CN113151123B - 一种低温产纤维素酶和木聚糖酶的蜡样芽孢杆菌 - Google Patents
一种低温产纤维素酶和木聚糖酶的蜡样芽孢杆菌 Download PDFInfo
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Abstract
一种低温下产纤维素酶和木聚糖酶的蜡样芽孢杆菌，保藏于中国典型培养物保藏管理中心，保藏地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路299号，分类名为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）TK‑2，保藏编号为CCTCC NO：M2021433，保藏日期为2021年4月22日。蜡样芽孢杆菌TK‑2具有低温耐受性，适应在较低温度下生长和产酶，尤其15℃低温下生产的木聚糖的酶活达到37℃下的2.3倍，所产的木聚糖酶的酶活可达到60.57IU/mL，纤维素酶（内切纤维素酶）的酶活为28.2IU/mL，所产的木聚糖酶和纤维素酶在较低催化温度下依然具有高酶活力，且具有优异的pH耐受性，在弱酸性、中性及碱性环境下均有较好的酶活力。
Description
技术领域
本发明涉及微生物工程技术领域，具体涉及一种低温产纤维素酶和木聚糖酶的蜡样芽孢杆菌。
背景技术
木聚糖(xylan)是一种多聚五碳糖，是植物细胞壁中半纤维素的主要成分，是自然界除纤维素之外另一丰富的再生多糖。木聚糖酶(xylanase)可将木聚糖转化为低聚木糖和木糖，在农业、能源、饲料、造纸、食品等领域具有广阔的应用前景。木聚糖酶来源广泛，其中利用微生物生产的木聚糖酶是主要的来源之一。当前，由于产木聚糖酶菌株种类有限，生产成本高，菌株产酶能力不够高效稳定等缺点制约着木聚糖酶的工业化应用。因此，开发出具有高活性、作用范围广的木聚糖酶新菌系具有重要的意义。
纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单体酶，而是其协同作用的多组分酶系。
蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)又称仙人掌杆菌，是一类兼性厌氧或好氧菌，广泛分布于植物、土壤和海洋中。随着对蜡样芽胞杆菌研究的深入，其功能和生理特性也逐一被发掘。蜡样芽胞杆菌有强大的生存能力，可产生抑菌物质，在生长过程中竞争性抑制有害微生物的生长。此外，蜡样芽胞杆菌还分泌大量高活性酶，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶和半纤维素酶，在食品、能源、纺织、医药和农业中具有潜在的应用价值。
自然环境中存在多种多样的微生物，但是大多都由于环境温度或菌体生长速度的限制而使得酶活效果大打折扣，通常温度较低，微生物的生长会受到抑制，产酶酶活较低，尤其在北方长期在寒冷环境中，芽孢杆菌的生存的产酶研究很少。鉴于此，对于低温环境中高效生长并产酶的微生物的研究至关重要。
发明内容
基于上述问题，本发明目的在于提供一种低温下高产纤维素酶(内切纤维素酶)和木聚糖酶的蜡样芽孢杆菌。该蜡样芽孢杆菌在较低温度下高效生长，同时高产纤维素酶(内切纤维素酶)和木聚糖酶。
本发明目的通过如下技术方案实现：
一种低温产纤维素酶和木聚糖酶的蜡样芽孢杆菌，其特征在于：所述蜡样芽孢杆菌保藏于中国典型培养物保藏管理中心，保藏地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，分类名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)TK-2，保藏编号为CCTCC NO：M2021433，保藏日期为2021年4月22日。
进一步，上述蜡样芽孢杆菌TK-2的发酵温度为10～20℃，优选15℃。
进一步，所述蜡样芽孢杆菌TK-2生产的纤维素酶和木聚糖酶的酶解温度为 30～70℃。
进一步，所述蜡样芽孢杆菌TK-2生产的木聚糖酶的酶解pH为4～10，pH 优选为4～7，蜡样芽孢杆菌TK-2生产的纤维素酶的酶解pH为5～11，pH优选 6～10。
本发明具有如下技术效果：
本发明中的蜡样芽孢杆菌TK-2具有低温耐受性，适应在较低温度下生长和产酶，生长和产酶温度低至15℃，尤其15℃低温下生产的木聚糖的酶活达到37℃下的2.3倍，所产的木聚糖酶的酶活可达到60.57IU/mL，纤维素酶(内切纤维素酶)的酶活为28.2IU/mL，所产的木聚糖酶和纤维素酶在较低催化温度下依然具有高酶活力，且具有优异的pH耐受性，在弱酸性、中性及碱性环境下均有较好的酶活力。
附图说明
图1：菌株TK-2菌落形态及刚果红透明圈情况。
图2：发酵温度为15℃时菌株TK-1和菌株TK-2的生长曲线。
图3：发酵温度对菌株TK-2产酶的影响。
图4：反应温度对菌株TK-2酶活力的影响。
图5：反应pH对菌株TK-2酶活力的影响。
图6：菌株TK-1和菌株TK-2生产的纤维素酶和木聚糖酶的酶活对比。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
实施例1：原始菌株TK-1的筛选及鉴定
(一)菌株的分离
(1)采集长白山自然保护区林区5g土样，溶于100mL配制的盐溶液，于 10℃，180rpm下振荡培养2～4h，盐溶液是0.006mM FeSO4·7H2O；0.01mM CaCO3·7H2O；0.08mMMgSO4·7H2O；0.07mM MnSO4·7H2O和0.006mM ZnSO4·7H2O组成。
(2)将混匀的土样盐溶液1mL进行不同梯度(10-2、10-3、10-4)稀释，取200ul的稀释液分别涂布于R2a固体平板中，放置于10℃恒温培养箱中静置培养7～10d，固定平板中含有0.5g酵母浸出粉、0.5g蛋白胨、0.5g酪蛋白水解物、0.5g葡萄糖、0.5g可溶性淀粉、0.3g磷酸二氢钾、0.024g无水硫酸镁、 0.3g丙酮酸钠、15.0g琼脂、1000蒸馏水，最终pH 7.2±0.2。
(3)之后根据菌落形态、颜色、大小及光泽度，进行不同的单菌落的挑取。
(二)菌株TK-1的筛选
(1)将挑取的单菌落用生理盐水(0.8％的氯化钠溶液)溶解，用接种环沾取适量菌液在LB固体培养基进行划线培养，经多次传代，结合显微镜观察，挑取菌落形态单一且状态一致的单菌落置于LB液体培养基中，在180rpm和10℃的条件下摇瓶培养3～4d。
(2)取摇瓶培养的菌液150ul，测定其OD600值，利用牙签沾取OD600在 0.6-0.8之间的菌液，点样至含有木聚糖和酵母提取物的木聚糖-刚果红固体培养基中，将接菌的固体平板转移至10℃恒温培养箱中，静置培养，所述木聚糖-刚果红固体培养基是由1.5％商品木聚糖、4g/L硫酸铵、0.5g/L磷酸二氢钾、2g/L 磷酸氢二钾、0.1g/L MgSO4·7H2O、6g/L氯化钠、0.1g/L氯化钙、20g/L琼脂、 0.5g/l酵母提取物和0.2g/L刚果红组成。
(3)对培养7～10d的木聚糖-刚果红固体培养基进行肉眼观察，主要对菌落生长状态及会否产生透明圈进行考察。
(4)挑取生长良好且透明圈最明显的菌株，命名为TK-1，接种至LB液体培养基中，180rpm，10℃下振荡培养，将对数期菌液进行甘油保菌(600uL菌液中加入400uL质量分数为50％甘油)。
(5)将菌株TK-1(10℃、180rpm)进行发酵培养，并取样分别进行内切纤维素酶活力和木聚糖酶活力的测定。内切纤维素酶和木聚糖酶活力采用DNS 法，取40μL酶液加入80μL含有0.2g/mL的木聚糖或纤维素底物中，50℃水浴10min，加入DNS试剂240μL，沸水煮沸5min，对照葡萄糖/木糖标准曲线，得生成的还原糖浓度。
菌株TK-1产酶活力如表1所示。
表1：
| 菌株 | 内切纤维素酶(IU/mL) | 木聚糖酶活(IU/mL) |
| 菌株TK-1 | 24.84 | 43.038 |
通过检测各酶活可知，本发明的菌株TK-1具有在低温环境下产纤维素酶和木聚糖酶的能力(在催化温度为50℃下检测)。
(三)鉴定
菌株TK-1用LB平板培养出来适量菌体，通过革兰氏染色，观察菌株的形态、颜色等，菌株TK-1为一种棒状细菌，具有大体积，不透明，白色毛玻璃状的粗糙表面。并对菌株进行生理化鉴定，测定的生理化指标如表2所示，“+”代表阳性，“-”代表阴性。
表2：菌株TK-1生理化指标的测定
| 试验 | Bacillus sp.TK-1 | 试验 | Bacillus sp.TK-1 |
| 革兰氏染色 | + | 吲哚产生 | + |
| 荧光色素 | + | 明胶液化 | + |
| 甲基红 | + | 马尿酸 | + |
| 接触角 | + | V-p测定 | + |
| 脓青素 | + | 硝酸盐还原 | + |
| 淀粉水解 | + | 甘露醇酸生产 | - |
通过使用blastn与NCBI数据库中所有可用的16S rDNA序列进行比较，相似性最高的结果是芽孢杆菌，结合形态，生理和生化鉴定，其中与蜡样芽孢杆菌的基因组序列上90％以上的相似度，进一步确定菌株TK-1为蜡样芽孢杆菌。
实施例2：原始菌株TK-1诱变处理
采用ARTP诱变，诱变步骤如下：
功率100W，诱变工作气体为氦气，气流量12s/m，距离为3mm下进行照射，进行诱变，将诱变后的菌悬液稀释后，取100μL稀释液在PDA平板中涂布，置于培养箱中培养。取培养至对数期(OD600在0.6～0.8之间)的菌液1mL 于1.5ml的离心管中，10000rpm，离心2min，弃上清，菌体用生理盐水重悬2 次得细胞悬液，稀释调节细胞数在106-108个/ml。
取细胞悬液10uL均匀涂布于金属载片(已灭菌)表面，调整ARTP仪器参数：
将处理后载片转移至含有1mL生理盐水的离心管中，振荡1min后，放置振荡培养箱(15℃，22rpm)振荡培养1h。
然后对菌悬液进行不同梯度稀释，并取150uL的稀释菌悬液进行LB平板涂布后，静置培养3-7d。将LB突变株生长快速的菌株点样至羧甲基纤维素/木聚糖-刚果红固体平板，进行透明圈观察。对透明圈大的菌株进行摇瓶发酵，用于酶活力检测。
实施例3：蜡样芽孢杆菌TK-2的生长及产酶分析
(一)蜡样芽孢杆菌TK-1和TK-2的生长特性分析
(1)将诱变得到的在低温下生长良好且产纤维素酶和木聚糖酶的菌株TK1 和突变菌株TK-2分别接种至LB液体培养基中，在转速为180rpm，不同温度 (10、15、20、25、37℃)下进行振荡培养，定点取样，测菌液OD600的值。
(二)蜡样芽孢杆菌TK-1和TK-2产酶特性分析
(1)将对数期菌液接种于发酵产酶培养基(硫酸铵4g/l，磷酸氢二钾2 g/L，七水硫酸镁0.1g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨1g/L，木聚糖/CMC-Na 1.5％)中，接菌量为200uL，转速为180rpm，不同温度(10、15、20、25、37℃) 下进行振荡培养48h，取样保存于-20℃冰箱中。
(2)将保存的发酵液室温下冻融后，8000rpm，离心5min，取发酵上清液进行内切纤维素酶活力和木聚糖酶活力测定，计算相对酶活力。
将菌株TK-1在发酵温度10℃、15℃、20℃、25℃及37℃培养下，观察其生长状况，通过结果分析，对于菌株TK-1的生长来讲，10～15℃是菌株TK-1 最佳的生长温度。如图3所示，菌株TK-1的相对酶活力在发酵温度为15～20℃之间最佳(于酶催化温度为50℃下检测)，与生长特性结果相比较后，综合确定菌株TK-1的最佳生长及产酶温度为15℃。发酵温度对经过诱变处理后得到的菌株TK-2的生长及产酶的影响与突变前基本一致，15℃也是其最优生长及产酶温度，其在15℃下的生长曲线如图2所示。
实施例4：蜡样芽孢杆菌TK-2的酶学性质表征
酶学性质表征过程中，是以内切纤维素酶来表征纤维素酶。
(1)保持其它测酶活力步骤不变，改变酶催化温度(30、40、50、60、70℃)，分别检测其对应催化温度下蜡样芽孢杆菌TK-2产酶的酶活力。并计算相对酶活力。
结果如图4所示，催化温度在30℃-40℃之间，菌株TK-2产生的木聚糖酶和纤维素酶的酶活力较高，这为后续低温酶解提供参考。
(2)保持其它测酶活力步骤不变，改变酶催化pH值(3、4、5、6、7、8、 9、10)，分别检测其对应pH值下的酶活力。并计算相对酶活力。
结果如图5所示，木聚糖酶最佳反应pH为中性左右，高于或低于7，酶活力有一定程度损失，但整体损失较少，因此当pH在4～10之间，木聚糖酶均具有较优异的酶活性质，而纤维素酶在pH为5以上，均具有优异的酶活性质，说明菌株TK-2产酶的酶具有较好的pH耐受性。
酶活的单位定义是：国际上酶分钟产生1μmol葡萄糖或木糖的酶量定义为一个酶活单位，其计算公式如下：
A：酶活，单位是IU/mL；
C：反应中产生的葡萄糖或木糖浓度，单位是mg/mL；
V1：反应体系的体积，单位是mL；
D：酶液的吸湿稀释倍数；
1000：将葡萄糖或木昂的mg数换算成μg数；
M：生成的单糖的摩尔质量，单位是g/mol，葡萄糖和木糖分别是180和150；
V2：加入酶液的体积，单位是mL；
经过计算菌株TK-1和TK-2的酶活，蜡样芽孢杆菌TK-2的木聚糖酶和纤维素酶(内切纤维素酶)的酶活分别为60.57IU/mL和28.2IU/mL，较诱变前的菌株TK-1(木聚糖酶为43.038IU/mL、纤维素酶为24.84IU/mL)分别提高了 40.75％和13.5％，以上酶活均是在催化温度为50℃下测得，如图6所示。可见，本发明的蜡样芽孢杆菌TK-2在低温15℃时同时具有高效产木聚糖酶和纤维素酶，所产的木聚糖酶和纤维素酶具有优异的pH耐受性和温度适应性，用于低温降解木质纤维素具有极大潜能。
Claims (1)
1.一种低温产纤维素酶和木聚糖酶的蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）TK-2，其特征在于：所述蜡样芽孢杆菌保藏于中国典型培养物保藏管理中心，保藏地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC NO：M2021433，保藏日期为2021年4月22日。
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| GR01 | Patent grant | ||
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