CN113106126B

CN113106126B - 一种提高真菌的原生质体转化效率或基因编辑效率的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN113106126B
Application number: CN202110024081.9A
Authority: CN
Inventors: 周志华; 邹根; 肖美丽; 柴顺星; 朱志华
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2020-01-09
Filing date: 2021-01-08
Publication date: 2023-07-18
Anticipated expiration: 2041-01-08
Also published as: CN113106126A; WO2021139779A1

Abstract

本发明提供了一种提高真菌的原生质体转化效率或基因编辑效率的方法及试剂盒。本发明的方法通过在以基因编辑为目的的原生质体转化过程中或之前，添加TritonX‑100或其类似物，抑制有丝分裂的抑菌剂，或肌醇或其类似物；更佳地还通过调节sgRNA‑Cas酶的浓度，有效地提高了真菌的原生质体转化效率及基因编辑效率，大量节约了获得转化子或基因编辑产物的时间以及提高了获得量。

Description

一种提高真菌的原生质体转化效率或基因编辑效率的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及提高真菌的原生质体转化效率或基因编辑效率的方法及试剂盒，特别是涉及应用化合物分子提高真菌进行基因组编辑的效率的方法及其在丝状真菌中的应用。

背景技术

基因组编辑技术是当前生命科学研究中常用的生物技术，利用该技术，科学家们能够对目标基因进行定点敲除和插入，是功能基因组研究的重要工具。经过多年的发展，目前主要有锌指核酸酶(ZFNs)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas9三种基因组编辑技术。以上所述3种基因组编辑技术的原理都是相同的，即借助核酸酶使得基因组上特定位点的DNA双链发生断裂，从而激活细胞的天然修复机制(包括非同源末端连接和同源重组修复)，使得该位点发生各种突变。相较于ZFNs和TALEN技术，CRISPR/Cas9技术具有操作简单、特异性好、能同时进行多位点编辑等优势，使它成为当下实验室主要的基因组编辑技术。

CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein)系统是从细菌的天然免疫系统中发现的，它的主要作用是识别入侵的病毒或其他外源DNA，并对其降解。这一过程主要包括crRNA的合成与crRNA引导下的DNA位点识别与剪切，因此这个系统被改造成一个有效的基因组编辑系统。根据这个基因组编辑系统的功能元件不同，CRISPR/Cas系统可以分为3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前，来自Streptococcus pyogenes的Cas9在CRISPR/Cas基因组编辑技术中应用最为广泛。

CRISPR/Cas9系统主要包括crRNA(CRISPR RNA)、tracrRNA(trans-activatingRNA)、Cas9(CRISPR associated system)三个部分。CrRNA和tracrRNA可以形成嵌合RNA，被称为sgRNA，它能识别并靶向PAM(protospacer adjacent motif，序列为5’-NGG-3’)位点上游的20bp序列，并在sgRNA的引导作用下，Cas9对该位点的DNA双链进行切割。经过CRISPR系统的不断改进，现在CRISPR/Cas9系统中的sgRNA是由一条包含crRNA和tracrRNA的核苷酸经折叠形成，它可以通过体外或体内转录形成。

真菌是一类与人类密切相关的微生物，除了具有巨大的食用和药用价值之外，还被广泛应用于工业开发，所以在真菌中建立高效的基因组编辑系统有利于它的研究和应用。2015年，Liu在里氏木霉中成功建立CRISPR/Cas9系统并实现对基因的高效敲除，这是首次在丝状真菌中建立CRISPR/Cas9系统。随后，CRISPR/Cas9系统在其他丝状真菌中也被成功建立。主要方法包括：(1)在出发菌株中表达Cas9蛋白，体内转录sgRNA或直接导入体外合成的sgRNA；(2)将Cas9和sgRNA构建到质粒上，导入到出发菌株中对目的基因进行编辑；(3)将体外合成的sgRNA和Cas9形成复合物之后再导入出发菌株中进行基因编辑(双体外CRISPR/Cas9系统)。随着CRISPR/Cas9技术的进一步发展以及人们对其认知的逐渐深入，它将会在更多的生物体中应用，获得更多的研究成果。

但是，CRISPR/Cas9技术目前在应用中仍然存在许多问题，如基因组编辑效率低、脱靶、PAM依赖等；而对于多核生物如米曲霉、麦角菌等，对其进行遗传操作后还需要进行传代与筛选才能得到纯合转化子，这是一项费时费力的工作。为了能使此类生物体或更多的真菌更好的应用于科学研究和实际生产，建立一个高效的CRISPR/Cas基因编辑系统是必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高真菌的原生质体转化效率或基因编辑效率的方法及试剂盒，用于该方法的试剂及试剂盒。

在本发明的第一方面，提供一种提高真菌的原生质体转化效率或基因编辑效率的方法，包括：将sgRNA与Cas酶混合获得sgRNA-Cas酶复合物，转化原生质体；其中，在进行原生质体转化时，添加：TritonX-100或其类似物，抑制有丝分裂的抑菌剂，或肌醇或其类似物。

在一个优选例中，所述的抑制有丝分裂的抑菌剂包括选自以下的试剂：苯菌灵、多菌灵、甲基硫菌灵，或其类似物；或所述的肌醇类似物包括：磷酸酰肌醇。

在另一优选例中，进行原生质体转化前(较佳地，对于多核丝状真菌)，还包括：在真菌的孢子形成、孢子萌发阶段和/或原生质体再生阶段，加入所述抑制有丝分裂的抑菌剂，或所述肌醇或其类似物。

在另一优选例中，所述的TritonX-100或其类似物在转化体系中的浓度为0.00001～0.1％(w/v)；较佳地为0.0005～0.05％；更佳地为0.001～0.02％；如0.002％，0.004％，0.006％，0.008％，0.01％，0.015％等。

在另一优选例中，所述的抑制有丝分裂的抑菌剂在转化体系中的浓度为：0.008～10ug/ml，较佳地0.01～5ug/ml；如0.02ug/ml，0.05ug/ml，0.08ug/ml，0.1ug/ml，0.2ug/ml，0.4ug/ml，0.5ug/ml，0.8ug/ml，1ug/ml，1.5ug/ml，2ug/ml，3ug/ml，4ug/ml。

在另一优选例中，所述的肌醇或其类似物在转化体系中的浓度为：0.006％～0.8％，较佳地0.01％～0.5％；如0.02％，0.05％，0.1％，0.2％，0.3％，0.4％。

在另一优选例中，所述CRISPR/Cas基因编辑方法中，采用sgRNA与Cas酶进行基因编辑，所述sgRNA靶向于真菌基因组中待编辑位点；较佳地，将sgRNA与Cas酶混合制备sgRNA-Cas酶复合物，转化原生质体。

在另一优选例中，所述sgRNA-Cas酶复合物在转化体系中的浓度为80～300nM；如较佳地90～250nM；更佳地100～200nM，如120，140，160，180，190nM。

在另一优选例中，sgRNA与Cas酶以摩尔比1:1～120:1混合，较佳地5:1～100:1，更佳地10:1～95:1，更佳地20:1～90:1，如30:1，40:1，50:1，60:1，70:1，80:1；较佳地，所述的Cas酶为Cas9酶。

在另一优选例中，转化体系中，原生质体的量为1×10⁴个/ml～1×10⁹个/ml；较佳地1×10⁵个/ml～1×10⁸个/ml；如5×10⁵个/ml、1×10⁶个/ml、5×10⁶个/ml、1×10⁷个/ml或5×10⁷个/ml等。

在本发明的另一方面，提供TritonX-100或其类似物，抑制有丝分裂的抑菌剂，或肌醇或其类似物的用途，用于：提高真菌的原生质体转化效率或基因编辑效率；或制备提高真菌的原生质体转化效率或基因编辑效率的组合物。

在一个优选例中，所述的原生质体转化为PEG介导原生质体转化。

在本发明的另一方面，提供一种用于真菌的原生质体转化的试剂盒，其中包括：靶向真菌基因组的sgRNA，Cas酶，或它们的复合物；化合物，选自：TritonX-100或其类似物，抑制有丝分裂的抑菌剂，或肌醇或其类似物，或它们的组合。

在一个优选例中，其中还包括选自下组的试剂：真菌培养基(如PDA培养基，SDB培养基，CD培养基等)；原生质体溶液(如含有山梨醇、KH₂PO₄的溶液，含有山梨醇、CaCl₂、Tris-HCl的溶液，含有PEG6000、CaCl₂、Tris-HCl的溶液、含有NaCl、KH₂PO₄的溶液)；原生质体清洗液；微量元素；基因组抽提试剂。

在一个优选例中，所述sgRNA-Cas酶复合物的浓度为80～300nM。

在另一优选例中，所述TritonX-100或其类似物的浓度为0.00001～0.1％；较佳地为0.0005～0.05％；更佳地为0.001～0.02％；

在另一优选例中，所述肌醇或其类似物的浓度(w/v)为0.006％～0.8％，较佳地0.01％～0.5％。

在另一优选例中，所述抑制有丝分裂的抑菌剂的浓度为0.008～10ug/ml，较佳地0.01～5ug/ml。

在本发明的另一方面，提供一种用于转化的组合物，包括：sgRNA-Cas酶复合物和有效量的TritonX-100或其类似物，抑制有丝分裂的抑菌剂，或肌醇或其类似物；较佳地，所述sgRNA-Cas酶复合物的浓度为80～300nM；或所述TritonX-100或其类似物的浓度为0.00001～0.1％；较佳地为0.0005～0.05％；更佳地为0.001～0.02％；所述肌醇或其类似物的浓度为0.006％～0.8％，较佳地0.01％～0.5％；或所述抑制有丝分裂的抑菌剂的浓度为0.008～10ug/ml，较佳地0.01～5ug/ml。

在另一优选例中，所述用于转化的组合物中还包括：其它转化试剂，或细胞学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒或所述的用于转化的组合物的用途，用于：提高真菌的原生质体转化效率或基因编辑效率；或进行真菌的原生质体转化或基因编辑。

在一个优选例中，所述真菌为多核真菌或丝状真菌；较佳地，所述真菌为子囊菌门的真菌；较佳地，所述真菌包括(但不限于)：木霉属真菌，虫草属真菌，曲霉属真菌；更佳地，所述真菌包括(但不限于)：里氏木霉(Trichoderma reesei)、蛹虫草(Cordycepsmilitaris)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)、黑曲霉(A.niger)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、灵芝(Ganoderma lucidum)、香菇(Lentinus edodes)、平菇(Pleurotus ostreatus)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)、金针菇(Flammulina velutipes)、真姬菇(Hypsizygus marmoreus)。

在另一优选例中，所述的sgRNA靶向于：里氏木霉的ura5基因；较佳地，靶基因识别位点具有SEQ ID NO:1中第355～374位所示的核苷酸序列；蛹虫草的ura5基因；较佳地，靶基因识别位点具有SEQ ID NO:2中第492～511位所示的核苷酸序列；米曲霉的AowA基因；较佳地，靶基因识别位点具有SEQ ID NO:3中第160～179位所示的核苷酸序列。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、sgRNA体外转录产物在2％琼脂糖凝胶电泳下的验证结果。图中泳道M为DS-2000DNA Marker电泳结果(片段从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)；泳道1、2为sgRNA体外转录产物。

图2、里氏木霉双体外CRISPR/Cas9原生质体ura5突变转化子测序验证靶标是否发生突变；其中，上图为转化体系中添加TritonX-100时得到的ura5突变转化子测序结果(sgRNA-Cas9 180nM)，下图为未添加TritonX-100时得到的ura5突变转化子测序结果(sgRNA-Cas9 180nM)。

图3、蛹虫草双体外CRISPR/Cas9原生质体ura5突变转化子测序验证靶标是否发生突变。

图4、米曲霉双体外CRISPR/Cas9突变wA转化子PCR验证结果示意图。图中泳道M为1kb DNA Ladder(片段从上到下依次为12000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2500bp、2000bp、1500bp、1000bp、500bp)，泳道1为△wA纯合突变转化子(只有一条约3000bp条带)，泳道2为△wA杂合突变转化子(有2条条带，分别为突变型3000bp和野生型300bp)，泳道3为野生型(约300bp)。

图5、米曲霉在添加肌醇或苯菌灵下的遗传操作流程。即在米曲霉原生质体介导转化过程中，分别在孢子形成、孢子萌发、原生质体再生3个阶段都添加肌醇或苯菌灵，增加米曲霉单核细胞的概率，从而增加纯合转化子概率。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，提供了优化的真菌原生质体转化技术以及基因编辑技术。本发明通过在以基因编辑为目的的原生质体转化过程中或之前，添加TritonX-100或其类似物，抑制有丝分裂的抑菌剂，或肌醇或其类似物；更佳地还通过调节sgRNA-Cas酶的浓度，有效地提高了真菌的原生质体转化效率及基因编辑效率，大量节约了获得转化子或基因编辑产物的时间以及提高了获得量。

本发明提供了一种提高真菌的原生质体转化效率或基因编辑效率的方法及试剂盒，包括：以CRISPR/Cas基因编辑方法靶向于真菌基因组中待编辑位点，进行基因编辑；其中，在利用CRISPR/Cas基因编辑试剂进行原生质体转化时，添加：TritonX-100或其类似物，抑制有丝分裂的抑菌剂，或肌醇或其类似物。

作为本发明的优选方式，所述真菌为多核真菌。

作为本发明的优选方式，所述真菌为丝状真菌。

作为本发明的优选方式，所述真菌为子囊菌门的真菌；较佳地，所述真菌包括：木霉属真菌，虫草属真菌，曲霉属真菌。

在本发明的更为具体的实施方式中，所述真菌包括：里氏木霉(Trichodermareesei)、蛹虫草(Cordyceps militaris)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)、黑曲霉(A.niger)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、灵芝(Ganoderma lucidum)、香菇(Lentinus edodes)、平菇(Pleurotusostreatus)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)、金针菇(Flammulina velutipes)、真姬菇(Hypsizygus marmoreus)等。应理解，尽管本发明的实施例中优选地以这些菌株作为实例，但是本发明的技术方案还可被应用于其它的真菌中。

本发明人研究了提高真菌原生质体转化效率以及基因编辑效率的方法。从一系列的化合物中，本发明人意外地发现，在转化体系中加入TritonX-100或其类似物，抑制有丝分裂的抑菌剂，或肌醇或其类似物，可以极为有效地提高转化效率和基因编辑效率。例如，在本发明人的一次具体的实验中，本发明人获得了12个转化子，且发现该12个转化子都发生了基因编辑。

本发明人还发现，在真菌，特别是多核真菌的孢子形成、孢子萌发或原生质体再生阶段的培养基中加入肌醇或苯菌灵，能提高获得纯合转化子的效率。所述肌醇是一种生长因子。所述苯菌灵是一种杀菌剂，能抑制细胞有丝分离。例如，在本发明人的一次具体的实验中，不添加肌醇苯菌灵时，纯化转化子获得量为0，而当添加肌醇时转化子获得量为7个，当添加苯菌灵时转化子获得量为16个，可见肌醇和苯菌灵的添加，极大地增加了获得纯合转化子的比例。

在本发明的优选方式中，所述的TritonX-100或其类似物包括选自以下的试剂：TritonX-100或其类似物，其中优选的为TritonX-100；所述的抑制有丝分裂的抑菌剂包括选自以下的试剂：苯菌灵、多菌灵、甲基硫菌灵，或其类似物，其中优选的为苯菌灵；或所述的肌醇或其类似物包括选自以下的试剂：肌醇，磷酸酰肌醇。

本发明还包括上述化合物的异构体、溶剂合物、前体或盐，只要它们也具有与所述化合物具有相同或基本相同的功能。所述的“盐”是指化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。所述的“化合物的前体”指当用适当的方法添加后，该化合物的前体在转化体系或培养体系中转化成所述化合物或其活性形式(如具有活性的盐或异构体)。

本领域人员应理解，在得知了本发明化合物的结构以后，可通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料，来获得本发明的化合物，比如化学合成或从生物(如动物或植物)中提取或在提取基础上进行改造的方法，这些方法均包含在本发明中。合成的化合物可以进一步通过柱层析法、高效液相色谱法等方式进一步纯化。此外，也可以通过商购的方式获得本发明的化合物。

基于本发明人的新发现，本发明还提供了一种用于转化的组合物，含有有效量的TritonX-100或其类似物，抑制有丝分裂的抑菌剂或肌醇，或它们的异构体、溶剂合物、前体，以及sgRNA-Cas酶复合物。

基于本发明人的新发现，本发明还提供了一种复合培养基，其包括：真菌培养基和有效量的TritonX-100或其类似物，抑制有丝分裂的抑菌剂或肌醇；较佳地，所述的真菌培养基为用于真菌孢子形成、孢子萌发和原生质体再生阶段培养的培养基。所述的真菌孢子形成或孢子萌发阶段培养的培养基可以是本领域已知的培养基。

本发明中，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

对于真菌的原生质体转化，研究之初，本发明人将sgRNA与Cas酶混合获得的sgRNA-Cas酶复合物与原生质体混合转化，但发现其转化效率极为低下，在有些情况下甚至难以获得有效的转化子。本发明人对于影响转化的可能因素进行分析、试验，发现sgRNA-Cas酶复合物的浓度对于转化效率具有较大的影响。在此基础上，本发明人优化了转化体系中sgRNA-Cas酶复合物的浓度，作为本发明的优选方式，sgRNA-Cas酶复合物在转化体系中的浓度为80～300nM，较佳地90～250nM，更佳地100～200nM，如120，140，160，180，190nM。

作为本发明的优选方式，所述的sgRNA-Cas酶复合物中，sgRNA与Cas酶以摩尔比1:1～120:1混合。

CRISPR介导的基因编辑中，可运用的Cas酶包括Cas9，Cas9n，Cas13a，Cas13d，CasRx等，这些Cas可被应用于本发明中。作为本发明的优选方式，所述的Cas酶为Cas9。此外，这些酶的变体、衍生物、活性片段或融合形式，也可被应用于本发明中。

所述的sgRNA(single-guided RNA)是针对基因组中待编辑的位点设计的序列。在本发明的优选实施方式中，所述的sgRNA针对于靶基因待编辑位点区域的约15～30bp(如约20bp)长度的序列区域进行设计。根据靶向编辑的特定需要，本领域技术人员还可以设计不同序列结构、不同长度的sgRNA。

此外，CRISPR介导的基因编辑中，根据靶向编辑的特定需要，还可以设计配合所述sgRNA的供体序列(Donor)。

基于本发明人的新发现，本发明还提供了一种用于真菌的原生质体转化的试剂盒，其中包括：靶向真菌基因组的sgRNA，Cas酶，或它们的复合物；化合物，选自：TritonX-100或其类似物，抑制有丝分裂的抑菌剂，或肌醇或其类似物，或它们的组合。

作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还包括选自下组的试剂：真菌培养基(如PDA培养基，SDB培养基，CD培养基等)；原生质体溶液(如含有山梨醇、KH₂PO₄的溶液，含有山梨醇、CaCl₂、Tris-HCl的溶液，含有PEG6000、CaCl₂、Tris-HCl的溶液、含有NaCl、KH₂PO₄的溶液)；原生质体清洗液；微量元素；基因抽提试剂。应理解，其它的常规用于原生质体转化、清洗、稳定等的试剂，用于真菌培养、制备原生质体等的试剂也可被包含在所述的试剂盒中。各种试剂可以被有效地配伍以方便本领域技术人员使用，或者可被分别置于不同的容器中备用。此外，本发明的试剂盒中还可包含说明其中各个试剂用法用量、操作步骤等的使用说明书。

在本发明的具体的实施例中，设计了靶向于下组基因的sgRNA：里氏木霉的ura5基因，蛹虫草的ura5基因，米曲霉的AowA基因。根据实施结果，对于sgRNA-Cas酶复合物在转化体系中的浓度调控，以及利用TritonX-100肌醇或苯菌灵的调节，均呈现显著的提高转化效率以及提高基因编辑效率的技术效果。

所述的里氏木霉为子囊菌门木霉属真菌，作为工业菌株，被应用于分解植物材料的酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等。所述的蛹虫草隶属于子囊菌门虫草属，具有重要的药用价值。所述的米曲霉为子囊菌门曲霉属真菌，作为一种常用于食品酿造的食品安全级菌株，具有多核的特征，这使它能很好的保持遗传稳定性，但同时也使基因组编辑变得更加困难，主要体现在得到纯合的转化子。

ura5是生物体编码乳清酸磷酸核糖转移酶的基因，参与尿嘧啶的合成代谢。因它具有双向选择(ura5不能在含5-FOA的条件下生长；ura5^-不能在基本培养基上生长，需另外添加尿苷或尿嘧啶)的性质，常作为遗传操作过程中的筛选标记。wA基因是聚酮合酶基因，参与米曲霉分生孢子色素的合成。argB基因参与精氨酸生物合成，在本发明中，作为营养缺陷型筛选标记，用于敲除wA基因。其中，里氏木霉ura5(Trura5)序列具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；蛹虫草ura5(Cmura5)序列具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；米曲霉wA(AowA)序列具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；米曲霉argB序列具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。本发明的技术方案可针对上述工业学、药学或食品学上有用的菌株进行改造，体现了其良好的应用价值。

根据本发明具体实施结果，本发明还提供了针对里氏木霉的ura5基因的优选的靶基因识别位点，其具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；针对蛹虫草的ura5基因的优选的靶基因识别位点，其具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；以及针对米曲霉的AowA基因的优选的靶基因识别位点，其具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。针对这些靶基因识别位点设计的sgRNA，其与Cas酶复合后，呈现了理想的基因编辑效果。

本发明的转化及基因编辑方法，可以一次性获得较多的转化子且基因编辑效率非常高，节约了大量时间，并可能降低了脱靶概率，为真菌的基因组编辑、基因功能研究与分子育种带来了极大的便利。

本发明的主要优点在于：

(1)sgRNA-Cas酶复合物为核酸与蛋白的混合体(为双体外CRISPR/Cas9系统)，在进行转化中存在效率低、基因编辑效果不理想的问题，而本发明通过添加适当的化合物和/或优化sgRNA-Cas9浓度，有效提高了双体外基因组编辑效率，能使基因组编辑效率达到100％。

(2)通过在转化体系中添加TritonX-100或其类似物提高原生质体转化效率，通过在培养时添加抑制有丝分裂的抑菌剂或肌醇类化合物提高真菌如米曲霉纯合转化子效率。

(3)首次在蛹虫草和米曲霉中建立双体外基因组编辑技术、并实现对基因组进行高效编辑。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、sgRNA体外转录与纯化

针对靶基因，设计sgRNA识别位点，合成如下用于形成sgRNA的引物：sgRNA-F：TAATACGACTCACTATA-sgRNA site-GTTTTAGAGCTAGAAAT AGCAA。

针对里氏木霉RutC30乳清酸磷酸核糖转移酶ura5(SEQ ID NO:1)所设计的sgRNA-F序列为：

sgRNA-Trura5-F：TAATACGACTCACTATAGGCGAGGGCGGCAACATCGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA(SEQ ID NO:5)。

针对蛹虫草Cm01的ura5(SEQ ID NO:2)所设计的sgRNA-F序列为：

sgRNA-Cmura5-F：TAATACGACTCACTATAGGACCGGATGGAGAAGCTTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA(SEQ ID NO:6)。

针对米曲霉NSAR1的聚酮合酶wA所设计的sgRNA-F序列为：

sgRNA-wA-F：TAATACGACTCACTATAGGGAAGATCTTCCGTTCAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA(SEQ ID NO:7)。

将这些sgRNA-F引物分别与sgRNA-R引物PCR扩增，回收得到sgRNA模板；所述sgRNA-R引物序列如下：

sgRNA-R：AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAA(SEQ ID NO:8)。

对这些短链的gRNA模板进行纯化，等体积酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1抽提之后，水相再用等体积氯仿抽提，得到的水相用3倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M醋酸钠在-20℃沉淀1h，4℃离心后75％乙醇的洗涤沉淀3次，待干燥后用5ul Nuclease-free water得到纯化后的sgRNA模板，用Nano-300微量分光光度计测定浓度。

以纯化得到的DNA为模板，用体外转录试剂盒(HiScribe^TM Quick T7 High YieldRNA Synthesis Kit，NEB#E2050S，具体方法参考试剂盒说明书)在37℃过夜反应后得到sgRNA粗产物，经过DNA凝胶电泳验证后(图1)，用与纯化sgRNA模板相同的方法纯化这些sgRNA，将干燥后sgRNA用5ul Nuclease-free water溶解，-80℃保存。

实施例2、sgRNA-Cas9复合物体外组装

将纯化好的sgRNA和商品化的Cas9(novoprotein E365-01A)以70:1(摩尔数)的比例加入到反应缓冲液中，反应缓冲液为2×原生质体溶液2(2M山梨醇，100mM CaCl₂，2MTris-HCl，pH 7.5)和10×active buffer(200mM HEPES free acid，1.5M KCl，5mM DTT，1mM EDTA，100mM MgCl₂·6H₂O，pH 7.5)，混匀后37℃孵育15min。

里氏木霉ura5基因的sgRNA-Cas9组装方法：将纯化好的sgRNA-Trura5与Cas9按70：1的比例加入反应体系中，37℃孵育15min。并且通过控制sgRNA和Cas9的加入量，分别制备20nM、60nM、100nM、180nM的sgRNA-Cas9复合物。

蛹虫草ura5基因的sgRNA-Cas9组装方法：将纯化好的sgRNA-Cmura5与Cas9按70：1的比例(Cas9为6ug)加入反应体系中，37℃孵育15min。

米曲霉wA基因的sgRNA-Cas9组装方法：将纯化好的sgRNA-AowA与Cas9按70：1的比例(Cas9为6ug)加入反应体系中，将反应缓冲液中的2×原生质体溶液2替换成2×solution1(1.6M NaCl，20mM CaCl₂，20mM Tris-HCl，pH 8.0)，37℃孵育15min。

实施例3、添加TritonX-100提高转化及基因编辑的效率

以里氏木霉Rut C30为底盘细胞，利用双体外CRISPR/Cas9技术对乳清酸磷酸核糖转移酶ura5基因(SEQ ID NO:1；其中第355～374位为sgRNA靶序列)进行突变，利用sgRNA-Cas9复合物(sgRNA模板由sgRNA-Trura5-F与sgRNA-R经PCR扩增所形成)进行转化，研究提高基因转化所获得的转化子数量及提高基因编辑的效率的方法。

原生质体制备根据文献(Rantasalo，A.et al.A universal gene expressionsystem for fungi.Nucleic Acids Res，2018 46，e111)进行修改，制备原生质体的菌丝通过在铺有玻璃纸的PDA中28℃培养15h获得，裂解酶(sigma)的浓度为5mg/ml。

转化体系：过滤离心收集原生质体，4ml原生质体经清洗后，200ul原生质体溶液2(1M山梨醇，50mM CaCl₂，1M Tris-HCl，pH 7.5)重悬，加入sgRNA-Cas9复合物，74μl原生质体溶液3(25％PEG6000，50mM CaCl₂，1M Tris-HCl，pH 7.5)，混匀后冰上静置20min，加入2ml原生质体溶液3后混匀室温静置15min；加入4ml原生质体溶液2后混匀，快速加入到50ml上层培养基(山梨醇182.17g/l，MgSO₄·7H₂O 1g/l，KH₂PO₄ 10g/l，(NH₄)₂SO₄ 6g/l，柠檬酸钠·2H₂O 3g/l，葡萄糖·H₂O 10g/l，FeSO₄·7H₂O 5mg/l，MnSO₄·H₂O 1.6mg/l，ZnSO₄·7H₂O1.4mg/l，CoCl₂ 1.2mg/l，琼脂糖1.2％)中，混匀后，平铺到2％琼脂平板上，28℃培养3～5天。

转化子数量为按上述操作获得所有转化子的数量，即转化1*10⁵个原生质体所获转化子的数量，编辑效率＝阳性转化子数/所有转化子数。

转化子验证：挑取转化子在SDB培养基中培养，利用Fastprep仪破碎细胞并用酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1抽提基因组，PCR扩增(△Trura5-F：ATGGCTACCACCTCCCAGC(SEQ IDNO:9)，△Trura5-R：TCAGTCAGTCGCCTTGTAC(SEQ ID NO:10))后测序验证突变菌株。

经过针对诸多受试样品的试验后，本发明人发现在转化体系中同时添加TritonX-100有利于提高转化及基因编辑的效率。以里氏木霉Trura5序列中的5’-GGCGAGGGCGGCAACATCGTcgg-3’(SEQ ID NO:11)为靶标序列(其中下划线为PAM序列)，利用sgRNA-Cas9复合物(sgRNA模板由sgRNA-Trura5-F与sgRNA-RPCR扩增所形成)对Trura5基因进行基因编辑，获得转化子后抽提基因组，用△Trura5-F/△Trura5-R引物扩增后进行测序分析。共测试了12个经前述转化操作的原生质体转化子样品(编号为1～12)，以野生型Trura5作为对照。

结果见图2，所有的转化子在靶标处都发生了突变。从图2可以看出，添加TritonX-100(0.006％)后转化子数量有显著的增加(sgRNA-Cas9复合物浓度180nM，12个转化子)，且基因组编辑效率保持较高，说明TritonX-100有利于提高原生质体转化效率。

实施例4、高浓度sgRNA-Cas9复合物提高基因组编辑效率

以里氏木霉Rut C30为底盘细胞，利用双体外CRISPR/Cas9技术对乳清酸磷酸核糖转移酶ura5基因(SEQ ID NO:1；其中第355～374位为sgRNA靶序列)进行突变，利用sgRNA-Cas9复合物(sgRNA模板由sgRNA-Trura5-F与sgRNA-R PCR扩增所形成)进行转化，检测sgRNA-Cas9浓度对于基因编辑效率的影响。

原生质体制备、转化以及转化体系、转化子验证方法同前述实施例3。

不同sgRNA-Cas9复合物浓度下里氏木霉ura5基因突变效率如表1，可见基因编辑效率随着sgRNA-Cas9复合物浓度的升高而升高，在100nM和180nM时达到100％。说明相对高浓度的sgRNA-Cas9复合物有利于提高双体外CRISPR/Cas9技术的基因编辑效率。

表1

实施例5、化合物TritonX-100提高双体外CRISPR/Cas9基因编辑效率

以里氏木霉Rut C30和蛹虫草Cm01为底盘细胞，利用双体外CRISPR/Cas9技术对ura5基因(SEQ ID NO:1(Trura5，其中第355～374位为sgRNA靶序列)、SEQ ID NO:2(Cmura5，其中第492～511位为sgRNA靶序列)进行突变，分别利用sgRNA-Cas9复合物1(sgRNA模板由sgRNA-Trura5-F与sgRNA-R PCR扩增所形成)、sgRNA-Cas9复合物2(sgRNA模板由sgRNA-Cmura5-F与sgRNA-R PCR扩增所形成)进行转化，通过添加TritonX-100提高基因编辑效率。

原生质体制备与转化与实施例3相同，但蛹虫草的原生质体通过酶解在SDB培养基中培养3天的芽生孢子获得。

转化子验证：抽取转化子基因组，里氏木霉ura突变转化子验证方法与实施例3相同；蛹虫草的ura5突变转化子基因组经PCR扩增(△Cmura5-F：ATGTCGGATCTCGCTCAGTAC(SEQID NO:12)，△Cmura5-R：CTAATCTGCATCTTTCT CC(SEQ ID NO:13))，所有的PCR产物送到公司测序。

TritonX-100(0.006％(w/v))对里氏木霉ura5基因突变效率的影响的测定结果如表2，可以看出添加TritonX-100，里氏木霉ura5突变转化子个数增加2～4倍，且每个转化子都在sgRNA识别位点处发生了突变。

表2

TritonX-100对蛹虫草ura5基因突变效率的影响如表3，表明在蛹虫草原生质体转化过程中不添加TritonX-100，没有得到转化子，而在添加TritonX-100后，得到了12个转化子，每个转化子都在sgRNA识别位点处发生了突变，如图3。图中，Cmura5是野生型，对12个样品测序(编号为1-12)，结果发现所有的转化子在靶标处都发生了突变，靶标序列为5’-GGACCGGATG GAGAAGCTTCcgg-3’(其中下划线为PAM序列)(SEQ ID NO:18)。

表3

实施例6、肌醇或苯菌灵有效增加多核丝状真菌米曲霉纯合转化子概率

以多核丝状真菌米曲霉NSAR1为底盘细胞，利用双体外CRISPR/Cas9技术对聚酮合酶wA(SEQ ID NO:3；其中第160～179位为sgRNA靶序列)基因进行突变，利用sgRNA-Cas9复合物(sgRNA模板由sgRNA-wA-F与sgRNA-R PCR扩增所形成)进行转化。通过添加肌醇或苯菌灵提高纯合转化子概率，从而达到提高基因编辑效率的目的。

准备marker(donor-DNA)：以米曲霉RIB40的基因组，以argB-wA-F(GATGCTTTCACGCTTTGCGCCAAGAGATCGCG AGGCTTTCACCCTGTATCCTGGCCTGA(SEQ ID NO:14))/argB-wA-R(GTCAACGCACTCTCCAGAG CCGG ATTAGGGTCTGACTTCGAGATGTTAATGGAGCTAGG(SEQ ID NO:15))扩增argB基因作为筛选标记，PCR扩增回收，通过真空浓缩至10ul。

原生质体制备：将在CD培养基((NH₄)₂SO₄ 4.66g/l，KCl 0.52g/l，KH₂PO₄ 1.52g/l，MgSO₄·7H₂O 1mol/l，葡萄糖10g/l，微量元素2 1/1000，pH 6.5，并添加0.1％(w/v)肌醇或1μg/ml苯菌灵)上产生的孢子用0.85％NaCl-0.1％Tween 80洗下，取1ml孢子接到100ml CD液体培养基(含0.1％(w/v)肌醇或1μg/ml苯菌灵)中，30℃培养。待孢子萌发后过滤收集菌丝。用20ml含有20mg/ml裂解酶(sigma)的原生质体化溶液(0.8M NaCl，10mM KH₂PO₄，pH6.0)在30℃酶解2h。过滤收集原生质体。用4ml原生质体清洗液(0.8M NaCl)清洗原生质体2次。

原生质体转化：200ul Solution1(0.8M NaCl，10mM CaCl₂，10mM Tris-HCl，pH8.0)重悬原生质体，加入sgRNA-Cas9复合物(终浓度为180nM)、donor-DNA与20％体积的Solution2(40％PEG4000，50mM CaCl₂，50mM Tris-HCl，pH 8.0。)，冰上静置30min。加1mlSolution2，混匀后，室温放置30min，加入9ml的原生Solution1，混匀后离心收集原生质体。200ul Solution1重悬后加入到50ml CD上层培养基(含0.8M NaCl的CD培养基，并加入肌醇(312.5μl 160g/l肌醇，终浓度为0.1％(w/v))或苯菌灵(10μl 5mg/ml苯菌灵，终浓度为1μg/ml)中，轻轻混匀，倒在下层培养基(2％琼脂)上，30℃培养3天左右可观察到菌丝长出(米曲霉原生质体转化全过程见图5)。

转化子验证：挑取转化子在SDB中培养，抽提基因组，PCR扩增(△wA-F：AGACCAGACAAGTGATTTCG(SEQ ID NO:16)，△wA-R：CGTTTCCAAGGTCTCCGTAG(SEQ ID NO:17))后DNA琼脂糖凝胶电泳检测(图4)，并测序验证。

由于米曲霉是一个多细胞的菌株，为了能提高纯合转化子的效率，分别在分生孢子形成、孢子萌发阶段与原生质体再生的培养基中添加肌醇或苯菌灵(图5)，从而提高单核原生质体的概率，更利于基因组编辑。

肌醇/苯菌灵对米曲霉wA基因编辑效率的影响如表4所示，可以看出，在不添加肌醇或苯菌灵情况下，虽然可以获得阳性转化子，但是无法直接获得纯合阳性转化子，还需要大量的时间进行传代和筛选才能获得纯合阳性转化子。而在添加肌醇或苯菌灵的情况下，可以获得大量的纯合阳性转化子，且占转化子的比例分别达到46.67％和76.19％。因此，本方法可以极大地加快多核丝状真菌基因编辑的速度。

表4

实施例7、其他有丝分裂抑制剂有效增加多核丝状真菌米曲霉纯合转化子效率

以多核丝状真菌米曲霉NSAR1为底盘细胞，利用双体外CRISPR/Cas9技术对聚酮合酶wA(SEQ ID NO:3；其中第160～179位为sgRNA靶序列)基因进行突变，利用sgRNA-Cas9复合物(sgRNA模板由sgRNA-wA-F与sgRNA-R PCR扩增所形成；终浓度为180nM)进行转化。通过添加其他有丝分裂抑制剂如多菌灵和甲基硫菌灵提高纯合转化子概率，从而达到提高基因组编辑效率的目的。

原生质体制备、转化以及转化体系、转化子验证方法同前述实施例6。不同的是将苯菌灵替换成0.5ug/ml多菌灵。

多菌灵对米曲霉wA基因编辑效率的影响如表5所示，在添加多菌灵的条件下，可以获得纯合阳性转化子，占转化子的比例达到60％。

表5

除此之外，2ug/ml的甲基硫菌灵也能显著促进米曲霉产生更多的单核原生质体。因此，其他有丝分裂抑制剂也可以提高多核丝状真菌的基因组编辑的纯合阳性转化子，加快多核丝状真菌基因编辑的速度。

实施例8、其他表面活性剂对双体外CRISPR/Cas9基因编辑效率的影响

以里氏木霉Rut C30为底盘细胞，利用双体外CRISPR/Cas9技术对乳清酸磷酸核糖转移酶ura5基因(SEQ ID NO:1；其中第355～374位为sgRNA靶序列)进行突变，利用sgRNA-Cas9复合物(sgRNA模板由sgRNA-Trura5-F与sgRNA-R经PCR扩增所形成；终浓度为180nM)进行转化，研究其他表面活性剂(如吐温-80、NP-40、PEG4000)对双体外CRISPR/Cas9基因编辑效率的影响。

原生质体制备、转化以及转化体系、转化子验证方法同前述实施例3。不同的是将原生质体转化时加入的TritonX-100替换成0.006％NP-40或0.1％吐温-80。

这些表面活性剂对里氏木霉ura5基因编辑效率的影响如表6，在添加0.006％NP-40或0.1％吐温-80的条件下，转化子的数量相对于不添加任何表面活性剂的条件下并无明显差异，只有在添加Triton X-100的条件下转化子数量明显增多，是不添加表面活性剂的2倍。因此，Triton X-100能提高基因编辑的转化子数量，但Tween80和NP-40在该浓度下对基因编辑转化子数量并无提高作用。

表6

序列信息：

里氏木霉Trura5序列(下划线表示sgRNA靶序列)(SEQ ID NO:1)

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蛹虫草Cmura5序列(下划线表示sgRNA靶序列)(SEQ ID NO:2)

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米曲霉AowA序列(下划线表示sgRNA靶序列)(SEQ ID NO:3)

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tgaaatctcagacgacatggtgtttgcggactacggtgtagactcactcctctcccttacagttactggcaggtatcgtgaagagttgaacctcgatttggactcctctgtgtttaccgatcatccaactgtcaacgacttcaagcggctcatcgcccaagtgagtccttcagagagccatgatggttcctccagtgaacaagagtcgaatttctctttcaacggtggcgagtcctcaagcgcaagcacacctgacataacgtcaccgccgaatgagaaggtagctcaagtcgagcaaaacggcaccatgaaggaaatccgtaacatcatggcggaggagatcggtgtacccgcagaagagatcgaccctgacgagaacttgggagagatgggtatggactcgcttctctcccttactgttcttggaagaatacgggagactttggacatggacctgccaggagagttcttcatcgaaaaccagaccctcaatgatatagaggtggctttggacctaaaacccaagactacctctgctccaattcctatgccagagccagtgaaattccctgaagctatccacgacctccagccaaagcttgctcaacatcccaaggccacatccatcctgttacaaggaaaccccaggacagcaacaaagacgttattcttgtttcctgacggctctggctcagctacatcttacgctaccatccccggactctctcctgacgtctgcgtttacgggttgaattgcccatatatgaagacacctgagaagctcaaatgcagcctagatgaactcactgcgccctatgtagcagagattcgtcgtcggcaacccaagggtccttacagcttcggtggctggtcagcaggagggatctgtgcatatgatgcggcacgccatctaatgtttgaggaaggtgaacaagtcgaccgcttgcttctccttgatacccccttccccatcggcctcgagaagctgccgcagagattgtacggcttcttcaactctatcggtctcttcggtgaaggtaaaacggcaccaccctcctggctcctaccccacttcctagcctttatcgacgctctcgacgcatacaaggccgcgccccttccattcaaagacgagaaatgggccaagaaactgcccaagacttatatcatctgggccaaggacggtgtttgcggtaagccgggagatccccggcctgatcccccgacagacggttccaaggatcccaaggagatggtctggcttcttaatgaccggaccgatctgggacctaacaagtgggatacattggttggacctgagaatattggtggaatcacagtaatggaagatgctaatcattttacgatgacgaagggcgaaaaagcgaaagagttgtctacatttatggctaacgccatggcttaa

米曲霉argB序列(SEQ ID NO:4)

ccctgtatcctggcctgaattccatccgctgtggccgactcaaccgaaacattagttggattgaatacggtggcatccactgcatactgcttcactaaagccggcgcgacaaaagcgaatataaggattgttataatcgcaatcagggatagcaagacacagaatattggccatcgtactctgcctcgtggtttctttgaatcattggtaacgagaaagtcttctgaggctgccgaagatcgtctagttgcaacgcccccgtatgttgccaagtcctcttcccggctgaggagtaaaggggtggattcggaagataattcgaatggaggcgcaggactcgagtcggaagattgtctttcgtcgatcggtgacgaaggacgcgaagagggcctggaccccttgttcagtaaaggcctgcttgcctcttcagccatgatggctgggggggccggataagtgggggagatggggagagggatgtggaggagataacacgatagcaatacgttatgggtagataagagagataaaagatgatggcgttcgtagattgagaaaagaaagctcccggtggtgatgagttcggtagaaggggacgtaaggctaagaattaaaatatttagcttgcgtatggacaacgcacgcaggatgaattggccagacctggaagtatagcctatcagtttgaatcaccgtgatgatcggcaatcataccacgctaacccgaactggacaaggcgtggtgtggagacggaaaaagcggatcacattggaggagtcacacttaacgctttcaagctaactgactgactcgacggtcgagctaaggtacgtactatttcttttttcttttctctttgtctcttgttgctgctgttgactctctctcttctagtccgataagaactgagtcatttcaatcctctggttcttactctatatattccccctcccctactacccaattgcttctccgcatactaccggaaattatctcatcatgacttgcggtctgaagctggccgccgctcgttacggcaaccataccttgcgccagaagattccactcaacgctgtgcgccgatacacttctcacactgctacttctacgactccccccacctcgccattcgctcctcgccattttctttccatcgctgatcttacctcaacggagttcgcaaccctcgtccgtaatgcatcttcacacaaacgaaccatcaagtcgggatcaatccctcagaacctgcttggttctatgaccggacagactgtagctatgctgttcagcaaacgcagtaccagaaccaggatatctactgaaggggctgtggtgcgcttgggaggacatccaatgtttctgggcaaggatgatattcaactcggtgtcaatgagtccttgtatgactctgcggttgtaatctcctccatggtctcttgtattgtagcccgagtcggcaagcacgctgaggttgcagaccttgccaagcattcaaccgtgcctgttatcaacgctctctgtgactccttccaccctctccaggccattgccgattttcagaccatctacgaaacatttacacctaaggcccatcgctctgacagtttgggtctggagggcctcaagattgcctgggtcggtgatgcaaacaacgttctgttcgacatggcaattgctgctaccaagatgggtattgatatcgccgttgcgactccgaagggctatgagattcctgccccgatgttggagctcatcaagcaggccagcaacggtgtctcaaagccaggaaagattattgagaccaacgttcctgaggaggcggttaagggtgcggatatcctggtaactgacacctgggtttccatgggacaggaggcagagtcgatcaagcgggtgaaggacttcgagggcttccagatcacttcggaacttgccaagcgcggtggtgcgaacgaaggctggaagttcatgcactgcctgcctcgtcaccctgaggaagtcagcgatgaagttttctacagcccacggtccttggtcttccccgaagcggagaatcggttgtgggctgcgatctcggccatggagggctttgttgtcaataagggaaggattgagtaagccttaaaaaagaaataaatcataaaaatctatatagtccaaagctcaattctgaatggattaatggaccgttgtttgactttccataccgaagtatgtagtatagaataccacaaacatgtaaacacgtctatatatgtagaagtaaaaccgcacttactacggaggtataaaaaaataaagccgttggtgcccgcattcacatgtcacgggcggagttgccgacaaaacaaggccaacaaccctccaaaatctcatgagctgctgcatccatcataccattaatgagcttgccactctcttagtgccctcttcctatatttattgccctccgtggccccaggcaacctagatggaggtatgtatttccctgctgacgggtagtaataaattacatcctaatgactccacaacagctttcgcagtccgggggcggctttcgctcgcgccgctcctatccctcactaaaccatgcctccctagctccattaacatctcga

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> 一种提高真菌的原生质体转化效率或基因编辑效率的方法及试剂盒

<130> 199479Z1

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 711

<212> DNA

<213> 里氏木霉(Trichoderma reesei )

<400> 1

atggctacca cctcccagct gcctgcctac aagcaggact tcctcaaatc cgccatcgac 60

ggcggcgtcc tcaagtttgg cagcttcgag ctcaagtcca agcggatatc cccctacttc 120

ttcaacgcgg gcgaattcca cacggcgcgc ctcgccggcg ccatcgcctc cgcctttgca 180

aagaccatca tcgaggccca ggagaaggcc ggcctagagt tcgacatcgt cttcggcccg 240

gcctacaagg gcatcccgct gtgctccgcc atcaccatca agctcggcga gctggcgccc 300

cagaacctgg accgcgtctc ctactcgttt gaccgcaagg aggccaagga ccacggcgag 360

ggcggcaaca tcgtcggcgc ttcgctcaag ggcaagaggg tcctgattgt cgacgacgtc 420

atcaccgccg gcaccgccaa gagggacgcc attgagaaga tcaccaagga gggcggcatc 480

gtcgccggca tcgtcgtggc cctggaccgc atggagaagc tccccgctgc ggatggcgac 540

gactccaagc ctggaccgag tgccattggc gagctgagga aggagtacgg catccccatc 600

tttgccatcc tcactctgga tgacattatc gatggcatga agggctttgc tacccctgag 660

gatatcaaga acacggagga ttaccgtgcc aagtacaagg cgactgactg a 711

<210> 2

<211> 784

<212> DNA

<213> 蛹虫草(Cordyceps militaris )

<400> 2

atgtcggatc tcgctcagta caagaaggac ttcctcaagt cttgtcatga cggtggcatt 60

ctcaagttcg gcacgttcga gctcaagtcc aagagaatat ctccctactt cttcaacgcc 120

ggcgattttc acaccgcccg cctcgccggt gcaattgcta aggcctttgc cctcaccatt 180

ctcgatgccc agaagaatgg tctcgagttt gacattgtct ttggccccgc ctacaaggga 240

attcctctgg ctacggccgt gaccatcaag attggagagc ttgaggctgc caacctggac 300

aagatctcct actcattcga ccgcaaagag gccaaggacc acggggaggg cggcaacatt 360

gttggtgctg gcctcaaggg caagcgcgtg ctgattatcg acgacgttgt cactgcggga 420

actgccaaga gagaggctat tgagaagatt agaaaggagg gcggaattgt ggccggtatt 480

gtcgttgctc tggaccggat ggagaagctt ccggccaccg atggcgacga ctccaagcct 540

ggtcccagcg ccattggtga gatgaagaag gagtacggca ttccgatttt ctccattgtg 600

acactcgacg acgtcatcga tggcatgcgt ggcctcatct cggaggagga tatcaagaag 660

gctgaggagt accgcgccaa atacaaggcc agcgactgag tggttgaagg ctgaaccacg 720

gagaaggcaa aacggcggcg gccatgaagc ttcggaggag agaacggaga aagatgcaga 780

ttag 784

<210> 3

<211> 6426

<212> DNA

<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400> 3

atggaggggc cacgcggcgt ctatctcttc ggagaccaga caagtgattt cgacgccggc 60

ttacgtcgcc tcctacaagt aaagaataac acaattgttg catcgttctt ccagagatgc 120

tttcacgctt tgcgccaaga gatcgcgagg ctttcaccat ctgaacggaa gatcttcccc 180

cggtttacga gcatagtgga tctactggcg cgtcaccggg agtcagaccc taatccggct 240

ctggagagtg cgttgacctg tatctatcaa ttgggatgct ttataaacta ctacggagac 300

cttggaaacg tgtacccatc tgcttcagac tgccatatag ttggcctgtg cgcgggtctt 360

cttagttctg cagctgtaag ctgttcgaac aatgttggag aattgctccc cgctgcggtt 420

gaagcggtgg tggtagctct ccgacttggt ctatgcgtcc ttaaagttcg agagctggtg 480

agctctgacc aagcgtcgtc aacaagctgg tcagtcttga tttcagggat tagcgagaaa 540

gatgcctcgc agcttatagg agaattcact gctgaacggg caattcctcc ttcatccaaa 600

ccgtatatca gtgcggtggg atataacagt ataaccatca gcgcaccgcc taaggtcctt 660

gatgatttaa ttgattctag gctgtctaag agccataagc cggtgagggc gcaaatccat 720

ggtccttacc atgcagcaca tctgtactat ggccgagatg tcgacaggat catcgaaagc 780

tgccataatg aggtcgtttc aaactacaca ccccgtatcc ccgtactatc aagtactacg 840

ggacagccga tagaggccaa acacatgaaa gatctactta aggccgccct tgaagagatt 900

ctactacgtc aactatgctg ggagaaagtg accgatgcct gctattccat attaaaaact 960

gctcgtcatc aaccatgcaa gttgttccca atttcaagca ctgcgacaca aagcttgttt 1020

acagctctta cgaaagccgg gataaccgac atcgaagtgg aaaatgggct cggagatgtt 1080

cccacgaacc cgaaggacaa ccttaacatc agcggcaggg cggactgctc caagatagct 1140

atcattggca tgtctggacg attcccagaa gctgatggca cagagagttt ctgggacctt 1200

ctgtataatg gcctcgatgt acaccggaag gtgcctgcag agcgttggga tgttgatgcc 1260

cacgttgatc ctaccggaac aaaacggaac accagcaagg ttccatacgg atgctggata 1320

aacgaaccgg ggttatttga cccccgcttc ttcaatatgt cgccacgcga agccctccag 1380

gcagatcccg ctcaaagact tgcattgctc acggcctatg aagctcttga aatggccggc 1440

tttatccccg acagcacccc ttctacacag agggatcgag tcggcctctt ctatggaatg 1500

actagcgatg actatcggga gataaatagt ggtcaagata ttgatactta ctttatccct 1560

ggtgggaatc gtgctttcac acctggccgg ataaactact atttcaagtt cagtgggccc 1620

agcgtcagcg ttgatacagc ttgttcttca agtcttgcgg ctattcatat ggcttgcaat 1680

tcgatctgga gaaatgattg cgatgctgct attgctggag gtgtcaatat attgacaaac 1740

cctgataacc atgccggtct tgaccgtggc catttcctgt ccagaaccgg gaattgcaac 1800

acatttgacg atggtgctga tggctactgt agagcagatg gagtgggtac aatcattctc 1860

aagcggctgg aagacgctca ggcggacaac gatccaatcc tcggtgtgat caatggagcc 1920

tataccaatc attcggcaga agcagtctcg attacccgcc ctcatgttgg cgcacaagcg 1980

tttatcttta ataagctatt gaacgatgcc aatatcgacc ctaaggacgt cagctacgtt 2040

gaaatgcatg gaactggtac tcaagctggg gatgcggtgg aaatgcaatc ggtcttggat 2100

acgtttgctc ccgactaccg ccgtggacca ggacagtctc tccatcttgg ttccgccaaa 2160

gcaaatgttg ggcatggaga gtcagcatct ggtgtaactg cacttgtgaa agtgctgcta 2220

atgatgaaga agaataccat accccctcat tgtggtataa agactaagat caaccacaac 2280

ttccccacgg atctcgcgca acgaaatgtc cacattgcct ttcaacctac cccttggaac 2340

agaccggctt ccggaaagcg gcagtgcttc attaacaact tttcggcggc tggtggaaat 2400

accgctcttt tgatggaaga cgctccaatc gctgaggtta aggggcagga cactcgacct 2460

gttcacgttg tgtctgtatc ggcacgatcc cagagtgcgc tcaaaaacaa catcaactct 2520

ctcgtaaaat acatcgacga acaaggaagg tcattcaatg tgaacgaggc agactttatc 2580

ccaagcttgg catacaccac cacagcacgg cgtatccatc acccattccg tgtcacagct 2640

atcgggtcta gtttgcagga gctgcgtgac tcacttaaca acagctctcg tctggaaagc 2700

tttacccctg tccctgcgac ggcccctggc gtagggttcg tgttcgctgg ccaaggagct 2760

cagcacaccg gaatgggaag gcaactatac gaaaaatgct ctcaattccg ggcaacaatg 2820

cagcacttcg attgcattag tcaaaaccaa gggtttcctt cgatccttcc cttggttgac 2880

ggaagcgtgc ccgtggagga gctgggccct atcgtgacac agctcggcac cacatgtctt 2940

cagatggctt tggtcaacta ttggggttca ctaggtataa aacctgcgtt cgttcttggg 3000

catagtctcg gggagtttgc tgctttgaat accgcaggag tattatcgac ttccgatacc 3060

atctaccttt gtggccgtcg ggctaccctc cttacagaat actgccaggt tgggacacac 3120

gccatgctgg ctgtcaaggc ttcctacccc caggtcaagc agttactgaa agaaggtgtg 3180

gatgaagttg cctgtgtcaa ctcacccagt gagacagtcg tcagtggcct caccgctgat 3240

attgatgact tggctcaaag gtgttccact gaaggttgga agtccactaa actaagggta 3300

ccgttcgctt tccattctgc ccaagttact ccaattcttg aacggtttca agaagaggcc 3360

cagggtgtca cgttccgtaa gccgtcgtta ccgtttgttt cctcactcct tggggaagtc 3420

atcaccgaat ctaattacga tgtcctggga gctcaatata tggtgaagca gtgccggaag 3480

tcggtgaact tccttggtgc tcttgaggcc accagatatg cgaaattgat gactgataag 3540

actgtctggc tggaagttgg tgcccatacc atttgctctg gtatgatcaa agcaacattc 3600

ggtccccagg ttaccactgt ggcatctctt cgccgagagg agaatgcatg gaaggtcctc 3660

tccaatagtc tatcggccct tcatttggct ggcattgata ttaattggaa agaatatcat 3720

caagacttca gctccagcca ccaggtgctc ccacttcctt cttacaagtg ggatctcaag 3780

aactactgga taccctacac taacaatttc tgccttacga agggtgctcc ccaaactgca 3840

attcaagctg caccacaaac tacattcctg accactgctg cgcaaaaggt tgttgagagt 3900

cgcgacgacg gtacaacagc gactgtcgtg gtgcaaaatg acatcgctga tcctgagttg 3960

aaccgtgtta tccaaggtca caaggtcaat ggagccgcac tttgcccatc gtcactctac 4020

gcagatattg cccagacact tggagagtat cttattgaga aatacaaacc cgagttcaaa 4080

gatcttggtc tcgatgtgtg tgacatggtc gtaccgaagc cactcatcgc gaagggagga 4140

gagcagctct ttagagtctc tgctattgct aattgggctg agaagaaggc ttcagttcaa 4200

gtatacgccg ttaatgctga cggcaaaaag accgtggatc atgcgtattg tacggtgaag 4260

ttctttgata ccaatgcctc cgagctcgag tggaagagaa tctcgtacct ggtcaagaga 4320

agcatcgaca gtcttcacca gaatgcggag acaggggagg ctcaccgtat ccagcgagga 4380

atggtctata aacttttcag cgcgttggtc gattatgatg aaaatttcaa gtcgattcgc 4440

gaggttatcc tggacagcga caataatgag gccaccgctc gtgtcaaatt ccaagcaccg 4500

ccaggaaatt tccaccgaaa cccattctgg attgacagtt tcggtcactt gtccggattc 4560

attatgaatg cgagcgacgc gaccgactct aagaaccaag tatttgttaa ccatggatgg 4620

gattcgatgc gttgcctgaa gaagttctcg cctgatgtca cttatcgcac ttatgtgagg 4680

atgcagccat ggcaaaacaa catttgggct ggagatgttt atatctttga gggcgacgat 4740

attattgctg tcttcggagg tgtgaagttc caagcactgg cacgcaagat acttgacact 4800

gttcttcccc ctgttggcgg ttcaaaggca ccaattacag cgaaatcacc acctccagct 4860

cgcactcaga aggccaacac cggcgccaag acccgtccta aagcacctgt tccttccaag 4920

tcgttcacca aatcttctgg gccgagtgtt gtcgtacgcg cactcagcat tctggcctca 4980

gaagttggcc tggcagagtc tgaaatctca gacgacatgg tgtttgcgga ctacggtgta 5040

gactcactcc tctcccttac agttactggc aggtatcgtg aagagttgaa cctcgatttg 5100

gactcctctg tgtttaccga tcatccaact gtcaacgact tcaagcggct catcgcccaa 5160

gtgagtcctt cagagagcca tgatggttcc tccagtgaac aagagtcgaa tttctctttc 5220

aacggtggcg agtcctcaag cgcaagcaca cctgacataa cgtcaccgcc gaatgagaag 5280

gtagctcaag tcgagcaaaa cggcaccatg aaggaaatcc gtaacatcat ggcggaggag 5340

atcggtgtac ccgcagaaga gatcgaccct gacgagaact tgggagagat gggtatggac 5400

tcgcttctct cccttactgt tcttggaaga atacgggaga ctttggacat ggacctgcca 5460

ggagagttct tcatcgaaaa ccagaccctc aatgatatag aggtggcttt ggacctaaaa 5520

cccaagacta cctctgctcc aattcctatg ccagagccag tgaaattccc tgaagctatc 5580

cacgacctcc agccaaagct tgctcaacat cccaaggcca catccatcct gttacaagga 5640

aaccccagga cagcaacaaa gacgttattc ttgtttcctg acggctctgg ctcagctaca 5700

tcttacgcta ccatccccgg actctctcct gacgtctgcg tttacgggtt gaattgccca 5760

tatatgaaga cacctgagaa gctcaaatgc agcctagatg aactcactgc gccctatgta 5820

gcagagattc gtcgtcggca acccaagggt ccttacagct tcggtggctg gtcagcagga 5880

gggatctgtg catatgatgc ggcacgccat ctaatgtttg aggaaggtga acaagtcgac 5940

cgcttgcttc tccttgatac ccccttcccc atcggcctcg agaagctgcc gcagagattg 6000

tacggcttct tcaactctat cggtctcttc ggtgaaggta aaacggcacc accctcctgg 6060

ctcctacccc acttcctagc ctttatcgac gctctcgacg catacaaggc cgcgcccctt 6120

ccattcaaag acgagaaatg ggccaagaaa ctgcccaaga cttatatcat ctgggccaag 6180

gacggtgttt gcggtaagcc gggagatccc cggcctgatc ccccgacaga cggttccaag 6240

gatcccaagg agatggtctg gcttcttaat gaccggaccg atctgggacc taacaagtgg 6300

gatacattgg ttggacctga gaatattggt ggaatcacag taatggaaga tgctaatcat 6360

tttacgatga cgaagggcga aaaagcgaaa gagttgtcta catttatggc taacgccatg 6420

gcttaa 6426

<210> 4

<211> 2619

<212> DNA

<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400> 4

ccctgtatcc tggcctgaat tccatccgct gtggccgact caaccgaaac attagttgga 60

ttgaatacgg tggcatccac tgcatactgc ttcactaaag ccggcgcgac aaaagcgaat 120

ataaggattg ttataatcgc aatcagggat agcaagacac agaatattgg ccatcgtact 180

ctgcctcgtg gtttctttga atcattggta acgagaaagt cttctgaggc tgccgaagat 240

cgtctagttg caacgccccc gtatgttgcc aagtcctctt cccggctgag gagtaaaggg 300

gtggattcgg aagataattc gaatggaggc gcaggactcg agtcggaaga ttgtctttcg 360

tcgatcggtg acgaaggacg cgaagagggc ctggacccct tgttcagtaa aggcctgctt 420

gcctcttcag ccatgatggc tgggggggcc ggataagtgg gggagatggg gagagggatg 480

tggaggagat aacacgatag caatacgtta tgggtagata agagagataa aagatgatgg 540

cgttcgtaga ttgagaaaag aaagctcccg gtggtgatga gttcggtaga aggggacgta 600

aggctaagaa ttaaaatatt tagcttgcgt atggacaacg cacgcaggat gaattggcca 660

gacctggaag tatagcctat cagtttgaat caccgtgatg atcggcaatc ataccacgct 720

aacccgaact ggacaaggcg tggtgtggag acggaaaaag cggatcacat tggaggagtc 780

acacttaacg ctttcaagct aactgactga ctcgacggtc gagctaaggt acgtactatt 840

tcttttttct tttctctttg tctcttgttg ctgctgttga ctctctctct tctagtccga 900

taagaactga gtcatttcaa tcctctggtt cttactctat atattccccc tcccctacta 960

cccaattgct tctccgcata ctaccggaaa ttatctcatc atgacttgcg gtctgaagct 1020

ggccgccgct cgttacggca accatacctt gcgccagaag attccactca acgctgtgcg 1080

ccgatacact tctcacactg ctacttctac gactcccccc acctcgccat tcgctcctcg 1140

ccattttctt tccatcgctg atcttacctc aacggagttc gcaaccctcg tccgtaatgc 1200

atcttcacac aaacgaacca tcaagtcggg atcaatccct cagaacctgc ttggttctat 1260

gaccggacag actgtagcta tgctgttcag caaacgcagt accagaacca ggatatctac 1320

tgaaggggct gtggtgcgct tgggaggaca tccaatgttt ctgggcaagg atgatattca 1380

actcggtgtc aatgagtcct tgtatgactc tgcggttgta atctcctcca tggtctcttg 1440

tattgtagcc cgagtcggca agcacgctga ggttgcagac cttgccaagc attcaaccgt 1500

gcctgttatc aacgctctct gtgactcctt ccaccctctc caggccattg ccgattttca 1560

gaccatctac gaaacattta cacctaaggc ccatcgctct gacagtttgg gtctggaggg 1620

cctcaagatt gcctgggtcg gtgatgcaaa caacgttctg ttcgacatgg caattgctgc 1680

taccaagatg ggtattgata tcgccgttgc gactccgaag ggctatgaga ttcctgcccc 1740

gatgttggag ctcatcaagc aggccagcaa cggtgtctca aagccaggaa agattattga 1800

gaccaacgtt cctgaggagg cggttaaggg tgcggatatc ctggtaactg acacctgggt 1860

ttccatggga caggaggcag agtcgatcaa gcgggtgaag gacttcgagg gcttccagat 1920

cacttcggaa cttgccaagc gcggtggtgc gaacgaaggc tggaagttca tgcactgcct 1980

gcctcgtcac cctgaggaag tcagcgatga agttttctac agcccacggt ccttggtctt 2040

ccccgaagcg gagaatcggt tgtgggctgc gatctcggcc atggagggct ttgttgtcaa 2100

taagggaagg attgagtaag ccttaaaaaa gaaataaatc ataaaaatct atatagtcca 2160

aagctcaatt ctgaatggat taatggaccg ttgtttgact ttccataccg aagtatgtag 2220

tatagaatac cacaaacatg taaacacgtc tatatatgta gaagtaaaac cgcacttact 2280

acggaggtat aaaaaaataa agccgttggt gcccgcattc acatgtcacg ggcggagttg 2340

ccgacaaaac aaggccaaca accctccaaa atctcatgag ctgctgcatc catcatacca 2400

ttaatgagct tgccactctc ttagtgccct cttcctatat ttattgccct ccgtggcccc 2460

aggcaaccta gatggaggta tgtatttccc tgctgacggg tagtaataaa ttacatccta 2520

atgactccac aacagctttc gcagtccggg ggcggctttc gctcgcgccg ctcctatccc 2580

tcactaaacc atgcctccct agctccatta acatctcga 2619

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

taatacgact cactataggc gagggcggca acatcgtgtt ttagagctag aaatagcaa 59

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

taatacgact cactatagga ccggatggag aagcttcgtt ttagagctag aaatagcaa 59

<210> 7

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

taatacgact cactataggg aagatcttcc gttcagagtt ttagagctag aaatagcaa 59

<210> 8

<211> 78

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

aaaagcaccg actcggtgcc actttttcaa gttgataacg gactagcctt attttaactt 60

gctatttcta gctctaaa 78

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

atggctacca cctcccagc 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

tcagtcagtc gccttgtac 19

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

ggcgagggcg gcaacatcgt cgg 23

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

atgtcggatc tcgctcagta c 21

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 13

ctaatctgca tctttctcc 19

<210> 14

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 14

gatgctttca cgctttgcgc caagagatcg cgaggctttc accctgtatc ctggcctga 59

<210> 15

<211> 59

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

gtcaacgcac tctccagagc cggattaggg tctgacttcg agatgttaat ggagctagg 59

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 16

agaccagaca agtgatttcg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 17

cgtttccaag gtctccgtag 20

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 靶标序列(Target Sequence)

<400> 18

ggaccggatg gagaagcttc cgg 23

Claims

1.一种提高真菌的原生质体转化效率或基因编辑效率的方法，包括：将sgRNA与Cas酶混合获得sgRNA-Cas酶复合物，转化原生质体；其中，在进行原生质体转化时添加TritonX-100；在真菌的孢子形成、孢子萌发阶段和/或原生质体再生阶段，添加肌醇或抑制有丝分裂的抑菌剂苯菌灵、多菌灵或甲基硫菌灵；

其中，所述真菌选自：木霉属真菌，虫草属真菌，曲霉属真菌；

所述的TritonX-100在转化体系中的浓度为0.00001～0.1%(w/v)；

所述的抑制有丝分裂的抑菌剂在转化体系中的浓度为：0.008～10 μg/ml；或

所述的肌醇在转化体系中的浓度为：0.006～0.8%(w/v)；

所述sgRNA-Cas酶复合物在转化体系中的浓度为80～300nM。

2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的TritonX-100在转化体系中的浓度为0.0005～0.05%(w/v)；

所述的抑制有丝分裂的抑菌剂在转化体系中的浓度为：0.01～5 μg/ml；或

所述的肌醇在转化体系中的浓度为：0.01～0.5%(w/v)。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的TritonX-100在转化体系中的浓度为0.001～0.02%(w/v)。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述sgRNA-Cas酶复合物在转化体系中的浓度为90～250nM。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，sgRNA与Cas酶以摩尔比1:1～120:1混合。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Cas酶为Cas9酶。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，转化体系中，原生质体的量为1×10⁴个/ml～1×10⁹个/ml。

8. TritonX-100，肌醇或抑制有丝分裂的抑菌剂苯菌灵、多菌灵或甲基硫菌灵的用途，用于：

提高真菌的原生质体转化效率或基因编辑效率；或

制备提高真菌的原生质体转化效率或基因编辑效率的组合物；

其中，在进行原生质体转化时添加TritonX-100；在真菌的孢子形成、孢子萌发阶段和/或原生质体再生阶段添加肌醇或抑制有丝分裂的抑菌剂苯菌灵、多菌灵或甲基硫菌灵；

所述的TritonX-100在转化体系中的浓度为0.00001～0.1%(w/v)；

所述的肌醇在转化体系中的浓度为：0.006～0.8%(w/v)。

9.一种用于真菌的原生质体转化的试剂盒，其中包括：

靶向真菌基因组的sgRNA，Cas酶，或sgRNA-Cas酶复合物；

化合物，选自：TritonX-100，肌醇，抑制有丝分裂的抑菌剂苯菌灵、多菌灵或甲基硫菌灵，或它们的组合；

所述sgRNA-Cas酶复合物的浓度为80～300nM；

所述TritonX-100的浓度为0.00001～0.1%(w/v)；

所述肌醇的浓度为0.006～0.8%(w/v)；或

所述抑制有丝分裂的抑菌剂的浓度为0.008～10 μg/ml。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，其中还包括选自下组的试剂：真菌培养基；原生质体溶液；原生质体清洗液；微量元素；基因组抽提试剂。

11. 如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的TritonX-100的浓度为0.0005～0.05%(w/v)；

所述的肌醇的浓度为：0.01～0.5%(w/v)；或

所述的抑制有丝分裂的抑菌剂的浓度为：0.01～5 μg/ml。

12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的TritonX-100的浓度为0.001～0.02%(w/v)。

13. 权利要求9～12任一所述的试剂盒的用途，用于：

提高真菌的原生质体转化效率或基因编辑效率；或

进行真菌的原生质体转化或基因编辑；

其中，所述真菌选自：木霉属真菌，虫草属真菌，曲霉属真菌。

14.一种用于真菌的原生质体转化的组合物，包括：sgRNA-Cas酶复合物和TritonX-100，肌醇，抑制有丝分裂的抑菌剂苯菌灵、多菌灵或甲基硫菌灵；其中，所述真菌选自：木霉属真菌，虫草属真菌，曲霉属真菌；

所述sgRNA-Cas酶复合物的浓度为80～300nM；

所述TritonX-100的浓度为0.00001～0.1%(w/v)；

所述肌醇的浓度为0.006～0.8%(w/v)；

所述抑制有丝分裂的抑菌剂的浓度为0.008～10 μg/ml。

15. 如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述的TritonX-100的浓度为0.0005～0.05%(w/v)；

所述的肌醇的浓度为：0.01～0.5%(w/v)；或

所述的抑制有丝分裂的抑菌剂的浓度为：0.01～5 μg/ml。

16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述的TritonX-100的浓度为0.001～0.02%(w/v)。

17.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，所述的sgRNA靶向于：

里氏木霉的ura5基因，靶基因识别位点具有SEQ ID NO: 1中第355～374位所示的核苷酸序列；

蛹虫草的ura5基因，靶基因识别位点具有SEQ ID NO: 2中第492～511位所示的核苷酸序列；

米曲霉的AowA基因，靶基因识别位点具有SEQ ID NO: 3中第160～179位所示的核苷酸序列。

18. 权利要求14～17任一所述的用于转化的组合物的用途，用于：

提高真菌的原生质体转化效率或基因编辑效率；或

进行真菌的原生质体转化或基因编辑；