL。取出在GM17中活化后的菌液按2％～4％的体积比接种于脱脂乳中，使体系中的活菌数达到10⁷cfu/mL。将接种好的样品放入37℃的培养箱中发酵，每隔4h取样，检测发酵过程中活菌数的变化，结果如图3所示。由图3可知，发酵8h后菌株CCFM1093活菌数增量达到1.81个数量级，而乳酸乳球菌乳酸亚种CICC6246发酵相同时间后活菌数增量仅有1.21个数量级，因此菌株CCFM1093在脱脂乳中生长速率快。

2、乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093在脱脂乳中的产酸特性

将-80℃保存的本发明乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093接种于GM17培养基中，在30℃下培养24h，传代培养2～3次，至10⁸～10⁹cfu/mL。取出在GM17中活化后的菌液按2％～4％体积比接种于脱脂乳中，使体系中的活菌数达到10⁷cfu/mL。将接种好的样品放入37℃的培养箱中发酵，每隔4h取样，检测发酵过程中pH的变化，实验结果如图4所示。由图4可知，发酵8h后菌株CCFM1093的滴定酸度为81.8°T，pH降至4.62，到达发酵终点，而乳酸乳球菌乳酸亚种CICC6246发酵相同时间后滴定酸度仅为31.9°T，pH仅降至5.91，未到达发酵终点，因此菌株CCFM1093在脱脂乳中产酸速率快。

3、乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093在脱脂乳发酵后的乳糖含量

将-80℃保存的本发明乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093接种于GM17培养基中，在30℃下培养24h，传代培养2～3次，至10⁸～10⁹cfu/mL。取出在GM17中活化后的菌液按2％～4％体积比接种于脱脂乳中，使体系中的活菌数达到10⁷cfu/mL，将接种好的样品放入37℃的培养箱中发酵。

利用高效液相色谱(HPLC)测定脱脂乳发酵后乳糖含量，发酵乳中乳糖含量如图5所示，由图5可知，发酵前脱脂乳中乳糖含量为6.43g/100g，乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093在到达发酵终点(8h)后乳糖含量较低，为5.17g/100g，而乳酸乳球菌乳酸亚种CICC6246发酵8h后乳糖含量为5.85g/100g，因此乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093发酵后乳糖含量显著低于乳酸乳球菌乳酸亚种CICC6246，筛选到的乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093乳糖利用能力强。

4、乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093在脱脂乳发酵后的挥发性物质含量

将-80℃保存的本发明乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093接种于GM17培养基中，在30℃下培养24h，传代培养2～3次，至10⁸～10⁹cfu/mL。取出在GM17中活化后的菌液按2％～4％体积比接种于脱脂乳中，使体系中的活菌数达到10⁷cfu/mL，将接种好的样品放入37℃的培养箱中发酵。

利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)测定脱脂乳发酵后挥发性物质含量，发酵乳中挥发性物质含量如图6所示。由图6可知，乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093在发酵8h后，发酵乳中2-壬酮的含量为334.63ng/100g，显著高于乳酸乳球菌乳酸亚种CICC6246和未发酵的脱脂乳，其含量分别仅为96.09ng/100g和100.00ng/100g，2-壬酮是一种重要的风味物质，因此筛选到的乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093产香特性优良。

实施例3：含有乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093的发酵剂的制备方法

取400μL的乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093接种于20mL GM17液体培养基中，30℃下活化2至3代，待乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093活菌数达到1×10⁸cfu/mL时，获得液体菌液；于4000rpm下离心20min，去除上清液后，收集菌体；在无菌环境下依次加入缓冲液和冷冻保护剂，待细胞浓度为1×10⁹cfu/mL时，真空冷冻干燥处理，即得直投式发酵剂。

实施例4：发酵乳的制备方法

将牛乳在压力14MPa～21MPa、温度40℃～85℃的条件下均质后进行巴氏杀菌，得到杀菌后的牛乳；将杀菌后的牛乳冷却至30℃～40℃，得到发酵原料；在发酵原料中接种乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093或实施例3所得的发酵剂后，于37℃下发酵8h，得到发酵乳；将发酵乳在4℃的条件下放置24h～48h，得到后熟后的发酵乳成品。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一株高产2-壬酮的乳酸乳球菌乳酸亚种及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cctggcctca 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (11)

1.一种乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)CCFM1093，已于2019年10月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:60808。

2.含有权利要求1所述的乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093的发酵剂。

3.根据权利要求2所述的发酵剂，其特征在于，所述发酵剂为直投式发酵剂，所述直投式发酵剂中乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093活菌浓度不低于1×10⁹cfu/mL。

4.权利要求1所述乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093或权利要求2-3任一项所述的发酵剂在制备食品方面的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述食品为发酵乳制品；所述发酵乳制品为发酵乳、发酵乳饮料、发酵酪乳、酸奶油和乳酒。

6.一种制备发酵乳的方法，其特征在于，所述方法为以牛乳或含有牛乳的物质为原料，利用权利要求1所述乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093、或权利要求2或3所述发酵剂发酵生产发酵乳。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法为将牛乳经均质、巴氏杀菌后冷却，得到发酵原料；在发酵原料中接种权利要求1所述乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093、或权利要求2或3所述发酵剂进行发酵，得到发酵乳。

8.根据权利要求6或7任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法为将牛乳在压力14MPa～21MPa、温度40℃～85℃的条件下均质后进行巴氏杀菌，得到杀菌后的牛乳；将杀菌后的牛乳冷却至30℃～40℃，得到发酵原料；在发酵原料中接种权利要求1所述乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093、或权利要求2或3任意一项所述发酵剂后于37℃下发酵8h，得到发酵乳；将发酵乳在4℃的条件下放置24h～48h，得到后熟后的发酵乳成品。

9.一种食品，其特征在于，所述食品含有权利要求1所述的乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093、或权利要求2或3所述发酵剂。

10.根据权利要求9所述的食品，其特征在于，所述食品为保健食品；或所述食品为使用权利要求1所述乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093、或权利要求2或3所述发酵剂生产得到的饮料或零食。

11.根据权利要求9所述的食品，其特征在于，所述食品为使用权利要求1所述乳酸乳球菌乳酸亚种CCFM1093、或权利要求2或3所述发酵剂生产得到的发酵乳、发酵酪乳、酸奶油或乳酒。

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