CN113061173B - 一种分离αs1-酪蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分离α_s1‑酪蛋白的方法，属于蛋白分离技术领域。本发明以生牛乳、含有牛乳的物质、牛乳酪蛋白、山羊乳、含有山羊乳的物质、羊乳酪蛋白为原料，通过脱脂—盐酸沉淀—尿素沉淀—透析—钙离子沉淀，得到纯度为90％以上的α_s1‑酪蛋白。本方法也可用于牛乳粉中α_s1‑酪蛋白的分离，简单易重复，不需要特殊仪器即可完成。得到的α_s1‑酪蛋白无毒无害，可直接用于后续生产或实验。

Description

一种分离αs1-酪蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种分离α_s1-酪蛋白的方法，属于蛋白分离技术领域。

背景技术

酪蛋白是动物乳中重要的成分之一，占乳蛋白总量的80％左右，包括α_s1-酪蛋白、α_s2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白四种蛋白质，分子量大小在19至25.2kDa之间，在牛奶中以胶束的状态存在，携带大量的钙和磷酸盐，并能提供丰富的氨基酸。其中α_s1-酪蛋白是牛奶酪蛋白中含量最高的一类(总酪蛋白的38％～40％)，它是一种高度磷酸化的蛋白，含有8～9个磷酸化基团。在经过水解后，得到与钙结合的可溶性磷酸肽，可促进钙的吸收，是牛乳活性肽的重要来源。与牛奶相比，羊乳中α_s1-酪蛋白占酪蛋白总量的5.6％，含量极少，加之α_s1-酪蛋白是最重要的高磷酸化蛋白之一，提取更加困难。

近几年来，随着乳品科技研究的日益深入，乳蛋白组分的分离纯化技术也提出了更高的要求。现阶段乳蛋白分离主要用到三种方法：等电点及盐析法、膜分离技术以及色谱分离法。等电点及盐析法主要是通过乳蛋白中不同组分等电点不同以及在不同盐浓度中的溶解度不同来实现分离的，其优点是操作简单，不需要复杂的设备，但纯度较低；膜分离技术可通过控制不同的孔径截留蛋白实现分离，其优点是操作条件温和，不会破坏蛋白原有的性质，但目前仅能实现酪蛋白或β-酪蛋白的分离；色谱法主要利用不同乳蛋白对各种离子的亲和力不同，通过离子交换色谱或高效液相色谱，来实现乳蛋白的分离，其优点使分辨率高，重复性好，纯度高，缺点是需要特定的设备，且效率较低。

目前公开的方法中，主要还是以制备得到α_s-酪蛋白为主：徐明芳等人公开了一种离子交换色谱分离乳源α_s-酪蛋白，该方法以酪蛋白为原料，配制成4mg/mL的溶液，上DEAE-Sepharose CL-6B色谱柱后洗脱，得到100％纯度的α_s-酪蛋白(公开号：CN 102746394A，公开于2012年10月24日)。张列兵等人公开了一种采用化学分级分离法纯化分离α_s-酪蛋白；该方法以牛乳酪蛋白为原料，配制成2.7％的水溶液，通过40mMCa²⁺沉淀分离κ-酪蛋白，再通过α_s-酪蛋白与β-酪蛋白在尿素溶液中溶解度不同分离α_s-酪蛋白。得到纯度为96.2％的α_s-酪蛋白(公开号：CN 101824085 A，公开于2010年9月8日)。李全阳等人公开了一种分离水牛奶中酪蛋白组分的方法；该方法以水牛奶为原料，采用等电点酸沉酪蛋白，再通过不同浓度的Ca²⁺离子分离α_s-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，得到纯度为91.6％的α_s-酪蛋白(公开号：CN 102675448 A，公开于2012年9月19日)。

但是现有技术都还局限于α_s-酪蛋白的提取，还没有真正的用于α_s1-酪蛋白的分离纯化技术，局限了对于α_s1-酪蛋白的开发与应用。

发明内容

针对目前牛乳或羊乳中α_s1-酪蛋白分离纯化方法较少，本发明提供一种通过等电点及盐析法分离纯化生牛乳或羊乳中α_s1-酪蛋白的方法。本方法以生牛乳为原料，经过酸沉，尿素分离，透析，Ca²⁺沉淀后得到较高纯度的α_s1-酪蛋白。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

先将牛奶或山山羊奶脱脂，脱脂后通过调节pH至等电点，将酪蛋白分离出来。由于α_s- 酪蛋白、β-酪蛋白与κ-酪蛋白在尿素中的溶解度不同，可通过调节尿素浓度分离α_s-酪蛋白。α_s1-酪蛋白与α_s2-酪蛋白磷酸化的程度不同，对Ca²⁺的敏感性不同，通过调节Ca²⁺的浓度可将α_s1-酪蛋白与α_s2-酪蛋白分离。

本发明提供了一种提取α_s1-酪蛋白的方法，所述方法是利用Ca²⁺将α_s1-酪蛋白从酪蛋白中分离出来。

在一种实施方式中，所述酪蛋白来源于牛奶、含有牛奶的物质、山羊奶或含有山羊奶的物质。

在一种实施方式中，当原料来源于牛奶、含有牛奶的物质时，所述方法为：

(1)先从原料中提取酪蛋白，将酪蛋白粉末溶解入6-7M的尿素溶液，调节pH至6.5-7.5；

(2)将尿素浓度调节为4.5-4.8M，调节pH至4.5-4.8，离心收集沉淀；

(3)将沉淀溶解至6-7M的尿素溶液中，并调节pH至6.5-7.5；

(4)加水稀释至尿素浓度为3.2-3.5M，调节pH至4.5-4.8，离心收集沉淀；

(5)将沉淀经用pH10-11的水溶液溶解后调节pH至7.0-7.5透析去除尿素，得到透析液；

(6)取透析液，先加入1-3mM的CaCl₂离心后取上清，再加入15-20mM的CaCl₂分离得到沉淀，将沉淀干燥后得到牛乳α_s1-酪蛋白。

在一种实施方式中，步骤(2)中的尿素浓度为4.6M，pH为4.6；步骤(4)中尿素浓度为3.3M，调节pH至4.6；

在一种实施方式中，步骤(5)中用pH11水溶液溶解后调节pH为7.2；

在一种实施方式中，先加入3mM的CaCl₂离心后取上清，再加入20mM的CaCl₂。

在一种实施方式中，当原料来源于山羊奶或含有山羊奶的物质时，所述方法为：

(1)先从原料中提取酪蛋白，将酪蛋白粉末溶解入6-7M尿素溶液，调节pH至6.5-7.5；

(2)将尿素浓度调节为2.8-3.2M，调节pH至4.0-4.2，离心收集沉淀；

(4)将沉淀用pH 11水溶液溶解后调节pH至9.0沉淀经透析去除尿素，得到透析液；

(5)取透析液，先加入1-3mM CaCl₂离心后取上清，再加入50-60mM CaCl₂分离得到沉淀，将沉淀干燥后得到山羊乳α_s1-酪蛋白。

在一种实施方式中，步骤(2)尿素浓度调节为3.0M，调节pH至4.1；步骤(4)用pH 11水溶液溶解后调节pH至9.0。

在一种实施方式中，先加入3mM CaCl₂离心后取上清，再加入60mM CaCl₂分离得到沉淀。

在一种实施方式中，先将牛奶或山羊奶脱脂，然后再加入浓盐酸至pH4-5，搅拌后离心取沉淀，沉淀经蒸馏水洗涤后冷冻干燥得到酪蛋白粉末。

本发明的有益效果：

本方法操作简单，不需要复杂的仪器设备便可得到纯度较高的α_s1-酪蛋白，且纯化过程中没有使用有毒有害试剂，得到的α_s1-酪蛋白可直接用于后续的实验。本方法同时适用于工业化生产和实验室制备，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为不同步骤的到的产物电泳图；最左侧为maker；1、2为脱脂后所得蛋白；3、4为沉淀的酪蛋白；5、6为步骤(6)沉淀后所得α_s-酪蛋白；7、8为最终提取得到的牛乳α_s1-酪蛋白。

图2为最终得到的牛乳α_s1-酪蛋白LC-MS鉴定图。

图3为取透析液后，分别加入1mM、2mM、3mM CaCl₂，3000g离心10min后取上清，再加入20mM CaCl₂，3000g离心10min，取沉淀冷冻干燥后得到的牛乳α_s1-酪蛋白；最左侧为maker；1、2为步骤沉淀的酪蛋白；3、4为取透析液后加入1mMCaCl₂沉淀后所得上清； 5、6为取透析液后加入2mMCaCl₂沉淀后所得上清；7、8为取透析液后加入3mMCaCl₂沉淀后所得上清。

图4为不同步骤的到的产物电泳图；最左侧为maker；1、2为步骤(1)脱脂后所得蛋白； 3、4为步骤(2)酸沉后所得酪蛋白；5、6为步骤(6)沉淀后所得α_s-酪蛋白；7、8为步骤(8)沉淀后所得山羊乳α_s1-酪蛋白。

图5为最终得到的山羊乳α_s1-酪蛋白LC-MS鉴定图。

图6为步骤(4)后未经过透析除净尿素提取的蛋白图。

图7为步骤(6)中取透析液后，分别加入1mM、2mM、3mM CaCl₂，3000g离心10min 后取上清，再加入60mM CaCl₂，3000g离心10min，取沉淀冷冻干燥后得到的山羊α_s1-酪蛋白；最左侧为maker；1、2为步骤(2)酸沉后所得酪蛋白；3、4为步骤(6)中取透析液后加入1mMCaCl₂沉淀后所得上清；5、6为步骤(6)中取透析液后加入2mMCaCl₂沉淀后所得上清；7、8为步骤(6)中取透析液后加入3mMCaCl₂沉淀后所得上清。

具体实施方式

实施例1

(1)牛奶脱脂：2L新鲜生牛乳，于2500g，4℃下离心20min，除去脂肪；

(2)沉淀酪蛋白：缓慢加入浓盐酸并搅拌，调节pH至4.6，搅拌30min后3000g离心10min，保留沉淀；沉淀打散后用蒸馏水洗涤，3000g离心10min，重复两次后冷冻干燥得到酪蛋白粉末；

(3)将酪蛋白粉末溶解入6.6M尿素溶液，配制质量-体积百分比浓度为4％的溶液，调节pH至7.0，4℃静置30min；

(4)加水稀释至尿素浓度为4.6M，调节pH至4.6，4℃静置30min后4000g离心收集沉淀；

(5)将沉淀溶解入6.6M尿素溶液，配制质量-体积百分比浓度为4％的溶液，调节pH至7.0，4℃静置30min；

(6)加水稀释至尿素浓度为3.3M，调节pH至4.6，4℃静置30min后4000g离心收集沉淀；

(7)沉淀用pH11水溶液溶解后调节pH至7.2，用pH7.2蒸馏水透析48h除净尿素。

(8)取透析液，加入3mM CaCl₂，3000g离心10min后取上清，再加入20mM CaCl₂，3000g离心10min，取沉淀冷冻干燥后得到纯度为94.25±0.97％的牛乳α_s1-酪蛋白。

实施例2

(1)将牛干酪素粉末溶解入6.6M尿素溶液，配制质量-体积百分比浓度为4g/100mL的溶液，调节pH至7.0，4℃静置30min；

(2)加水稀释至尿素浓度为4.6M，调节pH至4.6，4℃静置30min后4000g离心收集沉淀，沉淀用蒸馏水洗涤两次，3000g离心10min后得到冷冻干燥的酪蛋白粉末；

(3)将沉淀溶解入6.6M尿素溶液，配制质量-体积百分比浓度为4g/100mL的溶液，调节pH至7.0，4℃静置30min；

(4)加水稀释至尿素浓度为3.3M，调节pH至4.6，4℃静置30min后4000g离心收集沉淀；

(5)沉淀用pH11水溶液溶解后调节pH至7.2，用蒸馏水透析48h除净尿素；

(6)取透析液，加入3mM CaCl₂，3000g离心10min后取上清，再加入20mM CaCl₂，3000g离心10min，取沉淀冷冻干燥后得到纯度为95.57±1.24％的牛乳α_s1-酪蛋白。

对比例1

具体实施方式参见实施例1，区别在于，步骤(6)中取透析液后，分别加入1mM、2mM、3mM CaCl₂，最后沉淀冷冻干燥后得到的牛乳α_s1-酪蛋白的纯度分别为80.12±3.75％、91.34±1.45％、94.25±0.97％。

实施例3

(1)山羊奶脱脂：取新鲜山羊乳2L，于2500g，4℃下离心20min，除去脂肪；

(2)沉淀酪蛋白：缓慢加入盐酸溶液并搅拌，调节pH至4.1，搅拌30min后3000g离心10min，保留沉淀。沉淀打散后用蒸馏水洗涤，3000g离心10min，重复两次后冷冻干燥得到酪蛋白粉末；

(3)将酪蛋白粉末溶解入6.6M尿素溶液，配制质量-体积百分比浓度为4％的溶液，调节pH至7.0，4℃静置30min；

(4)加水稀释至尿素浓度为3.0M，调节pH至4.1，4℃静置30min后4000g离心收集沉淀；

(5)沉淀用pH 11水溶液溶解后调节pH至9.0，用pH9.0蒸馏水透析48h除净尿素。

(6)取透析液，加入3mM CaCl₂，3000g离心10min后取上清，再加入60mM CaCl₂，3000g离心10min，取沉淀冷冻干燥后得到纯度为93.8％的羊乳α_s1-酪蛋白。

实施例4

(1)山羊奶脱脂：取羊乳粉30g溶于200mL温水中，于2500g，4℃下离心20min，除去脂肪；

(2)沉淀酪蛋白：缓慢加入盐酸溶液并搅拌，调节pH至4.1，搅拌30min后3000g离心10min，保留沉淀。沉淀打散后用蒸馏水洗涤，3000g离心10min，重复两次后冷冻干燥得到酪蛋白粉末；

(3)将酪蛋白粉末溶解入6.6M尿素溶液，配制质量-体积百分比浓度为4％的溶液，调节pH至7.0，4℃静置30min；

(4)加水稀释至尿素浓度为3.0M，调节pH至4.1，4℃静置30min后4000g离心收集沉淀；

(5)沉淀用pH 11水溶液溶解后调节pH至9.0，用pH9.0蒸馏水透析48h除净尿素。

(6)取透析液，加入3mM CaCl₂，3000g离心10min后取上清，再加入60mM CaCl₂，3000g离心10min，取沉淀冷冻干燥后得到纯度为94.2％的羊乳α_s1-酪蛋白。

对比例2

具体实施方式参见实施例3，区别在于，步骤(4)后未经过透析除净尿素，导致分离效果较差，结果见图4。

对比例3

具体实施方式参见实施例3，区别在于，步骤(6)中取透析液后，分别加入1mM、2mM、3mM CaCl₂，最后沉淀冷冻干燥后得到的羊乳α_s1-酪蛋白的纯度分别为75.33±1.25％、89.50±0.56％、93.20±0.44％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种提取α_s1-酪蛋白的方法，其特征在于，利用Ca²⁺将α_s1-酪蛋白从酪蛋白中分离出来，所述酪蛋白来源于牛奶、含有牛奶的物质、山羊奶或含有山羊奶的物质；

当原料来源于牛奶、含有牛奶的物质时，所述方法为：

（1）先从原料中提取酪蛋白，将酪蛋白粉末溶解入6-7 M的尿素溶液，调节pH至6.5-7.5；

（2）将尿素浓度调节为4.5-4.8 M，调节pH至4.5-4.8，离心收集沉淀；

（3）将沉淀溶解至6-7 M的尿素溶液中，并调节pH至6.5-7.5；

（4）加水稀释至尿素浓度为3.2-3.5 M，调节pH至4.5-4.8，离心收集沉淀；

（5）将沉淀经用pH值为10-11的水溶液溶解后调节pH至7.0-7.5透析去除尿素，得到透析液；

（6）取透析液，先加入1-3 mM的CaCl₂离心后取上清，再加入15-20 mM的CaCl₂分离得到沉淀，将沉淀干燥后得到牛乳α_s1-酪蛋白；

当原料来源于山羊奶或含有山羊奶的物质时，所述方法为：

（1）先从原料中提取酪蛋白，将酪蛋白粉末溶解入6-7 M尿素溶液，调节pH至6.5-7.5；

（2）将尿素浓度调节为2.8-3.2 M，调节pH至4.0-4.2，离心收集沉淀；

（4）将沉淀用pH 11水溶液溶解后调节pH至9.0沉淀经透析去除尿素，得到透析液；

（5）取透析液，先加入1-3 mM CaCl₂离心后取上清，再加入50-60 mM CaCl₂分离得到沉淀，将沉淀干燥后得到山羊乳α_s1-酪蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当原料来源于牛奶、含有牛奶的物质时，步骤（2）中的尿素浓度为4.6M，pH为4.6；步骤（4）中尿素浓度为3.3 M，调节pH至4.6。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当原料来源于牛奶、含有牛奶的物质时，步骤（5）中用pH 11水溶液溶解后调节pH为7.2。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，当原料来源于牛奶、含有牛奶的物质时，先加入3 mM的CaCl₂离心后取上清，再加入20 mM的CaCl₂。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当原料来源于山羊奶或含有山羊奶的物质时，步骤（2）尿素浓度调节为3.0 M，调节pH至4.1；步骤（4）用pH 值为11水溶液溶解后调节pH至9.0。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当原料来源于山羊奶或含有山羊奶的物质时，先加入3 mM CaCl₂离心后取上清，再加入60 mM CaCl₂分离得到沉淀。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，先将牛奶或山羊奶脱脂，然后再加入浓盐酸至pH值为4-5，搅拌后离心取沉淀，沉淀经蒸馏水洗涤后冷冻干燥得到酪蛋白粉末。

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