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CN113109325A - 一种胃蛋白酶原i酶促化学发光检测试剂盒及其制备方法与应用 - Google Patents

一种胃蛋白酶原i酶促化学发光检测试剂盒及其制备方法与应用 Download PDF

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CN113109325A
CN113109325A CN202110280853.5A CN202110280853A CN113109325A CN 113109325 A CN113109325 A CN 113109325A CN 202110280853 A CN202110280853 A CN 202110280853A CN 113109325 A CN113109325 A CN 113109325A
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CN
China
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solution
pgi
labeled
antibody
pepsinogen
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CN202110280853.5A
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何小维
柳方方
王羽
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South China University of Technology SCUT
Original Assignee
South China University of Technology SCUT
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    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
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    • G—PHYSICS
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Abstract

本发明公开了一种胃蛋白酶原I酶促化学发光检测试剂盒及其制备方法与应用。该试剂盒包括标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物的溶液、标记有PGI抗体的酶标结合物的溶液及底物液。该试剂盒是将胃蛋白酶原抗体连接在磁珠微球表面作为固相试剂，经捕捉样本中的胃蛋白酶原以及加入酶标抗胃蛋白酶原单克隆抗体试剂后，形成酶标抗体夹心免疫复合物。本发明的优点在于将高灵敏的化学发光技术与稳定性强的磁微粒技术结合在一起，制备的试剂盒灵敏度高，稳定性好，能够满足临床要求；同时整个反应检测过程可以配套使用全自动检测分析仪器，连续加样，缩短了操作时间，可用于大规模的社区健康检查，具有一定的应用前景。

Description

一种胃蛋白酶原I酶促化学发光检测试剂盒及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于诊断试剂盒技术领域，具体涉及一种胃蛋白酶原I酶促化学发光检测试剂盒及其制备方法与应用。
背景技术
近年来，胃癌的发病率呈上升趋势，这主要归因于人们生活方式和饮食的改变。目前胃癌和其他胃部疾病的诊断仍依靠胃镜和组织病理学来确诊，但胃镜检查有一定痛苦，往往不为患者所接受，容易导致延误诊断和治疗。同时，大多数情况下直到胃癌达到晚期才可以诊断为胃癌。
胃蛋白酶原(PG)是胃液中胃蛋白酶(蛋白水解酶)的无活性前体，为一由375个氨基酸组成的蛋白多肽链，平均相对分子质量为42000，人胃黏膜中有7组胃蛋白酶同工酶原。分为PGI、PGII两个亚群，PGI主要由胃腺的主细胞的黏液颈细胞分泌；PGII，除由胃体和胃底粘膜的泌酸腺的主细胞分泌外，泌酸腺的黏液颈细胞、贲门腺和胃窦的幽门腺的黏液细胞以及十二指肠上段的Brunner腺也能产生PGⅡ,胃黏膜合成的PGⅡ约为总量的25％。胃蛋白酶原I(PGI)作为胃蛋白酶的失活前体，是胃粘膜炎症的重要指标之一。PGI的水平可以反映胃黏膜的形态和功能状态。研究发现胃癌患者的PGI将显着降低。与常规内窥镜检查相比，PGI水平的测量可为大规模筛查胃癌提供一种无创且方便的方法。
迄今为止，已开发出许多检测PGI的方法，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)，时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)，电化学发光免疫测定(ECLIA)和直接化学发光免疫测定(dCLIA)。但是，ELISA耗时且重现性差，不能用于高通量检测，RIA检测方法具有放射性，容易造成环境污染，仪器和试剂成本的ECLIA和dCLIA高，导致无法使用适用于在资源有限的地区进行大规模的健康检查。
而目前存在的PGI检测试剂盒测定需要较长的测试时间，大多为半自动测试，易造成样本污染，不能连续加样测试，并且存放时间受环境条件影响较大，长期存放的稳定性差，灵敏度差。
发明内容
为克服现有技术的上述不足，本发明提供了一种胃蛋白酶原I酶促化学发光检测试剂盒及其制备方法与应用。该胃蛋白酶原I(PGI)检测试剂盒，即开即用，无需配制，测量重复性好，灵敏度高，并且可长时间存放，可实现全自动加样，且样本用量少，节省样本。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的胃蛋白酶原I测定试剂盒，包括：
标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物的溶液、标记有PGI抗体的酶标结合物的溶液及底物液。
进一步地，所述标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物为磁微粒与PGI抗体的结合物；所述磁微粒的直径为1000-2000纳米；在所述标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物的溶液中，所述标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物的浓度为3-5μg/mL。所述标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物是由直径为1000-2000纳米的活化的磁微粒与PGI抗体洗涤、连接、封闭、稀释制备得到。
进一步地，所述标记有PGI抗体的酶标结合物为碱性磷酸酶与PGI抗体的结合物；在标记有PGI抗体的酶标结合物的溶液中，所述标记有PGI抗体的酶标结合物的浓度为0.4-0.6μg/mL。
进一步地，所述底物液为AMPDD底物液；所述底物液的生产厂家为万孚生物技术有限公司。
进一步优选地，本发明提供的胃蛋白酶原I测定试剂盒，还包括：PGI校准品。所述PGI校准品是由PGI抗原经稀释制备所得。所述PGI校准品制备，包括：用pH为7.5含有0.15mol/L NaCl，1％BSA，0.08％Tween-20，0.05％ProCline300的0.05mol/L Tris-HCl校准品稀释液将PGI抗原稀释，浓度为15ng/mL、80ng/mL，置于2-8℃保存。
本发明提供的制备胃蛋白酶原I测定试剂盒的方法，包括如下步骤：
(1)标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物的制备：
用硼酸盐缓冲液洗涤磁微粒(洗涤的次数为3次以上以进行活化)，得到活化后的磁微粒；将活化后的磁微粒加入硫酸铵缓冲液中，分散均匀，得到混合液1，然后加入PGI单克隆抗体，得到混合液2，将混合液2放在37℃培养箱中进行第一次孵育处理，放在磁力架上使用磁力分离上清液和沉淀，取上清液，往所述上清液中加入BSA溶液，进行第二次孵育处理(对磁微粒与抗体进行封闭)，得到标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物的溶液；
(2)标记有PGI抗体的酶标结合物的制备：
将碱性磷酸酶和PGI抗体加入水中，混合均匀，得到混合液3；往所述混合液中加入含戊二醛的磷酸盐缓冲液，进行第一次振荡孵育，然后加入单乙醇胺溶液(PGI抗体与碱性磷酸酶的终止液)，进行第二次振荡孵育，得到混合液4；将所述混合液进行透析处理，得到标记有PGI抗体的酶标结合物。
进一步地，步骤(1)所述磁微粒为Tosyl磁微粒；所述硼酸盐缓冲液的pH值为9.0-10.0，所述硼酸盐缓冲液的浓度为0.8-1.2mol/L；所述硫酸铵缓冲液的pH为9.0-10.0，所述硫酸铵缓冲液的浓度为2-4mol/L；在所述混合液1中，所述活化后的磁微粒的浓度为9-11mg/mL；在所述混合液2中，PGI单克隆抗体的浓度为150-250μg/mL。
优选地，步骤(1)所述硼酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L。
优选地，步骤(1)所述硫酸铵缓冲液的浓度为3mol/L。
优选地，步骤(1)所述硼酸盐缓冲液的pH值为9.5。
优选地，步骤(1)所述硫酸铵缓冲液的pH值为9.5。
进一步地，步骤(1)所述第一次孵育处理的温度为37℃，第一次孵育处理的时间为16-20小时；所述BSA溶液的浓度为1-1.5wt％，所述BSA溶液与上清液的体积比为1:1-1:2；所述第二次孵育处理的温度为37℃，第二次孵育处理的时间为5-7小时。
优选地，步骤(1)所述BSA溶液的浓度为1wt％。
优选地，步骤(1)所述第一次孵育处理的时间为18小时。
优选地，步骤(1)所述第二次孵育处理的时间为6小时。
进一步地，步骤(1)中进行第二次孵育处理后，标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物可以使用Tris-HCl缓冲液进行清洗。该Tris-HCl缓冲液为含0.15mol/L NaCl，0.05％Tween20的0.025mol/L Tris-HCl缓冲液(pH为7.0-8.0)。
进一步地，步骤(1)中进行第二次孵育处理后，标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物，还可以使用Tris-HCl缓冲液进行稀释。该Tris-HCl缓冲液为含有0.15mol/L NaCl，0.5％BSA，0.08％Tween-20，0.05％ProCline300的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH为7.0-8.0)。
进一步地，在步骤(2)所述混合液3中，碱性磷酸酶的浓度为1-3mg/mL，PGI抗体的浓度为3-5mg/mL；在所述含戊二醛的磷酸盐缓冲液中，戊二醛的浓度为1-2％；所述含戊二醛的磷酸盐缓冲液与混合液3的体积比为1:1-1:2；所述第一次振荡温育的温度为37℃，第一次振荡温育的时间为3-5h；所述单乙醇胺溶液的浓度为1-2mol/L；所述单乙醇胺溶液与含戊二醛的磷酸盐缓冲液的体积比为1:1-1:2；所述第二次振荡温育的时间为1-3h，第二次振荡温育的温度为室温；所述透析处理采用的透析袋截留分子量为40kD，所述透析处理的时间为3-5h。
优选地，在所述含戊二醛的磷酸盐缓冲液中，戊二醛的浓度为1％，所述含戊二醛的磷酸盐缓冲液的pH值为7.0-8.0。
进一步地，步骤(2)所述单乙醇胺溶液的浓度为1mol/L。
优选地，步骤(2)所述标记有PGI抗体的酶标结合物的保护剂可以为等体积的甘油和1％BSA。
优选地，步骤(2)所述标记有PGI抗体的酶标结合物可以使用缓冲液进行稀释至所需浓度；该缓冲液配方为含有0.15mol/L NaCl，1％BSA，0.08％Tween-20，0.1mmol/LZnCl2，5mmol/LMgCl2·6H2O，0.05％ProCline300的0.05mol/LMES缓冲液，pH＝5-7。
优选地，步骤(2)所述第一次振荡温育的时间为4h。
优选地，步骤(2)所述第二次振荡温育的时间为2h。
本发明提供的胃蛋白酶原I(PGI)测定试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物的溶液与标记有PGI抗体的酶标结合物的溶液加入反应容器中，加入待测样本，进行第一次孵育处理，清洗，加入底物液，进行第二次孵育处理，清洗，测定发光值，并根据主曲计算公式(可参照图2所示)，计算出浓度。
进一步地，所述标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物的溶液与标记有PGI抗体的酶标结合物的溶液的体积比为1:0.8-1-:1.2；所述标记有PGI抗体的酶标结合物的溶液与待测样本的体积比为4.8:1-5.2:1；所述第一次孵育处理的时间为5-10min；所述底物液与待测样本的体积比为18:1-20：1；所述第二次孵育处理的时间为5-10min。
本发明提供的试剂盒是将胃蛋白酶原抗体连接在磁珠微球表面作为固相试剂，经捕捉样本中的胃蛋白酶原以及加入酶标抗胃蛋白酶原单克隆抗体试剂后，形成酶标抗体夹心免疫复合物。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供的胃蛋白酶原I测定试剂盒，即开即用，无需配制，测量重复性好，灵敏度高，并且可长时间存放，可实现全自动加样，且样本用量少，节省样本。
(2)本发明提供的胃蛋白酶原I测定试剂盒，将高灵敏的化学发光技术与稳定性强的磁微粒技术结合在一起，制备的试剂盒灵敏度高，稳定性好，能够满足临床要求；同时整个反应检测过程配套可以使用全自动检测分析仪器，连续加样，缩短了操作时间，可用于大规模的社区健康检查，具有一定的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例提供的免疫分析试剂盒的检测原理示意图；
图2是本发明实施例中的胃蛋白酶原I(PGI)检测试剂盒的标准曲线；
图3为本发明实施例采用PGI的比对试验结果示意图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1
一种胃蛋白酶原I测定试剂盒，所述试剂盒包括(1)标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物的溶液；(2)标记有PGI抗体的酶标结合物的溶液；(3)底物液；(4)PGI校准品。
所述标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物为磁微粒与PGI抗体的结合物；所述磁微粒的直径为1000-2000纳米；在所述标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物的溶液中，标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物的浓度为4μg/mL。
在所述标记有PGI抗体的酶标结合物的溶液中，所述标记有PGI抗体的酶标结合物的浓度为0.5μg/mL。
所述底物液为AMPDD底物液；所述底物液的生产厂家为万孚生物技术有限公司。
所述标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物的溶液是由直径为1000～2000纳米的活化的磁微粒与PGI抗体洗涤、连接、封闭、稀释制备得到；所述标记有PGI抗体的酶标结合物是由碱性磷酸酶标记PGI抗体制备得到；所述PGI校准品是由PGI抗原经稀释制备所得；
所述磁微粒活化的缓冲液配方为0.1mol/L硼酸盐缓冲液，pH为9.5。
所述磁微粒与PGI单克隆抗体结合的缓冲液配方为3mol/L硫酸铵缓冲液，pH值为9.5。
所述磁微粒与PGI单克隆抗体封闭的缓冲液配方为1wt％BSA溶液。
所述磁微粒与PGI单克隆抗体结合后的清洗缓冲液配方为0.15mol/L NaCl，0.05％Tween20的0.025mol/L Tris-HCl缓冲液，pH＝7.5。
所述磁微粒缓冲液配方为含有0.15mol/L NaCl，0.5％BSA，0.08％Tween-20，0.05％ProCline300的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液，pH值为7.5。
所述PGI抗体与碱性磷酸酶结合的缓冲液配方为含1wt％戊二醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH值为7.5。
所述PGI抗体与碱性磷酸酶终止液配方为1mol/L的单乙醇胺溶液。
所述标记有PGI抗体的酶标结合物的保护剂为等体积的甘油和1wt％BSA。
所述标记有PGI抗体的酶标结合物稀释时的缓冲液配方为含有0.15mol/L NaCl，1％BSA，0.08％Tween-20，0.1mmol/LZnCl2，5mmol/LMgCl2·6H2O，0.05％ProCline300的0.05mol/LMES缓冲液，pH值为6.0。
所述PGI校准品稀释液缓冲液配方为含有0.15mol/L NaCl，1％BSA，0.08％Tween-20，0.05％ProCline300的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液，pH值为7.5。
实施例2
一种基于PGI试剂盒的制备方法，包括以下内容：
标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物的溶液的制备：用0.1mol/L的pH为9.5硼酸盐缓冲液将1mL的Tosyl磁微粒洗涤3次以进行活化；将活化后的磁微粒悬浮于550μL的3mol/L的pH为9.5硫酸铵缓冲液中；然后将200μL的1mg/mLPGI单克隆抗体溶液加入到硫酸铵结合缓冲液中；将试管放在37℃培养箱中旋转孵育18小时，反应后，将试管放在磁力架上以分离上清液，然后，往上清液中添加100μL的1wt％BSA溶液，并在37℃继续旋转孵育6小时；反应结束后，用含有0.15mol/L NaCl，0.05％Tween20的0.025mol/L的pH为7.2的Tris-HCl缓冲液洗涤5次；最后，用pH为7.5含有0.15mol/L NaCl，0.5％BSA，0.08％Tween-20，0.05％ProCline300的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液将标记有PGI单克隆抗体的磁微粒稀释至磁珠浓度为4μg/mL，并保存在2-8℃下以备后用。
标记有PGI抗体的酶标结合物的溶液的制备：将碱性磷酸酶与PGI抗体溶于超纯水中并分别稀释至4mg/mL和8mg/mL。将250μL的4mg/mL的碱性磷酸酶溶液转移至1.5mL试管中并与250μL的8mg/mL PGI抗体溶液混合,其次，向溶液中加入0.5mL含1wt％戊二醛的pH为7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液。将所得混合物在37℃下轻微振荡温育4h。然后向混合物中加入0.1mL的1mol/L的单乙醇胺溶液，随后在室温下振荡温育2h；将混合物在4℃下用PBS溶液透析，所述透析处理采用的透析袋截留分子量为40kD，所述透析处理的时间为4h；透析后，酶标PHI抗体转移至试管中，并与等体积的甘油和1wt％BSA混合。最后，用pH为6.0的含有0.15mol/L NaCl，1wt％BSA，0.08％Tween-20，0.1mmol/LZnCl2，5mmol/LMgCl2·6H2O，0.05wt％ProCline300的0.05mol/LMES缓冲液将酶标复合物稀释2000倍，得到浓度为0.5μg/mL的标记有PGI抗体的酶标结合物的溶液，放在2-8℃下以备后用。
PGI校准品制备：用pH为7.5含有0.15mol/L NaCl，1wt％BSA，0.08％Tween-20，0.05wt％ProCline300的0.05mol/L Tris-HCl校准品稀释液将PGI抗原稀释，浓度为15ng/mL、80ng/mL，置于2-8℃保存。
所述底物液为AMPDD底物液；所述底物液的生产厂家为万孚生物技术有限公司。
实施例3本发明试剂盒的性能评价
1.标准曲线
用标准品稀释液将PGI抗原稀释配置成不同浓度的校准品溶液S0-S6，浓度分别为0、3、6、12、25、50、100ng/mL，保存于-20℃备用。然后使用本发明实施例提供的试剂盒对校准品进行检测，分别读取各校准品对应的发光强度值。以浓度为横坐标，发光强度为纵坐标进行拟合得到标准曲线，结果如图2。
2.最低检测限
用零浓度校准品稀释液作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的光信号值，计算器平均值(M)和标准偏差(SD)，得出M+2SD，根据零浓度企业线性参考品和相邻浓度校准品之间的浓度与光信号值结果进行两点回归拟合得出一次方程(y＝7882x+554.2)，将M+2SD的光信号值带入方程y＝7882x+554.2中，求出对应的浓度值，即为最低检出限，结果如表1所示。
2.准确度
将PGI抗原低值样本(即含浓度80ng/mL的PGI抗原的血清，下面统称低值血清)加入高值血清(含浓度150ng/mL的PGI抗原的血清)中，所加入高值血清与低值血清之间的体积比为1:9，重复用本发明实施例的试剂盒检测两次，取平均值，根据公式(1)计算结果，结果如表1。
Figure BDA0002978713130000111
式中：R-回收率；V0-低值血清的体积；V-高值血清的体积；c-高值血清加入低值血清后检测浓度；c0-低值血清的浓度；cs-高值血清的浓度。
3.精密度
在3天内使用两种不同浓度的PGI校准品(15ng/mL、80ng/mL)对本发明实施例提供的试剂盒分别进行批内和批间精密度测定，其中6次重复测定用于批内精密度，6次不同天测定用于批间精密度，结果如表1。
4.干扰物质
选取4份含浓度为16ng/ml的PGI抗原的血清样本，分别向检测样本中添加如下干扰物质胆红素(0.22mg/mL)，甘油三酯(33mg/mL)，血红蛋白(5mg/mL)和总蛋白(13.2mg/mL)，使用本发明实施例提供的试剂盒对各样品进行检测，读取发光强度。以观察检测结果与对照样本(对照样品为没有添加干扰物质的含浓度为16ng/ml的PGI抗原的血清样本)结果偏差是否≤10％，结果如表1。
表1本发明试剂盒性能检测结果
Figure BDA0002978713130000112
Figure BDA0002978713130000121
实施例4、本发明试剂盒的临床性能
血清样本采自体检中心正常体检的供血者，筛选了95例体检样本用本发明实施例的试剂盒进行检测。该检测方法(参照图1所示)，包括：
标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物的溶液与标记有PGI抗体的酶标结合物的溶液加入反应容器中，所述标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物的溶液与标记有PGI抗体的酶标结合物的溶液的体积比为1:1，加入待测样本，进行第一次孵育处理，第一次孵育处理的时间为5min，清洗，加入底物液，所述底物液与待测样本的体积比为20:1，进行第二次孵育处理，第二次孵育处理的时间为5min，清洗，测定发光值，并根据主曲计算公式(该公式如图2所示)，计算出浓度。
使用雅培公司试剂盒同样对上述样品进行浓度检测(检测按照该试剂盒的说明书进行)。
将本发明实施例中制备的试剂盒得到的检测浓度与雅培公司试剂盒(型号为ARCHITECT Pepsinogen I)检测结果浓度进行分析对比，其中PGI临床相关性为R2＝0.977，说明本发明试剂盒与国际知名品牌试剂盒(雅培公司试剂盒)具有良好的相关性。临床相关性结果如图3所示。
本发明提供的PGI定量检测的试剂盒具有快速、高通量、高灵敏度、高精密度和高特异性等优点，即可满足临床PGI定量检测的需要，又为胃功能健康大规模筛查提供了工具，且与进口试剂相比价格相对低廉，性价比高，能够缓解患者的经济负担，有一定的应用价值。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种胃蛋白酶原I测定试剂盒，其特征在于，包括：
标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物的溶液、标记有PGI抗体的酶标结合物的溶液及底物液。
2.根据权利要求1所述的胃蛋白酶原I测定试剂盒，其特征在于，所述标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物为磁微粒与PGI抗体的结合物；所述磁微粒的直径为1000-2000纳米；在所述标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物的溶液中，所述标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物的浓度为3-5μg/mL。
3.根据权利要求1所述的胃蛋白酶原I测定试剂盒，其特征在于，所述标记有PGI抗体的酶标结合物为碱性磷酸酶与PGI抗体的结合物；在标记有PGI抗体的酶标结合物的溶液中，所述标记有PGI抗体的酶标结合物的浓度为0.4-0.6μg/mL。
4.根据权利要求1所述的胃蛋白酶原I测定试剂盒，其特征在于，所述底物液为AMPDD底物液；所述底物液的生产厂家为万孚生物技术有限公司。
5.一种制备权利要求1-4任一项所述的胃蛋白酶原I测定试剂盒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物的制备：
用硼酸盐缓冲液洗涤磁微粒，得到活化后的磁微粒；将活化后的磁微粒加入硫酸铵缓冲液中，分散均匀，得到混合液1，然后加入PGI单克隆抗体，得到混合液2，进行第一次孵育处理，磁力分离上清液和沉淀，取上清液，往所述上清液中加入BSA溶液，进行第二次孵育处理，得到标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物的溶液；
(2)标记有PGI抗体的酶标结合物的制备：
将碱性磷酸酶和PGI抗体加入水中，混合均匀，得到混合液3；往所述混合液中加入含戊二醛的磷酸盐缓冲液，进行第一次振荡孵育，然后加入单乙醇胺溶液，进行第二次振荡孵育，得到混合液4；将所述混合液进行透析处理，得到标记有PGI抗体的酶标结合物的溶液。
6.根据权利要求5所述的胃蛋白酶原I测定试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述磁微粒为Tosyl磁微粒；所述硼酸盐缓冲液的pH值为9.0-10.0，所述硼酸盐缓冲液的浓度为0.8-1.2mol/L；所述硫酸铵缓冲液的pH为9.0-10.0，所述硫酸铵缓冲液的浓度为2-4mol/L；在所述混合液1中，所述活化后的磁微粒的浓度为9-11mg/mL；在所述混合液2中，PGI单克隆抗体的浓度为150-250μg/mL。
7.根据权利要求5所述的胃蛋白酶原I测定试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述第一次孵育处理的温度为37℃，第一次孵育处理的时间为16-20小时；所述BSA溶液的浓度为1-1.5wt％，所述BSA溶液与上清液的体积比为1:1-1:2；所述第二次孵育处理的温度为37℃，第二次孵育处理的时间为5-7小时。
8.根据权利要求5所述的胃蛋白酶原I测定试剂盒的制备方法，其特征在于，在步骤(2)所述混合液3中，碱性磷酸酶的浓度为1-3mg/mL，PGI抗体的浓度为3-5mg/mL；在所述含戊二醛的磷酸盐缓冲液中，戊二醛的浓度为1-2％；所述含戊二醛的磷酸盐缓冲液与混合液3的体积比为1:1-1:2；所述第一次振荡温育的温度为37℃，第一次振荡温育的时间为3-5h；所述单乙醇胺溶液的浓度为1-2mol/L；所述单乙醇胺溶液与含戊二醛的磷酸盐缓冲液的体积比为1:1-1:2；所述第二次振荡温育的时间为1-3h，第二次振荡温育的温度为室温；所述透析处理采用的透析袋截留分子量为40kD，所述透析处理的时间为3-5h。
9.权利要求1-4任一项所述的胃蛋白酶原I测定试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物的溶液与标记有PGI抗体的酶标结合物的溶液加入反应容器中，加入待测样本，进行第一次孵育处理，清洗，加入底物液，进行第二次孵育处理，清洗，测定发光值，并根据主曲计算公式，计算出浓度。
10.根据权利要求9所述的胃蛋白酶原I测定试剂盒的检测方法，其特征在于，所述标记有PGI单克隆抗体的磁性微球结合物的溶液与标记有PGI抗体的酶标结合物的溶液的体积比为1:0.8-1:1.2；所述标记有PGI抗体的酶标结合物的溶液与待测样本的体积比为4.8:1-5.2:1；所述第一次孵育处理的时间为5-10min；所述底物液与待测样本的体积比为18:1-20：1；所述第二次孵育处理的时间为5-10min。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114252609A (zh) * 2021-12-23 2022-03-29 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种基质金属蛋白酶-9的检测试剂盒及其检测方法
CN114924065A (zh) * 2022-04-02 2022-08-19 深圳天辰医疗科技有限公司 胃蛋白酶原ⅰ的检测试剂盒及其制备方法与应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006162467A (ja) * 2004-12-08 2006-06-22 Kyowa Medex Co Ltd 光透過性磁性粒子を用いた免疫測定方法
CN102323417A (zh) * 2011-08-31 2012-01-18 内蒙古科慧生物科技有限责任公司 胃蛋白酶原i(pgi)定量测定试剂盒及其检测方法
CN104965077A (zh) * 2015-05-22 2015-10-07 必欧瀚生物技术（合肥）有限公司 一种胃蛋白酶原ⅰ酶促化学发光检测试剂盒
CN106226523A (zh) * 2016-07-04 2016-12-14 福建广生堂药业股份有限公司 一种免疫标志物的检测方法、试剂和检测试剂盒
CN112098654A (zh) * 2020-09-15 2020-12-18 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种胃蛋白酶原i/ii测定试剂盒及其制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006162467A (ja) * 2004-12-08 2006-06-22 Kyowa Medex Co Ltd 光透過性磁性粒子を用いた免疫測定方法
CN102323417A (zh) * 2011-08-31 2012-01-18 内蒙古科慧生物科技有限责任公司 胃蛋白酶原i(pgi)定量测定试剂盒及其检测方法
CN104965077A (zh) * 2015-05-22 2015-10-07 必欧瀚生物技术（合肥）有限公司 一种胃蛋白酶原ⅰ酶促化学发光检测试剂盒
CN106226523A (zh) * 2016-07-04 2016-12-14 福建广生堂药业股份有限公司 一种免疫标志物的检测方法、试剂和检测试剂盒
CN112098654A (zh) * 2020-09-15 2020-12-18 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种胃蛋白酶原i/ii测定试剂盒及其制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
贲长恩等: "《组织化学》", 30 November 2001, 人民卫生出版社 *
陈允硕: "《现代实用免疫细胞化学技术》", 31 October 1997, 上海科学技术出版社 *
陈志南等: "《抗体分子与肿瘤》", 30 June 2002, 人民军医出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114252609A (zh) * 2021-12-23 2022-03-29 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种基质金属蛋白酶-9的检测试剂盒及其检测方法
CN114924065A (zh) * 2022-04-02 2022-08-19 深圳天辰医疗科技有限公司 胃蛋白酶原ⅰ的检测试剂盒及其制备方法与应用

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