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CN113081884B - 一种抗黑色素组合物、制备方法及应用 - Google Patents

一种抗黑色素组合物、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明适用于生物医学技术领域，提供了一种抗黑色素组合物、制备方法及应用。所述的抗黑色素组合物，包括酪氨酸酶抑制剂与酪氨酸酶合成抑制剂，所述的酪氨酸酶抑制剂采用光甘草定、原儿茶醛、白皮杉醇中的至少一种；所述的酪氨酸酶合成抑制剂采用ECG、EGCG、白杨素中的至少一种。采用酪氨酸酶抑制剂与酪氨酸酶合成抑制剂配伍，两者的抗黑色素机制不同，分别通过抑制酪氨酸酶活性与合成，协同增效，达到更好的抗黑色素效果，且与单独给药以及阳性药曲酸相比，药物用量显著降低；按照本申请G1‑G9配伍给药，其黑色素含量抑制率在50~60%之间，每组中的2个药物均为1/4倍IC50即可达到50~60%的黑色素抑制效果，即抑制活性效价提高为原来的2倍以上。

Description

一种抗黑色素组合物、制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种抗黑色素组合物、制备方法及应用。
背景技术
体内黑色素合成机制:
黑色素是影响人的皮肤，眼睛和头发颜色的重要因素。一些生理和环境因素可上调黑色素合成，引起皮肤色素沉着。黑色素合成于表皮基底层的黑色素细胞中，并被运输到附近的角质形成细胞内，随着角质形成细胞的移动逐渐由基底层移行至角质层并脱落。
具体来说，人体内的黑色素合成并储存于黑色素细胞的黑素小体中，黑素小体是亚细胞的溶酶体样细胞器。而黑素小体需要一些特定的酶和结构蛋白质来合成黑色素。例如酶氨酸酶（TYR）、TRP1、TRP2等。
酪氨酸酶对于体内黑色素合成的作用：
在脊椎动物中，黑色素由酚类氨基酸前体L-酪氨酸形成通过一系列的酶促和自发化学反应称为拉珀-马森路径。黑色素在人体内的合成开始于L-酪氨酸，由关键酶酪氨酸酶（TYR）转化为多巴醌（DQ），此过程包括两个反应，即L-酪氨酸羟基化为L-Dopa，L-Dopa氧化为多巴醌。多巴醌（DQ）经过一系列生化反应（图2），生成两种类型的黑色素：Eumelanin（棕黑色）和Pheomelanin（红黄色），本文所指的黑色素抑制剂旨在减少Eumelanin生成以达到美白祛斑的作用。多巴醌（DQ）的形成是黑色素合成中的一个限速步骤，其余的黑色素合成过程可以在生理pH值下自发进行，因此酪氨酸酶（TYR）是黑色素合成的关键酶。
酪氨酸酶（单酚或邻二酚的氧氧化还原酶，EC1.14.18.1，顺式多酚氧化酶）是一种多功能的膜结合型3型含铜糖蛋白，位于黑素体的膜中。酪氨酸酶仅由黑素细胞产生，在其产生并在内质网和高尔基体中加工之后，被运输到黑素体中，并在其中合成黑色素。从结构的角度来看，2个铜离子被6个组氨酸残基包围，这个结构负责酪氨酸酶的催化活性。活性部位具有三个状态：色素形成过程中的氧化，甲基和脱氧形式。更具体地说，在活性位点，两个铜离子与双氧相互作用形成高反应性化学中间体，该中间体直接参与L-酪氨酸羟基化为L-Dopa（单酚酶活性）和L-Dopa氧化为多巴醌（二酚酶活性）的过程。
由此可见，酪氨酸酶的催化作用是体内黑色素合成的关键。抑制体内黑色素合成的重要方法是抑制酪氨酸酶活性，减少L-酪氨酸转化为多巴醌。因此，酪氨酸酶抑制剂是一类抑制黑色素合成的有效物质。
体内酪氨酸酶合成的调控:
人体内黑色素合成的调控主要通过对酪氨酸酶合成的调控而实现。调控酪氨酸酶的合成主要通过α-MSH-MC1R通路、Wnt通路和SCF-KIT通路三条信号通路进行。酪氨酸酶合成抑制剂即通过抑制α-MSH-MC1R通路、抑制Wnt通路或调控SCF-KIT通路，减少黑色素体内的酪氨酸酶含量，进而抑制黑色素合成。
α-MSH-MC1R通路被认为与皮肤适应紫外线照射等生理环境有关。除此之外，自由基、炎性介质和激素等因素也会刺激角质形成细胞分泌α-MSH。α-黑素细胞刺激素(α-MSH)或促肾上腺皮质激素(ACTH)与黑色素皮质受体1(MC1R)特异性结合，会激活腺苷酸环化酶（AC）。AC可催化三磷酸腺苷(ATP)转化为cAMP。cAMP水平的增加可直接激活依赖于cAMP的蛋白激酶A（PKA），并进一步上调cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的表达。CREB与MITF基因启动子中的CRE结构域结合，启动MITF的表达。MITF靶向酪氨酸酶TYR基因中的一个特异性序列，引起酪氨酸酶表达上调。
Wnt信号通路也靶向MITF的基因表达。该信号通路中的关键细胞因子是细胞内β-连环蛋白（β-catenin）。在没有Wnt信号的情况下，β-catenin依次被糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）磷酸化，并被泛素连接酶复合物识别，导致β-catenin通过泛素依赖性机制下调。然而，Wnt途径的激活将负调节GSK-3β，导致胞质β-catenin积累，β-catenin转移到细胞核并与T细胞因子（TCF）和淋巴细胞增强因子1（LEF）形成复合体，从而上调MITF基因的表达。因此，Wnt途径的激活通过上调MITF活性而刺激黑色素生成。
皮肤受紫外线（UVB）照射的会产生干细胞生长因子(SCF)，SCF与其受体KIT的胞外结构域结合并引起KIT二聚化，导致蛋白激酶结构域的活化，激活SCF-KIT通路。活化的KIT在酪氨酸残基处发生自磷酸化，引起RAS的激活并进一步导致RAF（MAPKKK）的活化，引发三级级联反应。RAF激活MEK(MAPKK)，MEK激活MAPK，使其磷酸化。MAPK包括三种亚型即p38、ERK和JNK。p38磷酸化催化MITF合成，而ERK和JNK磷酸化则催化MITF蛋白降解。
由此可见，MITF的表达是影响酪氨酸酶合成的关键因素。通过抑制α-MSH-MC1R通路、抑制Wnt通路或调控SCF-KIT通路（促进ERK和JNK磷酸化或抑制p38磷酸化），可减少MITF表达，从而降低酪氨酸酶合成量，减少体内黑色素合成。因此，酪氨酸酶合成抑制剂是另一类抑制黑色素合成的有效物质。
典型酪氨酸酶抑制剂及酪氨酸酶合成抑制剂：
高效低毒、具有代表性的酪氨酸酶抑制剂包括光甘草定、原儿茶醛、白皮杉醇等，高效低毒、具有代表性的酪氨酸酶合成抑制剂包括表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、白杨素等。
但是，上述的酪氨酸酶抑制剂和酪氨酸酶合成抑制剂在使用时，若各药物按照1/4倍IC50单独给药，其黑色素含量抑制率仅为25~35%之间，抗黑色素效果较差。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种抗黑色素组合物、制备方法及应用，旨在解决背景技术中指出的现有技术存在的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种抗黑色素组合物，包括酪氨酸酶抑制剂与酪氨酸酶合成抑制剂，所述酪氨酸酶抑制剂采用光甘草定、原儿茶醛、白皮杉醇中的至少一种；所述酪氨酸酶合成抑制剂采用ECG、EGCG、白杨素中的至少一种。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述酪氨酸酶抑制剂采用原儿茶醛或白皮杉醇；所述酪氨酸酶合成抑制剂采用ECG。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述酪氨酸酶抑制剂采用白皮杉醇，白皮杉醇浓度为0.19~3μg/mL，所述酪氨酸酶合成抑制剂采用ECG，ECG浓度为1~16μg/mL。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述白皮杉醇浓度为1.5μg/mL或3μg/mL，ECG浓度为1μg/mL。
本发明实施例的另一目的在于提供一种所述的抗黑色素组合物的制备方法，包括以下步骤：
将酪氨酸酶抑制剂与酪氨酸酶合成抑制剂混合，即得。
本发明实施例的另一目的在于提供一种所述的抗黑色素组合物在制备皮肤美白产品中的应用。
作为本发明实施例的另一种优选方案，皮肤美白产品包括药物或/和化妆品。
本发明实施例的另一目的在于提供一种所述的抗黑色素组合物在制备皮肤美白、抗炎、抗氧化、抗菌或/和抗过敏产品中的应用。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述的产品包括药物或/和化妆品。
采用酪氨酸酶抑制剂与酪氨酸酶合成抑制剂配伍，两者的抗黑色素机制不同，分别通过抑制酪氨酸酶活性与合成，协同增效，达到更好的抗黑色素效果，且与单独给药以及阳性药曲酸相比，药物用量显著降低；按照本申请G1-G9配伍给药，其黑色素含量抑制率在50~60%之间，每组中的2个药物均为1/4倍IC50即可达到50~60%的黑色素抑制效果，即抑制活性效价提高为原来的2倍以上；
本发明的抗黑色素组合物与目前常用的抗黑色素物质相比，细胞毒性低，安全性高；
本申请最佳配伍处方中的药物具有其他改善皮肤形态功能的药理作用：其中，白皮杉醇具有抗炎、抗氧化应激的作用，外用可以减缓皮肤衰老；ECG具有抗菌、抗氧化的作用，外用可以美白的同时，还可以消炎祛痘、抗皮肤过敏症并有抗皱作用；
与目前常用的抗黑色素活性物质相比，本发明的抗黑色素组合物其用量小、效果佳、安全性良好且来源稳定，更适合用作美白制剂。
附图说明
图1为G1:光甘草定与ECG中浓度配伍对B16-F10细胞黑色素含量的影响；
图2为G2:光甘草定与EGCG中浓度配伍对B16-F10细胞黑色素含量的影响；
图3为G3:光甘草定与白杨素中浓度配伍对B16-F10细胞黑色素含量的影响；
图4为G4:原儿茶醛与ECG中浓度配伍对B16-F10细胞黑色素含量的影响；
图5为G5:原儿茶醛与EGCG中浓度配伍对B16-F10细胞黑色素含量的影响；
图6为G6:原儿茶醛与白杨素中浓度配伍对B16-F10细胞黑色素含量的影响；
图7为G7:白皮杉醇与ECG中浓度配伍对B16-F10细胞黑色素含量的影响；
图8为G8:白皮杉醇与EGCG中浓度配伍对B16-F10细胞黑色素含量的影响；
图9为G9:白皮杉醇与白杨素中浓度配伍对B16-F10细胞黑色素含量的影响；
图10为各配伍组合对于黑色素含量抑制的药物相互作用指数；
图11为G1:光甘草定与ECG中浓度配伍对B16-F10细胞生长的影响；
图12为G2:光甘草定与EGCG中浓度配伍对B16-F10细胞生长的影响；
图13为G3:光甘草定与白杨素中浓度配伍对B16-F10细胞生长的影响；
图14为G4:原儿茶醛与ECG中浓度配伍对B16-F10细胞生长的影响；
图15为G5:原儿茶醛与EGCG中浓度配伍对B16-F10细胞生长的影响；
图16为G6:原儿茶醛与白杨素中浓度配伍对B16-F10细胞生长的影响；
图17为G7:白皮杉醇与ECG中浓度配伍对B16-F10细胞生长的影响；
图18为G8:白皮杉醇与EGCG中浓度配伍对B16-F10细胞生长的影响；
图19为G9:白皮杉醇与白杨素中浓度配伍对B16-F10细胞生长的影响；
图20为各配伍组合对于细胞生长抑制的药物相互作用指数；
图21为白皮杉醇单独给药对B16-F10细胞黑色素含量的影响；
图22为ECG单独给药对B16-F10细胞黑色素含量的影响；
图23为不同浓度白皮杉醇与不同浓度ECG配伍给药对B16-F10细胞黑色素含量的影响；
图24为各剂量组合对于黑色素含量抑制的药物相互作用指数；
图25为白皮杉醇单独给药对B16-F10细胞存活率的影响；
图26为ECG单独给药对B16-F10细胞存活率的影响；
图27为不同浓度白皮杉醇与不同浓度ECG配伍给药对B16-F10细胞存活率的影响；
图28为各剂量组合对于细胞生长抑制的药物相互作用指数；
图29为抗黑色素最佳处方对B16-F10细胞黑色素含量的影响；
图30为抗黑色素最佳处方对B16-F10细胞存活率的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
实施例1
该实施例提供了一种抗黑色素组合物，所述的抗黑色素组合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）原料选择：所述的酪氨酸酶抑制剂采用光甘草定；所述的酪氨酸酶合成抑制剂采用ECG；各原料均采用中浓度（即1/4倍IC50剂量）：光甘草定的浓度为0.52μg/mL，ECG的浓度为4μg/mL。
（2）将酪氨酸酶抑制剂与酪氨酸酶合成抑制剂混合，即得。
实施例2
与实施例1不同的是，本实施例中：所述的酪氨酸酶抑制剂采用光甘草定；所述的酪氨酸酶合成抑制剂采用EGCG。光甘草定的浓度为0.52μg/mL，EGCG的浓度为5μg/mL。
实施例3
与实施例1不同的是，本实施例中：所述的酪氨酸酶抑制剂采用光甘草定；所述的酪氨酸酶合成抑制剂采用白杨素。光甘草定的浓度为0.52μg/mL，白杨素的浓度为3μg/mL。
实施例4
与实施例1不同的是，本实施例中：所述的酪氨酸酶抑制剂采用原儿茶醛；所述的酪氨酸酶合成抑制剂采用ECG。原儿茶醛的浓度为0.7μg/mL，ECG的浓度为4μg/mL。
实施例5
与实施例1不同的是，本实施例中：所述的酪氨酸酶抑制剂采用原儿茶醛；所述的酪氨酸酶合成抑制剂采用EGCG。原儿茶醛的浓度为0.7μg/mL，EGCG的浓度为5μg/mL。
实施例6
与实施例1不同的是，本实施例中：所述的酪氨酸酶抑制剂采用原儿茶醛；所述的酪氨酸酶合成抑制剂采用白杨素。原儿茶醛的浓度为0.7μg/mL，白杨素的浓度为3μg/mL。
实施例7
与实施例1不同的是，本实施例中：所述的酪氨酸酶抑制剂采用白皮杉醇；所述的酪氨酸酶合成抑制剂采用ECG。白皮杉醇的浓度为0.75μg/mL，ECG的浓度为4μg/mL。
实施例8
与实施例1不同的是，本实施例中：所述的酪氨酸酶抑制剂采用白皮杉醇；所述的酪氨酸酶合成抑制剂采用EGCG。白皮杉醇的浓度为0.75μg/mL，EGCG的浓度为5μg/mL。
实施例9
与实施例1不同的是，本实施例中：所述的酪氨酸酶抑制剂采用白皮杉醇；所述的酪氨酸酶合成抑制剂采用白杨素。白皮杉醇的浓度为0.75μg/mL，白杨素的浓度为3μg/mL。
实施例10
与实施例1不同的是，本实施例中：所述的酪氨酸酶抑制剂采用白皮杉醇，白皮杉醇浓度为0.19μg/mL，所述的酪氨酸酶合成抑制剂采用ECG，ECG浓度为16μg/mL。
实施例11
与实施例1不同的是，本实施例中：所述的酪氨酸酶抑制剂采用白皮杉醇，白皮杉醇浓度为1.5μg/mL，所述的酪氨酸酶合成抑制剂采用ECG，ECG浓度为4μg/mL。
实施例12
与实施例1不同的是，本实施例中：所述的酪氨酸酶抑制剂采用白皮杉醇，白皮杉醇浓度为3μg/mL，所述的酪氨酸酶合成抑制剂采用ECG，ECG浓度为1μg/mL。
实施例13
与实施例1不同的是，本实施例中：所述的酪氨酸酶抑制剂采用光甘草定和原儿茶醛；所述的酪氨酸酶合成抑制剂采用ECG和EGCG。
实施例14
与实施例1不同的是，本实施例中：所述的酪氨酸酶抑制剂采用原儿茶和白皮杉醇；所述的酪氨酸酶合成抑制剂采用EGCG和白杨素。
实施例15
与实施例1不同的是，本实施例中：所述的酪氨酸酶抑制剂采用光甘草定和白皮杉醇；所述的酪氨酸酶合成抑制剂采用ECG和白杨素。
实施例16
与实施例1不同的是，本实施例中：所述的酪氨酸酶抑制剂采用光甘草定、原儿茶醛和白皮杉醇；所述的酪氨酸酶合成抑制剂采用ECG、EGCG和白杨素。
实验例1 筛选配伍组合
将3种酪氨酸酶抑制剂与3种酪氨酸酶合成抑制剂两两组合，形成9个配伍组合（G1-G9）。每个配伍中的药物均采用中浓度（即1/4倍IC50剂量）给药。以a-MSH刺激的B16细胞作为模型，评价9个配伍组合针对黑色素合成抑制效果以及细胞毒性；选择两药相互作用指数（CDI）为指标，评价各配伍组合的细胞黑色素含量、细胞存活率的药物相互作用性质。将黑色素抑制效果明显、协同作用强且细胞毒性较低、配伍减毒作用明显的组合定为最佳配伍组合。
1.1实验方法
1.1.1细胞培养
将复苏的B16黑色素瘤细胞转移到25 cm2烧瓶中，用DMEM（含10％FBS以及1%青霉素/链霉素）培养基，置于5%CO2、37℃培养箱中培养。每天更换新鲜培养基。当细胞汇合度80~90%时，用含EDTA的0.25%胰蛋白酶进行消化，从烧瓶底部释放细胞，将其悬浮在新鲜培养基中。利用血球计数板对细胞进行计数，将细胞密度调整到1×105/mL，用于后续实验。
1.1.2供试品溶液配制
为了计算IC50值并评价细胞毒性，各药物供试品配制的最大浓度为其IC50值的5倍左右，最小浓度为其IC50值的1/625倍，设置6组，组间距为5倍。a-MSH浓度为166.4ng/mL。
1.1.2.1配制母液
分别取光甘草定1mg、原儿茶醛10mg、白皮杉醇1.5mg、ECG 30mg、EGCG 30mg、白杨素5mg、曲酸125mg，分别置于15ml离心管中，分别加入10mL灭菌PBS分散均匀，配制母液。
取1.6mg的a-MSH（分子量1664.8），置于15mL离心管中，加入10mL灭菌PBS分散均匀，配制为100μM母液。
1.1.2.2配制不同配伍组合的含药培养基
根据前期的实验结果可知，光甘草定、原儿茶醛、白皮杉醇、ECG、EGCG、白杨素的IC50分别为2.062 μg/mL、2.844μg/mL、2.905μg/mL、15.403μg/mL、19.530μg/mL、12.081μg/mL。则各药物的中浓度剂量（1/4倍IC50）分别为光甘草定0.52μg/mL、原儿茶醛0.7μg/mL、白皮杉醇0.75μg/mL、ECG 4μg/mL、EGCG 5μg/mL、白杨素3μg/mL。参考“配制含药培养基”的方法，按照表1的配伍组合配制含药培养基。每个配伍组合的培养基中均含有166.4ng/mL的a-MSH。
表1 不同配伍组合的含药培养基成分
Figure DEST_PATH_IMAGE002
注：表中上数第一行为3种酪氨酸酶抑制剂，左数第一列为3种酪氨酸酶合成抑制剂，每个配伍组合均由应该酪氨酸酶抑制剂与一个酪氨酸酶合成抑制剂组成。
1.1.3分组与给药
24孔板每孔接种1mL密度为1×105/ml的细胞悬液，用于测定黑色素含量抑制率。96孔板每孔接种0.1mL密度为1×105/ml的细胞悬液，边缘各孔用0.1mLPBS溶液填充，用于测定细胞毒性。各孔板均置于培养箱，于37℃、5%CO2条件下培养24小时，24小时后移除原培养基。按照表2，根据配伍组合不同，将实验分为G1-G9共9个给药组。
表2 各抑制剂的给药配伍组合
药物 光甘草定 原儿茶醛 白皮杉醇
ECG G1 G4 G7
EGCG G2 G5 G8
白杨素 G3 G6 G9
每组的给药方案如表3所示，每个剂量设置5个复孔，实验重复3次。
表3 G1-G9各组给药方案
Figure DEST_PATH_IMAGE004
-，-代表两种抑制剂均不给药，仅加入a-MSH浓度为166.4ng/mL空白培养基；-，+代表只给酪氨酸酶合成抑制剂，剂量为IC50；+，-代表只给酪氨酸酶抑制剂，剂量为IC50；+，+代表给两种抑制剂的药物组合，剂量分别为各自IC50。
1.1.4黑色素含量抑制率测定
根据公式2（改良寇氏法）计算黑色素含量抑制率：
lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) （公式2）
其中Xm：lg最大剂量；I：lg(最大剂量/相临剂量) ；P：阳性反应率之和；Pm：最大阳性反应率；Pn：最小阳性反应率。
1.1.5细胞毒性测定
使用基于噻唑蓝（MTT）的细胞活力测定法，测试各浓度药物对于B16细胞的毒性，以确定各药物的安全范围。
96孔板每孔接种100μL，边缘孔用PBS缓冲液填充，置于培养箱培养24小时。24小时后移除原培养基。按照表2的不同分组，每个剂量设置5组复孔，实验重复3次。
加入含药培养基并孵育24小时后，移除含药培养基。每孔加50μl按试剂盒说明稀释后的1×MTT，于37°C避光孵育3 h，移除全部溶剂。加入150μlDMSO，振荡10min，然后使用酶标仪在490 nm处测量吸光度。
根据公式3计算黑素细胞的存活率：
细胞存活率（%）= OD490（给药组）/ OD490（空白培养基组）×100%。 （公式3）
1.1.6确定最佳配伍组合
计算G1-G9各组给药对于黑色素含量抑制以及细胞生长抑制的CDI值。根据黑色素含量抑制活性、细胞毒性以及CDI值综合判断G1-G9中的最佳配伍组合G※=中浓度A药+中浓度B药并进行下一步实验，以筛选A药和B药的最佳剂量组合。
黑色素相对含量计算公式：黑色素相对含量（％）= OD405（给药组）/ OD405（含a-MSH空白培养基组）×100％ （公式4）
CDI计算公式：CDI = AB/A*B （公式5）
根据公式4计算各组给药孵育后黑色素相对含量。根据公式5计算G1-G9各配伍组合对于细胞黑色素含量抑制的药物相互作用性质。公式5中，AB为药物组合使用时的黑色素相对含量，A或B是药物单独使用时的黑色素相对含量。
根据公式5，计算G1-G9各配伍组合对于细胞生长抑制的药物相互作用性质。
当CDI<1时两药为协同作用，当CDI<0.7时，协同作用非常显著，CDI=1则两药作用性质相加，CDI>1两药作用性质为拮抗。
G1-G9各配伍组合对于细胞黑色素含量抑制的协同作用越强，对于细胞生长抑制的拮抗作用越强，说明该组合中两种药物配伍的增效减毒作用越明显，该配伍组合越具有实际意义。
1.1.7统计分析
数据均用SPSS20.0进行统计学分析，数值以平均值（
Figure DEST_PATH_IMAGE006
）±标准差（SD）来表示，使用单因素ANOVA法判断组间数据是否有统计学差异，并计算P值，P<0.05用“*”表示，P<0.01用“**”表示。
1.2实验结果
1.2.1各配伍组合对B16-F10细胞黑色素含量的影响
1.2.1.1 G1:光甘草定与ECG中浓度配伍
对于G1:光甘草定与ECG中浓度配伍，按照1/4倍IC50实测值计算，光甘草定的浓度为0.52μg/mL，ECG的浓度为4μg/mL。G1对于B16-F10细胞黑色素含量抑制的实验结果如图1所示。
1.2.1.2 G2:光甘草定与EGCG中浓度配伍
对于G2:光甘草定与EGCG中浓度配伍，按照1/4倍IC50实测值计算，光甘草定的浓度为0.52μg/mL，EGCG的浓度为5μg/mL。G2对于B16-F10细胞黑色素含量抑制的实验结果如图2所示。
1.2.1.3 G3:光甘草定与白杨素中浓度配伍
对于G3:光甘草定与白杨素中浓度配伍，按照1/4倍IC50实测值计算，光甘草定的浓度为0.52μg/mL，白杨素的浓度为3μg/mL。G3对于B16-F10细胞黑色素含量抑制的实验结果如图3所示。
1.2.1.4 G4:原儿茶醛与ECG中浓度配伍
对于G4:原儿茶醛与ECG中浓度配伍，按照1/4倍IC50实测值计算，原儿茶醛的浓度为0.7μg/mL，ECG的浓度为4μg/mL。G4对于B16-F10细胞黑色素含量抑制的实验结果如图4所示。
1.2.1.5 G5:原儿茶醛与EGCG中浓度配伍
对于G5:原儿茶醛与EGCG中浓度配伍，按照1/4倍IC50实测值计算，原儿茶醛的浓度为0.7μg/mL，EGCG的浓度为5μg/mL。G5对于B16-F10细胞黑色素含量抑制的实验结果如图5所示。
1.2.1.6 G6:原儿茶醛与白杨素中浓度配伍
对于G6:原儿茶醛与白杨素中浓度配伍，按照1/4倍IC50实测值计算，原儿茶醛的浓度为0.7μg/mL，白杨素的浓度为3μg/mL。G6对于B16-F10细胞黑色素含量抑制的实验结果如图6所示。
1.2.1.7 G7:白皮杉醇与ECG中浓度配伍
对于G7:白皮杉醇与ECG中浓度配伍，按照1/4倍IC50实测值计算，白皮杉醇的浓度为0.75μg/mL，ECG的浓度为4μg/mL。G7对于B16-F10细胞黑色素含量抑制的实验结果如图7所示。
1.2.1.8 G8:白皮杉醇与EGCG中浓度配伍
对于G8:白皮杉醇与EGCG中浓度配伍，按照1/4倍IC50实测值计算，白皮杉醇的浓度为0.75μg/mL，EGCG的浓度为5μg/mL。G8对于B16-F10细胞黑色素含量抑制的实验结果如图8所示。
1.2.1.9 G9:白皮杉醇与白杨素中浓度配伍
对于G9:白皮杉醇与白杨素中浓度配伍，按照1/4倍IC50实测值计算，白皮杉醇的浓度为0.75μg/mL，白杨素的浓度为3μg/mL。G9对于B16-F10细胞黑色素含量抑制的实验结果如图9所示。
1.2.2各配伍组合对B16-F10细胞黑色素含量抑制的CDI
各配伍组合对B16-F10细胞黑色素含量抑制的CDI见图10所示。
1.2.3各配伍组合对B16-F10细胞黑色素含量抑制的综合分析
表4 G1-G9各组对B16-F10细胞黑色素含量抑制数据汇总
配伍组合 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9
A药平均黑色素抑制率 29.59% 31.47% 30.33% 34.49% 32.63% 32.86% 29.90% 29.24% 29.39%
B药平均黑色素抑制率 30.69% 23.09% 30.06% 30.06% 28.58% 30.57% 29.75% 27.37% 29.40%
配伍平均黑色素抑制率 52.54% 47.31% 51.04% 56.44% 53.22% 51.64% 55.95% 51.01% 51.09%
配伍CDI值 0.97 1 1.01 0.95 0.97 1.04 0.89 0.95 0.98
综合分析G1-G9各组给药的黑色素含量抑制率数据，可以看出各药物按照1/4倍IC50单独给药，其黑色素含量抑制率在25~35%之间；按照G1-G9配伍给药，其黑色素含量抑制率在50~60%之间。每组中的2个药物均为1/4倍IC50即可达到50~60%的黑色素抑制效果，即抑制活性效价提高为原来的2倍以上。因此，各配伍组合均有实际意义。其中，G4（原儿茶醛与ECG中浓度配伍）和G7（白皮杉醇与ECG中浓度配伍）的配伍抑制率较高，分别为56.44%和55.95%。
综合分析G1-G9各组给药的黑色素含量抑制CDI值数据，可以看出除G3和G6外其余各组均有配伍协同增效作用。其中G7（白皮杉醇与ECG中浓度配伍）的协同作用明显强于其余各组。
两个指标结合分析，G7（白皮杉醇与ECG中浓度配伍）和G4（原儿茶醛与ECG中浓度配伍）对于黑色素含量的抑制效果较好，抑制率超过55%；且两组的药物组合发挥出较好的协同作用。G7和G4的抗黑色素活性和配伍协同增效作用均较好。
1.2.4各配伍组合对B16-F10细胞生长的影响
1.2.4.1 G1:光甘草定与ECG中浓度配伍
对于G1:光甘草定与ECG中浓度配伍，按照1/4倍IC50实测值计算，光甘草定的浓度为0.52μg/mL，ECG的浓度为4μg/mL。G1对于B16-F10细胞生长抑制的实验结果如图11所示。
1.2.4.2 G2:光甘草定与EGCG中浓度配伍
对于G2:光甘草定与EGCG中浓度配伍，按照1/4倍IC50实测值计算，光甘草定的浓度为0.52μg/mL，EGCG的浓度为5μg/mL。G2对于B16-F10细胞生长抑制的实验结果如图12所示。
1.2.4.3 G3:光甘草定与白杨素配伍
对于G3:光甘草定与白杨素中浓度配伍，按照1/4倍IC50实测值计算，光甘草定的浓度为0.52μg/mL，白杨素的浓度为3μg/mL。G3对于B16-F10细胞生长抑制的实验结果如图13所示。
1.2.4.4 G4:原儿茶醛与ECG配伍
对于G4:原儿茶醛与ECG中浓度配伍，按照1/4倍IC50实测值计算，原儿茶醛的浓度为0.7μg/mL，ECG的浓度为4μg/mL。G4对于B16-F10细胞生长抑制的实验结果如图14所示。
1.2.4.5 G5:原儿茶醛与EGCG配伍
对于G5:原儿茶醛与EGCG中浓度配伍，按照1/4倍IC50实测值计算，原儿茶醛的浓度为0.7μg/mL，EGCG的浓度为5μg/mL。G5对于B16-F10细胞生长抑制的实验结果如图15所示。
1.2.4.6 G6:原儿茶醛与白杨素配伍
对于G6:原儿茶醛与白杨素中浓度配伍，按照1/4倍IC50实测值计算，原儿茶醛的浓度为0.7μg/mL，白杨素的浓度为3μg/mL。G6对于B16-F10细胞生长抑制的实验结果如图16所示。
1.2.4.7 G7:白皮杉醇与ECG配伍
对于G7:白皮杉醇与ECG中浓度配伍，按照1/4倍IC50实测值计算，白皮杉醇的浓度为0.75μg/mL，ECG的浓度为4μg/mL。G7对于B16-F10细胞生长抑制的实验结果如图17所示。
1.2.4.8 G8:白皮杉醇与EGCG配伍
对于G8:白皮杉醇与ECG中浓度配伍，按照1/4倍IC50实测值计算，白皮杉醇的浓度为0.75μg/mL，EGCG的浓度为5μg/mL。G8对于B16-F10细胞生长抑制的实验结果如图18所示。
1.2.4.9 G9:白皮杉醇与白杨素配伍
对于G9:白皮杉醇与白杨素中浓度配伍，按照1/4倍IC50实测值计算，白皮杉醇的浓度为0.75μg/mL，白杨素的浓度为3μg/mL。G9对于B16-F10细胞生长抑制的实验结果如图19所示。
1.2.5各配伍组合对B16-F10细胞生长抑制的CDI
各配伍组合对B16-F10细胞生长抑制的CDI见图20所示。
1.2.6各配伍组合对B16-F10细胞生长抑制的综合分析
表5 G1-G9各组对B16-F10细胞生长抑制数据汇总
配伍组合 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9
A药平均细胞存活率 97.14% 97.12% 97.82% 87.73% 87.91% 85.86% 95.49% 97.01% 95.98%
B药平均细胞存活率 90.23% 88.38% 94.55% 89.26% 90.07% 94.15% 88.15% 90.58% 96.04%
配伍平均细胞存活率 86.65% 85.52% 89.93% 79.04% 78.77% 81.36% 86.80% 84.86% 88.99%
配伍CDI值 1.02 1.01 1 1.03 1.02 1.03 1.04 1 1
综合分析G1-G9各组的细胞生长存活率数据，可以看出各组配伍给药的细胞存活率均在78%以上，没有明显的细胞毒性。各组中，G3（光甘草定与白杨素中浓度配伍）、G7（白皮杉醇与ECG中浓度配伍）和G9（白皮杉醇与白杨素中浓度配伍）的平均细胞存活率较高，分别为89.93%、86.80%和88.99%。
综合分析G1-G9各组的细胞生长CDI数据，除G3和G9外，其余配伍组合对于细胞生长抑制具有拮抗作用，即CDI＞1。其中G4（原儿茶醛与ECG中浓度配伍）、G6（原儿茶醛与白杨素中浓度配伍）和G7（白皮杉醇与ECG中浓度配伍）的拮抗作用较强，CDI值分别为1.03、1.03和1.04。
两个指标结合分析，G7这一配伍组合既有较高的细胞存活率（86.80%），又有较好的拮抗减毒作用。考虑到G7抗黑色素活性较好且协同增效作用最强，因此确定G7（白皮杉醇与ECG中浓度配伍）为最佳配伍组合，下一步实验将改变白皮杉醇与ECG的剂量组合，筛选两药的最佳剂量组合。
上述结果表明，与单独给药相比，配伍组合均将药物黑色素含量抑制效价提高1倍以上。其中，G7的协同增效作用明显强于其他各组合。G1-G9对细胞生长抑制作用的测定表明，各组合均没有明显的细胞毒性。其中，G7的细胞存活率较高且配伍减毒作用明显。因此确定G7为最佳配伍组合。
从协同增效的机理上分析，G7中的白皮杉醇属于酪氨酸酶抑制剂，其抑制蘑菇酪氨酸酶单酚酶抑制活性为曲酸的32.7倍。白皮杉醇阻止L-酪氨酸被酪氨酸酶催化氧化为L-多巴，抑制黑色素合成中的第一个关键步骤。
ECG作为酪氨酸酶合成抑制剂，通过抑制黑色素细胞内cAMP、CREB、MITF等酪氨酸酶合成相关基因和蛋白的表达，抑制TYR、TRP1、TRP2的合成，最终抑制细胞黑色素合成。在各个基于和蛋白中，ECG对于TYR基因表达的抑制最为明显。此外，Tang等人通过酶促反应的抑制实验证明，ECG在无细胞状态下也有一定的酪氨酸酶抑制作用但活性较弱，仅与曲酸相当。而EGCG和白杨素则不能直接抑制酪氨酸酶活性。
白皮杉与ECG配伍，一方面ECG抑制细胞酪氨酸酶合成，另一方面两药物均可直接抑制酪氨酸酶活性，共同减少酪氨酸酶催化合成黑色素。因此两药配伍达到很好的协同增效作用，提高效价，显著降低给药剂量。
实验例2 筛选最佳剂量组合
针对最佳配伍组合G7（白皮杉醇与ECG配伍），选定5个白皮杉醇剂量与5个ECG剂量，两两组合，形成25个剂量组合（D1-D25）。以a-MSH刺激的B16细胞作为模型，评价25个剂量组合针对黑色素合成抑制效果以及细胞毒性；选择两药相互作用指数（CDI）为指标，评价各剂量组合的细胞黑色素含量、细胞存活率的药物相互作用性质。将黑色素抑制效果明显、协同作用强且细胞毒性较低、配伍减毒作用明显的剂量定为最佳剂量组合。
2.1实验方法
2.1.1细胞培养
同“1.1.1”中的“细胞培养”的方法。
2.1.2供试品溶液配制
2.1.2.1配制母液
同“1.1.2.1”中“配制母液”的方法。
2.1.2.2配制不同配伍组合的含药培养基
对于最佳配伍组合G7（白皮杉醇与ECG中浓度配伍），参考第二部分中“配制含药培养基”的方法，按照表6的剂量组合配制含药培养基。每个剂量组合的培养基中均含有166.4ng/mL的a-MSH。
表6不同剂量组合的含药培养基成分
Figure DEST_PATH_IMAGE008
注：在定量实验中，最佳配伍组合中的白皮杉醇、ECG各选择5个剂量，分别为各自IC50的1/16倍、1/8倍、1/4倍、1/2倍、1倍，两两组合，形成25个剂量组合，用于定量实验。
2.1.3分组与给药
将细胞从培养箱中取出，弃去原培养基。按表7，根据给药的剂量组合不同，分为D1-D25共25组。
表7最佳协同配伍的给药剂量组合
Figure DEST_PATH_IMAGE010
D1-D25各组按照表8方案加入含药培养基，培养24h。给药时，每个剂量设置5个复孔，实验重复3次。
表8 D1-D25各组给药方案
Figure DEST_PATH_IMAGE012
-，-代表A与B均不给药，仅加入a-MSH浓度为166.4ng/mL空白培养基；-，+代表只给相应剂量的B药；+，-代表只给相应剂量的A药；+，+代表给相应剂量组合的A药与B药。
2.1.4黑色素含量抑制率测定
同“1.1.4”中“黑色素含量抑制率测定”的方法。
2.1.5细胞毒性测定
同“1.1.5”中“细胞毒性测定”的方法。
2.1.6确定最佳剂量组合
参考“2.1.6”中“确定最佳配伍组合”的方法。计算D1-D25各组给药对于黑色素含量抑制以及细胞生长抑制的CDI值。
根据黑色素含量抑制活性、细胞毒性以及CDI值综合判断D1-D25中的最佳配伍组合D※=a白皮杉醇+b ECG并进行下一步实验，以评价最佳配伍处方。
2.1.7统计分析
同“1.1.6”中“统计分析”的方法。
2.2实验结果
2.2.1黑色素含量抑制率
2.2.1.1白皮杉醇单独给药
白皮杉醇以0.19μg/mL、0.38μg/mL、0.75μg/mL、1.5μg/mL以及3μg/mL浓度单独给药，对于B16-F10细胞黑色素含量抑制的实验结果如图21所示。
2.2.1.2 ECG单独给药
ECG以1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL以及16μg/mL浓度单独给药，对于B16-F10细胞黑色素含量抑制的实验结果如图22所示。
2.2.1.3白皮杉醇与ECG配伍给药
白皮杉醇以0.19μg/mL、0.38μg/mL、0.75μg/mL、1.5μg/mL浓度分别与ECG以1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL以及16μg/mL浓度配伍给药，对于B16-F10细胞黑色素含量抑制的实验结果如图23所示。
2.2.2各剂量组合对B16-F10细胞生长抑制的CDI
2.2.3各剂量组合对B16-F10细胞黑色素含量抑制的综合分析
分析黑色素含量数据可知，剂量组合D1-D25给药后，细胞黑色素含量抑制率在47~62%之间，均有显著的黑色素抑制作用。相同ECG浓度的各组中，白皮杉醇浓度越高，细胞黑色素含量抑制率越高，变化趋势较明显。相同白皮杉醇浓度下，ECG浓度越高，细胞黑色素含量抑制率越高，但变化趋势不明显。与1μg/mL浓度的ECG组别相比，更高浓度的ECG与白皮杉醇配伍其黑色素含量抑制率无明显提升。因此，兼顾疗效与经济性考虑，1μg/mL的ECG与白皮杉醇配伍更具有实际意义。在该组别中，白皮杉醇浓度1.5μg/mL和3μg/mL的抑制效果较好。因此，从抗黑色素效果的角度分析，D4（白皮杉醇1.5μg/mL与ECG1μg/mL配伍）和D5（白皮杉醇3μg/mL与ECG1μg/mL配伍）较为理想，平均黑色素含量抑制率分别为59.97%和59.63%。
从黑色素含量抑制率的药物相互作用指数分析，不同浓度ECG与白皮杉醇配伍，ECG浓度越高，CDI值越高，两药物协同作用越弱。即1μg/mL浓度的ECG与白皮杉醇配伍的协同抗黑色素作用最强。随着白皮杉醇浓度增加，各组别的CDI值先下降再上升，白皮杉醇浓度为1.5μg/mL时CDI值最低，协同抗黑色素作用最强。因此从协同作用的角度分析，D4（白皮杉醇1.5μg/mL与ECG1μg/mL配伍）较为理想，平均CDI值为0.73。
综合上述两个指标，D4（白皮杉醇1.5μg/mL与ECG1μg/mL配伍）的抗黑色素效果最佳，协同作用最强。
2.2.4各剂量组合对B16-F10细胞存活率的影响
2.2.4.1白皮杉醇单独给药
白皮杉醇以0.19μg/mL、0.38μg/mL、0.75μg/mL、1.5μg/mL以及3μg/mL浓度单独给药，对于B16-F10细胞生长抑制的实验结果如图25所示。
2.2.4.2ECG单独给药
ECG以1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL以及16μg/mL浓度单独给药，对于B16-F10细胞生长抑制的实验结果如图26所示。
2.2.4.3白皮杉醇与ECG配伍给药
白皮杉醇以0.19μg/mL、0.38μg/mL、0.75μg/mL、1.5μg/mL浓度分别与ECG以1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL以及16μg/mL浓度配伍给药，对于B16-F10细胞生长抑制的实验结果如图27所示。
2.2.5各剂量组合对B16-F10细胞生长抑制的CDI
各剂量组合对B16-F10细胞生长抑制的CDI见图28所示。
2.2.6各剂量组合对B16-F10细胞生长抑制的综合分析
分析细胞存活率数据可知，剂量组合D1-D25给药后，平均细胞存活率在80~95之间，没有明显的细胞毒性。相同ECG浓度下，白皮杉醇浓度越高，细胞存活率越低；相同白皮杉醇浓度下，ECG浓度越高，细胞存活率越低。1μg/mL的ECG与不同浓度白皮杉醇配伍，其平均细胞存活率均高于90%；更高浓度的ECG与白皮杉醇配伍，其细胞存活率明显下降，普遍低于90%。在ECG浓度为1μg/mL的组别中，细胞存活率随着白皮杉醇浓度提高没有明显变化。各组别中，细胞毒性最小的是D1，其平均细胞存活率为94.87%。剂量组合D4的平均细胞存活率为92.35%，即D4的细胞毒性比D1略大。但D4的平均黑色素抑制率为59%，相较D1（48%）提高了11个百分点。综上所述，D4（白皮杉醇1.5μg/mL与ECG 1μg/mL配伍）的抗黑色素效果最佳且细胞毒性较低。
从细胞存活率抑制的药物相互作用指数分析，ECG浓度为1μg/mL的组别，其CDI值明显高于ECG浓度更高的组别，且均大于1。即1μg/mL浓度的ECG与白皮杉醇配伍的减毒作用最明显。D4的CDI值为1.03（＞1），表明D4（白皮杉醇1.5μg/mL与ECG 1μg/mL配伍）具有配伍减毒的作用。
考虑到抗黑色素效果、细胞毒性以及各自的药物相互作用性质，确定白皮杉醇1.5μg/mL与ECG1μg/mL配伍为最佳处方，该处方具有高效低毒的抗黑色素作用。
通过分析D1-D25的黑色素含量抑制率和细胞存活率变化趋势可知，随着2个药物浓度的升高，黑色素含量抑制率升高，细胞存活率降低。显然，黑色素含量抑制率高但细胞存活率低不符合筛选出高效低毒的剂量组合这一目标。因此，直接采用最高剂量组合D25以达到最强的抗黑色素效果（抑制率62%）是不可取的，这样一方面会牺牲安全性，另一方面为了提高1-2%的抑制率而将药物浓度提高数倍，药物剂量较大，实际应用中成本较高，性价比过低。
进一步分析上述参数的变化趋势，黑色素含量抑制率随ECG浓度的升高，变化不明显；然而细胞存活率随ECG浓度的升高，明显降低。因此，选用低浓度的ECG（1μg/mL）与白皮杉醇配伍可以达到高黑色素抑制率、高细胞存活率的“双赢”效果。1μg/mL的ECG与白皮杉醇配伍给药（即D1-D5组别），黑色素含量抑制率随白皮杉醇浓度增加而明显升高，抑制率变化范围高达11%；细胞存活率随白皮杉醇浓度增加而略微降低，存活率变化范围仅3%。因此，1μg/mL的ECG与较高浓度白皮杉醇配伍（即D4、D5组别）更具有实际意义。结合药物相互作用指数，D4（白皮杉醇1.5μg/mL与ECG 1μg/mL配伍）的协同抗黑色素作用明显强于D5。通过综合分析，确定D4为最佳剂量组合，即白皮杉醇1.5μg/mL与ECG 1μg/mL配伍为最佳处方。该处方抗黑色素效果好且配伍的协同增效作用明显，细胞毒性低且配伍有减毒作用。与曲酸等传统的酪氨酸酶抑制剂相比，抗黑色素最佳处方中的药物具有其他改善皮肤形态功能的药理作用。
最佳处方中的白皮杉醇具有抗炎、抗氧化应激的作用，外用可以减缓皮肤衰老。抗炎活性体现在白皮杉醇是一种选择性COX-2抑制剂，其对COX-2的抑制活性与塞来昔布相当。白皮杉醇抗氧化应激体现在其可以减少不对称二甲基精氨酸（ADMA），并可能在血液中高氧化应激期间（例如高血压和糖尿病）保持血流量。50μM的白皮杉醇孵育长达9小时能够增强内皮型一氧化氮合成酶（eNOS） mRNA和蛋白质含量，而20μM在48小时内显效。 ECG具有抗菌、抗氧化作用。外用可以美白的同时，还可以消炎祛痘、抗皮肤过敏症并有抗皱效果。
实验例3 最佳配伍处方的体外评价
前期实验筛选出的最佳处方为白皮杉醇1.5μg/mL与ECG1μg/mL配伍给药，其黑色素含量抑制率较高且协同增效明显，同时细胞毒性较低且具有配伍减毒作用。这部分实验以曲酸为阳性对照，以a-MSH刺激的B16细胞为模型，以黑色素含量抑制率和细胞毒性为指标，对最佳处方的体外药效和毒性进行评价。
3.1实验方法
3.1.1细胞培养
同“1.1.1”中的“细胞培养”的方法。
3.1.2分组与给药
将细胞从培养箱中取出，弃去原培养基。按表9，参照第二部分中“配制母液”“配制含药培养基”的方法，配制空白对照组、模型组、阳性对照组和最佳配伍组的培养基，按下表4个组别分别加入对应的培养基培养24h。给药时，每个剂量设置5个复孔，实验重复3次。
表9 抗黑色素最佳处方的验证实验给药分组
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3.1.3黑色素含量抑制率测定
同“1.1.4”中“黑色素含量抑制率测定”的方法。
3.1.4细胞毒性测定
同“1.1.5”中“细胞毒性测定”的方法。
3.1.5统计分析
同“1.1.7”中“统计分析”的方法。
3.2实验结果
3.2.1抗黑色素最佳处方对B16-F10细胞黑色素含量的影响
按照表9进行分组并给药，抗黑色素最佳处方对于B16-F10细胞黑色素含量抑制的实验结果如图29所示。
3.2.2抗黑色素最佳处方对B16-F10细胞存活率的影响
按照表1进行分组并给药，抗黑色素最佳处方对于B16-F10细胞生长抑制的实验结果如图30所示。
上述实验以曲酸作为阳性对照药，基于B16细胞对抗黑色素最佳处方的效果和安全性进行评价，结果如表10所示。
表10 抗黑色素最佳处方的验证实验结果汇总
分组 平均黑色素含量抑制率 平均细胞存活率
阳性对照组 42.51% 93.15%
最佳处方组 61.07% 92.74%
阳性对照组的药物为84μg/mL的曲酸，最佳处方组的药物为1.5μg/mL白皮杉醇与1μg/mL ECG配伍。最佳处方组的平均细胞存活率与阳性对照组基本一致，仅相差0.41%；然而最佳处方组的平均黑色素含量抑制率高出阳性对照组近50%。说明上述实验筛选出的最佳处方不仅给药剂量更低、无明显细胞毒性，且抗黑色素效果有显著提升。
白皮杉醇是酪氨酸酶抑制剂，ECG是酪氨酸酶合成抑制剂，酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶。二者以适当剂量配伍，抑制酪氨酸酶合成并降低酪氨酸酶催化活性，从两个途径共同抑制黑色素合成，抑制效果好且具有协同增效的作用。同时，协同增效可降低给药剂量，降低药物细胞毒性，从而保证安全性。
此外，曲酸等传统抗黑色素活性物质具有安全性等方面的缺陷，新型抗黑色素活性物质的提取、分离、鉴定以及合成的时间、经济成本较高，且单独使用往往用量大、价格高。相比之下，该最佳处方中的药物已有较多研究，其用量小、效果佳、安全性良好且来源稳定，适合作为美白活性物质使用。美白产品通过涂抹于皮肤表面发挥作用，白皮杉醇的抗炎、抗氧化应激活性以及ECG的抗菌、抗炎活性可以达到消炎祛痘、抗皮肤过敏症并有抗皱、延缓衰老的效果。因此，该处方可作为优良的美白制剂。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种抗黑色素组合物，其特征在于，包括酪氨酸酶抑制剂与酪氨酸酶合成抑制剂，所述的酪氨酸酶抑制剂采用白皮杉醇，白皮杉醇浓度为0.19~3μg/mL，所述的酪氨酸酶合成抑制剂采用ECG，ECG浓度为1~16μg/mL。
2.根据权利要求1所述的抗黑色素组合物，其特征在于，所述的白皮杉醇浓度为1.5μg/mL或3μg/mL，ECG浓度为1μg/mL。
3.一种如权利要求1所述的抗黑色素组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将酪氨酸酶抑制剂与酪氨酸酶合成抑制剂混合，即得。
4.一种如权利要求1~2任一所述的抗黑色素组合物在制备皮肤美白、抗炎、抗氧化、抗菌和/或抗过敏药物和/或化妆品中的应用。
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