CN113105542B - 一种乳铁蛋白制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种乳铁蛋白制备方法，其包括如下步骤：a)使原料乳液通过阳离子交换树脂层析柱；b)用洗脱液对步骤a)中的阳离子交换树脂进行包含至少两次洗脱的第一组洗脱，得到洗脱收集液；c)将步骤b)中的至少第2次洗脱收集液除盐；d)使步骤c)中经除盐的洗脱收集液通过阳离子交换树脂层析柱；e)用洗脱液对步骤d)中的阳离子交换树脂进行包含至少两次洗脱的第二组洗脱，得到洗脱收集液；f)将步骤e)中的至少最后一次洗脱收集液除盐并干燥得到乳铁蛋白产物。

Description

一种乳铁蛋白制备方法

技术领域

本发明属于蛋白纯化制备技术领域，具体地涉及一种乳铁蛋白制备方法，更具体地涉及一种以牛或羊脱脂乳、乳清液为原料制备乳铁蛋白的方法。

背景技术

乳铁蛋白(Lf)是富含在初乳中的一种功能因子，它最初于1939年由Sorensen等在动物乳中发现，1953年Polis等在制备乳过氧化物酶时得到了它的粗制品，1960年Johansson和Montreuil等从人乳中首次分离出Lf。近代研究证明，Lf具有许多独特的生物学功能：增强铁的传递和吸收；广谱的抗菌性；免疫作用；抗氧化作用；促进肠道菌群的平衡；作为生长因子；抗炎症；抗病毒作用等。对Lf的分离、加工、综合利用的研究，已经成为食品界，特别是乳品界关心的热点。Grove最早使用DEAE纤维素阴离子交换树脂分离出较纯的Lf成分，此后，他又开发出磷酸纤维素交换色谱法，并由Foley等对此法加以改进，得到的Lf的纯度为81％左右；目前分离乳铁蛋白主要有色谱法(吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、固定化单系抗体法等)和超滤法。超滤法操作简便，费用相对较低，易于形成工业化规模，其缺点是乳铁蛋白纯度较低，色谱法的优点是分离效果好、纯度高，但分离成本高，应用离子交换色谱法分离乳铁蛋白实现了工业化生产，虽然成本得到控制，但成本仍然较高，离子树脂的寿命1年左右，偏短，采用轴向流进料方式，吸附率低(处理相同物流，需要更多的树脂)，树脂的安装填料损耗大等问题，造成离子交换色谱法提取成本仍然较高。

CN104926936A公开了制备乳铁蛋白的方法，该方法利用阳离子交换树脂对液体乳进行离子交换处理，并通过盐溶液程序洗脱获得含有乳铁蛋白的盐溶液；采用超滤进行浓缩，进行干燥处理获得乳铁蛋白制品。

CN106008704A公开了一种生产乳铁蛋白和乳过氧化物酶的方法，该方法以乳液为原料，利用大孔阳离子交换树脂柱进行离子交换处理，使用氯化钠或氯化钾水溶液对树脂柱进行程序洗脱，收集含有乳过氧化物酶的第一洗脱收集液和含有乳铁蛋白的第二洗脱收集液；将第一洗脱收集液、第二洗脱收集液分别经膜滤浓缩8～12倍，然后分别洗滤脱盐，得到乳过氧化物酶浓缩液和乳铁蛋白浓缩液。

CN106008703B公开了一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，该方法同样使用阳离子交换树脂对牛乳中的乳铁蛋白进行吸附、解附；对解附液进行浓缩；得到浓缩液采用不溶性Fe³⁺螯合树脂对Fe³⁺进行吸附，再对浓缩液进行浓缩。获得低铁饱和度乳铁蛋。

纯化乳铁蛋白的方法有许多种，许多公司选择阳离子交换色谱系统来大范围的获得乳铁蛋白。对于乳铁蛋白的分离纯化开始于上世纪80年代，许多公司都致力于开发获得高纯度乳铁蛋白工艺。对乳铁蛋白分离纯化的方法从最初的阳离子交换到亲和层析再到免疫学方法，以及各种方法的组合对于分离纯化乳铁蛋白都有个有利弊。

目前使用离子交换色谱法制备乳铁蛋白研究较多，国外早已工业生产乳铁蛋白，2016年12月发布新的乳铁蛋白标准GB1903.17，将总蛋白质中乳铁蛋白含量由90％提高到95％，导致乳铁蛋白一度断货。很多申请的乳铁蛋白专利指标方法，按照GB1903.17-2016检测标准检测，蛋白质中乳铁蛋白含量很难达到95％。高纯度乳铁蛋白生产技术一直是当前行业技术难点，亟需解决问题之一。

发明内容

有鉴于此，本发明一个目的是提供一种操作简单、成本低、可工业化生产的高纯度乳铁蛋白制备方法。

本发明的另一目的是提供一种能够以高的回收率获得高纯度乳铁蛋白的制备方法。

发明人研究发现，当制备乳铁蛋白时，所得产物中乳铁蛋白在总蛋白质中含量达不到95％，这主要是因为混有部分过氧化物酶。当原料乳液通过阳离子树脂进行吸附时，阳离子树脂吸附牛乳中的蛋白质，主要是乳铁蛋白和过氧化物酶。乳铁蛋白吸附强度高于过氧化物酶。使用低浓度的钠或钾盐溶液洗脱时，可以首先将大部分过氧化物酶洗脱下来，但是仍然有一部分过氧化物酶残留未被洗脱。然后在使用高浓度的钠或钾盐溶液洗脱来获得乳铁蛋白洗脱收集液时，残留过氧化物酶的一部分也会被洗脱下来，从而获得的乳铁蛋白洗脱收集液中含有少量过氧化物酶，使得乳铁蛋白在总蛋白质中含量达不到95％。

本发明人对乳铁蛋白洗脱和纯化工艺进行优化和改进，解决了上述技术问题，获得了一种操作简单、成本低，可工业化生产的高纯度乳铁蛋白制备方法，总蛋白质中乳铁蛋白含量达到95％以上，解决了现有乳铁蛋白制备方法中总蛋白质中乳铁蛋白含量达不到95％的技术难题。本发明方法制备的乳铁蛋白符合GB1903.17标准。并且，本发明的方法中乳铁蛋白回收率可以达到80％以上。总蛋白含量可以达到90％以上。

本发明技术方案是：

1.一种乳铁蛋白制备方法，其包括如下步骤：

a)使原料乳液通过阳离子交换树脂层析柱；

b)用洗脱液对步骤a)中的阳离子交换树脂进行包含至少两次洗脱的第一组洗脱，得到洗脱收集液；

c)将步骤b)中的至少第2次洗脱收集液除盐；

d)使步骤c)中经除盐的洗脱收集液通过阳离子交换树脂层析柱；

e)用洗脱液对步骤d)中的阳离子交换树脂进行包含至少两次洗脱的第二组洗脱，得到洗脱收集液；

f)将步骤e)中的至少最后一次洗脱收集液除盐并干燥得到乳铁蛋白产物。

2.如条目1所述的方法，其中：

在步骤b)中，第一组洗脱包含至少三次洗脱；

在步骤f)中，将步骤e)中第二组洗脱中至少最后一次洗脱收集液与步骤b)中第一组洗脱中的至少最后一次洗脱收集液混合后，再进行除盐并干燥得到乳铁蛋白产物。

3.如条目1-2之一所述的方法，其中步骤b)中使用浓度依次升高的洗脱液进行程序洗脱；且步骤e)中使用浓度依次升高的洗脱液进行程序洗脱。

4.如条目1-3之一所述的方法，其中步骤a)中提供的原料乳液包含过氧化物酶。

5.如条目1-4任一项所述的方法，其中：

在步骤b)中，第一组洗脱包含三次洗脱；

在步骤c)中，将步骤b)中的第2次洗脱收集液除盐；

在步骤d)中，使步骤c)中经除盐的洗脱收集液通过阳离子交换树脂层析柱；

在步骤e)中，用洗脱液对步骤d)中的阳离子交换树脂进行包含两次洗脱的第二组洗脱，得到洗脱收集液；

在步骤f)中，将步骤e)中的第二洗脱收集液与步骤b)中的第三洗脱收集液组合，除盐并干燥得到乳铁蛋白产物。

6.如条目1-5任一项所述的方法，其中步骤a)中的乳液为牛或羊脱脂乳、或乳清液。

7.如条目1-6任一项所述的方法，其中步骤a)和步骤d)中的阳离子交换树脂各自独立地为琼脂糖型离子交换树脂、丙烯酸型离子交换树脂、聚苯乙烯型离子交换树脂中的任意一种或多种。

8.如条目1-7任一项所述的方法，其中步骤b)中使用的洗脱液各自独立地为氯化钠或氯化钾溶液，优选地其钠或钾离子的浓度各自独立地为0.07-0.8mol/L、优选0.1-0.6mol/L、优选0.12-0.5mol/L；和/或步骤e)中使用的洗脱液各自独立地为氯化钠或氯化钾溶液，优选地其钠或钾离子的浓度各自独立地为0.07-0.8mol/L、优选0.1-0.6mol/L、优选0.12-0.5mol/L。

9.如条目1-8任一项所述的方法，其中

步骤b)中的第一组洗脱包括顺序地使用第1洗脱液b1、和第2洗脱液b2进行洗脱，优选地第1洗脱液b1、和第2洗脱液b2各自独立地为氯化钠或氯化钾溶液；优选地第1洗脱液b1、和第2洗脱液b2中钠或钾离子的浓度的盐浓度依次升高；优选地，第1洗脱液b1中钠或钾离子的浓度为0.07～0.2mol/L、优选0.1～0.18mol/L、优选0.12～0.15mol/L；优选地，第2洗脱液b2中钠或钾离子的浓度为0.15～0.8mol/L、优选0.3-0.6mol/L、优选0.4-0.5mol/L；

优选地，步骤b)中的第一组洗脱包括顺序地使用第1洗脱液b1’、第2洗脱液b2’、和第3洗脱液b3’进行洗脱，优选地第1洗脱液b1’、第2洗脱液b2’、和第3洗脱液b3’各自独立地为氯化钠或氯化钾溶液；优选地第1洗脱液b1’、第2洗脱液b2’、和第3洗脱液b3’中钠或钾离子的浓度的盐浓度依次升高；优选地，第1洗脱液b1’中钠或钾离子的浓度为0.07～0.2mol/L、优选0.1～0.18mol/L、优选0.12～0.15mol/L；优选地，第2洗脱液b2’中钠或钾离子的浓度为0.15～0.28mol/L、优选0.18～0.26mol/L；优选地，第3洗脱液b3’中钠或钾离子的浓度为0.2～0.8mol/L、优选0.3-0.6mol/L、优选0.4-0.5mol/L；

和/或

步骤e)中的第二组洗脱包括顺序地使用第一洗脱液e1和第二洗脱液e2进行洗脱，优选地第一洗脱液e1和第二洗脱液e2各自独立地为氯化钠或氯化钾溶液；优选地第一洗脱液e1和第二洗脱液e2中钠或钾离子的浓度的盐浓度依次升高；优选地，第一洗脱液e1中钠或钾离子的浓度为0.07～0.2mol/L、优选0.1～0.18mol/L、优选0.12～0.15mol/L；优选地，第二洗脱液e2中钠或钾离子的浓度为0.2～0.8mol/L、优选0.3-0.6mol/L、优选0.4-0.5mol/L。

10.如条目1-9任一项所述的方法，其中步骤c)和f)的除盐各自独立地通过超滤进行。

11.如条目1-10任一项所述的方法，其中步骤f)中的干燥通过冷冻干燥或者低温喷雾干燥进行。

附图说明

图1为本发明的乳铁蛋白制备方法的一种实施方式的示意性流程图。

图2显示实施例3中制备的乳铁蛋白制品的乳铁蛋白检测图谱。

图3显示对比例1中制备的乳铁蛋白制品的乳铁蛋白检测图谱。

具体实施方式

本发明涉及一种乳铁蛋白制备方法，其包括如下步骤：

a)使原料乳液通过阳离子交换树脂层析柱；

b)用洗脱液对步骤a)中的阳离子交换树脂进行包含至少两次洗脱的第一组洗脱，得到洗脱收集液；

c)将步骤b)中的至少第2次洗脱收集液除盐；

d)使步骤c)中经除盐的洗脱收集液通过阳离子交换树脂层析柱；

e)用洗脱液对步骤d)中的阳离子交换树脂进行包含至少两次洗脱的第二组洗脱，得到洗脱收集液；

f)将步骤e)中的至少最后一次洗脱收集液除盐并干燥得到乳铁蛋白产物。

通过使用本发明的方法，所制备得到的乳铁蛋白制品中，总蛋白质中乳铁蛋白含量达到95％以上，并且乳铁蛋白回收率可以达到80％以上。另外，所制备得到的乳铁蛋白制品中蛋白含量可以达到90％以上。

在本文中，除非另有说明，否则总蛋白质中的乳铁蛋白含量也称作乳铁蛋白纯度。

在本文中，除非另有说明，否则百分比(％)指的是质量百分比。

以下将对本发明的各步骤进行详细描述。

步骤a)

在步骤a)中，使原料乳液通过阳离子交换树脂层析柱。该阳离子交换树脂吸附原料乳液中的乳铁蛋白。

原料乳液可以为任何含有乳铁蛋白的乳液。本文中的术语“乳液”指的是以液体形式存在的能够提供任何乳成分的材料。所述乳液可以为哺乳动物乳汁。其可以为新鲜牛奶、羊奶或乳清，也可以是通过将“乳粉”和“水”混合配制获得的液体奶，其中乳粉可以为全脂奶粉、脱脂乳粉或半脱脂乳粉，且可以是任何常规的乳粉，例如牛乳粉或者羊乳粉。当使用新鲜牛奶、羊奶或乳清作为原料，或者由全脂奶粉或半脱脂奶粉配制获得原料时，可以在进行步骤a)之前，预先进行脱脂处理。

优选地，原料乳液选自牛或羊脱脂乳、乳清液。

所述原料乳液可以含有过氧化物酶。

乳液的温度可以控制为3～55℃。由此，乳铁蛋白吸附效率高而受热变性几率小。

乳液的粒径分布没有特别限制，只要有利于乳铁蛋白的吸附即可。乳液的粒径分布D90可以为1微米以下。由此，易于进行吸附，乳铁蛋白提取效率高。

所述阳离子交换树脂可以为本领域中常作为乳铁蛋白吸附剂的任何阳离子交换树脂。优选地，所述阳离子交换树脂为琼脂糖型离子交换树脂、丙烯酸型离子交换树脂、聚苯乙烯型离子交换树脂中的任意一种或多种。

所述阳离子交换树脂的粒径可以为有利于吸附乳铁蛋白的任何粒径，例如180-220微米、例如200微米。由此，离子交换吸附效率高，有利于乳铁蛋白的提取。

所述层析柱可以为本领域中在通过色谱法分离乳铁蛋白时常用的任何尺寸的层析柱。层析柱的尺寸可以考虑生产速率以及成本而适当地选择。

层析柱的操作条件可以为适合于分离乳铁蛋白的任何条件。其可以考虑生产速率、工艺效率以及对乳铁蛋白性质的影响而适当地选择。在一种实施方式中，使原料乳液以恒定流速通过填充有阳离子交换树脂的层析柱，其中所述原料乳液的流速使得原料乳液在层析柱内的停留时间为1～15min、例如2～10min、例如2～5min、例如3-4min，乳液及层析柱内的温度控制在3～50℃、例如25～50℃；并且使得原料乳液连续流经该层析柱5～18h、例如5-10h、6-8h。所述吸附条件不会使乳铁蛋白受热变性，其能够实现乳铁蛋白的基本上完全吸附，并且同时具有高的工艺效率。

步骤b)

在步骤b)中，用洗脱液对步骤a)中的阳离子交换树脂进行包含至少两次洗脱的第一组洗脱，得到洗脱收集液。该洗脱将乳铁蛋白从层析柱洗脱下来。

优选地，第一组洗脱中使用的洗脱液浓度依次升高，即为程序洗脱。

优选地，第一组洗脱中使用的洗脱液各自独立地为氯化钠或氯化钾溶液，优选地其钠或钾离子的浓度为0.07-0.8mol/L、例如0.1-0.6mol/L、例如0.12-0.5mol/L、例如0.12-0.4mol/L。

在一种实施方式中，第一组洗脱包括至少二次洗脱。该第一组洗脱包括顺序地使用第1洗脱液b1、和第2洗脱液b2进行洗脱，优选地第1洗脱液b1、和第2洗脱液b2各自独立地为氯化钠或氯化钾溶液；优选地第1洗脱液b1、和第2洗脱液b2中钠或钾离子的浓度的盐浓度依次升高；优选地，第1洗脱液b1中钠或钾离子的浓度为0.07～0.2mol/L、例如0.1～0.18mol/L、例如0.12～0.15mol/L；优选地，第2洗脱液b2中钠或钾离子的浓度为0.15～0.8mol/L、例如0.3-0.6mol/L、例如0.4-0.5mol/L。

在一种实施方式中，第一组洗脱包括至少三次洗脱。在一种实施方式中，第一组洗脱包括三次洗脱。优选地，第一组洗脱包括顺序地使用第1洗脱液b1’、第2洗脱液b2’、和第3洗脱液b3’进行洗脱，优选地第1洗脱液b1’、第2洗脱液b2’、和第3洗脱液b3’各自独立地为氯化钠或氯化钾溶液；优选地第1洗脱液b1’、第2洗脱液b2’、和第3洗脱液b3’中钠或钾离子的浓度的盐浓度依次升高；优选地，第1洗脱液b1’中钠或钾离子的浓度为0.07～0.2mol/L、例如0.1～0.18mol/L、例如0.12～0.15mol/L；优选地，第2洗脱液b2’中钠或钾离子的浓度为0.15～0.28mol/L、优选0.18～0.26mol/L；优选地，第3洗脱液b3’中钠或钾离子的浓度为0.2～0.8mol/L、例如0.3-0.6mol/L、例如0.4-0.5mol/L。当使用在上述浓度范围内的洗脱液时，本发明具有优异的工艺稳定性。在上述浓度范围内，最终获得的乳铁蛋白制品中乳铁蛋白含量和回收率相对稳定，乳铁蛋白含量可以稳定在95％以上，并且乳铁蛋白回收率可以稳定在80％以上。

所使用的洗脱液的体积没有特别限制，其可为能够有效除去杂质，洗脱获得乳铁蛋白的任何合适的体积。

在一种实施方式中，所使用的第1洗脱液b1的体积可为待洗脱的层析柱的体积的2-10倍、例如3-8倍、例如4-7倍、例如5-6倍。在一种实施方式中，所使用的第2洗脱液b2的体积可各自为待洗脱的层析柱的体积的2-10倍、例如3-8倍、例如4-6倍、例如4-5倍。

在一种实施方式中，所使用的第1洗脱液b1’的体积可为待洗脱的层析柱的体积的2-10倍、例如3-8倍、例如4-7倍、例如5-6倍。在一种实施方式中，所使用的第2洗脱液b2’的体积可为待洗脱的层析柱的体积的0.5-10倍、例如0.6-5倍、例如0.8-4倍、例如0.9-3倍、例如1-2倍。在一种实施方式中，所使用的第3洗脱液b3’的体积可为待洗脱的层析柱的体积的2-10倍、例如3-8倍、例如4-6倍、例如4-5倍。采用所述体积，可以在实现优异的分离效率的同时不招致过长的工艺周期，提高工艺效率。

步骤c)

在步骤c)中，将步骤b)中的至少第2次洗脱收集液除盐。

在一种实施方式中，当步骤b)中的第一组洗脱包括三次洗脱时，可以对步骤b)中洗脱得到的第2次洗脱收集液b2’进行除盐。

所述除盐可以通过本领域中已知的任何合适的除盐方法进行。优选地，所述除盐通过超滤进行。所述超滤可以使用选自平板膜包或中空纤维膜的超滤膜进行。所述超滤膜的截留分子量可为25kDa-50kDa。使用这样的超滤膜，可以基本上除去所有的盐而不损失乳铁蛋白，并且能够提高乳铁蛋白纯度。

步骤d)

在步骤d)中，使步骤c)中经除盐的洗脱收集液通过阳离子交换树脂层析柱。该阳离子交换树脂层析柱吸附洗脱收集液中的乳铁蛋白。

在一种实施方式中，当步骤b)中的第一组洗脱包括三次洗脱时，可以将步骤b)中洗脱得到的第2次洗脱收集液b2’在进行除盐后通过阳离子交换树脂层析柱。

所述阳离子交换树脂可以为本领域中常作为乳铁蛋白吸附剂的任何阳离子交换树脂。优选地，所述阳离子交换树脂为琼脂糖型离子交换树脂、丙烯酸型离子交换树脂、聚苯乙烯型离子交换树脂中的任意一种或多种。

步骤d)中使用的阳离子交换树脂可与步骤a)中使用的阳离子交换树脂相同或不同。

所述阳离子交换树脂的粒径可以为有利于吸附乳铁蛋白的任何粒径，例如180-220微米、例如200微米。由此，离子交换吸附效率高，有利于乳铁蛋白的提取。

所述层析柱可以为本领域中在通过色谱法分离乳铁蛋白时常用的任何尺寸的层析柱。层析柱的尺寸可以考虑生产速率以及成本而适当地选择。

层析柱的操作条件可以为适合于分离乳铁蛋白的任何条件。其可以考虑生产速率、工艺效率以及对乳铁蛋白性质的影响而适当地选择。在一种实施方式中，使步骤c)中经除盐的洗脱收集液以恒定流速通过填充有阳离子交换树脂的层析柱，其中所述洗脱收集液的流速使得洗脱收集液在层析柱内的停留时间控制在例如1～15min、例如2～10min、例如2～5min、例如3-4min，层析柱内的温度控制在3～50℃、例如25～50℃。所述吸附条件不会使乳铁蛋白受热变性，其能够实现乳铁蛋白的基本上完全吸附，并且同时具有高的工艺效率。

步骤e)

在步骤e)中，用洗脱液对步骤d)中的阳离子交换树脂进行包含至少两次洗脱的第二组洗脱，得到洗脱收集液。

优选地，第二组洗脱中使用的洗脱液浓度依次升高，即为程序洗脱。

优选地，第二组洗脱中使用的洗脱液各自独立地为氯化钠或氯化钾溶液，优选地其钠或钾离子的浓度为0.07-0.8mol/L、例如0.1-0.6mol/L、例如0.12-0.5mol/L、例如0.12-0.4mol/L。

在一种实施方式中，第二组洗脱包括至少二次洗脱。在一种实施方式中，第二组洗脱包括二次洗脱。

在一种实施方式中，第二组洗脱包括顺序地使用第一洗脱液e1和第二洗脱液e2进行洗脱，优选地第一洗脱液e1和第二洗脱液e2各自独立地为氯化钠或氯化钾溶液；优选地第一洗脱液e1和第二洗脱液e2中钠或钾离子的浓度的盐浓度依次升高；优选地，第一洗脱液e1中钠或钾离子的浓度为0.07～0.2mol/L、例如0.1～0.18mol/L、例如0.12～0.15mol/L；优选地，第二洗脱液e2中钠或钾离子的浓度为0.2～0.8mol/L、例如0.3-0.6mol/L、例如0.4-0.5mol/L。在一种实施方式中，第二组洗脱中使用的第一洗脱液e1浓度可以比在第一组洗脱中用于获得相应的洗脱收集液(即至少第2次洗脱收集液，例如第2洗脱收集液)的洗脱液(例如第2洗脱液b2’)的浓度低。在一种实施方式中，第二组洗脱中使用的第二洗脱液e2浓度可以比在第一组洗脱中用于获得相应洗脱收集液(即至少第2次洗脱收集液，例如第2洗脱收集液)的洗脱液(例如第2洗脱液b2’)的浓度高。

当使用在上述浓度范围内的洗脱液时，本发明具有优异的工艺稳定性。在上述浓度范围内，最终获得的乳铁蛋白制品中乳铁蛋白含量和回收率相对稳定，乳铁蛋白含量可以稳定在95％以上，并且乳铁蛋白回收率可以稳定在80％以上。

所使用的洗脱液的体积没有特别限制，其可为能够有效除去杂质，洗脱获得乳铁蛋白的任何合适的体积。在一种实施方式中，所使用的第一洗脱液e1的体积可为待洗脱的层析柱的体积的2-10倍、例如3-8倍、例如4-7倍、例如5-6倍。在一种实施方式中，使用的第二洗脱液e2的体积可为待洗脱的层析柱的体积的2-10倍、例如3-8倍、例如4-6倍、例如4-5倍。采用所述体积，可以在实现优异的分离效率的同时不招致过长的工艺周期，提高工艺效率。

步骤f)

在步骤f)中，将步骤e)中的至少最后一次洗脱收集液除盐并干燥得到乳铁蛋白产物。

在一种实施方式中，当步骤e)的第二组洗脱包括二次洗脱时，将获得的第二洗脱收集液e2除盐并干燥得到乳蛋白产物。

在一种实施方式中，当步骤b)中的第一组洗脱包含至少三次洗脱时，在步骤f)中，将步骤e)中第二组洗脱中至少最后一次洗脱收集液与步骤b)中第一组洗脱中的至少最后一次洗脱收集液混合后，再进行除盐并干燥得到乳铁蛋白产物。

在一种实施方式中，当步骤b)中的第一组洗脱包含三次洗脱并且步骤e)的第二组洗脱包括二次洗脱时，在步骤f)中，将步骤e)中第二组洗脱中的第二洗脱收集液e2与步骤b)中第一组洗脱中的第3洗脱收集液b3’混合后，再进行除盐并干燥得到乳铁蛋白产物。

所述除盐可以通过本领域中已知的任何合适的除盐方法进行。优选地，所述除盐通过超滤进行。所述超滤可以使用选自平板膜包或中空纤维膜的超滤膜进行。所述超滤膜的截留分子量可为25kDa-50kDa。使用这样的超滤膜，可以基本上除去所有的盐而不损失乳铁蛋白，并且能够提高乳铁蛋白纯度。

所述干燥可以通过适合于获得乳铁蛋白制品而不使其变性的任何方法获得。优选地，所述干燥通过冷冻干燥或者低温喷雾干燥进行。

任选地，本发明还可以进一步包括其它步骤，例如在步骤f)之前、期间或之后进行除菌处理的步骤。其可以通过本领域中常用的除菌方法进行。

图1示例性地显示了本发明的方法的一种实施方式。

参见图1，该实施方式的方法包括a)使原料乳液通过阳离子交换树脂层析柱I；b)用第1洗脱液b1’、第2洗脱液b2’和第3洗脱液b3’对步骤a)中的阳离子交换树脂进行包含三次洗脱的第一组洗脱，得到第1洗脱收集液b1’、第2洗脱收集液b2’和第3洗脱收集液b3’；c)将步骤b)中的第2洗脱收集液b2’通过超滤而除盐；d)使步骤c)中经除盐的第2洗脱收集液b2’通过阳离子交换树脂层析柱II；e)用两种洗脱液(第一洗脱液e1和第二洗脱液e2)对步骤d)中的阳离子交换树脂进行包含两次洗脱的第二组洗脱，得到第一洗脱收集液e1和第二洗脱收集液e2；f)将步骤e)中的第二洗脱收集液e2通过超滤而除盐，以得到乳铁蛋白液，将该乳铁蛋白液干燥而得到乳铁蛋白产物。

以下实施例进一步说明本发明，而不限制其范围。

实施例

实验设备和条件

在以下各实施例和对比例中，所用实验设备和条件如下。

层析设备：Lisure APPS Process DN500

层析柱I和II：Lisure SAC-Bio-500

层析柱I和II的填料：琼脂糖阳离子交换树脂

层析柱I和II的柱效：装柱高度220cm，柱体积：17.3L

平板膜：默克密理博超滤膜Pellico 3Cassettewith Biomax30KD，型号：3Biomax盒式膜包，膜面积0.57m²，截留分子量30kDa

测试方法

乳铁蛋白制品中的乳铁蛋白含量(即乳铁蛋白纯度)按照GB1903.17-2016附录A方法检测。

总蛋白质含量按照GB 5009.5^a检测。

实施例1

使脱脂牛乳(干物质8.74g/100g，蛋白质3.09g/100g，乳铁蛋白13mg/100g)以480L/小时的恒定流速通过填充有阳离子交换树脂的层析柱I，其中所述流速使得作为原料乳液的脱脂牛乳在层析柱中的停留时间为4min，其中将脱脂牛乳及层析柱内的温度控制在50℃；脱脂牛乳持续流经层析柱，以持续吸附乳液中的乳铁蛋白6h。

采用5个柱体积的0.15mol/L氯化钠溶液(第1洗脱液b1’)对层析柱I进行洗脱，获得第1洗脱收集液b1’；采用1个柱体积的0.18mol/L氯化钠溶液(第2洗脱液b2’)对层析柱I进行洗脱，获得第2洗脱收集液b2’；采用4个柱体积的0.4mol/L氯化钠溶液(第3洗脱液b3’)对树脂层析柱I进行洗脱，获得第3洗脱收集液b3’。

将第2洗脱收集液b2’采用平板膜进行脱盐，获得收集液b2’。

将收集液b2’以480L/小时的恒定流速通过填充有阳离子交换树脂的层析柱II。

采用5个柱体积的0.15mol/L氯化钠溶液(第一洗脱液e1)对层析柱II进行洗脱，获得第一洗脱收集液e1；采用4个柱体积的0.4mol/L氯化钠溶液(第二洗脱液e2)对层析柱II进行洗脱，获得第二洗脱收集液e2。

将第二洗脱收集液e2与第3洗脱收集液b3’混合，采用平板膜对混合物进行脱盐处理，获得乳铁蛋白液。

将乳铁蛋白液通过真空冷冻干燥机进行冻干处理，获得乳铁蛋白制品。

分别对进样前、后的脱脂牛乳样品，冷冻干燥后的乳铁蛋白样品进行乳铁蛋白纯度和总蛋白含量检测。

实施例2

与实施例1区别在于，所用第2洗脱液为0.22mol/L氯化钠溶液。

实施例3

与实施例1区别在于，所用第2洗脱液为0.26mol/L氯化钠溶液。

实施例4

与实施例1区别在于，所用1洗脱液为0.12mol/L氯化钠溶液，所用第2洗脱液为0.26mol/L氯化钠溶液。

实施例5

使乳清液(制作切达干酪获得的乳清液，干物质6.55g/100g，蛋白质0.73g/100g，乳铁蛋白12mg/100g)以480L/小时的恒定流速通过填充有阳离子交换树脂的层析柱I，其中所述流速使得乳清液在层析柱中的停留时间为3.5min，其中将乳清液及层析柱内的温度控制在50℃；将乳清液连续流经层析柱，以持续吸附乳清液中的乳铁蛋白8h。

采用6个柱体积的0.13mol/L的氯化钠溶液(第1洗脱液b1’)对层析柱I进行洗脱，获得第1洗脱收集液b1’；采用1个柱体积的0.2mol/L氯化钠溶液(第2洗脱液b2’)对层析柱I进行洗脱，获得第2洗脱收集液b2’；采用4个柱体积的0.5mol/L氯化钠溶液(第3洗脱液b3’)对树脂层析柱I进行洗脱，获得第3洗脱收集液b3’；

将第2洗脱收集液b2’采用平板膜进行脱盐，获收集液b2’。

将收集液b2’以480L/小时的恒定流速通过填充有阳离子交换树脂的层析柱II。

采用5个柱体积的0.13mol/L氯化钠溶液(第一洗脱液e1)对层析柱II进行洗脱，获得第一收集液e1；采用4个柱体积的0.5mol/L氯化钠溶液(第二洗脱液e2)对层析柱II进行洗脱，获得第二洗脱收集液e2；

将第二洗脱收集液e2与第3洗脱收集液b3’混合，采用平板膜对混合物进行脱盐处理，获得乳铁蛋白液。

将乳铁蛋白液通过真空冷冻干燥机进行冻干处理，获得乳铁蛋白制品。

分别对进样前、后的脱脂牛乳样品，冷冻干燥后的乳铁蛋白样品进行乳铁蛋白纯度和总蛋白含量检测。

对比例1

使脱脂牛乳(干物质8.74g/100g，蛋白质3.09g/100g，乳铁蛋白13mg/100g)以480L/小时的恒定流速通过填充有阳离子交换树脂的层析柱I，其中所述流速使得作为原料乳液的脱脂牛乳在层析柱中的停留时间为4min，其中将脱脂牛乳及层析柱内的温度控制在50℃；将脱脂牛乳持续流经层析柱，以持续吸附乳铁蛋白6h。

采用5个柱体积的0.15mol/L氯化钠溶液(第1洗脱液)对层析柱I进行洗脱，获得洗脱第一收集液A1；采用4个柱体积的0.3mol/L氯化钠溶液(第2洗脱液)对层析柱I进行洗脱，获得第2洗脱收集液B1。

采用平板膜对第2洗脱收集液B1进行脱盐，获得乳铁蛋白收集液B2。

将乳铁蛋白收集液B2通过真空冷冻干燥机进行冻干处理，获得乳铁蛋白制品。

分别对进样前、后的脱脂牛乳样品，冷冻干燥后的乳铁蛋白样品进行乳铁蛋白纯度和总蛋白含量检测。

对比例2

与对比例1区别在于，所用第2洗脱液为0.6mol/L氯化钠溶液。

对比例3

与对比例1区别在于，所用第1洗脱液为0.21mol/L氯化钠溶液，第2洗脱液为0.6mol/L氯化钠溶液。

结果

表1显示了本发明实施例1-5和对比例1-3中获得的样品的乳铁蛋白纯度与回收率、以及总蛋白含量。

从表1可以看出，本发明的工艺能够在保证回收率的前提条件下，按照GB1903.17标准，实现了总蛋白质中乳铁蛋白含量达95％的标准；而按照现有技术的常规方法，总蛋白质中乳铁蛋白含量低于95％，如对比例1-2；或者虽然总蛋白质中乳铁蛋白含量达到95％的标准，但是回收率极低，才54.9％，如对比例3。对比例2和3的对比表明，在现有技术中，当提高第1洗脱液的浓度来实现95％以上的乳铁蛋白纯度时，回收率会显著降低。而在本发明中，当提高第1洗脱液的浓度时，不仅能够在乳铁蛋白纯度已经很高的情况下继续提高乳铁蛋白含量，而且回收率仍然很高，没有明显降低。

因此，可以看出，现有技术在实现95％以上纯度的同时，必须显著牺牲回收率，其无法两者兼顾。而与此相反，本发明在实现至少95％纯度的同时，还仍然能够实现例如至少80％的高的回收率，并不需要显著牺牲回收率，能够兼顾高的乳铁蛋白纯度和回收率。

因此，本发明解决了现有乳铁蛋白制备方法中难以同时实现总蛋白质中乳铁蛋白含量达到95％以上，并且乳铁蛋白回收率高的技术难题。本发明方法制备的乳铁蛋白制品符合GB1903.17标准。

表1试验样品乳铁蛋白纯度与回收率比较

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (14)

1.一种乳铁蛋白制备方法，其包括如下步骤：

a)使原料乳液通过阳离子交换树脂层析柱；

b)用洗脱液对步骤a)中的阳离子交换树脂进行包含三次洗脱的第一组洗脱，得到洗脱收集液；

c)将步骤b)中的第2次洗脱收集液除盐；

d)使步骤c)中经除盐的洗脱收集液通过阳离子交换树脂层析柱；

e)用洗脱液对步骤d)中的阳离子交换树脂进行包含两次洗脱的第二组洗脱，得到洗脱收集液；

f)将步骤e)中的第二洗脱收集液与步骤b)中的第三洗脱收集液组合，除盐并干燥得到乳铁蛋白产物；

其中步骤b)中的第一组洗脱包括顺序地使用第1洗脱液b1’、第2洗脱液b2’、和第3洗脱液b3’进行洗脱，第1洗脱液b1’、第2洗脱液b2’、和第3洗脱液b3’各自独立地为氯化钠或氯化钾溶液；第1洗脱液b1’、第2洗脱液b2’、和第3洗脱液b3’中钠或钾离子的浓度的盐浓度依次升高；第1洗脱液b1’中钠或钾离子的浓度为0.07～0.2mol/L；第2洗脱液b2’中钠或钾离子的浓度为0.15～0.28mol/L；第3洗脱液b3’中钠或钾离子的浓度为0.2～0.6mol/L；和

步骤e)中的第二组洗脱包括顺序地使用第一洗脱液e1和第二洗脱液e2进行洗脱，第一洗脱液e1和第二洗脱液e2各自独立地为氯化钠或氯化钾溶液；第一洗脱液e1和第二洗脱液e2中钠或钾离子的浓度的盐浓度依次升高；第一洗脱液e1中钠或钾离子的浓度为0.07～0.2mol/L；第二洗脱液e2中钠或钾离子的浓度为0.2～0.8mol/L。

2.如权利要求1所述的方法，其中步骤a)中提供的原料乳液包含过氧化物酶。

3.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中步骤a)中的乳液为牛或羊脱脂乳、或乳清液。

4.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中步骤a)和步骤d)中的阳离子交换树脂各自独立地为琼脂糖型离子交换树脂、丙烯酸型离子交换树脂、聚苯乙烯型离子交换树脂中的任意一种或多种。

5.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中

第一组洗脱中的第1洗脱液b1’中钠或钾离子的浓度为0.1～0.18mol/L。

6.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中第一组洗脱中的第1洗脱液b1’中钠或钾离子的浓度为0.12～0.15mol/L。

7.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中第一组洗脱中的第2洗脱液b2’中钠或钾离子的浓度为0.18～0.26mol/L。

8.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中第一组洗脱中的第3洗脱液b3’中钠或钾离子的浓度为0.3-0.6mol/L。

9.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中第一组洗脱中的第3洗脱液b3’中钠或钾离子的浓度为0.4-0.5mol/L。

10.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中第二组洗脱中的第一洗脱液e1中钠或钾离子的浓度为0.1～0.18mol/L。

11.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中第二组洗脱中的第一洗脱液e1中钠或钾离子的浓度为0.12～0.15mol/L。

12.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中第二组洗脱中的第二洗脱液e2中钠或钾离子的浓度为0.3-0.6mol/L。

13.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中第二组洗脱中的第二洗脱液e2中钠或钾离子的浓度为0.4-0.5mol/L。

14.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中

步骤c)和f)的除盐各自独立地通过超滤进行，和/或

步骤f)中的干燥通过冷冻干燥或者低温喷雾干燥进行。

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