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CN113087795A - 针对趋化因子cx3cl1的抗体及其应用 - Google Patents

针对趋化因子cx3cl1的抗体及其应用 Download PDF

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CN113087795A
CN113087795A CN201911338538.2A CN201911338538A CN113087795A CN 113087795 A CN113087795 A CN 113087795A CN 201911338538 A CN201911338538 A CN 201911338538A CN 113087795 A CN113087795 A CN 113087795A
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seq
amino acid
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ser
thr
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CN201911338538.2A
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林鉴
蔺利娟
朱戬
王晋
吴建
王骊淳
任红媛
毕建军
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Shanghai Puming Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Puming Biotechnology Co ltd
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Publication date
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Abstract

本发明提供一种针对CX3CL1的人源化抗体或其片段，抗体或其片段的编码核酸和包含抗体或其片段的组合物等，以及它们在治疗疾病中的用途。本发明提供的抗体或其片段对CX3CL1具有高亲和力，特异性阻断CX3CL1/CX3CR1信号通路，阻断CX3CR1表达细胞的迁移活性。

Description

针对趋化因子CX3CL1的抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，本发明涉及特异性结合趋化因子CX3C亚型CX3CL1的抗体及其抗原结合片段，以及所述抗体及其抗原结合片段的应用。
背景技术
趋化因子是一类功能相关的小分子分泌蛋白，因其具有白细胞趋化性和细胞因子活性而被命名为“趋化因子”。在人体内，这个家族由大约50种相关分子组成，在其他哺乳动物也有相近的同系物。趋化因子20％～95％的序列包含保守的半胱氨酸残基，根据半胱氨酸的数量和间距，被分为四种亚型：CC，CXC，XC和CX3C亚型(C为半胱氨酸，X为任意氨基酸)。
CX3C亚型只有一个趋化因子CX3CL1，也称为不规则趋化因子(fractalkine，FKN)或神经元趋化因子(neurotactin)，是唯一膜结合性趋化因子。CX3CL1在多种细胞中表达，其唯一的受体为趋化因子受体CX3CR1。CX3CR1是一种7次跨膜域G蛋白偶联受体。正常情况下，机体的自然杀伤细胞(NK细胞)、单核细胞、肥大细胞、血小板和效应T细胞膜上均有CX3CR1的表达。
在炎症性细胞从外周循环中到达炎症部位的过程中，CX3CL1/CX3CR1起到了至关重要的作用。受体CX3CR1与配体CX3CL1结合后，引发钙离子内流而产生细胞趋化反应，从而诱导细胞到生物体的特定部位。CX3CR1参与一些炎症过程主要是通过诱导并招募NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、效应T细胞，使其到达炎症的部位实现的。CX3CR1不仅对这些细胞具有趋化作用，同时由于CX3CR1具有一个特殊的粘蛋白茎结构，CX3CR1还具有很好的粘附炎性细胞的作用，这使得CX3CR1在炎症的发生及发展的病理过程中发挥重要的作用。研究表明，许多疾病的病理改变的发生都与CX3CR1有着密不可分的关联。
日本卫材公司通过传统的杂交瘤技术，成功筛选得到了1个高亲和力的针对人CX3CL1的小鼠单克隆抗体3A5-2。经过人源化改造后的抗体H3-2L4仍保持了与人CX3CL1的高亲和力(参见CN102597003A)，目前已处于类风湿、克罗恩氏病等的临床2期或临床1/2期研究中。但是，H3-2L4人源化抗体还保留了较多的鼠源氨基酸，在人体内引起排斥免疫反应的概率相对比较高；另外，其与靶点结合的CDR区还保留了若干翻译后修饰位点，在人体内存在因为被修饰而丧失生物活性的风险。
发明内容
为了最大程度地减少抗体引起的排斥免疫反应，应使人治疗用抗体倾向尽量少地包含鼠源氨基酸。为了解决这一技术问题，本发明旨在通过更加优化的人源化设计最大程度减少目标抗体的鼠源氨基酸的数目，使之预期拥有更好的体内安全性。
此外，本发明还旨在通过细胞表面展示技术对人源化后的抗体的6个CDR氨基酸进行随机突变建库，来筛选出具有更高亲和力的抗体分子；并且，还可对亲和力成熟后的抗体进行第二次工程改造，构建可变区全序列随机突变抗体库，以筛选得与小鼠CX3CL1以高亲和力结合的抗体，为在小鼠模型中研究CX3CL1相关疾病作用机制提供抗体选择。
针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种抗人趋化因子CX3CL1的抗体或其片段，尤其是人源化抗体或其片段，相比于现有CX3CL1人源化抗体，本发明提供的抗体具有更少的鼠源氨基酸，且对CX3CL1的亲和力更高。本发明的目的还在于提供进一步得到的与小鼠CX3CL1具有高亲和力的抗体。基于前述，本发明的目的还在于提供这些抗体的应用。
具体而言，本发明提供以下技术方案。
本发明所述抗体的“片段”涵盖抗体的各种功能性片段，例如其抗原结合部分，如Fab、F(ab’)2或scFv片段。
所述CX3CL1是指不规则趋化因子(fractalkine)或神经元趋化因子(neurotactin)。优选地，所述CX3CL1为灵长类哺乳动物CX3CL1，更优选为人CX3CL1。
一方面，本发明提供一种抗体或其片段，所述抗体或其片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL/VK)，其中所述重链可变区(VH)包含来自以下序列中任一个所示的重链可变区的3个CDR(H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3)：
SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28；和/或
其中所述轻链可变区(VL)包含来自以下序列中任一个所示的轻链可变区的3个CDR(L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3)：
SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31。
优选地，本发明提供的抗体或其片段中，所述重链可变区(VH)包含来自以下序列中任一个所示的重链可变区的3个CDR(H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3)：
SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28；和/或
其中所述轻链可变区(VL)包含来自以下序列中任一个所示的轻链可变区的3个CDR(L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3)：
SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30和SEQ ID NO:31。
根据本发明的具体实施方式，本发明提供的抗体或其片段中，所述重链可变区(VH)和所述轻链可变区(VL)包含来自以下序列组合所示的6个CDR(H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3)：
(1)SEQ ID NO:11+SEQ ID NO:23；
(2)SEQ ID NO:14+SEQ ID NO:22；
(3)SEQ ID NO:14+SEQ ID NO:23；
(4)SEQ ID NO:14+SEQ ID NO:24；
(5)SEQ ID NO:14+SEQ ID NO:25；
(6)SEQ ID NO:15+SEQ ID NO:22；
(7)SEQ ID NO:15+SEQ ID NO:23；
(8)SEQ ID NO:15+SEQ ID NO:24；
(9)SEQ ID NO:15+SEQ ID NO:25；
(10)SEQ ID NO:16+SEQ ID NO:22；
(11)SEQ ID NO:16+SEQ ID NO:23；
(12)SEQ ID NO:16+SEQ ID NO:24；
(13)SEQ ID NO:16+SEQ ID NO:25；
(14)SEQ ID NO:17+SEQ ID NO:22；
(15)SEQ ID NO:17+SEQ ID NO:23；
(16)SEQ ID NO:17+SEQ ID NO:24；
(17)SEQ ID NO:17+SEQ ID NO:25；
(18)SEQ ID NO:26+SEQ ID NO:29；
(19)SEQ ID NO:26+SEQ ID NO:30；
(20)SEQ ID NO:26+SEQ ID NO:31；
(21)SEQ ID NO:27+SEQ ID NO:29；
(22)SEQ ID NO:27+SEQ ID NO:30；
(23)SEQ ID NO:27+SEQ ID NO:31；
(24)SEQ ID NO:28+SEQ ID NO:29；
(25)SEQ ID NO:28+SEQ ID NO:30；或
(26)SEQ ID NO:28+SEQ ID NO:31。
本发明提供的轻、重链CDR的组合来自上述轻、重链可变区，基于给定轻、重链可变区的氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定其中包含的CDR的氨基酸序列。例如，根据本发明的具体实施方式，采用Chothia编码方法划分可变区氨基酸序列中的CDR。以本领域已知方法划分得到的轻重链CDR及其组合也被涵盖在本发明的范围内。
优选地，所述重链可变区(VH)和所述轻链可变区(VL)包含选自以下的CDR组合：
(1)依次示于SEQ ID NO:37、44、42的H-CDR1(NYYIH)、H-CDR2(WFIPGSDPPKFNERFKG)、H-CDR3(GPTQGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:49、51、48的L-CDR1(RASGRIHGFLA)、L-CDR2(TDNTLAE)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(2)依次示于SEQ ID NO:37、41、39的H-CDR1(NYYIH)、H-CDR2(WYLPGDDSPKFNERFKG)、H-CDR3(SPTDETQGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:46、51、48的L-CDR1(RASGRIHDFLA)、L-CDR2(TDNTLAE)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(3)依次示于SEQ ID NO:37、41、39的H-CDR1(NYYIH)、H-CDR2(WYLPGDDSPKFNERFKG)、H-CDR3(SPTDETQGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:49、51、48的L-CDR1(RASGRIHGFLA)、L-CDR2(TDNTLAE)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(4)依次示于SEQ ID NO:37、41、39的H-CDR1(NYYIH)、H-CDR2(WYLPGDDSPKFNERFKG)、H-CDR3(SPTDETQGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:46、52、48的L-CDR1(RASGRIHDFLA)、L-CDR2(TDNTLSG)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(5)依次示于SEQ ID NO:37、41、39的H-CDR1(NYYIH)、H-CDR2(WYLPGDDSPKFNERFKG)、H-CDR3(SPTDETQGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:49、52、48的L-CDR1(RASGRIHGFLA)、L-CDR2(TDNTLSG)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(6)依次示于SEQ ID NO:37、44、39的H-CDR1(NYYIH)、H-CDR2(WFIPGSDPPKFNERFKG)、H-CDR3(SPTDETQGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:46、51、48的L-CDR1(RASGRIHDFLA)、L-CDR2(TDNTLAE)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(7)依次示于SEQ ID NO:37、44、39的H-CDR1(NYYIH)、H-CDR2(WFIPGSDPPKFNERFKG)、H-CDR3(SPTDETQGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:49、51、48的L-CDR1(RASGRIHGFLA)、L-CDR2(TDNTLAE)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(8)依次示于SEQ ID NO:37、44、39的H-CDR1(NYYIH)、H-CDR2(WFIPGSDPPKFNERFKG)、H-CDR3(SPTDETQGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:46、52、48的L-CDR1(RASGRIHDFLA)、L-CDR2(TDNTLSG)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(9)依次示于SEQ ID NO:37、44、39的H-CDR1(NYYIH)、H-CDR2(WFIPGSDPPKFNERFKG)、H-CDR3(SPTDETQGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:49、52、48的L-CDR1(RASGRIHGFLA)、L-CDR2(TDNTLSG)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(10)依次示于SEQ ID NO:37、41、40的H-CDR1(NYYIH)、H-CDR2(WYLPGDDSPKFNERFKG)、H-CDR3(GPAPAEGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:46、51、48的L-CDR1(RASGRIHDFLA)、L-CDR2(TDNTLAE)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(11)依次示于SEQ ID NO:37、41、40的H-CDR1(NYYIH)、H-CDR2(WYLPGDDSPKFNERFKG)、H-CDR3(GPAPAEGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:49、51、48的L-CDR1(RASGRIHGFLA)、L-CDR2(TDNTLAE)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(12)依次示于SEQ ID NO:37、41、40的H-CDR1(NYYIH)、H-CDR2(WYLPGDDSPKFNERFKG)、H-CDR3(GPAPAEGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:46、52、48的L-CDR1(RASGRIHDFLA)、L-CDR2(TDNTLSG)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(13)依次示于SEQ ID NO:37、41、40的H-CDR1(NYYIH)、H-CDR2(WYLPGDDSPKFNERFKG)、H-CDR3(GPAPAEGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:49、52、48的L-CDR1(RASGRIHGFLA)、L-CDR2(TDNTLSG)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(14)依次示于SEQ ID NO:37、44、40的H-CDR1(NYYIH)、H-CDR2(WFIPGSDPPKFNERFKG)、H-CDR3(GPAPAEGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:46、51、48的L-CDR1(RASGRIHDFLA)、L-CDR2(TDNTLAE)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(15)依次示于SEQ ID NO:37、44、40的H-CDR1(NYYIH)、H-CDR2(WFIPGSDPPKFNERFKG)、H-CDR3(GPAPAEGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:49、51、48的L-CDR1(RASGRIHGFLA)、L-CDR2(TDNTLAE)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(16)依次示于SEQ ID NO:37、44、40的H-CDR1(NYYIH)、H-CDR2(WFIPGSDPPKFNERFKG)、H-CDR3(GPAPAEGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:46、52、48的L-CDR1(RASGRIHDFLA)、L-CDR2(TDNTLSG)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(17)依次示于SEQ ID NO:37、44、40的H-CDR1(NYYIH)、H-CDR2(WFIPGSDPPKFNERFKG)、H-CDR3(GPAPAEGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:49、52、48的L-CDR1(RASGRIHGFLA)、L-CDR2(TDNTLSG)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(18)依次示于SEQ ID NO:53、54、39的H-CDR1(NYNIH)、H-CDR2(WYLPGDDSSKFNERFEG)、H-CDR3(SPTDETQGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:46、51、48的L-CDR1(RASGRIHDFLA)、L-CDR2(TDNTLAE)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(19)依次示于SEQ ID NO:53、54、39的H-CDR1(NYNIH)、H-CDR2(WYLPGDDSSKFNERFEG)、H-CDR3(SPTDETQGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:46、56、48的L-CDR1(RASGRIHDFLA)、L-CDR2(TDNALAE)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(20)依次示于SEQ ID NO:53、55、39的H-CDR1(NYNIH)、H-CDR2(WYLPGDDSPRFNERFKG)、H-CDR3(SPTDETQGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:46、51、48的L-CDR1(RASGRIHDFLA)、L-CDR2(TDNTLAE)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(21)依次示于SEQ ID NO:53、55、39的H-CDR1(NYNIH)、H-CDR2(WYLPGDDSPRFNERFKG)、H-CDR3(SPTDETQGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:46、56、48的L-CDR1(RASGRIHDFLA)、L-CDR2(TDNALAE)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(22)依次示于SEQ ID NO:53、55、39的H-CDR1(NYNIH)、H-CDR2(WYLPGDDSPRFNERFKG)、H-CDR3(SPTDETQGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:46、51、48的L-CDR1(RASGRIHDFLA)、L-CDR2(TDNTLAE)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(23)依次示于SEQ ID NO:53、55、39的H-CDR1(NYNIH)、H-CDR2(WYLPGDDSPRFNERFKG)、H-CDR3(SPTDETQGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:46、56、48的L-CDR1(RASGRIHDFLA)、L-CDR2(TDNALAE)、L-CDR3(QQFWSTPYT)；
(24)依次示于SEQ ID NO:53、55、39的H-CDR1(NYNIH)、H-CDR2(WYLPGDDSPRFNERFKG)、H-CDR3(SPTDETQGDY)；和，依次示于SEQ ID NO:46、51、48的L-CDR1(RASGRIHDFLA)、L-CDR2(TDNTLAE)、L-CDR3(QQFWSTPYT)。
根据本发明的具体实施方式，在所述抗体或其片段中，所述重链可变区包含选自以下的序列：
示于SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和/或
所述轻链可变区包含选自以下的序列：
SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
优选地，根据本发明的具体实施方式，在所述抗体或其片段中，所述抗体或其片段包含的重链可变区和轻链可变区选自以下组合：
(1)示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(2)示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(3)示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(4)示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(5)示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:25的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(6)示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(7)示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(8)示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(9)示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:25的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(10)示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(11)示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(12)示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(13)示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:25的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(14)示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(15)示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(16)示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(17)示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:25的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(18)示于SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:29的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(19)示于SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:30的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(20)示于SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(21)示于SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:29的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(22)示于SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:30的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(23)示于SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(24)示于SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:29的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(25)示于SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:30的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；或
(26)示于SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
优选地，所述抗体或其片段为针对趋化因子CX3CL1、优选哺乳动物CX3CL1、更优选人CX3CL1、食蟹猴CX3CL1或小鼠CX3CL1的抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含VH框架区和VL框架区；
所述抗体为单克隆抗体、单链抗体、双功能抗体、单域抗体、纳米抗体、完全或部分人源化的抗体或者嵌合抗体等任意形式，或者，所述抗原结合片段为半抗体或者抗体或半抗体的抗原结合片段，例如scFv、BsFv、dsFv、(dsFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2或Fv。
进一步优选地，所述抗体或其片段还包含人或鼠源的恒定区，优选包含人或鼠源的重链恒定区(CH)和/或轻链恒定区(CL)；优选地，所述抗体或其片段包含重链和轻链；
更优选地，所述抗体或其片段包含IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重链恒定区和/或κ或λ型轻链恒定区。
优选地，所述抗体为单克隆抗体，优选为鼠、嵌合或人源化的单克隆抗体；优选地，所述单克隆抗体的重链恒定区为IgG4亚型，轻链恒定区为κ型；
优选地，所述单克隆抗体的重链恒定区包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；优选地，所述单克隆抗体的轻链恒定区包含如SEQ ID NO:36所示氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
本发明所述的至少75％同一性为至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、进一步优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性等≥75％的任何百分比的同一性。
特别地，本发明的抗体或其片段至少包含重链可变区和轻链可变区，二者均包括上述CDR以及间隔的框架区(frame work)，各个结构域的排列方式为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。在这一方面，所述“至少75％同一性”导致的氨基酸序列上的至多25％差异可存在于重链可变区或轻链可变区中的任意框架区中，或者存在于本发明的抗体或其片段中重链可变区和轻链可变区以外的任意结构域或序列中。所述差异可以由任何位置的氨基酸缺失、添加或置换产生，其中置换可以是保守置换或非保守置换。
根据本发明的具体实施方式，特别优选地，本发明提供如下抗体：
人源化抗体AM85，所述抗体包含SEQ ID NO:14所示的重链可变区，SEQ ID NO:22所示的轻链可变区，SEQ ID NO:35所示的重链恒定区，SEQ ID NO:36所示的轻链恒定区；
人源化抗体AM85-M3，所述抗体包含SEQ ID NO:26所示的重链可变区，SEQ ID NO:31所示的轻链可变区，SEQ ID NO:35所示的重链恒定区，SEQ ID NO:36所示的轻链恒定区；
人源化抗体AM85-M8，所述抗体包含SEQ ID NO:28所示的重链可变区，SEQ ID NO:30所示的轻链可变区，SEQ ID NO:35所示的重链恒定区，SEQ ID NO:36所示的轻链恒定区。
另一方面，基于本发明的抗体或其片段，本发明还提供一种核酸分子，其编码本发明的任意抗体或其片段或者编码所述抗体或其片段中包含的重链CDR、轻链CDR、轻链可变区、重链可变区、重链或轻链。
还一方面，本发明提供一种载体，其包含本发明的核酸分子。所述载体可以为真核表达载体、原核表达载体、人工染色体及噬菌体载体等。
本发明的载体或核酸分子可以用于转化或转染宿主细胞或以任何方式进入宿主细胞内，用于保存或表达抗体等目的。因此，另一方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的核酸分子和/或载体，或者所述宿主细胞被本发明的核酸分子和/或载体转化或转染。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，例如细菌或昆虫、真菌、植物或动物细胞。
基于本发明的公开内容，本发明提供的抗体或其片段、核酸分子、载体和/或宿主细胞可以通过使用本领域已知的任何常规技术方法获得。所述抗体或其片段、核酸分子、载体和/或宿主细胞可以被包含在组合物(例如药物组合物)中，更特别地被包含在药物制剂中，从而根据实际需要用于各种目的。
因此，在又一方面，本发明还提供一种组合物，所述组合物包含本发明所述的抗体或其片段、核酸分子、载体和/或宿主细胞。优选地，所述组合物为药物组合物，其任选地还包含药学上可接受的辅料。
作为结合CX3CL1、尤其是人CX3CL1的抗体或其片段，本发明还提供上述主题的相关应用。
具体而言，再一方面，发明提供所述的抗体或其片段、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、治疗和/或改善炎性疾病；
优选地，所述炎性疾病为溃疡性结肠炎、克罗恩病、炎性肠病、类风湿性关节炎、肾炎、肾小球肾炎、肌炎、多发性硬化、视神经脊髓炎、动脉粥样硬化、牛皮癣、系统性红斑狼疮(例如中枢神经系统的狼疮或狼疮性肾炎)或自身免疫性肝胆疾病。
或者，发明提供所述的抗体或其片段、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物在制备药物中的用途，所述药物用于阻断CX3CL1/CX3CR1信号通路和/或阻断CX3CR1表达细胞的迁移。
或者，发明提供所述的抗体或其片段、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物作为药剂在小鼠模型中研究CX3CL1/CX3CR1信号通路相关或者CX3CL1或CX3CR1相关疾病作用机制中的用途。
又一方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的抗体或其片段、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物。该试剂盒可用于治疗、诊断或检测用途。例如，通过所述抗体或其片段与待测样品接触，来检测样品中是否存在CX3CL1。
本发明通过更加优化的人源化设计最大程度地减少了目标抗体(小鼠单克隆抗体3A5-2)的鼠源氨基酸的数目，从而使人源化后的抗体具有更好的体内安全性。进一步地，通过细胞表面展示技术，本发明对人源化后的抗体的6个CDR区域中的氨基酸进行随机突变建库，通过对抗体库的流式分选，筛选得到相比于3A5-2的原人源化抗体H3-2L4具有更高亲和力的抗体分子，相比H3-2L4，亲和力成熟抗体中甚至有部分抗体在KD上有1个数量级的亲和力提高，对CX3CL1/CX3CR1信号通路的阻断相当而最大阻断率有10％-20％的提高。
进一步地，本发明对亲和力成熟抗体还进行了第二次工程改造，同样构建了可变区全序列随机突变抗体库，通过测定二次工程改造后抗体与小鼠、食蟹猴和人CX3CL1的结合动力学参数，筛选得到了和小鼠CX3CL1有高亲和力结合的抗体，该抗体在保留其与人和食蟹猴CX3CL1结合活性的同时，其与小鼠CX3CL1的结合KD提高了30-40倍，达到nM级，因此可以尤其作为替代抗体在小鼠模型里研究CX3CL1相关的疾病作用机制。
另外本发明充分研究了抗体的物理化学性质，发现抗体的单体率、亲水性、熔点(Tm)都处在一个正常的水平。特别是，检测发现本发明的抗体可以体外阻断CX3CR1表达细胞的迁移活性，且相比于H3-2L4甚至有5倍提高。
综上，相比于现有CX3CL1抗体，本发明提供的抗体是更为理想的临床先导药物。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示了鼠源抗体3A5-2的人源化设计。
图2显示了人源化抗体3A5-2_hz20的6个CDR和亲和力成熟改造的突变位点选择。
图3为亲和力成熟改造中利用突变引物的2步PCR法来制备突变单链抗体基因的示意图。
图4显示了通过流式分选得到的突变体克隆与抗原的FACS结合分析结果。
图5显示了亲和力成熟抗体阻断靶点下游信号通路的cAMP实验结果。
图6显示了亲和力成熟抗体和工程改造抗体阻断CX3CR1表达细胞的迁移活性实验结果。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
人CX3CL1：氨基酸序列示于SEQ ID NO:32；
小鼠CX3CL1：氨基酸序列示于SEQ ID NO:33；
食蟹猴CX3CL1：氨基酸序列示于SEQ ID NO:34；
重链恒定区：氨基酸序列示于SEQ ID NO:35；
轻链恒定区：氨基酸序列示于SEQ ID NO:36；
人CX3CR1：氨基酸序列示于SEQ ID NO:58。
实施例1小鼠单克隆抗体3A5-2的人源化设计和人源化抗体的体外结合活性测定
1.1小鼠单克隆抗体3A5-2的人源化设计
综合Kabat、Chothia的抗体编码方案，确定鼠源抗体3A5-2的重链和轻链的6个抗原互补决定簇(CDR)的氨基酸序列区域及支撑抗体保守三维构象的框架区(FR)。随后通过分析搜索已知人源抗体序列，选择与鼠源抗体最为相似接近的人源抗体重链可变区序列，如IGHV1-69，选择其抗体框架区序列作为模板，将鼠源抗体重链CDR与人源抗体FR组合，生成人源化抗体重链可变区序列。同样过程，选择IGKV1-13抗体框架区序列作为模板，生成人源化抗体轻链可变区序列。此外，确定回复突变位点：对照设计好的人源化抗体序列和原始的鼠源抗体序列，检查有哪些氨基酸的不同，检查这些氨基酸是否对支持抗体结构起重要作用或者对与抗原的结合起重要作用。同时，检查人源化设计后的序列是否有潜在的翻译后修饰位点，如N(天冬酰胺)糖基化位点、N脱酰胺化位点、D(天冬氨酸)异构化位点等。
3A5-2的人源化设计见图1，其中分别显示了3A5-2重链可变区(3A5-2_VH)和轻链可变区(3A5-2_VK)的三个人源化序列(3A5-2_VH_hz0、3A5-2_VH_hz1和3A5-2_VH_hz2；3A5-2_VK_hz0、3A5-2_VK_hz1和3A5-2_VK_hz2)，后缀为“_hz0”的人源化序列表示鼠源抗体CDR直接移植至人框架区。
合成上述人源化的重链可变区基因，将其构建到含人单克隆抗体IgG4亚类的重链恒定区基因的哺乳动物细胞表达载体中；同样地，合成轻链可变区基因，将其构建到含人单克隆抗体κ亚类的轻链恒定区基因的哺乳动物细胞表达载体中。构建好的人源化抗体的重链载体和轻链载体交叉配对(表1)，使用聚乙烯亚胺(PEI)转染HEK293细胞，约7天后收集细胞上清，使用ProteinA纯化得到人源化抗体蛋白。
将人源化抗体命名为“鼠源抗体简称_hz”，其中鼠源抗体CDR直接移植至人框架区的抗体命名为“鼠源抗体简称_hz00”，进一步改造得到的抗体根据序列不同进行编号。
表1.重、轻链交叉配对表达的人源化抗体
Figure BDA0002331619800000161
1.2人源化抗体的体外结合活性测定
利用Fortebio(BLITZ pro1.1.0.28)仪器分析人源化抗体与抗原人CX3CL1(hCX3CL1)的结合动力学参数。测定前先将NTA生物探针浸泡于PBS中10分钟；然后将该探针置于含100nM的抗原的PBS中300秒，捕获带His标签的抗原；进一步将探针与100nM抗体进行结合反应，结合时间400秒；之后将探针转移至PBS中，进行解离反应，时间为600秒。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行1：1Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数。结果见表2。
表2.鼠抗3A5-2人源化后得到的抗体的结合动力学参数
Ab ID 响应 K<sub>D</sub>(M) K<sub>on</sub>(1/Ms) k<sub>off</sub>(s<sup>-1</sup>) K<sub>off</sub>/K<sub>off</sub>(H3-2L4)
H3-2L4 0.306 5.95E-09 4.42E+05 2.63E-03 1.00
3A5-2_hz00 0.252 9.05E-09 5.35E+05 4.84E-03 1.84
3A5-2_hz10 0.280 6.50E-09 5.16E+05 3.35E-03 1.28
3A5-2_hz20 0.217 1.49E-08 4.99E+05 7.45E-03 2.77
3A5-2_hz01 0.013 <1.0E-12 2.83E+04 <1.0E-07 NA
3A5-2_hz11 0.015 <1.0E-12 3.22E+04 <1.0E-07 NA
3A5-2_hz21 0.009 <1.0E-12 6.86E+04 <1.0E-07 NA
3A5-2_hz02 0.010 <1.0E-12 2.14E+04 <1.0E-07 NA
3A5-2_hz12 0.012 <1.0E-12 5.75E+04 <1.0E-07 NA
3A5-2_hz22 0.001 <1.0E-12 3.04E+04 <1.0E-07 NA
实施例2人源化抗体的亲和力成熟改造
2.1亲和力成熟抗体库的设计和构建
人源化抗体3A5-2_hz20被选作亲和力成熟改造的模板。将3A5-2_hz20的重链可变区和轻链可变区通过GS linker连接构建成单链抗体(single-chain variable fragment，scFv)，该单链抗体的CDR是亲和力成熟改造的目标，而骨架区在亲和力成熟改造中将保持不变，重轻链共6个CDR分别构建成单独的抗体库。基于经验和序列特性，H-CDR3中有一些氨基酸在亲和力成熟的改造中是保持不变，如图2所示，不变氨基酸以粗体斜体示出。
设计合成了用于CDR的随机突变引物，每个突变位置只引入20％的核苷酸突变，在引物两侧有约20个碱基对的未突变碱基。通过突变引物与其他常规引物的两步PCR，将突变整合到最终的单链抗体基因中。单链抗体基因在5’末端有148bp的突出端，在3’末端有222bp的突出端，与展示DNA载体pYD上的序列相同，即所谓的同源区域。该2步PCR法的示意图见图3。
用4μg线性化载体和12μg单链抗体基因通过电穿孔法共同转化酵母菌株EBY100，然后酵母利用其同源重组机制将单链抗体基因连接到展示DNA载体中。每个CDR区突变抗体库的库容见表3。
表3. 6个CDR突变抗体库的库容
# 抗体库 氨基酸突变数目 库容
1 H1 10 1.0×10<sup>8</sup>
2 H2 8 1.7×10<sup>8</sup>
3 H3 7 1.6×10<sup>8</sup>
4 L1 8 1.2×10<sup>8</sup>
5 L2 8 1.1×10<sup>8</sup>
6 L3 7 5×10<sup>7</sup>
2.2亲和力成熟抗体库的流式分选
6个CDR突变抗体库经过1轮的磁珠分选后，再进行了4轮的抗原浓度依次递减的FACS分选。第一轮用300nM生物素化的hCX3CL1分选，第二轮抗原浓度降为100nM，第三轮抗原浓度降为10nM，第四轮抗原浓度降为1nM。每轮的FACS分选收集了文库的0.1％至0.5％的克隆进行培养，再进行下一轮的分选，最后分离得到亲和力改善的突变体克隆。
挑选了96个酵母菌落进行了测序分析，最终从H2文库中选择出7个独特的突变体克隆，从H3文库中选择出4个独特的突变体克隆，并根据亲和力排序和突变分别从L1和L2文库中选择出5个独特的突变体克隆，见表4。
表4.通过流式分选选择的突变体克隆
Figure BDA0002331619800000181
2.3分选克隆的亲和力分析
将突变体克隆的酵母菌接种在酵母培养基中，诱导相关单链抗体的表达。14000rpm离心1分钟收集酵母细胞，用含1％BSA的PBS洗涤1次。重悬酵母细胞的密度为5000000个/ml，于96孔U形孔板中每孔加入100μl的细胞。加入100μl梯度稀释的生物素化抗原溶液，室温震荡孵育30分钟后，置于冰上10分钟。4℃下14000rpm离心1分钟离心收集细胞，用预冷的含1％BSA的PBS洗涤1次。加入100μl 1:500稀释的SA荧光二抗，冰上孵育30分钟。4℃下14000rpm离心1分钟离心收集细胞，用预冷的含1％BSA的PBS洗涤2次。用流式细胞仪分析细胞群的平均荧光读值。结果如图4所示，经过5轮分选的突变体克隆与抗原的结合EC50值均高于H3-2L4抗体。
2.4亲和力成熟抗体IgG的重组表达
综合分析以上亲和力提高克隆的突变位点，将6个CDR的相关突变位点组合起来。包含各种组合突变位点的抗体可变区分别见序列表中所示的11种重链可变区(AM_vh1至AM_vh11)和8种轻链可变区(AM_vl1至AM_vl8)以及图1所示的35A-2_VK-hz0。
合成重链可变区基因，将其构建到含人单克隆抗体IgG4亚类的重链恒定区基因的哺乳动物细胞表达载体中；同样地，合成轻链可变区基因，将其构建到含人单克隆抗体κ亚类的轻链恒定区基因的哺乳动物细胞表达载体中。如实施例1的1.1部分中针对人源化抗体表达，将构建好的亲和力成熟抗体的重链载体和轻链载体交叉配对，使用聚乙烯亚胺(PEI)转染HEK293细胞，约7天后收集细胞上清，使用ProteinA纯化得到亲和力成熟抗体蛋白。
将亲和力成熟抗体命名为“AMxy”，其中x来自重链可变区AM_vh的数字编号，y来自轻链可变区AM_vl的数字编号，例如下文的AM85包含AM_vh8和AM_vl5。
2.5亲和力成熟抗体与人CX3CL1的动力学参数测定
采用GE公司BIAcore仪器S200测定抗体抗原相互作用力。参考GE公司Humanantibody capture kit(货号BR-1008-39，Lot10261753)操作说明，首先在传感芯片CM5分析通道和对照样品通道都饱和偶联最大量抗人Fc抗体，然后在分析通道流过含有7.5μg/ml抗人CX3CL1嵌合抗体的缓冲液使其均匀分布，最后在分析通道和对照样品通道一起流过梯度稀释的抗原样品(起始浓度20nM，1:3稀释8个浓度点，并且设定0.741nm浓度点重复)，测定抗体抗原结合后发生的光反应值。经仪器软件拟合分析，最终得到抗体的结合常数Kon和解离常数Koff，以及亲和力常数KD。
结果表明，经过重轻链重新组合的大部分亲和力成熟抗体，它们与抗原的结合活性比H3-2L4都有一定程度的提高。其中包含AM_vh8或AM_vh9、AM_vl5或AM_vl6的抗体的结合活性提高达到了1个数量级的差异。见表5。
表5.Biacore分析亲和力成熟后IgG抗体的动力学参数
Figure BDA0002331619800000191
Figure BDA0002331619800000201
2.6亲和力成熟抗体对CX3CL1下游信号通路的阻断活性测定
采用cAMP法进行检测。
首先在CHO-K1细胞上构建了稳定表达人CX3CR1的稳定细胞系，命名为CHOK1-CX3CR1细胞。培养该细胞至70％至90％的汇合度，胰蛋白酶消化收集，400g离心5分钟，弃上清。用含IBMX的培养基重悬细胞至125000个/ml的密度，于384孔板中每孔加入4μl的细胞。待测抗体溶于含1％BSA的培养基，起始浓度为30μg/ml，3倍稀释，8个稀释浓度(包含0浓度)，加2μl每个浓度的抗体至384孔板。使用含1％BSA的培养基配制浓度为0.2μg/ml的CX3CL1蛋白，加2μl至384孔板中，室温放置10分钟。使用含1％BSA的培养基配制浓度为5μM的Forskolin，加2μl至384孔板中，于37℃放置30分钟。最后加入5μl anti-cAMP-Cryptate溶液和5ul cAMP-d2溶液，室温放置1小时后读板检测。
结果显示，相比于H3-2L4抗体，本发明的亲和力成熟抗体阻断CX3CL1与其受体的信号通路的IC50值没有显著差异，而最大阻断率有10％-20％左右的提升。见图5和表6。
表6.亲和力成熟抗体阻断靶点下游信号通路的cAMP实验结果
AM85 AM86 AM87 AM88 AM95 AM96 AM97 AM98 H3-2L4 hIgG
IC50(nM) ～2.253 1.69 1.734 1.901 1.186 1.746 1.677 ～2.299 1.695 NA
最大阻断率(％) 126 121 123 124 123 110 121 110 100 NA
实施例3结合小鼠CX3CL1的替代抗体的工程改造
3.1工程改造抗体库的构建和筛选
方法如在实施例2的抗体亲和力成熟改造中所述。选择了亲和力成熟抗体AM85作为二次工程改造的模板，设计了重轻链全可变区的随机突变的抗体库。经过5轮小鼠CX3CL1抗原浓度依次递减的FACS筛选，得到FACS结合抗原的能力强于模板的克隆，将其重新扩大培养，抽提DNA测序。分析测序结果，合成新的抗体重轻链可变区基因，构建到真核表达载体中。将重轻链表达载体交叉组合，瞬时转染HEK293细胞进行重组表达，经ProteinA一步纯化得到SDS-PAGE纯度在95％以上的抗体蛋白。
各种抗体可变区分别见序列表中所示的3种重链可变区(AM_vh8_m1至AM_vh8_m3)和3种轻链可变区(AM_vl5_m1至AM_vl5_m3)。
表7.重轻链交叉配对表达的工程改造抗体
Figure BDA0002331619800000211
3.2工程改造抗体与不同种属CX3CL1的结合活性测定
方法如上文所述，采用GE公司BIAcore仪器S200测定二次工程改造后抗体与小鼠、食蟹猴和人CX3CL1的结合动力学参数。
结果表明，经过二次工程化后的抗体，在保留其与人和食蟹猴CX3CL1结合活性的同时，其与小鼠CX3CL1的结合KD值从原来的约50nM的水平提高了30～40倍，达到nM级。二次工程化后的抗体可以作为替代抗体在小鼠模型里研究CX3CL1相关的疾病作用机制。见表8。
表8.工程改造抗体的种属交叉结合活性
Figure BDA0002331619800000212
3.3工程改造抗体阻断CX3CL1受体表达细胞趋化活性测定
培养稳定表达CX3CR1蛋白的CHOK1-CX3CR1细胞至约50％的汇合度，用PBS洗细胞两遍之后加入无血清的培养基饥饿培养过夜。胰蛋白酶消化收集细胞，400g离心5分钟，弃上清。用含无血清培养基重悬细胞至3×106个/ml的密度。于24孔板中每孔加入600μl的培养基，加入终浓度为0.2μg/ml的人CX3CL1和不同浓度的待测抗体；将迁移小室放置于24孔板中，加入50μl细胞至迁移上室。24孔板放入37℃培养箱孵育4小时后，将上层迁移小室转移到含有600μl胰酶的另一24空板中，置于37℃培养箱中继续孵育10分钟，500g离心1分钟后，弃去迁移小室，加入50μl的FBS终止酶反应。将两个24孔板对应孔的细胞合并，500g离心5分钟后，弃上清，加入120μlCellTiter-Glo，室温放置10分钟后检测发光强度。
结果显示，相比于H3-2L4抗体，第一次亲和力成熟改造后的抗体AM85以及第二次小鼠CX3CL1交叉结合活性改造后的抗体AM85-M3和AM85-M8，在体外阻断CX3CR1表达细胞的迁移活性方面，IC50值有约5倍左右的显著提高。见图6和表9。
表9.抗体阻断CX3CR1表达细胞的迁移活性实验结果
Ab ID. 最大阻断率(％) IC50(nM)
H3-2L4 100 3.33
AM85 100 0.59
AM85-M3 100 0.68
AM85-M8 100 0.69
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
序列表
<110> 迈威（上海）生物科技有限公司
上海普铭生物科技有限公司
<120> 针对趋化因子CX3CL1的抗体及其应用
<130> LC19110082
<160> 58
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 119
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1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Phe Ile Pro Gly Ser Asp Pro Pro Lys Phe Asn Glu Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Pro Ala Pro Ala Glu Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
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1 5 10 15
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20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Asn Glu Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Thr Asp Asn Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
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20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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85 90 95
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100 105 110
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
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<400> 30
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Arg Ile His Asp Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Thr Asp Asn Ala Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Thr Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Trp Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 31
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<213> 人工(Artificial)
<220>
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<223> AM_vl5_m3
<400> 31
Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Arg Ile His Asp Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Thr Asp Asn Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 397
<212> PRT
<213> human CX3CL1
<400> 32
Met Ala Pro Ile Ser Leu Ser Trp Leu Leu Arg Leu Ala Thr Phe Cys
1 5 10 15
His Leu Thr Val Leu Leu Ala Gly Gln His His Gly Val Thr Lys Cys
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130 135 140
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Thr Ala Ala Thr Trp Gln Ser Ser Ala Pro His Gln Pro Gly Pro Ser
195 200 205
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210 215 220
Ser Thr Gln Ala Ser Thr Ala Ser Ser Pro Ala Pro Glu Glu Asn Ala
225 230 235 240
Pro Ser Glu Gly Gln Arg Val Trp Gly Gln Gly Gln Ser Pro Arg Pro
245 250 255
Glu Asn Ser Leu Glu Arg Glu Glu Met Gly Pro Val Pro Ala His Thr
260 265 270
Asp Ala Phe Gln Asp Trp Gly Pro Gly Ser Met Ala His Val Ser Val
275 280 285
Val Pro Val Ser Ser Glu Gly Thr Pro Ser Arg Glu Pro Val Ala Ser
290 295 300
Gly Ser Trp Thr Pro Lys Ala Glu Glu Pro Ile His Ala Thr Met Asp
305 310 315 320
Pro Gln Arg Leu Gly Val Leu Ile Thr Pro Val Pro Asp Ala Gln Ala
325 330 335
Ala Thr Arg Arg Gln Ala Val Gly Leu Leu Ala Phe Leu Gly Leu Leu
340 345 350
Phe Cys Leu Gly Val Ala Met Phe Thr Tyr Gln Ser Leu Gln Gly Cys
355 360 365
Pro Arg Lys Met Ala Gly Glu Met Ala Glu Gly Leu Arg Tyr Ile Pro
370 375 380
Arg Ser Cys Gly Ser Asn Ser Tyr Val Leu Val Pro Val
385 390 395
<210> 33
<211> 395
<212> PRT
<213> mouse CX3CL1
<400> 33
Met Ala Pro Ser Pro Leu Ala Trp Leu Leu Arg Leu Ala Ala Phe Phe
1 5 10 15
His Leu Cys Thr Leu Leu Pro Gly Gln His Leu Gly Met Thr Lys Cys
20 25 30
Glu Ile Met Cys Asp Lys Met Thr Ser Arg Ile Pro Val Ala Leu Leu
35 40 45
Ile Arg Tyr Gln Leu Asn Gln Glu Ser Cys Gly Lys Arg Ala Ile Val
50 55 60
Leu Glu Thr Thr Gln His Arg Arg Phe Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys
65 70 75 80
Trp Val Gln Asp Ala Met Lys His Leu Asp His Gln Ala Ala Ala Leu
85 90 95
Thr Lys Asn Gly Gly Lys Phe Glu Lys Arg Val Asp Asn Val Thr Pro
100 105 110
Gly Ile Thr Leu Ala Thr Arg Gly Leu Ser Pro Ser Ala Leu Thr Lys
115 120 125
Pro Glu Ser Ala Thr Leu Glu Asp Leu Ala Leu Glu Leu Thr Thr Ile
130 135 140
Ser Gln Glu Ala Arg Gly Thr Met Gly Thr Ser Gln Glu Pro Pro Ala
145 150 155 160
Ala Val Thr Gly Ser Ser Leu Ser Thr Ser Glu Ala Gln Asp Ala Gly
165 170 175
Leu Thr Ala Lys Pro Gln Ser Ile Gly Ser Phe Glu Ala Ala Asp Ile
180 185 190
Ser Thr Thr Val Trp Pro Ser Pro Ala Val Tyr Gln Ser Gly Ser Ser
195 200 205
Ser Trp Ala Glu Glu Lys Ala Thr Glu Ser Pro Ser Thr Thr Ala Pro
210 215 220
Ser Pro Gln Val Ser Thr Thr Ser Pro Ser Thr Pro Glu Glu Asn Val
225 230 235 240
Gly Ser Glu Gly Gln Pro Pro Trp Val Gln Gly Gln Asp Leu Ser Pro
245 250 255
Glu Lys Ser Leu Gly Ser Glu Glu Ile Asn Pro Val His Thr Asp Asn
260 265 270
Phe Gln Glu Arg Gly Pro Gly Asn Thr Val His Pro Ser Val Ala Pro
275 280 285
Ile Ser Ser Glu Glu Thr Pro Ser Pro Glu Leu Val Ala Ser Gly Ser
290 295 300
Gln Ala Pro Lys Ile Glu Glu Pro Ile His Ala Thr Ala Asp Pro Gln
305 310 315 320
Lys Leu Ser Val Leu Ile Thr Pro Val Pro Asp Thr Gln Ala Ala Thr
325 330 335
Arg Arg Gln Ala Val Gly Leu Leu Ala Phe Leu Gly Leu Leu Phe Cys
340 345 350
Leu Gly Val Ala Met Phe Ala Tyr Gln Ser Leu Gln Gly Cys Pro Arg
355 360 365
Lys Met Ala Gly Glu Met Val Glu Gly Leu Arg Tyr Val Pro Arg Ser
370 375 380
Cys Gly Ser Asn Ser Tyr Val Leu Val Pro Val
385 390 395
<210> 34
<211> 408
<212> PRT
<213> cyno CX3CL1
<400> 34
Met Ala Pro Ile Ser Leu Ser Trp Leu Leu His Leu Ala Thr Leu Cys
1 5 10 15
His Leu Thr Val Leu Leu Ala Gly Gln His His Gly Val Thr Lys Cys
20 25 30
Asn Ile Thr Cys Ser Lys Met Thr Ser Lys Ile Pro Val Ala Leu Leu
35 40 45
Ile His Tyr Gln Gln Asn Gln Glu Ser Cys Gly Lys Arg Ala Ile Val
50 55 60
Leu Glu Thr Arg Gln His Arg Leu Phe Cys Ala Asp Pro Lys Glu Gln
65 70 75 80
Trp Val Lys Asp Ala Met Gln His Leu Asp Arg Gln Ala Ala Ala Leu
85 90 95
Thr Arg Asn Gly Gly Thr Phe Glu Lys Gln Val Gly Leu Val Lys Pro
100 105 110
Arg Thr Thr Leu Ala Ala Arg Gly Met Glu Glu Ser Ala Val Pro Glu
115 120 125
Pro Glu Ala Thr Gly Glu Ser Ser Ser Leu Lys Pro Thr Pro Ser Ser
130 135 140
Arg Glu Ala Gln Thr Ala Leu Gly Thr Ser Pro Glu Gln Ser Thr Gly
145 150 155 160
Val Thr Gly Ser Ser Gly Thr Gly Leu Pro Leu Thr Pro Lys Ala Gln
165 170 175
Asp Gly Gly Pro Val Gly Thr Glu Leu Phe Arg Gly Pro Pro Val Ser
180 185 190
Thr Ala Ala Ala Trp Gln Ser Ser Ala Pro His Gln Pro Gly Pro Gly
195 200 205
Leu Trp Ala Glu Gly Lys Thr Ser Glu Ala Pro Ser Thr Gln Asp Pro
210 215 220
Ser Thr Gln Ala Ser Ser Asn Pro Arg Ala Ser Ser Thr Gln Ala Ser
225 230 235 240
Thr Thr Ser Ser Pro Ala Pro Glu Glu Asn Thr Pro Ser Glu Gly Gln
245 250 255
Pro Val Trp Gly Gln Gly Gln Ser Pro Arg Pro Glu Asn Ser Leu Glu
260 265 270
Arg Glu Glu Met Gly Pro Val Pro Ala His Thr Asp Ala Phe Gln Asp
275 280 285
Trp Gly Pro Gly Ser Met Ala His Val Ser Val Val Pro Val Ser Ser
290 295 300
Glu Gly Thr Pro Ser Arg Glu Pro Val Val Ser Gly Ser Trp Thr Pro
305 310 315 320
Lys Ala Glu Glu Pro Ile His Ala Thr Met Asp Pro Gln Arg Leu Gly
325 330 335
Val Leu Ile Thr Pro Val Pro Asp Ser Gln Ala Ala Thr Arg Arg Gln
340 345 350
Ala Val Gly Leu Leu Ala Phe Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Gly Val
355 360 365
Ala Met Phe Ala Tyr Gln Ser Leu Gln Gly Cys Pro Arg Lys Met Ala
370 375 380
Gly Glu Met Val Glu Gly Leu Arg Tyr Ile Pro Arg Ser Cys Gly Ser
385 390 395 400
Asn Ser Tyr Val Leu Val Pro Val
405
<210> 35
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 重链恒定区
<400> 35
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 36
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> 轻链恒定区
<400> 36
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> H-CDR1
<400> 37
Asn Tyr Tyr Ile His
1 5
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> H-CDR2
<400> 38
Trp Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Lys Phe Asn Glu Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> H-CDR3
<400> 39
Ser Pro Thr Asp Glu Thr Gln Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> H-CDR3
<400> 40
Gly Pro Ala Pro Ala Glu Gly Asp Tyr
1 5
<210> 41
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> H-CDR2
<400> 41
Trp Tyr Leu Pro Gly Asp Asp Ser Pro Lys Phe Asn Glu Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> H-CDR3
<400> 42
Gly Pro Thr Gln Gly Asp Tyr
1 5
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> H-CDR2
<400> 43
Trp Val Asp Pro Gly Tyr Gly Pro His Lys Phe Asn Glu Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> H-CDR2
<400> 44
Trp Phe Ile Pro Gly Ser Asp Pro Pro Lys Phe Asn Glu Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> H-CDR2
<400> 45
Trp Leu Leu Pro Gly Glu Asp Ser Pro Lys Phe Asn Glu Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> L-CDR1
<400> 46
Arg Ala Ser Gly Arg Ile His Asp Phe Leu Ala
1 5 10
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> L-CDR2
<400> 47
Asn Glu Lys Thr Leu Ala Asp
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> L-CDR3
<400> 48
Gln Gln Phe Trp Ser Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> L-CDR1
<400> 49
Arg Ala Ser Gly Arg Ile His Gly Phe Leu Ala
1 5 10
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> L-CDR1
<400> 50
Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Phe Leu Ala
1 5 10
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> L-CDR2
<400> 51
Thr Asp Asn Thr Leu Ala Glu
1 5
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> L-CDR2
<400> 52
Thr Asp Asn Thr Leu Ser Gly
1 5
<210> 53
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> H-CDR1
<400> 53
Asn Tyr Asn Ile His
1 5
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> H-CDR2
<400> 54
Trp Tyr Leu Pro Gly Asp Asp Ser Ser Lys Phe Asn Glu Arg Phe Glu
1 5 10 15
Gly
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> H-CDR2
<400> 55
Trp Tyr Leu Pro Gly Asp Asp Ser Pro Arg Phe Asn Glu Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> L-CDR2
<400> 56
Thr Asp Asn Ala Leu Ala Glu
1 5
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> H-CDR2
<400> 57
Trp Thr Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Lys Phe Asn Glu Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 58
<211> 355
<212> PRT
<213> human CX3CR1
<400> 58
Met Asp Gln Phe Pro Glu Ser Val Thr Glu Asn Phe Glu Tyr Asp Asp
1 5 10 15
Leu Ala Glu Ala Cys Tyr Ile Gly Asp Ile Val Val Phe Gly Thr Val
20 25 30
Phe Leu Ser Ile Phe Tyr Ser Val Ile Phe Ala Ile Gly Leu Val Gly
35 40 45
Asn Leu Leu Val Val Phe Ala Leu Thr Asn Ser Lys Lys Pro Lys Ser
50 55 60
Val Thr Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Phe
65 70 75 80
Val Ala Thr Leu Pro Phe Trp Thr His Tyr Leu Ile Asn Glu Lys Gly
85 90 95
Leu His Asn Ala Met Cys Lys Phe Thr Thr Ala Phe Phe Phe Ile Gly
100 105 110
Phe Phe Gly Ser Ile Phe Phe Ile Thr Val Ile Ser Ile Asp Arg Tyr
115 120 125
Leu Ala Ile Val Leu Ala Ala Asn Ser Met Asn Asn Arg Thr Val Gln
130 135 140
His Gly Val Thr Ile Ser Leu Gly Val Trp Ala Ala Ala Ile Leu Val
145 150 155 160
Ala Ala Pro Gln Phe Met Phe Thr Lys Gln Lys Glu Asn Glu Cys Leu
165 170 175
Gly Asp Tyr Pro Glu Val Leu Gln Glu Ile Trp Pro Val Leu Arg Asn
180 185 190
Val Glu Thr Asn Phe Leu Gly Phe Leu Leu Pro Leu Leu Ile Met Ser
195 200 205
Tyr Cys Tyr Phe Arg Ile Ile Gln Thr Leu Phe Ser Cys Lys Asn His
210 215 220
Lys Lys Ala Lys Ala Ile Lys Leu Ile Leu Leu Val Val Ile Val Phe
225 230 235 240
Phe Leu Phe Trp Thr Pro Tyr Asn Val Met Ile Phe Leu Glu Thr Leu
245 250 255
Lys Leu Tyr Asp Phe Phe Pro Ser Cys Asp Met Arg Lys Asp Leu Arg
260 265 270
Leu Ala Leu Ser Val Thr Glu Thr Val Ala Phe Ser His Cys Cys Leu
275 280 285
Asn Pro Leu Ile Tyr Ala Phe Ala Gly Glu Lys Phe Arg Arg Tyr Leu
290 295 300
Tyr His Leu Tyr Gly Lys Cys Leu Ala Val Leu Cys Gly Arg Ser Val
305 310 315 320
His Val Asp Phe Ser Ser Ser Glu Ser Gln Arg Ser Arg His Gly Ser
325 330 335
Val Leu Ser Ser Asn Phe Thr Tyr His Thr Ser Asp Gly Asp Ala Leu
340 345 350
Leu Leu Leu
355

Claims (14)

1.一种抗体或其片段，所述抗体或其片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区(VH)包含来自以下序列中任一个所示的重链可变区的3个CDR(H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3)：
SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28；和/或
其中所述轻链可变区(VL)包含来自以下序列中任一个所示的轻链可变区的3个CDR(L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3)：
SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31。
2.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述重链可变区(VH)包含来自以下序列中任一个所示的重链可变区的3个CDR(H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3)：
SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28；和/或
其中所述轻链可变区(VL)包含来自以下序列中任一个所示的轻链可变区的3个CDR(L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3)：
SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30和SEQ ID NO:31。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其片段，其特征在于，所述重链可变区(VH)和所述轻链可变区(VL)包含来自以下序列组合所示的6个CDR(H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3)：
(1)SEQ ID NO:11+SEQ ID NO:23；
(2)SEQ ID NO:14+SEQ ID NO:22；
(3)SEQ ID NO:14+SEQ ID NO:23；
(4)SEQ ID NO:14+SEQ ID NO:24；
(5)SEQ ID NO:14+SEQ ID NO:25；
(6)SEQ ID NO:15+SEQ ID NO:22；
(7)SEQ ID NO:15+SEQ ID NO:23；
(8)SEQ ID NO:15+SEQ ID NO:24；
(9)SEQ ID NO:15+SEQ ID NO:25；
(10)SEQ ID NO:16+SEQ ID NO:22；
(11)SEQ ID NO:16+SEQ ID NO:23；
(12)SEQ ID NO:16+SEQ ID NO:24；
(13)SEQ ID NO:16+SEQ ID NO:25；
(14)SEQ ID NO:17+SEQ ID NO:22；
(15)SEQ ID NO:17+SEQ ID NO:23；
(16)SEQ ID NO:17+SEQ ID NO:24；
(17)SEQ ID NO:17+SEQ ID NO:25；
(18)SEQ ID NO:26+SEQ ID NO:29；
(19)SEQ ID NO:26+SEQ ID NO:30；
(20)SEQ ID NO:26+SEQ ID NO:31；
(21)SEQ ID NO:27+SEQ ID NO:29；
(22)SEQ ID NO:27+SEQ ID NO:30；
(23)SEQ ID NO:27+SEQ ID NO:31；
(24)SEQ ID NO:28+SEQ ID NO:29；
(25)SEQ ID NO:28+SEQ ID NO:30；或
(26)SEQ ID NO:28+SEQ ID NO:31；
优选地，所述重链可变区(VH)和所述轻链可变区(VL)包含选自以下的CDR组合：
(1)依次示于SEQ ID NO:37、44、42的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:49、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(2)依次示于SEQ ID NO:37、41、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:46、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(3)依次示于SEQ ID NO:37、41、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:49、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(4)依次示于SEQ ID NO:37、41、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:46、52、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(5)依次示于SEQ ID NO:37、41、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:49、52、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(6)依次示于SEQ ID NO:37、44、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:46、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(7)依次示于SEQ ID NO:37、44、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:49、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(8)依次示于SEQ ID NO:37、44、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:46、52、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(9)依次示于SEQ ID NO:37、44、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:49、52、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(10)依次示于SEQ ID NO:37、41、40的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:46、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(11)依次示于SEQ ID NO:37、41、40的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:49、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(12)依次示于SEQ ID NO:37、41、40的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:46、52、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(13)依次示于SEQ ID NO:37、41、40的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:49、52、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(14)依次示于SEQ ID NO:37、44、40的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:46、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(15)依次示于SEQ ID NO:37、44、40的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:49、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(16)依次示于SEQ ID NO:37、44、40的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:46、52、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(17)依次示于SEQ ID NO:37、44、40的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:49、52、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(18)依次示于SEQ ID NO:53、54、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:46、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(19)依次示于SEQ ID NO:53、54、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:46、56、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(20)依次示于SEQ ID NO:53、55、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:46、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(21)依次示于SEQ ID NO:53、55、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:46、56、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(22)依次示于SEQ ID NO:53、55、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:46、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(23)依次示于SEQ ID NO:53、55、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:46、56、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
(24)依次示于SEQ ID NO:53、55、39的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ IDNO:46、51、48的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述重链可变区包含选自以下的序列：
示于SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和/或
所述轻链可变区包含选自以下的序列：
SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述抗体或其片段包含的重链可变区和轻链可变区选自以下组合：
(1)示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(2)示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(3)示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(4)示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(5)示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:25的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(6)示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(7)示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(8)示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(9)示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:25的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(10)示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(11)示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(12)示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(13)示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:25的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(14)示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(15)示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(16)示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:24的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(17)示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:25的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(18)示于SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:29的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(19)示于SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:30的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(20)示于SEQ ID NO:26的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(21)示于SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:29的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(22)示于SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:30的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(23)示于SEQ ID NO:27的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(24)示于SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:29的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(25)示于SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:30的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；或
(26)示于SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段为针对趋化因子CX3CL1、优选哺乳动物CX3CL1、更优选人CX3CL1、食蟹猴CX3CL1或小鼠CX3CL1的抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含VH框架区和VL框架区；
所述抗体为单克隆抗体、单链抗体、双功能抗体、单域抗体、纳米抗体、完全或部分人源化的抗体或者嵌合抗体等任意形式，或者，所述抗原结合片段为半抗体或者抗体或半抗体的抗原结合片段，例如scFv、BsFv、dsFv、(dsFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2或Fv；
优选地，所述抗体或其片段还包含人或鼠源的恒定区，优选包含人或鼠源的重链恒定区(CH)和/或轻链恒定区(CL)；优选地，所述抗体或其片段包含重链和轻链；
更优选地，所述抗体或其片段包含IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重链恒定区和/或κ或λ型轻链恒定区。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体，优选为鼠、嵌合或人源化的单克隆抗体；优选地，所述单克隆抗体的重链恒定区为IgG4亚型，轻链恒定区为κ型；
优选地，所述单克隆抗体的重链恒定区包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述单克隆抗体的轻链恒定区包含如SEQ ID NO:36所示氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
7.一种核酸分子，其编码权利要求1至6中任一项所述的抗体或其片段或者编码所述抗体或其片段中包含的重链CDR、轻链CDR、轻链可变区、重链可变区、重链或轻链。
8.一种载体，其包含权利要求7所述的核酸分子。
9.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求7所述的核酸分子和/或权利要求8所述的载体，或者所述宿主细胞被权利要求7所述的核酸分子和/或权利要求8所述的载体转化或转染。
10.一种组合物，其包含权利要求1至6中任一项所述的抗体或其片段、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的载体或权利要求9所述的宿主细胞；
优选地，所述组合物为药物组合物，其任选地还包含药学上可接受的辅料。
11.权利要求1至6中任一项所述的抗体或其片段、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞或权利要求10所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、治疗和/或改善炎性疾病；
优选地，所述炎性疾病为溃疡性结肠炎、克罗恩病、炎性肠病、类风湿性关节炎、肾炎、肾小球肾炎、肌炎、多发性硬化、视神经脊髓炎、动脉粥样硬化、牛皮癣、系统性红斑狼疮(例如中枢神经系统的狼疮或狼疮性肾炎)或自身免疫性肝胆疾病。
12.权利要求1至6中任一项所述的抗体或其片段、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞或权利要求10所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于阻断CX3CL1/CX3CR1信号通路和/或阻断CX3CR1表达细胞的迁移。
13.权利要求1至6中任一项所述的抗体或其片段、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞或权利要求10所述的组合物作为药剂在小鼠模型中研究CX3CL1/CX3CR1信号通路相关或者CX3CL1或CX3CR1相关疾病作用机制中的用途。
14.一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1至6中任一项所述的抗体或其片段、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞或者权利要求10所述的组合物。
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