CN113122605B - 一种生产抗cd47抗体的培养基及发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种生产抗CD47抗体的培养基及其发酵方法，本发明基础培养基中包含氨基酸、葡萄糖、维生素、微量元素、无机盐和其他物质；发酵过程中适时进行补料培养，补料培养基包括氨基酸组分。本发明将自主优化的培养基代替商业化的培养基，更好地促进细胞生长，有效提高了抗CD47抗体的表达量。并在发酵过程中调整补料工艺，有效降低了蛋白酸碱峰含量，提高了目的蛋白纯度。

Description

一种生产抗CD47抗体的培养基及发酵方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种生产抗CD47抗体的培养基及发酵方法。

背景技术

单克隆抗体具有高特异性、低副作用、效果优异的特点，在治疗和诊断中应用越来越广泛。分化簇蛋白47(CD47)也称为整合素相关蛋白(IAP)、卵巢癌抗原OA3和Rh-相关的抗原，是一种广泛表达在细胞膜表面的五次跨膜蛋白(pentaspan transmembrane)超家族成员。CD47与巨噬细胞上的SIRP-α(信号调节蛋白-α)相互作用，从而抑制吞噬作用。该途径的癌细胞逃避吞噬作用并由此促进癌细胞存活(Jaiswal，S.等人，Trends in Immunol31:212-219,2010)，这是最新发现的肿瘤免疫逃逸机制，因此治疗学上靶向CD47已广泛应用于多种癌症。

CD47广泛的表达于细胞的表面，可与SIRPα、血小板反应蛋白(thrombospondin-1，TSP1)以及整合素相互作用，介导凋亡、增殖、免疫等一系列的反应。TSP1与细胞的增殖，生长和分化有关，CD47与TSP1的结合在调节细胞迁移，细胞增殖和凋亡以及促进血管生成和炎症反应中发挥重要作用。此外CD47是细胞表面一个重要的自我识别标记。CD47可以与巨噬细胞表面SIRPα结合，磷酸化其免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)，随后招募SHP-1蛋白，产生一系列的级联反应抑制巨噬细胞的吞噬作用。

不同的研究表明，几乎所有的肿瘤细胞和组织都高表达CD47。肿瘤细胞表面高表达的CD47通过与巨噬细胞表面SIRPα结合，释放“不要吃我”的信号，导致肿瘤组织浸润区的巨噬细胞不但同肿瘤细胞和谐相处，而且还会通过促进肿瘤内血管增殖，抑制效应T细胞发挥作用，促进肿瘤细胞扩增和生长。

目前已有报道了多个抗CD47抗体，美国专利US2015/0183874A报道了衍生自B6H12的人IgG1型嵌合单克隆抗体和通过CDR移植产生的人源化B6H12抗体，其相比较于已知抗体具有更低的免疫原性。美国专利US9045541报道了不显著引起血凝反应的抗CD47抗体，并且该抗体与已知抗体相比，在肿瘤模型中显著有效，例如提高巨噬细胞的吞噬肿瘤细胞的能力。

现有技术中对抗CD47抗体的生产方法报道较少。CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞，Chinese Hamster Overy)是生产单克隆抗体蛋白药物应用最为广泛的宿主细胞，有近70％已经上市的治疗性蛋白是由CHO细胞表达生产的。相对于其他细胞表达系统，CHO细胞具有与人相似的翻译后修饰、历史背景清晰、细胞稳健、生长迅速等优势。

然而由于单克隆抗体具有复杂的大分子结构，在生产和储存过程中会产生大量修饰。比如糖基化、氧化、脱酰胺等，使得抗体产生大量的异质性，也被称为电荷异构体。采用CEX-HPLC或CIEF方法进行分析会得到一系列的峰，主要分为三类：酸性峰、主峰、碱性峰。电荷异构体对单抗稳定性及生物学功能的发挥具有重要的影响，因而其称为单抗生产工艺中需要控制的非常重要的质量属性，也是生产工艺稳定性的重要反应指标。电荷异构体产生酸碱峰，碱性峰主要来源于C末端赖氨酸去除不完全、N末端焦谷氨酰胺环化胺等。酸性峰一般来源于N-糖末的唾液酸化修饰、氨基酸残基的脱酰胺等。但此酸性峰和碱性峰对应的电荷异构体具有相似的化学性质，通过后期纯化分离控制电荷异质性具有一定的难度，而通过控制细胞培养工艺流程来控制抗体电荷异质性的方法也具有一定的挑战性，成为本领域一直难以解决的问题。

CN105779394A公开了一种在培养基中添加谷氨酰胺降低酸性峰的含量的方法，然而谷氨酰胺对后期的工艺的稳定性带来非常不利的影响，在培养过程中加入谷氨酰胺后，谷氨酰胺易降解，产生大量铵离子，对细胞生长表达带来不利的影响。此外，对于CHO表达系统，加入谷氨酰胺仅能降低所分泌抗体的酸性峰的含量，无法根据需要提高抗体酸性峰的含量。

CN10328259A公开了一种动物细胞的培养方法，以通常的培养温度培养一定时间之后，通过使培养温度降低至25～35℃而继续培养来抑制所述酸性峰的产生，发明人采用此方法尝试，这种方法针对抗CD47抗体来说并不适用。

CN104560882A公开了一种降低重组人肿瘤坏死因子受体-Fc重组蛋白(rhTNFR-Fc)抗体酸性变体含量的CHO细胞培养工艺，该方法通过在CHO细胞培养工艺过程中使用不同的市售基础培养基和浓缩培养基来降低目标蛋白的酸性峰水平。市售培养基成分固定，并不针对特定目的蛋白，对抗CD47抗体来说，降低酸性峰水平有限，且目的蛋白产量不能得到提高。

CN108823267A公开了一种调节CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法，将CHO-K1细胞接种到培养基中进行细胞培养，在细胞培养过程中添加酪氨酸或/和半胱氨酸，以提高或降低抗体酸性峰含量。

哺乳动物细胞培养对于培养环境的要求非常苛刻，同时对表达抗体的质量要求极其严格，因此如何通过工艺条件优化达到产品的质量要求显得尤为关键。如何提高抗体表达量同时又降低酸性、碱性变异体含量的方法是本领域一直难以解决的问题之一。

发明内容

基于现有技术的不足，本发明目的在于提供一种能降低酸性和碱性变异体含量的CHO细胞培养工艺，特别涉及一种抗CD47抗体基于CHO表达系统的细胞培养工艺。

为了实现上述目的，本发明提供一种生产抗CD47抗体的培养基，以及利用该培养基生产抗CD47抗体的方法，本发明通过对培养基进行优化，有效提高了抗CD47抗体的表达量，并且降低了酸性和碱性变体含量。

本发明的技术方案如下：

一种生产抗CD47抗体的培养基，所述培养基包含氨基酸8～12g/L、葡萄糖6-10g/L、维生素0.8～1.2g/L、微量元素0.1-0.2g/L、无机盐6-12g/L、其他物质2～4g/L。

优选地，所述培养基中氨基酸包括L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-丝氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、磷酸化-L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-蛋氨酸、S-磺基-L-半胱氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-赖氨酸。

优选地，所述培养基中维生素为生物素、D-泛酸钙、叶酸、环己六醇、烟酰胺、盐酸吡多醇、核黄素、维生素B12、盐酸硫胺素、硫辛酸、叶黄素。

优选地，所述培养基中微量元素为六水合三氯化铁、氯化胆碱、亚硒酸钠、氯化锰、四水合钼酸铵、无水氯化锌、二水合氯化铜、氯化钴、硫酸铜、碘化钾、氯化铝。

优选地，所述培养基中无机盐为无水碳酸氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化钾、氯化钙、二水合柠檬酸三钠、硫酸钾、氯化镁。

优选地，所述培养基中其他物质为P-F68(聚氧丙烯聚氧乙烯嵌段型聚醚)、丁二胺、乙醇胺、丙酮酸钠。

进一步优选地，所述培养基包括如下表1所示的组分：

表1培养基配方

在一个优选的试验方案中，所述培养基包括如表2所示的组分：

表2

一种生产抗CD47抗体的补料培养基，包括如下的组分：L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-丝氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、磷酸化-L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-蛋氨酸、S-磺基-L-半胱氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-赖氨酸。

优选地，所述补料培养基中各组分的浓度为表1中对应组分浓度的5～12倍。

本发明的第二个目的是提供一种生产抗CD47抗体的方法，采用上述培养基克服了细胞生长带来的负面作用，有效地提高了抗体的表达量，并且降低了酸碱峰的含量，有效提高了目的抗体的纯度。

一种生产抗CD47抗体的方法，包括如下步骤：(a)提供包含编码抗CD47单克隆抗体目的基因的CHO细胞；(b)在本发明所述培养基中逐级放大培养所述细胞；(c)转至发酵罐中进行高密度培养，生长至一定阶段向发酵体系中流加补料培养基至培养结束。

优选地，步骤(c)中高密度培养步骤包括以下三个阶段：

(1)细胞生长阶段：用本发明所述培养基悬浮细胞培养，起始密度约为2～6×10⁵cells/mL，起始培养温度为37±0.5℃，pH为7.2±0.1。

(2)细胞生产抗体阶段：当细胞密度生长到5～7×10⁶cells/mL时，细胞培养进入细胞生产蛋白质阶段，流加补料培养基促进细胞表达抗体蛋白，每天流加量为培养物体积的2～3％；当细胞密度达到13～18×10⁶cells/mL降低培养温度至32±0.5℃，pH为6.90±0.05。

(3)当细胞培养14天或者细胞活力降低至90％以下时，停止流加补料培养基，结束培养。

优选地，(2)细胞生产抗体阶段，所述补料培养基组分为本发明所述基础培养基中的氨基酸，浓度为基础培养基中氨基酸浓度的5～12倍。

优选地，所述补料培养基组分和浓度如表3所述。

表3补料培养基配方

组分	浓度(mM)	组分	浓度(mM)
				L-天冬氨酸	25～60	L-脯氨酸	15～36
L-谷氨酸	20～48	磷酸化-L-酪氨酸	10～24
				L-天冬酰胺	25～60	L-缬氨酸	15～36
L-丝氨酸	25～60	L-蛋氨酸	7～16.8
				L-谷氨酰胺	30～72	S-磺基-L-半胱氨酸	5～12
L-甘氨酸	1.5～3.6	L-异亮氨酸	15～36
				L-组氨酸	5～12	L-亮氨酸	20～48
L-精氨酸	10～24	L-苯丙氨酸	5～12
				L-苏氨酸	15～36	L-色氨酸	10～24
L-丙氨酸	10～24	L-赖氨酸	20～48

进一步优选地，补料培养基是在本发明表2所述培养基的基础上，控制氨基酸浓度为基础培养基中氨基酸浓度的5～12倍，更加优选补料培养基中氨基酸浓度为8～10倍。

优选地，(2)细胞生产抗体阶段，补料培养基流加方式为半连续流加；进一步地，第一天流加量为培养物体积的2％，以后每天流加培养物体积的3％。

优选地，(2)细胞生产抗体阶段，搅拌转速180～250rpm，溶氧含量不低于35％，更加优选地，溶氧含量为35～60％。

一个优选的试验方案，一种生产抗CD47抗体的方法，包括如下步骤：提供包含编码抗CD47单克隆抗体目的基因的CHO细胞，在培养基中传代扩增所述细胞，每三天扩增一次，经过30mL、150mL、500mL三级转瓶扩增，细胞密度达到2～3×10⁶cells/mL，转至发酵罐中；发酵罐中进行高密度培养阶段，搅拌速度180～250rpm，溶氧含量大于35％，温度为37±0.5℃，pH为7.2±0.1，培养3～4天后当细胞密度达到5～7×10⁶cells/mL时，开始流加补料培养基，补料培养基为半连续流加方式，第一天流加量为2％培养物体积，以后每天流加3％培养物体积；培养6～7天后当细胞密度达到13～18×10⁶cell/mL时，降低培养温度至32±0.5℃，pH为6.9±0.05，流加培养过程中每天取样检测细胞密度与活力，当培养14天或细胞活力低于90％，停止流加补料培养基，培养结束。取样，经亲和层析纯化后测定抗CD47单克隆抗体的表达量、蛋白SEC纯度、酸碱峰。

本发明将自主优化的培养基代替商业化的培养基，更好地促进细胞生长，有效提高了抗CD47单克隆抗体的表达量。并在发酵过程调整补料工艺，有效降低了蛋白酸碱峰含量，提高了目的蛋白纯度。

具体实施方式

下面结合具体实施案例对本发明进行阐述，应该理解的是，以下实施例仅用于例证的目的，并不限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内做出的任何修改、等同的替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

以下实施例所用的试剂、原料除有特殊说明外，均可通过商业途径获得。

实施例1

提供包含编码抗CD47单克隆抗体目的基因的CHO细胞；在表2所述的基础培养基中以0.5×10⁶cells/mL传代扩增所述细胞，每三天扩增一次，经过30mL、150mL、500mL三级转瓶扩增，细胞密度达到2×10⁶cells/mL，转至5L发酵罐中；5L发酵罐中进行高密度培养阶段，初始培养体积3L，搅拌速度180～250rpm，溶氧含量35％，温度为37±0.5℃，pH为7.2±0.1，培养3～4天后当细胞密度达到6×10⁶cells/mL时，开始流加表4所述的补料培养基，第一天流加量为2％培养物体积，以后每天流加3％培养物体积；培养6～7天后当细胞密度达到18×10⁶cell/mL时，降低培养温度至32±0.5℃，pH为6.9±0.05，流加培养过程中每天取样检测细胞密度与活力，培养14天或者细胞活力低于90％，停止流加补料培养基，培养结束。培养过程细胞检测结果见表5，培养结束取样经亲和层析纯化后测定抗CD47单克隆抗体的表达量、蛋白SEC纯度、酸碱峰。

表4补料培养基配方

组分	浓度(mM)	组分	浓度(mM)
				L-天冬氨酸	40	L-脯氨酸	24
L-谷氨酸	32	磷酸化-L-酪氨酸	16
				L-天冬酰胺	40	L-缬氨酸	24
L-丝氨酸	40	L-蛋氨酸	11.2
				L-谷氨酰胺	48	S-磺基-L-半胱氨酸	8
L-甘氨酸	2.4	L-异亮氨酸	24
				L-组氨酸	8	L-亮氨酸	32
L-精氨酸	16	L-苯丙氨酸	8
				L-苏氨酸	24	L-色氨酸	16
L-丙氨酸	16	L-赖氨酸	32

表5实施例1细胞检测结果

实施例2

提供包含编码抗CD47单克隆抗体目的基因的CHO细胞；在表6所述的基础培养基中以0.5×10⁶cells/mL传代扩增所述细胞，每三天扩增一次，经过30mL、150mL、500mL三级转瓶扩增，细胞密度达到3×10⁶cells/mL，转至5L发酵罐中；5L发酵罐中进行高密度培养阶段，初始培养体积3L，搅拌速度180～250rpm，溶氧含量60％，温度为37±0.5℃，pH为7.2±0.1，培养3～4天后当细胞密度达到7×10⁶cells/mL时，开始流加表7所述的补料培养基，第一天流加量为2％培养物体积，以后每天流加3％培养物体积；培养6～7天后当细胞密度达到13×10⁶cell/mL时，降低培养温度至32±0.5℃，pH为6.9±0.05，流加培养过程中每天取样检测细胞密度与活力，培养14天或者细胞活力低于90％，停止流加补料培养基，培养结束。培养过程细胞检测结果见表8，培养结束取样经亲和层析纯化后测定抗CD47单克隆抗体的表达量、蛋白SEC纯度、酸碱峰。

表6基础培养基配方

表7补料培养基配方

组分	浓度(mM)	组分	浓度(mM)
				L-天冬氨酸	36	L-脯氨酸	24
L-谷氨酸	30	磷酸化-L-酪氨酸	18
				L-天冬酰胺	42	L-缬氨酸	18
L-丝氨酸	42	L-蛋氨酸	9.6
				L-谷氨酰胺	48	S-磺基-L-半胱氨酸	7.2
L-甘氨酸	2.4	L-异亮氨酸	24
				L-组氨酸	7.2	L-亮氨酸	36
L-精氨酸	14.4	L-苯丙氨酸	9.6
				L-苏氨酸	31.2	L-色氨酸	18
L-丙氨酸	18	L-赖氨酸	18

表8实施例2细胞检测结果

实施例3

提供包含编码抗CD47单克隆抗体目的基因的CHO细胞；在表9所述的基础培养基中以0.5×10⁶cells/mL传代扩增所述细胞，每三天扩增一次，经过30mL、150mL、500mL三级转瓶扩增，细胞密度达到2×10⁶cells/mL，转至5L发酵罐中；5L发酵罐中进行高密度培养阶段，初始培养体积3L，搅拌速度180～250rpm，溶氧含量40％，温度为37±0.5℃，pH为7.2±0.1，培养3～4天后当细胞密度达到5×10⁶cells/mL时，开始流加表10所述的补料培养基，第一天流加量为2％培养物体积，以后每天流加3％培养物体积；培养6～7天后当细胞密度达到18×10⁶cell/mL时，降低培养温度至32±0.5℃，pH为6.9±0.05，流加培养过程中每天取样检测细胞密度与活力，培养14天或者细胞活力低于90％，停止流加补料培养基，培养结束。培养过程细胞检测结果见表11，培养结束取样经亲和层析纯化后测定抗CD47单克隆抗体的表达量、蛋白SEC纯度、酸碱峰。

表9基础培养基配方

表10补料培养基配方

组分	浓度(mM)	组分	浓度(mM)
				L-天冬氨酸	30	L-脯氨酸	30
L-谷氨酸	37.5	磷酸化-L-酪氨酸	22.5
				L-天冬酰胺	52.5	L-缬氨酸	22.5
L-丝氨酸	52.5	L-蛋氨酸	12
				L-谷氨酰胺	60	S-磺基-L-半胱氨酸	9
L-甘氨酸	3	L-异亮氨酸	30
				L-组氨酸	9	L-亮氨酸	45
L-精氨酸	18	L-苯丙氨酸	12
				L-苏氨酸	39	L-色氨酸	22.5
L-丙氨酸	22.5	L-赖氨酸	22.5

表11实施例3细胞检测结果

实施例4

提供包含编码抗CD47单克隆抗体目的基因的CHO细胞；在表2所述的基础培养基中以0.5×10⁶cells/mL传代扩增所述细胞，每三天扩增一次，经过30mL、150mL、500mL三级转瓶扩增，细胞密度达到3×10⁶cells/mL，转至5L发酵罐中；5L发酵罐中进行高密度培养阶段，初始培养体积3L，搅拌速度180～250rpm，溶氧含量35％，温度为37±0.5℃，pH为7.2±0.1，培养3～4天后当细胞密度达到6×10⁶cells/mL时，开始流加表12所述的补料培养基，第一天流加量为2％培养物体积，以后每天流加3％培养物体积；培养6～7天后当细胞密度达到18×10⁶cell/mL时，降低培养温度至32±0.5℃，pH为6.9±0.05，流加培养过程中每天取样检测细胞密度与活力，培养14天或者细胞活力低于90％，停止流加补料培养基，培养结束。培养过程细胞检测结果见表13，培养结束取样经亲和层析纯化后测定抗CD47单克隆抗体的表达量、蛋白SEC纯度、酸碱峰。

表12补料培养基配方

表13实施例4细胞检测结果

实施例5

提供包含编码抗CD47单克隆抗体目的基因的CHO细胞；在表2所述的基础培养基中以0.5×10⁶cells/mL传代扩增所述细胞，每三天扩增一次，经过30mL、150mL、500mL三级转瓶扩增，细胞密度达到2×10⁶cells/mL，转至5L发酵罐中；5L发酵罐中进行高密度培养阶段，初始培养体积3L，搅拌速度180～250rpm，溶氧含量35％，温度为37±0.5℃，pH为7.2±0.1，培养3～4天后当细胞密度达到6×10⁶cells/mL时，开始流加表14所述的补料培养基，每天流加3％培养物体积；培养6～7天后当细胞密度达到18×10⁶cell/mL时，降低培养温度至32±0.5℃，pH为6.9±0.05，流加培养过程中每天取样检测细胞密度与活力，培养14天或者细胞活力低于90％，停止流加补料培养基，培养结束。培养过程细胞检测结果见表15，培养结束取样经亲和层析纯化后测定抗CD47单克隆抗体的表达量、蛋白SEC纯度、酸碱峰。

表14补料培养基配方

组分	浓度(mM)	组分	浓度(mM)
				L-天冬氨酸	15	L-脯氨酸	9
L-谷氨酸	12	磷酸化-L-酪氨酸	6
				L-天冬酰胺	15	L-缬氨酸	9
L-丝氨酸	15	L-蛋氨酸	4.2
				L-谷氨酰胺	18	S-磺基-L-半胱氨酸	3
L-甘氨酸	0.9	L-异亮氨酸	9
				L-组氨酸	3	L-亮氨酸	12
L-精氨酸	6	L-苯丙氨酸	3
				L-苏氨酸	9	L-色氨酸	6
L-丙氨酸	6	L-赖氨酸	12

表15实施例5细胞检测结果

对比实施例1

提供包含编码抗CD47单克隆抗体目的基因的CHO细胞；在CD01培养基中以0.5×10⁶cells/mL传代扩增所述细胞，每三天扩增一次，经过30mL、150mL、500mL三级转瓶扩增，细胞密度达到2×10⁶cells/mL，转至5L发酵罐中；5L发酵罐中进行高密度培养阶段，初始培养体积3L，搅拌速度250rpm，溶氧含量35％，温度为37±0.5℃，pH为7.2±0.1，培养3～4天后当细胞密度达到6×10⁶cells/mL时，开始流加补料培养基PFF06，补料培养基为半连续流加方式，第一天流加量为2％培养物体积，以后每天流加3％培养物体积；培养6～7天后当细胞密度达到18×10⁶cell/mL时，降低培养温度至32±0.5℃，pH为6.9±0.05，流加培养过程中每天取样检测细胞密度与活力，培养14天或者细胞活力低于90％，停止流加补料培养基，培养结束。培养过程细胞检测结果见表16，培养结束取样经亲和层析纯化后测定抗CD47单克隆抗体的表达量、蛋白SEC纯度、酸碱峰。

表16对比实施例1细胞检测结果

对比实施例2

提供包含编码抗CD47单克隆抗体目的基因的CHO细胞；在Actipro培养基中以0.5×10⁶cells/mL传代扩增所述细胞，每三天扩增一次，经过30mL、150mL、500mL三级转瓶扩增，细胞密度达到2×10⁶cells/mL，转至5L发酵罐中；5L发酵罐中进行高密度培养阶段，初始培养体积3L，搅拌速度250rpm，溶氧含量35％，温度为37±0.5℃，pH为7.2±0.1，培养3～4天后当细胞密度达到6×10⁶cells/mL时，开始流加补料培养基CB7a+CB7b，补料培养基为半连续流加方式，第一天流加量为2％培养物体积，以后每天流加3％培养物体积；培养6～7天后当细胞密度达到18×10⁶cell/mL时，降低培养温度至32±0.5℃，pH为6.9±0.05，流加培养过程中每天取样检测细胞密度与活力，培养14天或者细胞活力低于90％，停止流加补料培养基，培养结束。培养过程细胞检测结果见表17，培养结束取样经亲和层析纯化后测定抗CD47单克隆抗体的表达量、蛋白SEC纯度、酸碱峰。

表17对比实施例2细胞检测结果

对比实施例3

提供包含编码抗CD47单克隆抗体目的基因的CHO细胞；在Advanced CHO培养基中以0.5×10⁶cells/mL传代扩增所述细胞，每三天扩增一次，经过30mL、150mL、500mL三级转瓶扩增，细胞密度达到2×10⁶cells/mL，转至5L发酵罐中；5L发酵罐中进行高密度培养阶段，初始培养体积3L，搅拌速度250rpm，溶氧含量35％，温度为37±0.5℃，pH为7.2±0.1，培养3～4天后当细胞密度达到6×10⁶cells/mL时，开始流加补料培养基Advanced Feed 1，补料培养基为半连续流加方式，第一天流加量为2％培养物体积，以后每天流加3％培养物体积；培养6～7天后当细胞密度达到18×10⁶cell/mL时，降低培养温度至32±0.5℃，pH为6.9±0.05，流加培养过程中每天取样检测细胞密度与活力，培养14天或者细胞活力低于90％，停止流加补料培养基，培养结束。培养过程细胞检测结果见表18，培养结束，取样经亲和层析纯化后测定抗CD47单克隆抗体的表达量、蛋白SEC纯度、酸碱峰。

表18对比实施例3细胞检测结果

对比实施例4

提供包含编码抗CD47单克隆抗体目的基因的CHO细胞；在Dynamis培养基中以0.5×10⁶cells/mL传代扩增所述细胞，每三天扩增一次，经过30mL、150mL、500mL三级转瓶扩增，细胞密度达到2×10⁶cells/mL，转至5L发酵罐中；5L发酵罐中进行高密度培养阶段，初始培养体积3L，搅拌速度250rpm，溶氧含量35％，温度为37±0.5℃，pH为7.2±0.1，培养3～4天后当细胞密度达到6×10⁶cells/mL时，开始流加补料培养基Feed C，补料培养基为半连续流加方式，第一天流加量为2％培养物体积，以后每天流加3％培养物体积；培养6～7天后当细胞密度达到18×10⁶cell/mL时，降低培养温度至32±0.5℃，pH为6.9±0.05，流加培养过程中每天取样检测细胞密度与活力，培养14天或者细胞活力低于90％，停止流加补料培养基，培养结束。培养过程细胞检测结果见表19，培养结束，取样经亲和层析纯化后测定抗CD47单克隆抗体的表达量、蛋白SEC纯度、酸碱峰。

表19对比实施例4细胞检测结果

实施例1-5及对比例1-4抗体测定结果见表20。

表20实施例及对比例抗体发酵检测结果

Claims (2)

1.一种生产抗CD47抗体的培养基，其特征在于，所述培养基包括基础培养基和补料培养基；其中基础培养基由如下组分组成：

组分 浓度/mM 组分 浓度/mM L-天冬氨酸 3-6 生物素 0.0012-0.004 L-谷氨酸 2.5-7.5 D-泛酸钙 0.006-0.02 L-天冬酰胺 3.5-10.5 叶酸 0.006-0.02 L-丝氨酸 3.5-10.5 环己六醇 0.6-2 L-谷氨酰胺 4-12 烟酰胺 0.06-0.2 L-甘氨酸 0.2-0.6 盐酸吡多醇 0.012-0.04 L-组氨酸 0.6-1.8 核黄素 0.0024-0.008 L-精氨酸 1.2-3.6 维生素B12 0.0012-0.004 L-苏氨酸 2.6-7.8 盐酸硫胺素 0.012-0.04 L-丙氨酸 1.5-4.5 硫辛酸 0.0024-0.008 L-脯氨酸 2.0-6.0 叶黄素 0.00000054-0.0000018 磷酸化-L-酪氨酸 1.5-4.5 六水合三氯化铁 0.12-0.4 L-缬氨酸 1.5-4.5 氯化胆碱 0.6-2 L-蛋氨酸 0.8-2.4 亚硒酸钠 0.00000012-0.0000004 S-磺基-L-半胱氨酸 0.6-1.8 氯化锰 0.0000018-0.000006 L-异亮氨酸 2-6 四水合钼酸铵 0.00000018-0.0000006 L-亮氨酸 3-9 无水氯化锌 0.000012-0.00004 L-苯丙氨酸 0.8-2.4 二水合氯化铜 0.0000012-0.000004 L-色氨酸 1.5-4.5 氯化钴 0.000024-0.00008 L-赖氨酸 1.5-4.5 硫酸铜 0.00003-0.0001 无水碳酸氢钠 15-50 碘化钾 0.00003-0.0001 氯化钠 54-100 氯化铝 0.000006-0.00002 磷酸氢二钠 4.8-16 P-F68 1-3g/L 硫酸镁 1.08-3.6 丁二胺 0.00009-0.0003 氯化钾 4.8-16 乙醇胺 0.0009-0.003 氯化钙 0.9-3 丙酮酸钠 0.000009-0.00003 二水合柠檬三钠 2.1-7 D-葡萄糖 30-50 硫酸钾 0.6-2 氯化镁 1.2-4

补料培养基由如下组分组成：

组分 浓度/mM 组分 浓度/mM L-天冬氨酸 25~60 L-脯氨酸 15~36 L-谷氨酸 20~48 磷酸化-L-酪氨酸 10~24 L-天冬酰胺 25~60 L-缬氨酸 15~36 L-丝氨酸 25~60 L-蛋氨酸 7~16.8 L-谷氨酰胺 30~72 S-磺基-L-半胱氨酸 5~12 L-甘氨酸 1.5~3.6 L-异亮氨酸 15~36 L-组氨酸 5~12 L-亮氨酸 20~48 L-精氨酸 10~24 L-苯丙氨酸 5~12 L-苏氨酸 15~36 L-色氨酸 10~24 L-丙氨酸 10~24 L-赖氨酸 20~48

。

2.一种生产抗CD47抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：（a）提供包含编码抗CD47抗体的目的基因的CHO细胞；（b）在权利要求1所述基础培养基中逐级放大培养所述细胞；（c）转至发酵罐中进行高密度培养；

步骤（c）所述高密度培养包括如下三个阶段：

（1）细胞生长阶段：用权利要求1所述基础培养基悬浮细胞培养，起始密度约为2~6×10⁵cells/ml，起始培养温度为37±0.5℃，pH为7.2±0.1；

（2）细胞生产抗体阶段：当细胞密度生长到5~7×10⁶cells/ml时，细胞培养进入细胞生产蛋白质阶段，流加权利要求1所述补料培养基促进细胞表达抗体蛋白，每天流加量为培养物体积的2~3%；当细胞密度达到13~18×10⁶ cells/ml降低培养温度至32±0.5℃，pH为6.90±0.05；

（3）当细胞培养14天或者细胞活力降低至90%以下时，停止流加补料培养基，结束培养。