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CN113117069B - 抗新型冠状病毒疫苗及其制备方法 - Google Patents

抗新型冠状病毒疫苗及其制备方法 Download PDF

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CN113117069B CN202110576082.4A CN202110576082A CN113117069B CN 113117069 B CN113117069 B CN 113117069B CN 202110576082 A CN202110576082 A CN 202110576082A CN 113117069 B CN113117069 B CN 113117069B
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Abstract

本发明公开抗新型冠状病毒疫苗及其制备方法。本发明的抗新型冠状病毒疫苗为由脂质外层和核糖核酸分子内核构成的纳米颗粒结构，脂质外层由脂质体构成，核糖核酸分子包括用于编码产生靶向溶酶体的第一抗原的mRNA和/或用于编码产生靶向胞质的第二抗原的mRNA，和用于编码产生外分泌的靶向B细胞的第三抗原的mRNA。本发明的疫苗能产生多样性的免疫反应。

Description

抗新型冠状病毒疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及纳米疫苗，具体地涉及抗新型冠状病毒的纳米颗粒疫苗及其制备方法。
背景技术
COVID-19急性呼吸疾病(2019Novel Coronavirus Acute Respiratory Disease)是当前严重威胁公共卫生安全的传染病。自第一例患者确诊以来，并在世界范围扩散。已被WHO宣布为全球突发公共卫生事件(PHEIC)，这也是WHO传染病应急机制中的最高等级。
现已确认引发COVID-19的病毒为一种新型冠状病毒SARS-CoV-2，这种病毒归属于Sarbe病毒亚属，正冠状病毒亚科，但形成了另外一簇的进化分枝。SARS-CoV-2与MERS-CoV和SARS-CoV都不同，它成为可以感染人类的冠状病毒科中的第七个成员。与SARS-CoV比，SARS-CoV-2传播力更强；潜伏期更长,可在潜伏期传播；传染源更难切断。
人类已有超过30种疾病可以通过疫苗有效预防。但针对冠状病毒家族疫苗，研发依然面临巨大挑战。SARS-CoV-2为β冠状病毒，与SARS病毒基因组相似性为～80％。SARS-CoV-2病毒免疫原性可参考冠状病毒家族中SARS-CoV和MERS-CoV的抗原表位研究。报道的SARS和MERS疫苗主要选择全长或者部分S蛋白作为免疫原。表达SARS和MERS病毒S蛋白的DNA疫苗，在多个动物模型中均能诱导出强烈的免疫应答，抵抗病毒感染。多个正在进行的MERS疫苗正在进行临床研究。
S蛋白为SARS-CoV-2的主要抗原表位区。上海巴斯德研究所及石正丽团队发现SARS-CoV-2病毒进入人体细胞的受体与SARS-CoV相同，为ACE2(血管紧张素转换酶2)。2020年2月20日，《科学》杂志在线发表UT Austin大学冷冻电镜分析Spike蛋白三聚体高清结构(Jason McLellan)，再度确认SARS-CoV-2的S蛋白结构是疫苗应对的关键区域。该结果为S蛋白作为疫苗研发靶抗原提供重要依据。
国内外数十家机构20多个疫苗项目正在研发，包括减毒/灭活疫苗、重组蛋白亚单位疫苗、DNA疫苗、腺相关病毒疫苗、RNA疫苗。
虽然灭活疫苗有成功的开发历史，但部分RNA病毒疫苗产品虽可诱导出中和抗体，但免疫后的人群仍会被病毒感染。DNA疫苗和蛋白亚单位疫苗，对冠状病毒家族目前尚无成功研发案例。DNA疫苗必须进入细胞核内发挥作用，对基因组的安全性产生影响。mRNA疫苗可以克服DNA疫苗的缺点。但是目前核酸疫苗采用的是spike全长或者部分序列，即使诱导出中和抗体阻断病毒进入细胞，也不具备诱导CD8+T细胞反应特异清除病毒感染细胞。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供能够产生多样性免疫反应的抗新型冠状病毒纳米颗粒疫苗。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种抗新型冠状病毒疫苗，其为由脂质外层和核糖核酸分子内核构成的纳米颗粒结构，所述脂质外层由脂质体构成，所述核糖核酸分子包括用于编码产生靶向溶酶体的第一抗原的mRNA和/或用于编码产生靶向胞质的第二抗原的mRNA，和用于编码产生外分泌的靶向B细胞的第三抗原的mRNA。
在某些实施方案中，抗新型冠状病毒疫苗的第一抗原为融合蛋白，其包含溶酶体信号肽和源自SARS-Cov-2 S蛋白的第一片段，可选地，进一步包含与溶酶体信号肽连接的腔内区。
在某些实施方案中，第一抗原进一步包含跨越溶酶体膜的跨膜区，且所述第一片段位于溶酶体信号肽或腔内区与跨膜区之间。更优选地，第一抗原进一步包括与跨膜区连接胞质区。
在某些实施方案中，本发明的抗新型冠状病毒的所述溶酶体信号肽、所述跨膜区和所述腔内区分别源自LAMP蛋白。
在某些实施方案中，第二抗原包含FKBP12或其突变体和源自SARS-Cov-2 S蛋白的第二片段；优选地，突变体包含选自E12G、F37V、R72G和K106E中的至少一种突变。
在某些实施方案中，抗新型冠状病毒疫苗的脂质体包括DOTAP、DOPE、Choi和DSPE-PEG2000，其摩尔比为30-50:10-20:30-48.5:1.5-5。
在某些实施方案中，抗新型冠状病毒疫苗的脂质体与总mRNA的质量比为8-12:1。
本发明的第二方面，提供一种用于制备抗新型冠状病毒疫苗的方法，其包括以下步骤：
(1)取DOTAP、DOPE、Choi和DSPE-PEG2000分别溶于无水乙醇制得母液；
(2)以使得DOTAP、DOPE、Choi和DSPE-PEG2000的摩尔比为30-50:10-20:30-48.5:1.5-5的量将制得的各母液混合，得到脂质体混合溶液；
(3)将脂质体混合溶液缓慢滴注到mRNA水溶液中，使有机相与水相的比例为1:1-1:20，搅拌15-180分钟，得到纳米颗粒悬浮液，其中mRNA包含用于编码产生靶向溶酶体的第一抗原的mRNA和/或用于编码产生靶向胞质的第二抗原的mRNA，可选地进一步包含编码产生外分泌的靶向B细胞的第三抗原的mRNA；
(4)将所得纳米颗粒悬浮液经超滤离心过滤浓缩，然后用含70-90w/v％浓度蔗糖的PBS将浓缩液稀释，即得纳米颗粒状抗新型冠状病毒疫苗。
在某些实施方案中，用于制备抗新型冠状病毒疫苗的方法进一步包括将纳米颗粒状抗新型冠状病毒疫苗进行冷冻干燥制得干粉剂的步骤。
本发明的第三方面，提供一种用于将mRNA递送至目标细胞的方法，其包括使纳米颗粒与目标细胞接触的步骤；
其中，所述纳米颗粒由脂质外层和核糖核酸分子内核构成，所述脂质外层由DOTAP、DOPE、Choi和DSPE-PEG2000构成，所述核糖核酸分子包含用于编码产生第一抗原的mRNA和/或用于编码产生第二抗原的mRNA，所述第一抗原含有LAMP蛋白或其片段，第二抗原含有FKBP12或其片段；
优选地，DOTAP、DOPE、Choi和DSPE-PEG2000的摩尔比为30-50:10-20:30-48.5:1.5-5。
人体控制病毒的第一时间不是靠抗体，而是靠细胞免疫。人体在发现冠状病毒后，免疫系统就会启动识别机制，第一步就是细胞免疫，T细胞特异性识别并消灭被感染的细胞。抗体只是游离在细胞外，一般情况下不会进入细胞，如果病毒从感染细胞内出来了，抗体可以把病毒抓住消灭掉，但是没有T细胞的话，感染细胞会不断地产生病毒。传统的疫苗，主要的目的是诱导B细胞，产生中和性的抗体。
本发明的疫苗最大的优势是能产生多样性的免疫反应。疫苗进入到细胞后表达产生多种病毒的抗原蛋白，部分抗原蛋白例如DD-S和LAMP-S蛋白在细胞内快速降解，进入抗原MCH I以及MHC II呈递途经，诱导出细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)。该类细胞可以直接杀死被病毒感染的细胞；同时可以诱导出辅助性的T细胞(CD4+T细胞)，这类细胞被病毒抗原激活后，可以分泌多种细胞因子，刺激特异性B细胞迅速大量扩增，产生特异抗体。Spike蛋白为外分泌蛋白，分泌出去后可以刺激B细胞，诱导产生抗体。
此外，本发明的疫苗还具有以下优点：安全性好，无基因突变风险；LNP递送系统高效稳定，非毒株依赖，不受毒株资源限制，并且生产工艺简便。
附图说明
图1RNA琼脂糖凝胶电泳图。
图2LNP-mRNA粒径及表面电势。
图3流式细胞仪分析的细胞活率。
图4复溶后LNP-mRNA粒径及表面电势。
图5WB检测LNP-mRNA的表达。
图6转染后293细胞中mRNA相对内参基因GAPDH的Ct值，数据越低表示浓度越高。
图7ELISA法检测上清中spike蛋白的浓度。
图8免疫小鼠后产生结合抗体的情况。
图9中和抗体检测结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
本发明的术语“新型冠状病毒”在本文有时也称作“SARS-Cov-2”或简称为“新冠病毒”。
本发明的抗新型冠状病毒疫苗为纳米颗粒状，其为由脂质外层和核糖核酸分子内核构成。疫苗颗粒的平均直径一般为500nm以下，优选300nm以下，更优选200nm以下，进一步优选100nm以下。另一方面，疫苗颗粒的平均直径为20nm以上，优选30nm以上，更优选40nm以上。
本发明中，构成脂质外层的脂质体一般为混合物。本发明发现当包含DOTAP(即(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺)、DOPE(即二油酰磷脂酰乙醇胺)、Choi(即胆固醇)和DSPE-PEG2000(即二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)四种成分时，得到的脂质体混合物能够高效地将mRNA递送到目标细胞里面，并有效表达目标蛋白。另外，通过优化，使得纳米脂质体LNP颗粒可以在体内有效的保护RNA，防止血浆和组织中RNA酶对RNA的降解。
本发明中，DOTAP与mRNA总量(基于质量)的比例一般在0.8:1-10:1范围内。DOTAP比例越高，越容易实现对mRNA的包裹。因此，在上述范围内优选更高的DOTAP比例。
本发明中，DOTAP、DOPE、Choi和DSPE-PEG2000四种成分的摩尔比一般为30-50:10-20:30-48.5:1.5-5，优选35-45:12-18:32-45:2-4，更优选38-42:14-16:35-40:2.5-3。
本发明的核糖核酸分子(即，RNA)一般是指mRNA，其至少包括由用于编码产生靶向溶酶体的第一抗原的mRNA和用于编码产生靶向胞质的第二抗原的mRNA组成的组中的至少一种。可选地，本发明的核糖核酸分子还可包含用于编码产生第三抗原的mRNA。本发明中，用于编码产生抗原(包括第一抗原、第二抗原和第三抗原)的mRNA需包含编码区和可选地与其可操作连接的非编码区。编码区的碱基序列对应于相应的抗原的氨基酸序列。编码区可以是天然野生型序列，也可以是优化(例如密码子偏好性改造)后的碱基序列。非编码区用于促进或增强编码区的功能，例如提高编码区的表达水平等。非编码区的实例包括但不限于增强子、启动子等。
本发明的第一抗原为融合蛋白，优选地，其包含溶酶体信号肽和源自SARS-Cov-2S蛋白的第一片段，可选地，进一步包含与溶酶体信号肽连接的腔内区。溶酶体信号肽是指能够将与其连接的目标蛋白如抗原等引导定位至溶酶体的肽片段。优选地，溶酶体信号肽和腔内区可源自于LAMP蛋白，更优选地，第一抗原的N端为LAMP的信号肽区和腔内区，其氨基酸序列如SEQ ID No.:7。
本发明的第一抗原优选进一步包含跨越溶酶体膜的跨膜区。跨膜区优选位于第一抗原的C端。优选地跨膜区为一次性跨膜区，可使用已知的任何跨膜区，例如源自LAMP蛋白第383-405位之间的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的第一抗原进一步包含胞质区。优选地，胞质区位于融合蛋白的C末端。胞质区的序列不限定，可以是任何蛋白的胞质区。优选地，胞质区源自LAMP蛋白，例如其406-417位氨基酸之间的片段。优选地，跨膜区和胞质区连接为一体，其具有例如SEQ ID No.:8所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的第一抗原具有SEQ ID No.:4所示的序列。
本发明的第二抗原包含FKBP12或其突变体和源自SARS-Cov-2 S蛋白的第二片段。其中，FKBP12可以是全长蛋白，也可以是其突变体。此处的突变体包括源自该全长蛋白且具有细胞质定位功能的部分片段，或包含氨基酸突变。氨基酸突变的实例包括但不限于E12G、F37V、R72G和K106E。本发明中，因包含FKBP12的DD区(destabilizing domain)而使第二抗原稳定性降低，促进其降解。在某些实施方案中，本发明的第二抗原具有SEQ ID No.：5所示的序列。
本发明中，第一片段、第二片段可以源自不同抗原蛋白或其片段。优选地，第一片段和第二片段均源自同一抗原蛋白。第一片段和第二片段可以相同也可以不同。优选地，第一片段和第二片段分别为源自新型冠状病毒S蛋白的不同片段。在某些实施方案中，本发明的第一片段的序列如SEQ ID No.：9所示，第二片段的序列如SEQ ID No.：11所示。
在某些实施方案中，本发明的第一片段为源自新型冠状病毒S蛋白的N端片段。例如，至少包含作为诱导抗体核心区的RBD区的片段。此时，优选第一片段不包含N端的前12个氨基酸。更优选地，第一片段包含S蛋白至少第524位氨基酸之间的序列。例如，第550位氨基酸之前的序列、第600位氨基酸之前的序列。在某一实施方案中，第一片段包含S蛋白第13-524位之间的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的第二片段为S蛋白的片段，优选包含S蛋白的胞外区。例如，S1区域和/或S2区域的胞外区。在某些实施方案中，本发明的第二片段包含S蛋白第13-931位之间的氨基酸序列。
本发明的第三抗原为外分泌的靶向B细胞的抗原。优选地，第三抗原与第一抗原、第二抗原均来源于相同的蛋白。本发明的第三抗原优选为全长S蛋白，例如SEQ ID No.6所示。当然也可选择全长蛋白第1-12位氨基酸以及胞外区片段的片段或融合蛋白。
本发明中第一抗原、第二抗原和第三抗原可以是相同的抗原，或者源自相同抗原的不同片段，或者是三种不同的抗原。第一抗原、第二抗原和第三抗原的大小一般为1000个氨基酸以下。例如，900个氨基酸以下等。
本发明的用于制备抗新型冠状病毒疫苗的方法一般包括以下步骤：
(1)取DOTAP、DOPE、Choi和DSPE-PEG2000分别溶于无水乙醇制得母液；
(2)将制得的上述各母液混合使得DOTAP、DOPE、Choi和DSPE-PEG2000的摩尔比为30-50:10-20:30-48.5:1.5-5，得到脂质体混合溶液；
(3)将脂质体混合溶液缓慢滴注到mRNA水溶液中，使有机相与水相的比例为1:1-1:20，优选1:5-1:15，更优选1:6-1:10，搅拌15-180分钟，优选20-150分钟，更优选60-120分钟，得到纳米颗粒悬浮液。其中mRNA包含用于编码产生靶向溶酶体的第一抗原的mRNA和/或用于编码产生靶向胞质的第二抗原的mRNA，可选地进一步包含编码产生SARS-Cov-2的全长S蛋白的mRNA；
(4)将所得纳米颗粒悬浮液经超滤离心过滤浓缩，然后用含高浓度蔗糖的PBS将浓缩液稀释，即得纳米颗粒状抗新型冠状病毒疫苗。
可选地，进一步包括将纳米颗粒状抗新型冠状病毒疫苗进行冷冻干燥制得干粉剂的步骤。
本发明的用于将mRNA递送至目标细胞的方法，即，用于递送mRNA的系统，其包括使纳米颗粒与目标细胞接触的步骤。其中，纳米颗粒由脂质外层和核糖核酸分子内核构成。脂质外层由DOTAP、DOPE、Choi和DSPE-PEG2000构成。核糖核酸分子包含用于编码产生第一抗原的mRNA和/或用于编码产生第二抗原的mRNA。此处的第一抗原和第二抗原与前述相同。在此不再赘述。
实施例
一、DNA制备
1.1序列设计：根据gene bank数据库公开的SARS-Cov-2病毒基因组序列，选择出SARS-Cov-2病毒spike蛋白(棘突蛋白，S蛋白)基因(以下称为S蛋白基因)，参考SARS-cov病毒S蛋白的结构，使用生物信息学方法分析该蛋白的S1区、S2区、RBD区以及信号肽。分别选择S蛋白基因不同长度的片段，构建以下三个载体，三个载体的编码核酸序列见表1。
表1
序列名 序列号
LAMP-S SEQ ID No:1
DD-S SEQ ID No:2
Spike SEQ ID No:3
将上述序列进行密码子偏好性、GC含量、mRNA二级结构、mRNA自由能、核糖体绑定位点等优化，合成优化后的序列，并克隆到体外转录用载体上。
1.2质粒DNA制备：将含有目的基因的质粒，转化到DH5a感受态细菌中，挑选单克隆使用LB培养基培养过夜，使用无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒DNA。
二、mRNA制备
2.1将步骤一中制备的质粒DNA，使用限制性内切酶SpeI-HF线性化。取1个干净的1.5ml EP管中，依次加入表2所示试剂进行酶切反应。
表2
Figure BDA0003084405030000101
用掌上离心机瞬离10s，37℃水浴中反应3h。
备注：如果加入的质粒DNA的量变化，其他添加物的添加量相应的进行调整。
酶切后的质粒保留1μl用于质粒DNA酶切线性化检测，参照《QSC/SOP-QC-0001-01电泳法检测质粒DNA酶切线性化标准操作》。剩余样品中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，室温沉淀10分钟。最高转速(14000g)离心15分钟使DNA沉淀。吸去上清后，加入1ml 70％乙醇洗沉淀，最高转速(14000g)离心10分钟，去掉上清。重复一次该步骤。
去掉上清后，离心10s将离心管璧的残留乙醇收集到管底，小心以吸头吸去残留的乙醇，室温放置三分钟吹干乙醇。加入50μL超纯水溶解DNA沉淀。
待沉淀完全溶解后，使用NanoDrop检测DNA浓度，并调整到1μg/μL，置于-20℃冰箱保存。
2.2体外转录法制备mRNA
从-20℃冰箱取出体外转录试剂盒，将10x反应缓冲液和2x NTP/CAP溶液放于冰上解冻。完全解冻后，用振荡器震荡混匀，稍微离心，立即将2xNTP/CAP溶液放于冰上，将10x反应缓冲液放于室温。
取1个无核酸酶的1.5ml离心管，依次加入表3所示试剂进行体外转录反应。
表3
Figure BDA0003084405030000111
用掌上离心机离心10s，37℃水浴中反应3h。
备注：如果体外转录反应体系的体积变化，其他添加物的添加量相应的进行调整。
反应结束后，在离心管中加入25μl TURBO DNase，充分混匀后稍微离心，37℃孵育15min去除DNA模板。
在离心管中加入750μl预冷的氯化锂溶液，充分混匀，放于-20℃沉淀30分钟。同时提前预冷离心机到4℃。
将离心管放入预冷的离心机，使用最高转速(14000g)4℃离心15分钟沉淀mRNA。
小心的吸去上清，加入1ml 70％乙醇溶液清洗RNA沉淀。以最高转速(13200rpm)4度离心15分钟。
小心彻底吸干净70％乙醇，以500μl无核酸酶污染的超纯水溶解RNA沉淀。
取1μl RNA溶液，加到9μl双蒸水里面，充分混匀后，以NanoDrop检测RNA的浓度。如检测浓度不在100～1000ng/μL，根据结果重新稀释RNA检测，使检测浓度在100～1000ng/μL之内。根据稀释倍数计算原RNA溶液的浓度。分装成20μg每管，于-80℃超低温冰箱保存。
三、纳米LNP制备
3.1阳离子脂质(DOTAP)与mRNA比例筛选(即N/P)
在超净工作台上，用移液器吸取mRNA样品5μg于DNA/RNAse free离心管中。然后加入不同质量的DOTAP(10mg/mL)，DOTAP/mRNA质量比(W/W)为1:1、2.5:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1，然后补足DNA/RNAase free水至20μL,静置10分钟，再加入2μL的10X上样缓冲液，混匀后，进行琼脂糖凝胶电泳。
电泳结果如图1所示。根据图1，当DOTAP/mRNA质量比(W/W)为1:1时即实现对mRNA的包裹，随着该比例变大，包裹效果越好。当DOTAP/mRNA质量比为10:1可实现对mRNA 100％的包裹。
3.2LNP-mRNA制备、筛选及优化
3.2.1称取DOTAP、DOPE、Choi和DSPE-PEG2000并分别溶于无水乙醇制得浓度为10mg/mL的母液。
3.2.2将DOTAP、DOPE、Choi和DSPE-PEG2000按摩尔比例(30-50:10-20:30-48.5:1.5-5)混合得到脂质体混合溶液，优选为40:10:48.5:1.5。
3.2.3以脂质体混合溶液:mRNA的质量比为10:1的比例，取1μg/μL的mRNA20μL稀释到超纯水中，将上述脂质体混合溶液缓慢滴注入到上述mRNA水溶液中，其中有机相：水相的比例为1:1，1:2，1:3，1:4，1:5，1:10，1:20，优选的为1:3。搅拌15，20，30，60，90，120，150，180分钟，优选的为120分钟。
3.2.4将得到的纳米颗粒悬浮液经100KDa超滤离心管离心过滤浓缩，2800rpm/min，20-60min。后用微量PBS洗涤离心管，洗涤液与浓缩液混合，并用含有高浓度蔗糖的PBS(质量比80％)将浓缩液稀释至200μL，最终脂质混合液中含有蔗糖8％，涡旋30s，4℃静止20-30min，-80℃保存。
3.3LNP-mRNA表征
3.3.1采用动态光散射(DLS)等方法表征所得到的纳米颗粒，筛选出大小均匀且mRNA负载率高的纳米颗粒。优选粒径<200nm。
3.3.2LNP-mRNA负载率测定
首先采用Cy5标记的mRNA作为模型mRNA合成LNP-mRNA(Cy5)，利用Cy5的在675nm波长下的荧光信号值，测定mRNA(Cy5)的荧光-浓度标准曲线，进一步的测定出所合成LNP-mRNA(Cy5)负载mRNA量，从而计算得到LNP-mRNA的mRNA负载率。脂质体组分比例为40:10:48.5:1.5时获得LNP-mRNA的mRNA负载率在～50％。
3.4LNP-mRNA细胞毒性
将制备的不同配比的LNP-mRNA颗粒加到293细胞中，终浓度为1μg/ml。分别使用完全培养基、血清饥渴24小时、血清饥渴3小时处理细胞。使用同等浓度的lipofactamine2000作为阳性对照处理细胞。转染24小时后，收集细胞，使用细胞活性/细胞毒性试剂盒标记细胞，用流式细胞仪分析细胞活率。结果如图3所示。如图3所示，在完全培养基中，不同配比的LNP加入细胞中后，细胞存活率为90％以上，表现出非常低的细胞毒性。即使在无血清环境中，不同配比的LNP加入细胞中后，细胞存活率为60％以上，远远高于lipofactmine2000组的细胞活率。
3.5LNP-mRNA冷冻干燥及复溶
为了方便运输，保持LNP-mRNA的稳定性，制备好的LNP-mRNA经冷冻干燥制成LNP-mRNA干粉剂。
复溶方法：100μg LNP-mRNA干粉溶于100μL PBS，完全溶解后，室温静置2、5、10、15、20、30、60、120分钟。复溶后LNP-mRNA的粒径采用DLS方法进行表征。结果如图4所示(10分钟)。
四、实施验证
4.1LNP-mRNA纳米颗粒递送效率以及蛋白表达验证
将293细胞种到12孔板中，细胞密度为30～40％汇合度，培养4～6小时。
转染前将培养基更换成无血清的DMEM，使用lipofactamine2000转染1μg RNA或者DNA到293细胞，在转染LAMP-S的孔中加入终浓度为50μM的氯喹，转染DD-S的孔中加入终浓度为1μM的shield-1，37℃培养过夜。
转染后20小时，收集细胞，分别提取总RNA和蛋白，使用qPCR法检测转染到细胞中的mRNA量；使用WB法检测细胞中spike蛋白的量。结果如图5所示。
4.2不同冻融次数对LNP-mRNA纳米颗粒转染效率的影响
将CHO细胞种到12孔板中，每孔细胞数为2e5，培养过夜。
转染前将培养基更换成无血清的F12K培养基，将LNP-mRNA溶液从冰箱取出，斡旋混匀，室温放置20分钟。按照以下分组，将LNP-mRNA加到细胞中，终浓度为1μg/ml。
阳性对照组：使用lipofactamine2000转染1μg spike RNA到CHO细胞
LNP-mRNA组：分别反复冻融1次、2次和4次的样品。
NC组：阴性对照组，没有处理过的CHO细胞。
将细胞培养过夜后，补加血清至10％，继续培养。转染2天后，收集上清，使用ELISA法检测上清中spike蛋白的浓度。结果如图7所示。
4.3纳米LNP-mRNA诱导免疫原性实验
小鼠免疫原性实验，选用BalB/C雌性小鼠,6-8周龄,肌肉注射,每次接种时两侧后腿注射100μl。
分组：纳米LNP mRNA实验组，200μl/只，共8只；spike蛋白阳性对照组2μg/只，共3只；Blank-LNP阴性对照组,共3只；免疫过程分两次免疫，第一次免疫后间隔2周进行第二次加强免疫。
样本信息：
1)mRNA-LNP，浓度为300μg/ml(本发明的三抗原)；
2)Blank-LNP，浓度为300μg/ml；
3)Spike蛋白阳性对照
免疫方法：
1)mRNA-LNP实验组：100μl/下肢，左右腿各100μl；
2)Blank-LNP对照组：100μl/下肢，左右腿各100μl；
3)Spike蛋白对照组：2μg/只，皮下注射；
首先对免疫小鼠进行基本生物学体征评价，包括大小、体重、基本活动能力等；再进行免疫血清的鉴定：取mRNA疫苗免疫小鼠全血，分离血清，利用ELISA检测特异性S蛋白抗体。
检测到LNP-S-mRNA在免疫的小鼠中产生有效的结合抗体。观察到来自免疫小鼠的特异性结合抗体具有依赖血清稀释的趋势。阳性和阴性样品的初始稀释度为1:50，然后进行4倍系列稀释。在免疫后49天，通过各种刺突特异性IgGELISA测定获得血清中的刺突特异性结合IgG应答。结果如图8所示。LNP-S-mRNA免疫后可诱导高表达的结合抗体。
中和抗体检测，LNP-S-mRNA引发强力的假病毒中和抗体反应；用LNP-S-mRNA或LNP对照或PBS免疫BALB/C小鼠(n＝8/组)，加强免疫后收集血清，并评估针对同型SARS-CoV-2_D614(野生型)假病毒的中和抗体滴度。血清样品的初始稀释度为1：100，连续3倍稀释。将50μg/ml的S1阳性中和抗体(S1，Mouse Mab，Cat#40591-MM43；IC50：1.41μg/ml)用作阳性对照。结果如图9所示，LNP-S-mRNA免疫后可诱导高滴度的中和抗体。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
序列表
<110> 北京启辰生生物科技有限公司
启辰生生物科技（珠海）有限公司
<120> 抗新型冠状病毒疫苗及其制备方法
<130> BH2000157-1
<141> 2020-05-26
<150> 2020104869971
<151> 2021-05-29
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2784
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
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gaagagcatg ttcgagtcac gaaagctttt tccgtgaaca tattcaaagt ctgggtccag 1080
gcctttaagg tcgagggcgg ccagtttgga agcgtggaag agtgtctcct tgacgaaaat 1140
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gtgatcgcct ggaacagcaa caatctggat tctaaagtgg gcggcaacta caattatctg 2460
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<212> DNA
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<210> 3
<211> 3822
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
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aggacccaac ttcctcctgc ctacaccaac tccttcacca ggggagtcta ctaccctgac 120
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aaccctgtgc tgccattcaa tgatggagtc tactttgcca gcacagagaa gagcaacatc 300
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225 230 235 240
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245 250 255
Asn Ile Asn Pro Asn Lys Thr Ser Ala Ser Gly Ser Cys Gly Ala His
260 265 270
Leu Val Thr Leu Glu Leu His Ser Glu Gly Thr Thr Val Leu Leu Phe
275 280 285
Gln Phe Gly Met Asn Ala Ser Ser Ser Arg Phe Phe Leu Gln Gly Ile
290 295 300
Gln Leu Asn Thr Ile Leu Pro Asp Ala Arg Asp Pro Ala Phe Lys Ala
305 310 315 320
Ala Asn Gly Ser Leu Arg Ala Leu Gln Ala Thr Val Gly Asn Ser Tyr
325 330 335
Lys Cys Asn Ala Glu Glu His Val Arg Val Thr Lys Ala Phe Ser Val
340 345 350
Asn Ile Phe Lys Val Trp Val Gln Ala Phe Lys Val Glu Gly Gly Gln
355 360 365
Phe Gly Ser Val Glu Glu Cys Leu Leu Asp Glu Asn Ser
370 375 380
<210> 8
<211> 36
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Met Leu Ile Pro Ile Ala Val Gly Gly Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu
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Ile Val Leu Ile Ala Tyr Leu Val Gly Arg Lys Arg Ser His Ala Gly
20 25 30
Tyr Gln Thr Ile
35
<210> 9
<211> 511
<212> PRT
<213> Coronavirus
<400> 9
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1 5 10 15
Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser
20 25 30
Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn
35 40 45
Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys
50 55 60
Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala
65 70 75 80
Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr
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115 120 125
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Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser
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260 265 270
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325 330 335
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340 345 350
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
355 360 365
Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala
370 375 380
Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
385 390 395 400
Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
405 410 415
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
420 425 430
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435 440 445
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
450 455 460
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
465 470 475 480
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe
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50 55 60
Gln Met Ser Val Gly Gln Gly Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr
65 70 75 80
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<212> PRT
<213> coronavirus
<400> 11
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Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg
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Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr
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Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr
180 185 190
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Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr
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Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu
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865 870 875 880
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885 890 895
Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala
900 905 910
Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile
915

Claims (7)

1.一种抗新型冠状病毒疫苗，其特征在于，其为由脂质外层和核糖核酸分子内核构成的纳米颗粒结构，所述脂质外层由脂质体构成，所述核糖核酸分子包括用于编码产生靶向溶酶体的第一抗原的mRNA、用于编码产生靶向胞质的第二抗原的mRNA以及用于编码产生外分泌的靶向B细胞的第三抗原的mRNA，其中mRNA由SEQ ID No:1-3所示的编码核酸序列优化后经转录得到；并且所述第一抗原的氨基酸序列为SEQ ID No:4，所述第二抗原的氨基酸序列为SEQ ID No:5以及所述第三抗原的氨基酸序列为SEQ ID No:6。
2.根据权利要求1所述的抗新型冠状病毒疫苗，其特征在于，所述脂质体包括DOTAP、DOPE、Choi和DSPE-PEG2000，其摩尔比为30-50:10-20:30-48.5:1.5-5。
3.根据权利要求1所述的抗新型冠状病毒疫苗，其特征在于，脂质体与总mRNA的质量比为8-12:1。
4.一种用于制备抗新型冠状病毒疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取DOTAP、DOPE、Choi和DSPE-PEG2000分别溶于无水乙醇制得母液；
(2)以使得DOTAP、DOPE、Choi和DSPE-PEG2000的摩尔比为30-50:10-20:30-48.5:1.5-5的量将制得的各母液混合，得到脂质体混合溶液；
(3) 将脂质体混合溶液缓慢滴注到mRNA水溶液中，使有机相与水相的比例为1:1-1:20，搅拌15-180分钟，得到纳米颗粒悬浮液，其中mRNA包含用于编码产生靶向溶酶体的第一抗原的mRNA、用于编码产生靶向胞质的第二抗原的mRNA以及编码产生外分泌的靶向B细胞的第三抗原的mRNA，其中mRNA由SEQ ID No:1-3所示的编码核酸序列优化后经转录得到，所述第一抗原的氨基酸序列为SEQ ID No:4，所述第二抗原的氨基酸序列为SEQ ID No:5，所述第三抗原的氨基酸序列为SEQ ID No:6；
(4) 将所得纳米颗粒悬浮液经超滤离心过滤浓缩，然后用含高深度蔗糖的PBS将浓缩液稀释，即得纳米颗粒状抗新型冠状病毒疫苗。
5.根据权利要求4所述的用于制备抗新型冠状病毒疫苗的方法，其特征在于，进一步包括将纳米颗粒状抗新型冠状病毒疫苗进行冷冻干燥制得干粉剂的步骤。
6.一种用于将mRNA递送至体外目标细胞的方法，其特征在于，包括使纳米颗粒与体外目标细胞接触的步骤；
其中，所述纳米颗粒由脂质外层和核糖核酸分子内核构成，所述脂质外层由DOTAP、DOPE、Choi和DSPE-PEG2000构成，所述核糖核酸分子包含用于编码产生第一抗原的mRNA、用于编码产生第二抗原的mRNA以及编码产生外分泌的靶向B细胞的第三抗原的mRNA，所述第一抗原含有LAMP蛋白或其片段，第二抗原含有FKBP12或其片段，其中mRNA由SEQ ID No:1-3所示的编码核酸序列优化后经转录得到，所述第一抗原的氨基酸序列为SEQ ID No:4，所述第二抗原的氨基酸序列为SEQ ID No:5，所述第三抗原的氨基酸序列为SEQ ID No:6。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，DOTAP、DOPE、Choi和DSPE-PEG2000的摩尔比为30-50:10-20:30-48.5:1.5-5。
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