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CN113171469B - 靶向肿瘤细胞表面Trop2蛋白的肿瘤治疗纳米药物及其制备方法 - Google Patents

靶向肿瘤细胞表面Trop2蛋白的肿瘤治疗纳米药物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种靶向肿瘤细胞表面Trop2蛋白的肿瘤治疗纳米药物及其制备方法，纳米药物为靶向Trop2、响应GSH的新型纳米药物，通过负载Trop2抗体，可靶向过表达Trop2的肿瘤细胞，使纳米药物富集于肿瘤组织，最大程度减少对正常组织、细胞的毒副作用，并对细胞质中高浓度GSH做出响应，使纳米药物在特异位点胞质处快速释放主药，减少对其他生物过程的干扰。且该纳米药物在血液中循环时间长，能提高主药利用率、延长主药作用时长，提高治疗效果。本发明还发现了促进TNBC侵袭转移的lnc RNA，提供了该lnc RNA在诊断、治疗三阴性乳腺癌上的应用，能将其siRNA作为上述纳米药物的主药，应用于三阴性乳腺癌的治疗。

Description

靶向肿瘤细胞表面Trop2蛋白的肿瘤治疗纳米药物及其制备 方法
技术领域
本发明涉及肿瘤分子生物学领域，更具体地，涉及靶向肿瘤细胞表面Trop2蛋白的肿瘤治疗纳米药物及其制备方法。
背景技术
正常组织中，微血管内皮间隙致密、结构完整，大分子物质不易透过血管壁；而实体瘤组织则完全相反，实体瘤组织则存在对大分子类物质的选择性高通透性及滞留效应(即EPR效应)。实体瘤组织的特点恰恰促进了包裹主药的纳米粒子类物质在肿瘤组织的选择性分布，使药效增加的同时减少了系统副作用。但是，尽管肿瘤组织对纳米粒子类物质具有EPR效应，但研究表明，该过程的效率并不高，通过EPR效应在实体肿瘤中积累的纳米粒子数量平均仅为注射剂量的0.7％。为了改善该问题，现有技术进一步研究有抗体偶联物，以提高靶向性和效力，以抗体-siRNA偶联物(Antibody-siRNA conjugates,SRCs)为例，其是将具靶向性质的抗体和siRNA偶联而成的一种新型抗肿瘤药物，可将抗体与siRNA本身或其载体相连，进而减少脱靶效应和提高生物利用度。该类抗体偶联物虽然能够提高靶向性，但是也存在缺陷，如，用纳米粒子负载某些抗体时，抗体过大的分子量会限制可以放置在单个纳米颗粒上的单克隆抗体的数量，从而导致效率下降。除此之外，有些抗体中的Fc结构域可能具有免疫原性和细胞毒性，可能会导致副作用。
同时，即使选择靶向性抗体能实现靶向性，但其作用效果仍然是有限的，该类纳米粒子无法使主药在所需针对的特异位点以作用，无法基于肿瘤微环境的特异性实现响应式的主药释放，即该类纳米粒子的应用和治疗效果仍然是受限的；以包裹主药siRNA为例，siRNA若不进入特异位点胞质而释放以作用于靶基因，其利用率显然是较低的，沉默效果也显然受限。
所以，目前亟需一种既连接有靶向性物质又能在特异位点响应性释放主药且毒副作用小的响应式纳米药物，从而提高主药的作用效果。且进一步地，及时发现一种能应用于预测、诊断和/或预防肿瘤的标志物、作用靶点也能实现在主药层面上的挖掘，方便纳米药物结合与标志物、作用靶点对应的主药，实现相应的肿瘤治疗功能。
发明内容
本发明首次构建了负载Trop2抗体和主药的胞内响应纳米粒子类型纳米药物，通过包裹于主药外的PDSA对胞浆内GSH响应，纳米药物能实现在胞浆内快速释放包裹主药，且由于本发明纳米药物还负载连接有Trop2抗体，所以该纳米药物除了有助于主药的释放外，还能借助于Trop2抗体提高靶向性，从而减少毒副作用。由于Trop2抗原在多种肿瘤组织中呈现特异性高表达，所以，该纳米药物适用于多种肿瘤组织，有助于结合不同主药对多种过表达 Trop2的肿瘤实现靶向治疗，并实现在肿瘤组织中的富集，且所述纳米药物对胞内浓度GSH 响应而快速释放主药，能在Trop2抗体已经使纳米药物具有靶向性的前提下，进一步在生物环境中使主药的作用位点具有特异性。本发明人采用siRNA包裹物进行纳米药物的性能检测，结果表明本申请中的纳米药物相比于裸露的主药siRNA在被细胞摄取的能力上显著提高，所以利用本申请的纳米药物还能促进主药的被摄取，以提高同剂量注入药物的效力。形成的纳米药物能有效减少脱靶效应，并提高生物利用度。同时，本发明人还发现本申请所构建的纳米药物具有较长的血液循环半衰期，基于该纳米药物能使得主药得以存留于生物体内较长时间，便于提高所用主药的利用率，延长主药作用时间。基于Trop2抗体以及胞内响应的特点，结合主药形成的纳米药物具有足够强的靶向性，且Trop2抗体相比于现有技术中分子量大的抗体，能够避免对纳米药物负载产生限制，有助于纳米药物负载数量的提升，提高效率。且 Trop2抗体较其他Fc结构域有免疫原性和细胞毒性的抗体更加安全，基于该Trop2抗体的纳米药物的安全性从本发明人对纳米药物的体内毒性测试结果也可以看出。所以本申请纳米药物不仅能提高靶向性和主药的疗效，且能减少或避免毒副作用，最大程度减少对正常组织、细胞的损伤。
本发明提供了一种胞内响应纳米药物，即上述的纳米药物，包括治疗肿瘤的主药、包裹在主药外且在细胞质内谷胱甘肽浓度下分解的高分子聚合物PDSA以及与PDSA和/或主药连接的Trop2抗体。所述PDSA是将胱氨酸二甲酯盐酸盐加入至脂肪二酸与三乙胺的混合溶液中合成的高分子聚合物，该高分子聚合物材料在较低浓度谷胱甘肽下保持稳定，对较高浓度谷胱甘肽则作出响应。GSH作为一种常见的还原性物质在细胞浆中含量丰富，而在细胞外基质中浓度很低，基于该特点，能利用GSH浓度实现响应式纳米药物，从而促进包裹的主药在细胞浆中释放并发挥作用。以细胞质内谷胱甘肽浓度(2-10×10-3M)为细胞外谷胱甘肽浓度(2-10×10-6M)的1000倍为例，PDSA能在胞质谷胱甘肽浓度下快速响应并释放其包裹的主药。而与PDSA或主药连接的Trop2抗体则能靶向在肿瘤组织中过表达的Trop2抗原，从而使纳米药物靶向并富集于肿瘤组织，以提高纳米药物的靶向性，并提高主药作用肿瘤组织的效率。
进一步地，粒径分布范围为20～150nm；更进一步地，粒径分布范围为40～80nm；本申请的纳米药物粒径分布范围控制在20～150nm有助于应用在生物体上以便顺利通过多种生物屏障，提高运输性能。
进一步地，所述主药为siRNA分子，且siRNA分子包括以抑制肿瘤发生、发展的靶基因 siRNA。通过Trop2抗体，所述纳米药物至少能实现在主药释放前的靶向性，当主药为靶向作用并抑制肿瘤发生、发展的靶基因siRNA分子时，能在主药层面进一步实现靶向性，从而在主药层次上减少细胞毒性，避免对其他基因造成干扰，减少正常基因被干扰而导致的副作用。且主药为siRNA分子时，更有利于纳米药物的制备和负载，相比于分子量大的主药，siRNA 分子量小，有助于纳米药物同时负载较多siRNA，从而提高靶向作用的效果。
进一步地，所述siRNA沉默长链非编码RNA基因的表达，所述长链非编码RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次发现核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的长链非编码RNA(以下记作Uc003xsl.1)在三阴性乳腺癌组织中相比Luminal组织明显上调，其与NKRF蛋白结合并占据了NKRF上与IL8启动子上负性反应元件结合的位点，进而抑制了NKRF与IL8启动上的NRE的结合，从而促进IL8的转录，最终促进下游炎性蛋白诱导的三阴乳腺癌细胞转移。表明Uc003xsl.1能作为预测或诊断三阴性乳腺癌转移的一种标志物，有助于及时获取患者的病情从而方便进行针对性的治疗，以提高后续的治疗效果。本发明人通过纳米药物负载Uc003xsl.1的siRNA沉默三阴性乳腺癌细胞内Uc003xsl.1表达后，肿瘤细胞的侵袭和转移受到明显抑制，表明长链非编码RNA Uc003xsl.1的抑制剂有助于实现三阴性乳腺癌的治疗，有助于结合其他药物实现全面的三阴性乳腺癌治疗；且进一步地，siRNA具有靶向性，有助于提高治疗效果的同时利用靶向性减少毒副作用。同时，本发明结合Uc003xsl.1的siRNA 与负载有Trop2抗体的PDSA胞内响应纳米载体形成上述纳米药物，能显著提高靶基因siRNA 靶向性，能使得靶基因siRNA能够更好地靶向过表达Trop2的肿瘤细胞，包括三阴性乳腺癌细胞，使得纳米粒子在对应的肿瘤组织中富集。且PDSA会对细胞质中高浓度的GSH作出响应，能够实现胞内的主药快速释放，高效沉默靶基因。纳米药物同时负载Trop2抗体和抑制核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因的siRNA时，能实现对三阴性乳腺癌侵袭、转移功能的抑制，胞内响应纳米药物包裹该siRNA时至少能实现对三阴性乳腺癌的抑制，能应用于三阴性乳腺癌的治疗过程。长链非编码RNA(以下记作Uc003xsl.1)基因序列源于基因AC008691.1，长链非编码RNA的核苷酸序列如下所示：
GAGACGGTACCCGCGCCCCACAGTCCACCCGCTCCTCGGAGTCCCCCCGCGCCCC GGAGTCCACCCGCGCCCCGGAGTCCACCCGCGCAGGTCCACTTCTCCATCCCTGCTCTC GACCTCCGCCCCTGCGGTGGGGGAAGTTCCTGGGGCGGTGGCTGGGACCAGGCCGGGT TTTAGGCGGGCGCAGATTTCCGGGCTAACTTTCCTCGCCGTCTCAGCGCGGGAAGGGG GAAATGGGAAACCCGGGCCAGAGCAGCGGAGCTTCCCAGCCGCACACTTCCTCCCTCC AGCCGTTTGTCTCGGCAGGGGAGGGCCCAGGCAGCCAAGCCGGCAGGCCCACTGGTTA TCCGACCTTGTGCTCTGGCCGTGGGTGGAGACCTTACATCCAGCTCAGAGCGCCTCCTC CCATCCCCTGTGTCCTCTAGGCCTCCCCAGACTTTGCCTTTTAGCCTTCCAGTGAAACAA GTTCTGTATCCAAGATATACAATTAAGTGGACAAAGCAGATTGCAGAAAGTCTTTTCGTA GCTCACAAGGGGACATCAAAGATGACAAAGAGGAGTGGAAGAAGACAGAGAGAATCA ATGTGAGGAGCCTGGAACAGGGCTCTGAATTGTCTTCCCGCAGTGAAATCACTTGTCTA TTGCTGAGCCAAGAATTTGACTCTGAGCATCTAGGATGAGAAAGAAGAACTGGCACCT ACGCCATCTCTGCCCCTCGGGACTGACTATTTTGGCCCAGTTTCCTCAACAATGAAATGG GACTAATTATCCCAGGTCACACTTCTCTCTGGGCTTACCCTGGGAATCAGATGATTGAGC TTTGGATCTCACTCTGTTGCCCAGGCTGGAATGCAGTGATACGATCATGATTCACTGCAG CCTCAAACTCCTGGGTTCAAGTAACCCTCCCACCTCAGCTTTCTGAGTAACTGGGACTA CAGAATGCCCCACCCCACTTAGTCCATAGTGATGCCCACCTGTGGTTAATGGAGCTGAG GCTGCTGGACCAAAGGGAGGAAGTCTGTTAGGCATATGTGGAACCCAAAAGAGGAACT TCATCAACTGTCATGGACAGCTCTGCCACTTTGTGACCCTGTGGACTTTTTGGGAAGTGTTTTTGTGGTTCACCAGTCTCTCATTAGGCAAGGCCATTTGTCCTGGGTTGGTCTTCTTC ATTGGTGGAAAGTACAGCTGGGAGATTTGGAATGGTTGCAGATTGACTTGACTCTCATA AGGAACTGCCACCATGAGCTTTTGGGGAAAGACCTCAAGCTGTGGTGTGTTGCTGAGG ATTGTGGGATTCCTCCAAATCTTGGGGAACATTTTGAGTCATCACTGGCAGCAGATTTCT GTTGACAACTTGAGCAACTTCAGAATGAAGAAGCCATCTTCATCTCTCACATGAATATG ACTTTGGGTAAATCATCTCGAAATCTGAACCCATGGTTGTGATCCACACTCCTCCTGAGT TCTGATTTTTAGTGTAACCTTTTTCTTCTCATTTTTTCTTCTTTGTGCATCTCTTAAGGAGG TTTTTAAAATCTCATAATTAAAAAATTTATTTCTTCAAAACTTTTTATTTTGAAATCACTGT AAATTCACATACATTTGTATAAAATGCCACAGAAAAATCCTGTGTGCCTTTTACTCAGTTT ATTCTAATGATAACATCCTTAAAGAGATTTAAAAATTACTGAGATATAATTGAAATATGAG AAAATTCACTCTTTTATGCATTTAAATATCCTTTATGTTTTTTCATAGCTTATTAGCTCATTT CTTTTCAGTGCTGAATAATTCTTAATTGTCTGGATATACCATAGCTTATTTATCCATTCACG TATTGAAGGATGTTCTAGTGCTTTTAAGTTTTGGCAATTATGAATAAAGCTGCTGTATACA TTCAAAAAAAAAAAA。
进一步地，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，为5’ -GAAAGUACAGCUGGGAGAUTT-3’，所述siRNA的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示，为5’-AUCUCCCAGCUGUACUUUCTT-3’；或，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，为5’-CCAUCUUCAUCUCUCACAUTT-3’，所述siRNA的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，为5’-AUGUGAGAGAUGAAGAUGGTT-3’。在本发明的多个实施例中，采用所述siRNA均能对Uc003xsl.1实现有效的沉默，从而抑制其表达，以达到抑制三阴性乳腺癌侵袭、转移的治疗效果。
进一步地，主药为被修饰的siRNA分子，如被修饰的Uc003xsl.1siRNA分子，所述修饰包括核糖修饰、碱基修饰或磷酸骨架修饰。为了siRNA的运输以及靶向作用，对siRNA进行修饰还有助于改进siRNA在临床上的实际应用，有助于进一步提高siRNA联合其他物质时的治疗效果。针对性的修饰除了能产生上述效果外，还能利用核糖、碱基、磷酸骨架的修饰进一步研究负载被修饰siRNA的纳米药物的相关生物学过程，从而便于进行进一步改进以获取更为有效的纳米药物，从而以提高治疗效果、患者的生存率。
进一步地，所述siRNA分子的核苷酸被部分替换和/或增减，核苷酸被部分替换和/或增减后的siRNA分子沉默siRNA核苷酸变化前靶基因的表达。以Uc003xsl.1siRNA分子为例，其作为Uc003xsl.1表达抑制剂而存在，而基于同一Uc003xsl.1对应的核苷酸序列，除了上述 SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.5序列外，部分在SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.5序列siRNA基础上增减和/或替换部分核苷酸所产生的siRNA同样能抑制Uc003xsl.1的表达。所以，靶向某个基因的siRNA并不局限于少数几种核苷酸序列。
本发明还提供了一种胞内响应纳米药物在制备治疗过表达Trop2的肿瘤的药物中的用途。由于本发明所述纳米药物中连接有Trop2抗体，纳米药物对于过表达的Trop2组织具有靶向性，且Trop2在多种类型的肿瘤中都呈现过表达，表明本发明纳米药物能适用于治疗过表达 Trop2的多种肿瘤，所以该纳米药物能应用于制备治疗过表达Trop2的肿瘤的药物。
本发明还提供了一种胞内响应纳米药物在制备治疗乳腺癌的药物中的用途。在本发明的一个实施例中，所述Trop2在乳腺癌组织中较正常乳腺组织程序特异性高表达，所以本发明纳米药物同样能适用于乳腺癌的治疗。
进一步地，乳腺癌为三阴性乳腺癌。在本发明的一个实施例中，较其他类型乳腺癌，三阴性乳腺癌组织中Trop2表达程度最高，所以，本发明纳米药物应用于三阴性乳腺癌时，其靶向性和富集程度会更高，对应的，释放的主药的效果也会更加明显。
进一步地，所述治疗乳腺癌的药物为抑制三阴性乳腺癌侵袭转移的药物。在本发明的一个实施例中，同时负载有Trop2抗体和Uc003xsl.1siRNA的纳米药物能够明显抑制三阴性乳腺癌的侵袭、转移，表明本发明所述纳米药物还能结合靶向抑制三阴性乳腺癌侵袭、转移的药物实现对应的抑制效果。
本发明还提供了一种药物组合物，包括上述的胞内响应纳米药物。
本发明还提供了一种上述胞内响应纳米药物的制备方法，包括步骤：
S1、将胱氨酸二甲酯盐酸盐加入至脂肪二酸与三乙胺的混合溶液中，合成PDSA高分子聚合物；
S2、配置聚乙二醇修饰的磷脂(PEG-lipid)和能够特异性连接Trop2抗体的聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯溶液(PEG-NHS)；
S3、基于纳米沉淀法利用PDSA溶液、PEG-lipid溶液、PEG-NHS溶液、主药溶液、Trop2 抗体制备负载Trop2抗体和主药的PDSA胞内响应纳米药物。
在上述长链非编码RNA被发现的基础上，本发明还提供了长链非编码RNA在制备诊断、治疗三阴性乳腺癌的药物中的用途，所述长链非编码RNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。更具体的，提供了长链非编码RNA在制备预防、预测、诊断、治疗三阴性乳腺癌侵袭转移的药物中的用途。在本发明的一个实施例中，Uc003xsl.1在三阴性乳腺癌组织以及高转移细胞中较其他乳腺癌组织明显上调，且当Uc003xsl.1表达被下调时，三阴性乳腺癌的侵袭、转移明显受到抑制；表明长链非编码RNA Uc003xsl.1能作为预测、诊断三阴性乳腺癌侵袭转移的标志物，其有助于应用在预测或诊断三阴性乳腺癌侵袭转移的药物的生产。
三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是一种特殊的分子亚型乳腺癌，约占乳腺癌患者15％左右。三阴性乳腺癌患者的预后较差，其病理学特点为恶性度高、发病年龄比较早、早期易发生内脏和骨骼等器官转移。且三阴性乳腺癌患者生存期短，一旦肿瘤发生转移，生存期通常只有12到15个月。而目前三阴性乳腺癌的侵袭和转移往往无法进行及时的预防或诊断，容易使患者失去抑制三阴性乳腺癌转移的机会。同时，现有技术中抑制三阴性乳腺癌转移的手段非常有限，难以满足患者及临床治疗的需求。所以，长链非编码RNA Uc003xsl.1的发现能提供有效的三阴性乳腺癌治疗手段，能作为预测、诊断、预防三阴性乳腺癌转移的标志物，方便获得有效抑制三阴性乳腺癌转移的治疗物质，能应用以延长三阴性乳腺癌患者的生存期限。
本发明还提供了一种抑制剂在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的用途，所述抑制剂抑制长链非编码RNA基因的表达，所述长链非编码RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。在本发明的一个实施例中，通过抑制剂siRNA抑制Uc003xsl.1的表达后，三阴性乳腺癌侵袭、转移功能明显受到抑制，而侵袭、转移属于三阴性乳腺癌发展中的过程；即表明下调Uc003xsl.1表达的抑制剂能够应用于三阴性乳腺癌的治疗中以抑制三阴性乳腺癌发展。
进一步地，所述治疗三阴性乳腺癌的药物为抑制三阴性乳腺癌侵袭、转移的药物。在本发明的一个实施例中，Uc003xsl.1的抑制剂siRNA沉默Uc003xsl.1表达后，三阴性乳腺癌的侵袭、转移受到明显抑制。
进一步地，所述抑制剂为siRNA分子。siRNA能够靶向作用于Uc003xsl.1，一方面基于其靶向性能够提高作用靶基因的效率，靶向沉默Uc003xsl.1对应的基因片段，同时，还能避免对其他基因的表达造成干扰而导致副作用，有助于实现对乳腺癌组织、细胞的靶向杀伤、治疗。且当抑制剂为siRNA分子时还有利于借助其他载体实现更进一步的高效运输、靶向运输，有助于基于较少的剂量即能实现显著的治疗效果，能有效避免剂量过多而可能导致的副作用。相比于非靶向性的治疗药物或抑制剂，siRNA能够除了能避免对其他基因表达造成影响外，还能在联合其他药物治疗时避免对其他药物的治疗效果产生负向影响；有助于结合其他药物或载体实现在治疗上增益的效果。
进一步地，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，为 5’-GAAAGUACAGCUGGGAGAUTT-3’，所述siRNA的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示，为5’-AUCUCCCAGCUGUACUUUCTT-3’；或，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如 SEQ ID NO.4所示，为5’-CCAUCUUCAUCUCUCACAUTT-3’，所述siRNA的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，为5’-AUGUGAGAGAUGAAGAUGGTT-3’。在本发明的多个实施例中，采用上述siRNA均能对Uc003xsl.1实现有效的沉默，从而抑制其表达，以达到抑制三阴性乳腺癌侵袭、转移的治疗效果。
进一步地，所述siRNA分子为被修饰的siRNA分子，所述被修饰的siRNA分子沉默所述长链非编码RNA基因的表达。所述修饰包括核糖修饰、碱基修饰或磷酸骨架修饰。由于siRNA是基于SEQ ID NO.1核苷酸序列而设计的，所以往往不单单只有与上述siRNA序列完全相同的siRNA才能实现沉默的效果，当对所述siRNA进行修饰并使得修饰后的siRNA仍能抑制Uc003xsl.1表达时，修饰后的siRNA同样能起到抑制三阴性乳腺癌侵袭、转移的效果。且为了siRNA的运输以及靶向作用，对siRNA进行修饰还有助于改进siRNA在临床上的实际应用，有助于进一步提高单独的siRNA或siRNA联合其他物质时的治疗效果。针对性的修饰除了能产生上述效果外，还能利用核糖、碱基、磷酸骨架的修饰进一步研究后续siRNA 沉默机制以及沉默所引发的生物学过程，如应用标记进行修饰，有助于研究siRNA在临床使用时的运输效率以及可能引发的生物机制、其他抑癌机制，从而基于该研究基础实现更为有效的治疗药物或方案，以提高治疗效果、患者的生存率。
进一步地，所述siRNA分子的核苷酸被部分替换和/或增减，核苷酸被部分替换和/或增减后的siRNA分子沉默所述长链非编码RNA基因的表达。所述siRNA是作为Uc003xsl.1表达抑制剂而存在，而基于同一Uc003xsl.1对应的核苷酸序列，除了上述SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.5序列外，部分在SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.5序列siRNA基础上增减和/或替换部分核苷酸所产生的siRNA同样能抑制Uc003xsl.1的表达，所以，siRNA并不局限于只有上述核苷酸序列，且在SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.5序列基础上进行部分核苷酸的增加和/或替换有助于随着对Uc003xsl.1研究的深入而获取能进一步高效抑制Uc003xsl.1表达或便于联合其他治疗物质实现治疗的siRNA。
本发明还提供了一种药物组合物，包括抑制长链非编码RNA基因表达的抑制剂，所述长链非编码RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，还包括与抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。所述与抑制剂配伍的载体和/辅料有助于抑制剂快速作用；进一步地，载体选择病毒、纳米粒子、胆固醇或脂质体中的一种或多种，纳米粒子不仅便于抑制剂的包裹，还有助于基于纳米粒子进行修饰以便实现更为多样的靶向治疗。病毒、胆固醇、脂质体载体也能为抑制剂提供适用多种场景下的载体环境。
进一步地，包括抑制剂和纳米粒子载体，所述抑制剂为siRNA分子，纳米粒子载体包含 PDSA、Trop2抗体成分，且PDSA包裹于抑制剂外，Trop2抗体与PDSA和/或抑制剂连接。实际上所述纳米粒子载体即为上述胞内响应纳米药物除主药外的组成部分。PDSA能够快速响应胞内谷胱甘肽，实现包含物的快速释放。所述Trop2抗体有助有进一步提高纳米粒子的靶向性，因为在本发明的一个实施例中，Trop2抗原在TNBC细胞中过表达，所以借助Trop2抗体有助于靶向至TNBC组织中。包裹siRNA形成的纳米药物，其能进入到膜细胞中，并沿神经细胞突触、血管和淋巴血管传播，解决了现有技术中siRNA传递缺乏有效载体的技术问题，有助于提高siRNA的靶向作用效率。且通过所述的纳米粒子载体包裹siRNA后，一方面能基于Trop2实现靶向运输，另一方面能利用PDSA实现纳米药物的胞内释放，实现胞内响应释放靶基因siRNA，能够高效沉默靶基因，从而以达到显著抑制三阴性乳腺癌侵袭转移的效果，并最大程度的避免毒害作用，减少对正常组织细胞的损伤。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：提供了靶向Trop2、响应GSH的新型纳米药物，该纳米药物通过负载Trop2抗体，可更好地靶向过表达Trop2的肿瘤细胞，包括乳腺癌细胞，使纳米颗粒在肿瘤组织中富集，最大程度减少了对正常组织细胞的毒副作用，并对细胞质中高浓度的GSH做出响应，使纳米药物能在特异位点胞质处加速释放主药，进一步减少对其他生物过程的干扰。且合成步骤简单，制备工艺易于操作、可大批量生产，易于实现临床转化。同时，该种纳米药物在血液中循环时间较长，能提高主药的利用率、延长主药的作用时长，提高主药治疗效果。当主药为siRNA时，除了利用siRNA能进一步提高靶向性以及治疗效果外，对应的纳米药物能够快速响应细胞质中高浓度GSH而促进siRNA释放，高效沉默靶基因。且本发明还发现了促进TNBC转移的靶基因lncRNA Uc003xsl.1，基于长非编码RNAUc003xsl.1能实现三阴性乳腺癌转移的预测或诊断，及时获取患者的病情从而方便进行针对性的治疗，以提高后续的治疗效果，以延长患者的生存期。且通过长非编码RNAUc003xsl.1 的抑制剂能实现三阴性乳腺癌侵袭或转移的抑制，能在三阴性乳腺癌的治疗上实现临床应用，从而预防或治疗三阴性乳腺癌的转移，至少能起到抑制肿瘤发展的趋势。结合其他治疗药物，便于在各个维度上实现对肿瘤的治疗，提高治疗效果。本发明采用的抑制剂为siRNA，通过 siRNA能够靶向作用靶基因，避免对其他基因或其他药物产生干扰，有助于实现高效的抑制，并避免产生其他毒副作用，提高患者治疗体验，提高依从性，从而便于后续的持续治疗。本发明更将长链非编码RNA的siRNA作为上述胞内响应纳米药物的主药，形成的纳米药物能够实现对三阴性乳腺癌的侵袭、转移的抑制，能应用于三阴性乳腺癌的治疗。通过负载Trop2 抗体的PDSA纳米药物提高靶向性，更好地靶向过表达Trop2的肿瘤细胞，使纳米药物在肿瘤组织中富集，并实现胞内响应释放，从而进一步避免对其他正常细胞的损伤。且胞内响应释放快速，在血液中循环时间长，能够高效沉默靶基因，又能实现快速而又持久的作用，显著抑制三阴性乳腺癌的转移，提高治疗效果。
附图说明
图1为Luminal和TNBC组织、高转移和普通MDA-MB-231细胞的测序热图及基因交集；
图2为MIF-AS1、PRNCR1和Uc003xsl.1在Luminal和TNBC组织以及高转移和普通MDA-MB-231细胞中的qPCR验证；
图3为敲低Uc003xsl.1后对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭的影响；
图4为Uc003xsl.1与NKRF相互作用；
图5为Uc003xsl.1参与调控IL8的转录活性；
图6为还原响应高分子材料PDSA的合成路线图；
图7为一种PDSA的核磁共振氢谱；
图8为多种PDSA的分子量统计表；
图9为Trop2在乳腺癌细胞系及正常乳腺上皮细胞系中的表达情况；
图10为Trop2在MDA-MB-231细胞系中的亚细胞定位；
图11为Trop2在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的IHC染色；
图12为一种载有Trop2抗体和Uc003xsl.1siRNA的纳米粒子的尺寸分布图；
图13为一种载有Trop2抗体和Uc003xsl.1siRNA的纳米粒子的微观形貌图；
图14为高分子材料PDSA与GSH共孵育4小时后分子量变化；
图15为载有Trop2抗体和Uc003xsl.1siRNA的纳米粒子在不同GSH浓度水溶液中粒径变化；
图16为载有Trop2抗体和荧光标记Uc003xsl.1siRNA的纳米粒子在不同浓度的GSH水溶液中释放曲线；
图17为载有Trop2抗体和荧光染料标记siRNA的纳米粒子与细胞培养4小时后的细胞内荧光强度；
图18为纳米粒子在不同Uc003xsl.1siRNA浓度下敲低目标基因的效率；
图19为载有Trop2抗体和Uc003xsl.1siRNA的纳米粒子对细胞迁移的影响；
图20是载有Trop2抗体和Uc003xsl.1siRNA的纳米粒子对细胞侵袭的影响；
图21为纳米粒子的体内代谢性能检测；
图22为纳米粒子的肿瘤富集情况；
图23为纳米粒子的体内分布情况；
图24为各组纳米粒子治疗后的肺转移情况；
图25为经各组纳米粒子治疗后裸鼠的肝肾功能；
图26为经各组纳米粒子治疗后裸鼠心、肝、脾、肺、肾的病理组织染色。
具体实施方式
本发明附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。为了更好说明以下实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对于本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。
实施例1
Uc003xsl.1的获取及分析
一、Uc003xsl.1的获取
本申请发明人从中山大学孙逸仙纪念医院收集到6个乳腺癌新鲜组织，6个乳腺癌新鲜组织中包括3个TNBC和3个Luminal乳腺癌组织。然后通过Illumina PE150进行lncRNA测序以分析lncRNA在6个乳腺癌新鲜组织中的表达情况，测序热图如图1A(左)所示，并筛选出在TNBC组织表达水平较Luminal组织上调的30条lncRNA。
同时，为了找出与TNBC转移相关的生物标志物，发明人构建了乳腺癌肺转移模型，从小鼠肺转移灶收集高转移的MDA-MB-231细胞，并通过lncRNA测序筛选出在高转移 MDA-MB-231细胞较普通MDA-MB-231-细胞表达上调的267条lncRNA，测序热图如图1A (右)所示，其中MDA-MB-231-M代表高转移的MDA-MB-231细胞。
根据以上两个lncRNA测序数据的候选lncRNA的交集，发明人最终筛选出在TNBC组织和高转移MDA-MB-231细胞中表达水平均上调的3条lncRNA，即MIF-AS1，PRNCR1和Uc003xsl.1，如图1B所示。
随后，本申请发明人通过qPCR分析分别对以上3条lncRNA进行了验证，结果如图2所示，在3条候选lncRNA中，只有Uc003xs1.1在TNBC组织和高转移MDA-MB-231细胞中表达均显著上调，表明Uc003xs1.1与TNBC的转移密切相关。
在此基础上，本申请发明人将Uc003xsl.1作为靶基因进行进一步研究。
二、Uc003xsl.1基因功能分析及信号通路验证
由(1)中结果可知，Uc003xsl.1在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中表达量较高，在此基础上，本申请利用依据Uc003xsl.1核苷酸序列设计的siRNA沉默三阴性乳腺癌细胞系 MDA-MB-231中Uc003xsl.1的表达以进一步研究其功能，发现siRNA沉默MDA-MB-231细胞中Uc003xsl.1的表达后，肿瘤细胞的迁移和侵袭功能受到明显抑制，结果如图3所示，表明抑制Uc003xsl.1基因表达能实现肿瘤细胞迁移、侵袭的抑制，且提示Uc003xsl.1能够促进三阴性乳腺癌的转移。本实施例中si-lnc1代表SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3序列形成的siRNA。si-lnc2代表SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5序列形成的siRNA；si-NC为对照组。
然后，本申请发明人对其分子机制进行进一步研究，通过RNA pull-down后蛋白质质谱检测发现：Uc003xsl.1与胞核中的NF-κB抑制因子(NF-κB repressing factor,NKRF)存在相互作用的关系，进而参与调控NF-κB下游靶基因IL8的转录活性，检测结果如图4、5所示。本实施例中前缀si代表对应后缀靶基因的siRNA应是被理解的。
Uc003xsl.1与NKRF蛋白结合后，占据了NKRF上与IL8启动子上负性反应元件(negative regulatory element,NRE)的结合位点，进而抑制了NKRF与IL8启动子上的NRE的结合，从而促进IL8的转录，最终促进下游炎性蛋白诱导的三阴乳腺癌细胞转移。
实施例2
PDSA的合成与结构分析
一、PDSA的合成
本实施例中的PDSA是一种在较高谷胱甘肽浓度下分解的高分子聚合物，本实施例中采用“一锅法”进行大批量制备，其制备过程包括：(1)将脂肪二酸和三乙胺混合溶解，所述脂肪二酸包括丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、十一碳二酸、十二碳二酸或十三碳二酸等所有脂肪二酸，混合溶解所使用的溶剂为二甲亚砜或二甲基甲酰胺等强极性溶剂；
(2)在冰盐浴条件下，将胱氨酸二甲酯盐酸盐(Cystine dimethyl esterdihydrochloride) 逐滴加入到脂肪二酸和三乙胺的混合溶液中。然后，在室温下搅拌反应15分钟至4小时后，除去反应体系中沉淀物，浓缩滤液，使用乙酸乙酯沉淀出粗产品。
(3)用二甲亚砜或二甲基甲酰胺等强极性溶剂溶解粗产品，加入乙酸乙酯沉淀出产物，反复沉淀三次后，真空干燥获得纯化的PDSA。如图6所示，为PDSA的合成路线图。
二、PDSA的结构检测分析
本实施例中使用Varian(300MHz)型核磁共振仪分析检测PDSA的结构，使用尺寸排除色谱分析法和多角度激光光散射连用分析(SEC-MALLS)检测PDSA的分子量。使用双检测器系统，包括MALLS装置(DAWN EOS,Wyatt Technology)和干涉折射仪(Optilab DSP,Wyatt Technology)。聚合物的浓度为10mg/mL，DMF作为流动相，流速为0.3mL/min。结果如图7、8所示，图7、8分别是一种PDSA的核磁共振氢谱和几种PDSA的分子量统计表。
实施例3
Trop2在乳腺癌中表达情况的检测
一、不同乳腺细胞系中Trop2的基因表达检测
本发明人基于正常乳腺上皮细胞系：MCF10A、HMEC；TNBC细胞系：MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-468、BT549；HER2+乳腺癌细胞系BT474、SKBR3；Luminal型乳腺癌细胞系T47D、MCF-7和ZR751进行了不同细胞中Trop2基因表达水平的检测，检测方法为Westernblot，检测结果如图9所示，发现Trop2在乳腺癌细胞系中比正常乳腺上皮细胞系MCF10A和HMEC高表达，其中在TNBC细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-436、 MDA-MB-468和BT549中表达量最高，在HER2+乳腺癌细胞系BT474和SKBR3中表达量次之，在Luminal型乳腺癌细胞系T47D、MCF-7和ZR751中表达量最低。上述结果也表明 Trop2抗原作为乳腺癌的标志物而存在，且即使多种乳腺癌组织中都存在高表达的情况，但多种乳腺癌组织中高表达程度仍然是不同的，所以基于该结果，也表明Trop2抗原作为乳腺癌以及具体到三阴性乳腺癌都是可以作为一个靶点而存在。
二、亚细胞定位
在MDA-MB-231细胞系中检测了Trop2的亚细胞定位，结果如图10所示，发现Trop2主要定位于细胞质和细胞膜。结合本申请其他实施例中提及的胞内响应纳米粒子，进一步表明了Trop2抗体不仅有助于提高靶向性，且有助于靶向胞质并促进纳米粒子胞质内响应释放靶基因siRNA，减少对其他正常细胞、组织的毒副作用。
三、不同乳腺组织的IHC染色
本发明人从中山大学孙逸仙纪念医院收集了共79例福尔马林固定、石蜡包埋的乳腺组织样本，其中包括20例正常乳腺组织、22例Luminal型乳腺癌组织、14例Her2+乳腺癌组织和23例TNBC组织。
然后，对这些样本进行免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)染色，结果如图11所示，发现Trop2在乳腺癌组织中比正常乳腺组织高表达，并且在TNBC组织中表达量最高。通过该结果进一步证明了上述结果，其能作为乳腺癌以及三阴性乳腺癌中显著的标志物和靶点。
实施例4
负载Trop2抗体、siRNA的PDSA纳米材料的制备及性能检测
一、负载Trop2抗体、siRNA的PDSA纳米材料的制备
本实施例中使用纳米沉淀法制备载有Trop2抗体和siRNA的PDSA纳米粒子。
(1)选取二甲基甲酰胺作为溶剂，分别配置PDSA、聚乙二醇修饰的磷脂(PEG-lipid) 和能够特异性连接Trop2抗体的聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯(PEG-NHS)溶液。
(2)取PDSA溶液、PEG-lipid溶液、PEG-NHS溶液、siRNA水溶液、Trop2抗体与阳离子脂质体混合，在搅拌条件下，逐滴加入到去离子水中，获得纳米溶液。本实施例中的siRNA为：正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的siRNA。
(3)将纳米溶液转移至超滤膜中(EMD Millipore,MWCO 100K)，离心分离纳米粒子，使用去离子水洗涤两次后，收集纳米粒子并将其分散到1mL PBS缓冲溶液中备用。
在获取的纳米粒子后，本实施例还使用Nano-ZS ZEN3600型粒径仪测定纳米粒子的尺寸，结果如图12所示，表明形成的纳米粒子粒径范围为20～150nm之间，且进一步地尺寸集中分布于40～80nm之间；使用Tecnai G20 S-TWIN型的TEM观测纳米粒子的形貌，结果如图13 所示，纳米粒子近乎球形状态而存在，该结构有助于穿过多种生物屏障。
二、高分子材料PDSA及其纳米材料还原性检测分析
(1)取一定量的高分子材料PDSA和GSH，溶于DMF和H2O的混合溶液中(体积比为9:1，最终GSH浓度为10mM)。在不同时间点，取出100μL溶液，使用尺寸排除色谱检测评估PDSA的还原响应性；结果如图14所示，表明PDSA具有较好的还原响应性。
(2)对于载有Trop2抗体和siRNA的纳米粒子，将其分散在GSH的水溶液中，于不同时间点使用动态光散射检测纳米粒子的尺度，结果如图15所示。
三、纳米粒子控制释放检测
按照上述制备方法制备载有Trop2抗体和荧光染料标记siRNA的PDSA纳米粒子。多次洗涤后，将其分散在1mL PBS中。将该纳米粒子溶液转移至透析管中，随后将透析管放置于37℃含不同浓度谷胱甘肽的PBS水溶液中(GSH为0、1mM、10mM)。在指定的时间点，取出5μL纳米粒子溶液并加入到100μL二甲亚砜溶液。使用荧光分光光度计测量荧光染料的荧光强度。siRNA的累计释放率按下面公式计算：累计释放量(％)＝(Mt/M∞)×100；其中 Mt是在指定时间点从纳米粒子里释放出的siRNA，M∞是纳米粒子里负载的siRNA总量。从而获得如图16所示纳米粒子的siRNA的控制释放曲线，从图16可知，包载siRNA的纳米粒子相比于低谷胱甘肽浓度下在较高谷胱甘肽浓度下具有明显释放量，验证了纳米粒子的释放能力以及应用在细胞内的潜力。
四、负载Trop2抗体和siRNA的PDSA纳米粒子被细胞摄取的能力检测
将细胞接种在6孔板中，加入2mL含10％胎牛血清的培养基孵育24小时，让其充分贴壁。随后分别加入荧光染料标记siRNA(Naked siRNA)、载有荧光染料标记siRNA的纳米粒子(Nano)以及同时载有Trop2抗体和荧光染料标记siRNA的纳米粒子(Nano-Trop2)。孵育4小时后，移去培养基并用PBS冲洗细胞三次。使用流式细胞仪分析纳米粒子的细胞摄取情况，结果如图17所示，应用纳米粒子的两个组别都具有较佳的对应细胞摄取能力，且 Nano-Trop2组别表现的对应细胞摄取能力最佳，表明本申请中的纳米粒子相比于裸露的 siRNA更有利于被细胞摄取，从而有助于直接作用细胞，提高包裹物的作用效果。
实施例5
负载Trop2抗体、靶基因siRNA的PDSA纳米材料性能检测及肿瘤抑制效果检测
本实施例在上述实施例1～4的基础上，基于Uc003xsl.1靶基因设计siRNA，并采取如实施例4的制备方法制备同时含有负载Trop2抗体、靶基因siRNA的PDSA纳米粒子，检测该载体的性能以及基于该载体的靶基因siRNA作用效果。本实施例中所指的siRNA为靶基因Uc003xsl.1siRNA，本实施例中的siRNA为：正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的siRNA。
一、纳米粒子的目标基因沉默效率及沉默后细胞功能变化
将乳腺癌MDA-MB-231细胞接种在6孔板中，加入2mL含10％胎牛血清的培养基孵育24小时，让其充分贴壁。随后加入单独载有不同浓度siRNA(Nano)或同时载有Trop2抗体和不同浓度siRNA的纳米粒子(Nano-Trop2)。孵育24小时后，将细胞换液再孵育48小时。提RNA后进行qPCR检测lncRNA Uc003xsl.1的表达，发现靶向Trop2能明显提高对目标基因的沉默效率。
确定该纳米粒子对目标基因的高效沉默作用后，研究其对细胞功能的影响。发现用载有Trop2抗体和siRNA的纳米粒子敲低Uc003xsl.1后，能够显著抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭。图18是纳米粒子在不同siRNA浓度下敲低目标基因的效率，从图中可知，靶向Trop2且负载siRNA的纳米粒子相比于单独载有siRNA的纳米粒子，沉默的效果更显著，表明Trop2抗体能明显提高对目标基因的沉默效率；图19是载有Trop2抗体和siRNA的纳米粒子对细胞迁移的影响，其中Nano-siCTL为阴性对照的包裹siCTL的纳米粒子，Nano-siuc003为包裹Uc003xsl.1siRNA的纳米粒子(下文以siuc003代表Uc003xsl.1siRNA)，Nano-Trop2-siuc003代表同时负载Trop抗体和Uc003xsl.1siRNA的纳米粒子，且上述、下述纳米粒子均通过PDSA进行包裹；图20是载有Trop2抗体和siRNA的纳米粒子对细胞侵袭的影响。图19、20表明siuc003的纳米粒子、同时负载Trop2和siuc003的纳米粒子均对肿瘤细胞侵袭、迁移产生抑制，且同时负载Trop2和siuc003的纳米粒子抑制效果最明显。
二、纳米粒子体内代谢性能检测
把9只健康裸鼠分3组，分别通过尾静脉注射荧光染料标记siRNA(Naked siRNA)、载有荧光染料标记siRNA的纳米粒子(Nano)以及同时载有Trop2抗体和荧光染料siRNA 的纳米粒子(Nano-Trop2)，然后在不同时间点收集眼眶静脉血进而检测荧光强度，结果如图21所示，发现该纳米粒子有较长的血液循环半衰期，表明本申请中的纳米粒子能较长的停留于体内，有助于纳米粒子的充分利用，也有助于提供长作用期，从而提高治疗、抑制效果。
三、纳米粒子肿瘤富集能力及体内分布情况评估
把9只裸鼠分3组，在背部皮下种植1×107的MDA-MB-231细胞，等待瘤子长大到体积约150mm3时我们分别给予荧光染料标记siRNA(Naked siRNA)、载有荧光染料标记siRNA的纳米粒子(Nano)以及同时载有Trop2抗体和荧光染料siRNA的纳米粒子(Nano-Trop2)，24小时后对裸鼠进行活体成像检测纳米粒子在肿瘤部位富集情况，接着取肿瘤、肾、肺、脾、肝、心和肌肉等重要器官并检测其荧光强度，发现靶向Trop2的纳米粒子在肿瘤部位有更强的富集能力，且主要经肾脏代谢。图22为纳米粒子的肿瘤富集情况；图23为纳米粒子的体内分布情况，图中siuc003 NPs代表载有荧光染料标记siRNA的纳米粒子(Nano)组、 siuc003/Trop2 NPs代表同时载有Trop2抗体和荧光染料siRNA的纳米粒子组。
四、纳米粒子体内抑制肿瘤转移效果
把9只裸鼠分3组，通过尾静脉注射2×106表达荧光素酶的MDA-MB-231细胞。当用生物荧光成像技术检测到肺转移灶时(约7周)，分别通过尾静脉注射载有阴性对照的siCTL的纳米粒子(siCTL NPs)、载有siRNA的纳米粒子以及同时载有Trop2抗体和siRNA的纳米粒子，隔天注射一次(siuc003为1nmoL)，连续注射3次，3周后取肺组织并用4％多聚甲醛固定，进而对肺转移灶进行分析，发现siuc003/Trop2 NPs组抑制肺转移的能力最强。图24 为各组纳米粒子治疗后的肺转移情况。图中siuc003 NPs代表载有siRNA的纳米粒子组、siuc003/Trop2 NPs代表同时载有Trop2抗体和siRNA的纳米粒子组。
五、纳米粒子的体内毒性测试
把25只裸鼠分5组，我们分别给予PBS200uL(Control)、单纯的纳米材料(Nano)、载有Trop2抗体的纳米粒子(Nano-Trop2)、载有siRNA的纳米粒子以及同时载有Trop2抗体和siRNA的纳米粒子。隔天尾静脉注射200uL(si003为1nmoL)，注射3次后观察约3周，先对各组裸鼠进行眼静脉取血，检测各组的肝肾功能，之后拉颈法处死裸鼠，收集各组裸鼠心，肝，脾，肺，肾等重要器官，进行石蜡包埋切片后病理组织染色，发现各治疗组中重要器官均无明显损伤，表明本申请中的纳米粒子及其包裹物具有安全性，有助于后续实际的临床应用。图25为经各组纳米粒子治疗后裸鼠的肝肾功能；图26为经各组纳米粒子治疗后裸鼠心，肝，脾，肺，肾的病理组织染色。图中siuc003 NPs代表载有荧光染料标记siRNA的纳米粒子(Nano)组、siuc003/Trop2 NPs代表同时载有Trop2抗体和荧光染料siRNA的纳米粒子组。PBS组、单纯的纳米材料组、仅载有Trop2抗体的纳米粒子组均对器官组织无影响，图中未示出。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学孙逸仙纪念医院
<120> 靶向肿瘤细胞表面Trop2蛋白的肿瘤治疗纳米药物及其制备方法
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1917
<212> DNA
<213> 未知
<400> 1
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agggctctga attgtcttcc cgcagtgaaa tcacttgtct attgctgagc caagaatttg 660
actctgagca tctaggatga gaaagaagaa ctggcaccta cgccatctct gcccctcggg 720
actgactatt ttggcccagt ttcctcaaca atgaaatggg actaattatc ccaggtcaca 780
cttctctctg ggcttaccct gggaatcaga tgattgagct ttggatctca ctctgttgcc 840
caggctggaa tgcagtgata cgatcatgat tcactgcagc ctcaaactcc tgggttcaag 900
taaccctccc acctcagctt tctgagtaac tgggactaca gaatgcccca ccccacttag 960
tccatagtga tgcccacctg tggttaatgg agctgaggct gctggaccaa agggaggaag 1020
tctgttaggc atatgtggaa cccaaaagag gaacttcatc aactgtcatg gacagctctg 1080
ccactttgtg accctgtgga ctttttggga agtgtttttg tggttcacca gtctctcatt 1140
aggcaaggcc atttgtcctg ggttggtctt cttcattggt ggaaagtaca gctgggagat 1200
ttggaatggt tgcagattga cttgactctc ataaggaact gccaccatga gcttttgggg 1260
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cattttgagt catcactggc agcagatttc tgttgacaac ttgagcaact tcagaatgaa 1380
gaagccatct tcatctctca catgaatatg actttgggta aatcatctcg aaatctgaac 1440
ccatggttgt gatccacact cctcctgagt tctgattttt agtgtaacct ttttcttctc 1500
attttttctt ctttgtgcat ctcttaagga ggtttttaaa atctcataat taaaaaattt 1560
atttcttcaa aactttttat tttgaaatca ctgtaaattc acatacattt gtataaaatg 1620
ccacagaaaa atcctgtgtg ccttttactc agtttattct aatgataaca tccttaaaga 1680
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ttaattgtct ggatatacca tagcttattt atccattcac gtattgaagg atgttctagt 1860
gcttttaagt tttggcaatt atgaataaag ctgctgtata cattcaaaaa aaaaaaa 1917
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaaaguacag cugggagaut t 21
<210> 3
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccaucuucau cucucacaut t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
augugagaga ugaagauggt t 21

Claims (13)

1.一种纳米药物，其特征在于，包括治疗肿瘤的主药、包裹在主药外且在细胞质内谷胱甘肽浓度下分解的高分子聚合物PDSA以及与PDSA和/或主药连接的Trop2抗体，所述主药为siRNA分子，所述siRNA沉默长链非编码RNA的表达，所述长链非编码RNA的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种纳米药物，其特征在于，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述siRNA的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；或，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述siRNA的反义链的核苷酸序列如SEQID NO.5所示。
3.权利要求1～2任一项所述的纳米药物在制备治疗乳腺癌的药物中的用途，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述治疗乳腺癌的药物为抑制三阴性乳腺癌侵袭转移的药物。
5.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1～2任一项所述的纳米药物。
6.一种权利要求1～2任一项所述的纳米药物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
S1、将胱氨酸二甲酯盐酸盐加入至脂肪二酸与三乙胺的混合溶液中，合成PDSA高分子聚合物；
S2、配置聚乙二醇修饰的磷脂(PEG-lipid)和能够特异性连接Trop2抗体的聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯溶液(PEG-NHS)；
S3、基于纳米沉淀法利用PDSA溶液、PEG-lipid溶液、PEG-NHS溶液、siRNA主药水溶液、Trop2抗体制备负载Trop2抗体和主药的PDSA纳米药物；所述siRNA主药沉默长链非编码RNA的表达，所述长链非编码RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
7.长链非编码RNA在制备诊断、治疗三阴性乳腺癌的药物中的用途，所述长链非编码RNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
8.一种抑制剂在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的用途，所述抑制剂抑制长链非编码RNA基因的表达，所述长链非编码RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述治疗三阴性乳腺癌的药物为抑制三阴性乳腺癌侵袭转移的药物。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述抑制剂为siRNA分子。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述siRNA的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；或，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述siRNA的反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
12.一种药物组合物，其特征在于，包括抑制长链非编码RNA基因表达的抑制剂，所述长链非编码RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
13.根据权利要求12所述的一种药物组合物，其特征在于，还包括纳米粒子载体，所述抑制剂为siRNA分子，纳米粒子载体包含PDSA、Trop2抗体，且PDSA包裹于抑制剂外，Trop2抗体与PDSA和/或抑制剂连接。
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