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CN113046474A - 一种检测腺病毒的试剂盒 - Google Patents

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CN113046474A
CN113046474A CN201911386991.0A CN201911386991A CN113046474A CN 113046474 A CN113046474 A CN 113046474A CN 201911386991 A CN201911386991 A CN 201911386991A CN 113046474 A CN113046474 A CN 113046474A
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迟大利
吴大治
夏懿
杨志军
李晓光
张曦
李崇山
沈立松
范列英
李荷楠
隋国栋
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Shanghai Fosun Long March Medical Science Co ltd
Shanghai Municipal Center For Disease Control & Prevention
Shanghai Xingyao Med Tech Development Co ltd
XinHua Hospital Affiliated To Shanghai JiaoTong University School of Medicine
Peking University Peoples Hospital
Peking University Third Hospital
Shanghai East Hospital
Fudan University
Original Assignee
Shanghai Fosun Long March Medical Science Co ltd
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Peking University Peoples Hospital
Peking University Third Hospital
Shanghai East Hospital
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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

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Abstract

本发明公开了腺病毒的基于LAMP技术的检测试剂盒。LAMP引物根据腺病毒的特异保守序列设计，每组引物包含6条寡核苷酸。用于腺病毒检测时，可通过肉眼观察呈白色沉淀；亦可使用恒温核酸扩增分析仪对扩增产物与核酸染料结合后发出荧光信号进行检测并进行处理分析，形成扩增曲线，并根据Tt值判断检测结果。本发明为腺病毒测提供了一个新的技术平台，适宜在基层单位、现场监测和床旁检测中推广应用。

Description

一种检测腺病毒的试剂盒
技术领域
本发明属于以等温扩增为代表的分子生物学检测方法在腺病毒检测方面的应用，即腺病毒的环介导等温扩增检测方法和试剂盒。
背景技术
腺病毒（Adenovirus, AdV）是一种没有包膜的直径为70~90 nm的颗粒、线状、双链DNA病毒，分为2个属、6个亚群（A-F），包括51个血清型。腺病毒可通过人、水、媒介物和器械传播。在室温条件下，腺病毒在污物中存在周期可延长至3周。腺病毒在儿童和军营人员中更易发生感染和大规模流行，大多数婴幼儿在出生后的5年内至少感染过1种腺病毒株。
腺病毒可导致肺炎、发热上呼吸道疾病、结膜炎、膀胱炎、肠胃炎等，根据感染者的免疫和心肺功能的差异性可导致严重的呼吸窘迫甚至死亡。腺病毒感染全年散发，冬春季相对较多，阳性检出率最高可达15%。
近年来，分子生物学方法不断被应用到呼吸道病毒的快速检测中，呼吸道病毒的实验室诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了呼吸道病毒实验室诊断的发展方向。相对于传统的实验室检测法，分子诊断技术具有无可比拟的检测速度、特异性和灵敏度，已成为实验室诊断的新标准。
其中，环介导等温扩增法具有检测灵敏度高、结果判断直观，且不需要荧光定量PCR仪等价格昂贵的设备等优点，具有广泛应用前景。
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一种新型等温核酸扩增技术，具有快速、简便、经济、灵敏等优点，目前已被广泛应用于核酸快速检测领域。LAMP的原理是针对靶基因上6个区域设计3对引物（FIP[F1c+F2]、BIP[B2+B1c]、F3、B3、LF、LB），在链置换型DNA聚合酶的作用下，于等温条件在短时间内（15~45min）进行核酸扩增。扩增产物与核酸染料结合后发出荧光信号，荧光信号可由仪器捕获，并进行处理分析，形成扩增曲线，并根据Tt值判断检测结果。与传统PCR相比，LAMP具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果判定简单、成本低廉等特点。LAMP检测灵敏度至少比普通PCR高出2个数量级。此外，等温扩增仅需恒温扩增及荧光检测装置，对设备的要求简单，其操作过程耗时较短，可在1小时内完成。LAMP反应结果的检测不需要像普通PCR进行凝胶电泳，只需通过肉眼观察浑浊产物或者通过仪器检测荧光曲线即可，是一种高效、简便、快捷的检测方法。
因此，开发一种针对腺病毒的环介导等温扩增试剂盒具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种用于腺病毒核酸检测的方法；另一目的在于提供一种用于该方法的试剂盒。
1. 腺病毒的LAMP检测专用引物
根据腺病毒基因组特异性保守序列，应用在线引物设计软件Primer Explorer V5，上传靶序列后，即可初步得到多组引物序列。
根据LAMP引物设计的关键因素，主要包括引物末端的稳定性、GC含量、引物间的距离和二级结构对其进行筛选，最终得到的LAMP引物。具体来说，为了在反应中能使F1c和B1c更加容易弯转，可以形成双茎环结构，引物F1c和B1c要高于其他几条引物的Tm值5℃左右。为提高核苷酸越与模板退火结合效率，每条引物最末端的六个碱基自由能⊿G值≤-4Kcal/mol，F3/B3，F2/B2，LF/LB的3’-端⊿G值≤-4Kcal/mol，F1c和B1c的5’-端的⊿G值≤-4Kcal/mol。对于引物的GC含量设定范围在40%~60%之间。对于引物之间的距离，从F2的5’-端到B2的5’-端应在120~180bp之间，从F2的5’-端到F1c的3’-端也就是茎环段在40~60bp之间，从F2的5’-端到F3的3’-端在0~20bp之间。最后要特别注意引物之间不能形成二级结构。通过以上设计原则筛选即得到最终引物如下。
F3: 5’-ACCCAACTACATTGGCTTTA-3’；
B3: 5’-TGATTCCACATGCTGAAGT-3’；
FIP: 5’-GGATGCTTGACCTGCCTATTGGACTTATGTACTACAACAG-3’；
BIP: 5’-TGAATGCGGTGGTTGACTTGGGTTCTGTCACCCAGAGA-3’；
LF: 5’-AGCACTCCCATGTTGCCAGT-3’
LB: 5’-CAGGACAGAAACACAGAACTATCATATC-3’。
2. 腺病毒的LAMP检测方法
本发明所提供的腺病毒的LAMP检测方法，主要包括以下步骤：
[1]核酸提取：使用上海复星长征医学科学有限公司生产的核酸提取试剂对待测样本进行核酸提取。
[2]LAMP扩增
以上述提取的待测物核酸为模板，在专用引物的介导下进行扩增。其中，LAMP反应体系（30 μl）包括：待测物的基因组核酸12μl，20mM Tris·HCl (pH8.8)，10mM KCl，10mMMgSO4，10mM(NH4)2SO4，0.1% Tween20，1M Betaine，SYBR GREEN（×1），1.5mM dNTP each，9UBst DNA polymerase，9U逆转录酶，引物用量为：6pmol F3和B3，48pmol FIP和BIP，12pmolLF和LB。反应管置于54~68℃恒温反应15~45min，优选为63℃恒温反应30min。
[3]结果判定
1)肉眼观察
反应结束后，肉眼观察产物是否浑浊。与阴性对照相比，明显出现浑浊物的样本为阳性，阳性产物经离心后在试管底部出现沉淀物；若无浑浊现象，则为阴性标本。
2)荧光检测
使用恒温核酸扩增分析仪对扩增产物与核酸染料结合后发出荧光信号进行检测并进行处理分析，形成扩增曲线，并根据Tt值判断检测结果。
3. 腺病毒的LAMP检测试剂盒
本发明所提供的腺病毒的LAMP检测试剂盒，包含有上述LAMP检测的专用引物、主要试剂和反应参数，本发明具有以下优点：
[1]高特异性
6条引物对靶序列的6个特异区域的识别保证了LAMP扩增的高度特异性，即LAMP能够从相差仅一个核苷酸的基因标本中寻找出相应的靶序列进行扩增；
[2]高效扩增
灵敏度比普通PCR高约100倍；
[3]操作简便
只需将待检样品(靶核酸)和检测试剂置于约63℃恒温水浴锅中30min左右即可判断结果；
[4]结果直观
可通过肉眼观察或恒温核酸扩增分析仪检测结果。本发明可以在等温条件下简便快速（63℃恒温反应30min）、高效特异地检测到腺病毒。该法不需要复杂仪器，为腺病毒的检测提供了一个新的技术平台，尤其适用于人群筛查，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
具体实施方式
现以本发明技术方案为前提，列举出详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例子。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、用于对腺病毒进行LAMP检测的引物设计
利用NCBI数据库检索获得腺病毒基因组特异性保守序列，应用在线引物设计软件PrimerExplorer V5，上传靶序列后，即可初步得到多组引物序列。根据LAMP引物设计的关键因素，主要包括引物末端的稳定性、GC含量、引物间的距离和二级结构对其进行筛选，最终得到的LAMP引物。
实施例2、用于腺病毒进行LAMP检测方法的建立
用实施例1获得的用于对腺病毒进行LAMP检测的引物对临床样本核酸提取液进行LAMP检测，具体操作步骤如下：
[1]反应体系
使用上海复星长征医学科学有限公司生产的核酸提取试剂对待测样本进行核酸提取，将提取产物作为模板，在实施例1获得的LAMP专用引物的引导下进行等温扩增。其中，LAMP反应体系（30 μl）包括：待测物的基因组核酸12μl，20mM Tris·HCl (pH8.8)，10mM KCl，10mM MgSO4，10mM(NH4)2SO4，0.1% Tween20，1M Betaine，SYBR GREEN（×1），1.5mM dNTPeach，9U Bst DNA polymerase，9U逆转录酶，引物用量为：6pmol F3和B3，48pmol FIP和BIP，12pmol LF和LB。
[2]结果判定
可通过肉眼观察或恒温核酸扩增分析仪检测结果。
1）反应结束后肉眼观察产物是否浑浊。与阴性对照相比，明显出现浑浊物的样本为阳性，阳性产物经离心后在试管底部出现沉淀物。若无浑浊现象，则为阴性标本。
2）使用恒温核酸扩增分析仪对扩增产物与核酸染料结合后发出荧光信号进行检测并进行处理分析，形成扩增曲线，并根据Tt值判断检测结果。
实施例3、制备腺病毒的LAMP检测试剂盒
将LAMP反应发生混合物即LAMP反应引物（1.2uM F3和B3；9.6uM FIP和BIP；2.4uM LF和LB）、LAMP反应酶（Bst DNA聚合酶3U/ul；逆转录酶3U/ul）、反应缓冲液（60mM Tris·HCl(pH8.8)；30mM KCl；30mM MgSO4；30mM (NH4)2SO4；0 .3% Tween20；3M Betaine；4.5mM dNTPeach、SYBR GREEN（×3））、阴性对照和阳性对照（含有腺病毒基因组特异性保守序列的质粒稀释液）共同包装，得到腺病毒的LAMP检测试剂盒。

Claims (4)

1.本发明为一种腺病毒环介导等温扩增技术检测方法与试剂盒，其特征在于，用于对腺病毒进行快速检测的专用引物，即根据腺病毒基因组的特异性保守靶序列设计，用以定性检测待测样品中的腺病毒；每套引物包含6条寡核苷酸序列，即2条外引物F3和B3，2条内引物FIP和BIP和2条环引物LF和LB。
2.如权利要求1所述的检测方法与试剂盒，其特征在于，腺病毒环介导等温扩增检测方法主要包括以下步骤：以待测物的基因组核酸为模板，在权利要求1所述专用引物的引导下进行环介导等温扩增扩增；扩增产物与核酸染料结合后发出荧光信号，荧光信号可由仪器捕获，并进行处理分析，形成扩增曲线，并根据Tt值判断检测结果。
3.如权利要求1所述的检测方法与试剂盒，其特征在于：使用核酸提取试剂对待测样本进行核酸提取；环介导等温扩增反应体系包括：待测物的基因组核酸12μl，20mM pH8.8的Tris·HCl，10mM KCl，10mM MgSO4，10mM(NH4)2SO4，0.1% Tween20，1M Betaine，1×SYBRGREEN，1.5mM dNTP，9U Bst DNA polymerase，9U逆转录酶，引物用量为：6 pmol F3和B3，48pmol FIP和BIP，12pmol LF和LB。
4.如权利要求1所述的检测方法与试剂盒，其特征在于，环介导等温扩增条件为：反应管置于54~68℃恒温反应15~45min，优选为63℃恒温反应30min。
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