CN113045654A

CN113045654A - 抗ox40抗体及其用途

Info

Publication number: CN113045654A
Application number: CN201911380303.XA
Authority: CN
Inventors: 张宏恺; 晋瑞娜; 王媛
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2021-06-29
Also published as: CN114630839A; TW202130661A; TWI841816B; WO2021129874A1; CN114630839B

Abstract

本发明涉及尤其是新型抗OX40抗体，包含所述抗OX40抗体的组合物，编码所述抗OX40抗体的核酸，制备所述抗OX40抗体的方法，和所述抗OX40抗体的用途。

Description

抗OX40抗体及其用途

技术领域

背景技术

具有实体肿瘤的患者中的抗肿瘤免疫应答已经通过使用生物制剂进行治疗而增强。例如，两种抗PD-1单克隆抗体：纳武单抗 (nivolumab)

和派姆单抗(pembrolizumab)

已在美国和欧盟批准用于治疗不可切除或转移性黑色素瘤和转移性非小细胞肺癌等疾病。使用这些药物治疗患者已经产生通过无进展存活期和/或总体存活期的改善而衡量的抗肿瘤应答。本领域仍然需要更多的癌症治疗产品和方法以补充现有标准护理。

PD-1和CTLA-4在T细胞激活过程中发挥免疫抑制作用，从而抑制T细胞对肿瘤细胞的免疫杀伤功能；因而针对这两个靶点的阻断性单克隆抗体可以解除这种免疫抑制，恢复T细胞抗肿瘤免疫功能。除了这样的抑制型免疫检查点分子之外，激活型免疫检查点分子正逐渐成为药物研发的新靶标。

激活型免疫检查点分子，主要指T细胞活化的共刺激信号分子-T 细胞共刺激受体，属于肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)家族，用于调节T细胞的增殖、激活和分化，包括 OX40、CD40、4-1BB和GITR等。

OX40受体，也称为CD134和TNFRSF4(肿瘤坏死因子受体超家族成员4)，是TNFR超家族受体的成员，其不在静息初始T细胞上组成型表达，与CD28不同。OX40是次级共刺激免疫检查点分子，在激活后24至72小时表达；其配体OX40L(也成为CD252、TNFSF4) 也不在静息抗原递呈细胞上表达，而是在其激活后表达。OX40的表达依赖于T细胞的完全激活。

OX40与其配体OX40L结合传递共刺激信号。OX40和OX40L 的相互作用能够在OX40的胞内区域内招募TNFR相关(TRAFs)分子，形成包含IKKα和IKKβ以及PI3k和PKB(Akt)的信号传导复合物；OX40还与TCR信号协同作用，通过未知机制增强细胞内Ca²⁺，从而增强NFAT入核。OX40可激活经典的NF-κB1途径或非经典的 NF-κB2途径、PI3k/PKB和NFAT途径，进而调控制T细胞分裂和存活的基因，以及促进细胞因子基因的转录以及细胞因子受体的表达，对于细胞存活至关重要。OX40信号传导会引起包括CTLA-4和Foxp3 的下调。

当OX40与其配体OX40L结合时，有助于提高免疫系统应答能力：1.增加效应T细胞和记忆T细胞的存活和扩增，增加细胞因子 (例如IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ)的分泌；2.降低调节性T细胞的免疫抑制活性，进一步放大T细胞活化效应。在肿瘤微环境中，免疫激活可导致OX40表达。可增强效应T细胞的活化和增殖，并抑制调节性T细胞，从而导致复杂的抗肿瘤免疫反应。目前在Clinical Trials 网站上已经可以检索到若干抗OX40抗体治疗癌症的临床项目。

本领域需要更多的新型抗OX40抗体以提供新的癌症治疗选择。

发明内容

本发明通过提供特异性结合和激活OX40的新型抗OX40抗体而满足了上述需要。

在一个方面，本发明提供了一种分离的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID NO:1所示重链CDR1结构域，SEQ ID NO:2所示重链CDR2结构域，和SEQ ID NO:3所示重链CDR3结构域的重链可变区；和具有SEQ ID NO:9所示轻链CDR1结构域，SEQ ID NO:10所示轻链CDR2结构域，和SEQ ID NO:11所示轻链CDR3 结构域的轻链可变区。

在一个方面，本发明提供了一种分离的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID NO:17所示重链CDR1结构域，SEQ ID NO:18所示重链CDR2结构域，和SEQ ID NO:19所示重链CDR3 结构域的重链可变区；和具有SEQ ID NO:25所示轻链CDR1结构域， SEQID NO:26所示轻链CDR2结构域，和SEQ ID NO:27所示轻链 CDR3结构域的轻链可变区。

在一个方面，本发明提供了一种分离的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含：具有SEQ ID NO:33所示重链CDR1结构域，SEQ ID NO:34所示重链CDR2结构域，和SEQ ID NO:35所示重链CDR3 结构域的重链可变区；和具有SEQ ID NO:41所示轻链CDR1结构域， SEQID NO:42所示轻链CDR2结构域，和SEQ ID NO:43所示轻链 CDR3结构域的轻链可变区。

在一个方面，本发明提供了一种抗体-药物缀合物，其包含本文所述的OX40抗体或其抗原结合片段和另外的治疗剂；优选地，所述抗OX40抗体或其抗原结合片段与所述另外的治疗剂通过接头连接。

在一个方面，本发明提供了一种核酸，其编码本文所述的抗OX40 抗体或其抗原结合片段。

在一个方面，本发明提供了一种表达载体，其包含本文所述的核酸。

在一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本文所述的核酸或本文所述的表达载体。

在一个方面，本发明提供了一种用于产生本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在适合于抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养本文所述的宿主细胞，和从培养基中回收表达的抗体或其抗原结合片段。

在一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，或本文所述的抗体-药物缀合物，或本文所述的核酸，或本文所述的表达载体，及药学上可接受的载体。

在一个方面，本发明提供了本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，或本文所述的抗体-药物缀合物，或本文所述的药物组合物，其用于治疗癌症。

在一个方面，本发明提供了一种用于治疗癌症的方法，其包括向需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，或本文所述的抗体-药物缀合物，或本文所述的药物组合物，从而治疗所述癌症。

在一个方面，本发明提供了本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，或本文所述的抗体-药物缀合物，或本文所述的药物组合物，在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

在一个方面，本发明提供了本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，或本文所述的抗体-药物缀合物，或本文所述的药物组合物，其用于下述一项或多项：抑制Treg功能(例如抑制Treg的遏制性功能)、杀死表达OX40的细胞(例如表达高水平OX40的细胞)、提高效应T细胞功能和/或提高记忆T细胞功能、降低肿瘤免疫、增强T 细胞功能和/或消减表达OX40的细胞。

在一个方面，本发明提供了本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，或本文所述的抗体-药物缀合物，或本文所述的药物组合物，在制备用于治疗下述一项或多项的药物中的用途：抑制Treg功能(例如抑制Treg的遏制性功能)、杀死表达OX40的细胞(例如表达高水平OX40的细胞)、提高效应T细胞功能和/或提高记忆T细胞功能、降低肿瘤免疫、增强T细胞功能和/或消减表达OX40的细胞。

在一个方面，本发明提供了一种药物组合，其包含本文所述的抗 OX40抗体或其抗原结合片段，或本文所述的抗体-药物缀合物，或本文所述的药物组合物，以及一种或多种另外的治疗剂。

在一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本文所述的抗 OX40抗体或其抗原结合片段，或本文所述的抗体-药物缀合物，或本文所述的药物组合物，优选其进一步包括给药装置。

附图说明

图1：500nM Fc-ILZ-OX40L刺激分选的 Jurkat/NF-KappaB-GFP+hOX40报告细胞系单克隆，流式细胞分析刺激后细胞GFP表达阳性率。

图2：Phage ELISA法检测噬菌体单克隆与OX40重组蛋白的结合，计算噬菌体对OX40和噬菌体对BSA的OD450nm的比值。

图3：转染4种scFv-Fc表达质粒的HEK293FT细胞培养上清加入或不加入交联二抗，刺激Jurkat/NF-κB-GFP+hOX40报告细胞，流式细胞分析细胞GFP阳性率。

图4：抗OX40抗体的聚集的分析。

图5：抗OX40抗体的体内抗肿瘤效力。抗OX40抗体相对于对照显著抑制肿瘤生长。

图6：抗OX40抗体的T细胞调节效果。抗OX40抗体相对于对照在脾和肿瘤中明显上调辅助CD4+ T细胞和细胞毒性CD8+ T细胞。

图7：交联和可溶性抗OX40抗体的剂量依赖性作用。

具体实施方式

在一个实施方式中，本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:4所示重链可变区，或与SEQ ID NO:4所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；和SEQ ID NO:12所示轻链可变区，或与SEQ ID NO:12所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、 86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区。

在一个实施方式中，本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:20所示重链可变区，或与SEQ ID NO:20所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；和SEQ ID NO:28所示轻链可变区，或与SEQ ID NO:28所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区。

在一个实施方式中，本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:36所示重链可变区，或与SEQ ID NO:36所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；和SEQ ID NO:44所示轻链可变区，或与SEQ ID NO:44所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区。

在一个实施方式，本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段进一步包含重链恒定区和轻链恒定区；优选地，所述重链恒定区为SEQ ID NO:5或21所示重链恒定区，或与SEQID NO:5或21所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链恒定区；和/或优选地，所述轻链恒定区为SEQ ID NO:13所示轻链恒定区，或与SEQ ID NO:13所示序列具有至少 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链恒定区。

在一个实施方式中，本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段进一步包含连接到所述重链可变区的重链信号肽和/或连接到所述轻链可变区的重链信号肽；优选地，所述重链信号肽为SEQ ID NO:6 所示重链信号肽，或与SEQ ID NO:6所示序列具有至少80％、81％、 82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链信号肽；和/或优选地，所述轻链信号肽为SEQID NO:14所示轻链信号肽，或与SEQ ID NO:14所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链信号肽。

在一个实施方式中，本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段为IgG抗体或其抗原结合片段，优选为IgG1抗体或其抗原结合片段。

在一个实施方式中，本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体或其抗原结合片段。

在一个实施方式中，本文所述的抗OX40抗原结合片段为Fab、 Fab'、F(ab')2、Fv、scFv或sdAb。

在一个方面，本发明提供了一种抗体-药物缀合物，其包含根据本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段和另外的治疗剂；优选地，所述抗OX40抗体或其抗原结合片段与所述另外的治疗剂通过接头连接。

在一个实施方式中，本文所述的核酸包含：

(a)SEQ ID NO:49所示重链可变区核苷酸编码序列和/或SEQ ID NO:51所示轻链可变区核苷酸编码序列；

(b)SEQ ID NO:53所示重链可变区核苷酸编码序列和/或SEQ ID NO:55所示轻链可变区核苷酸编码序列；或

(c)SEQ ID NO:57所示重链可变区核苷酸编码序列和/或SEQ ID NO:59所示轻链可变区核苷酸编码序列；

优选地，所述核酸进一步包含SEQ ID NO:50或54所示重链恒定区核苷酸编码序列和/或SEQ ID NO:52所示轻链恒定区核苷酸编码序列。

在一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本文所述的核酸或表达载体。

在一个方面，本文提供了一种用于产生本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在适合于抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养本文所述的宿主细胞，和从培养基中回收表达的抗体或其抗原结合片段。

在一个实施方式中，本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，或本文所述的抗体-药物缀合物，或本文所述的药物组合物用于治疗癌症。在一个实施方式中，所述癌症选自鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌，肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端黑素瘤、结节性黑素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病、水肿(例如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖、脑瘤和脑癌、以及头颈癌，及相关转移。

在一个方面，本发明提供了一种用于治疗癌症的方法，其包括向需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，或本文所述的抗体-药物缀合物，或本文所述的药物组合物，从而治疗所述癌症。在一个实施方式中，所述癌症选自鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌，肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端黑素瘤、结节性黑素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病、水肿(例如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖、脑瘤和脑癌、以及头颈癌，及相关转移。

在一个方面，本发明提供了本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，或本文所述的抗体-药物缀合物，或本文所述的药物组合物，在制备用于治疗癌症的药物中的用途。在一个实施方式中，所述癌症选自鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌 (包括胃肠癌和胃肠基质癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌，肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端黑素瘤、结节性黑素瘤、多发性骨髓瘤和 B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病、水肿(例如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖、脑瘤和脑癌、以及头颈癌，及相关转移。

在一个方面，本文提供了本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，或本文所述的抗体-药物缀合物，或本文所述的药物组合物用于下述一项或多项：抑制Treg功能(例如抑制Treg的遏制性功能)、杀死表达OX40的细胞(例如表达高水平OX40的细胞)、提高效应T细胞功能和/或提高记忆T细胞功能、降低肿瘤免疫、增强T细胞功能和/或消减表达OX40的细胞。

在一个方面，本文提供了本文所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，或本文所述的抗体-药物缀合物，或本文所述的药物组合物在制备用于治疗下述一项或多项的药物中的用途：抑制Treg功能(例如抑制Treg的遏制性功能)、杀死表达OX40的细胞(例如表达高水平OX40的细胞)、提高效应T细胞功能和/或提高记忆T细胞功能、降低肿瘤免疫、增强T细胞功能和/或消减表达OX40的细胞。

要理解，可以组合本文所述各个实施方式的一个、一些、或所有特性以形成本发明的其它实施方式。本发明的这些和其它方面对本领域技术人员会变得显而易见。通过下面的详述进一步描述本发明的这些和其它实施方式。

若当描述针对最大对映性比对时，两个序列中的核苷酸或氨基酸的序列是相同的，则两个多核苷酸或多肽序列被称为是“相同的”。两个序列之间的比较是通常通过于比较窗上比较所述序列而进行以识别及比较具有序列相似性的局部区域。如本文使用的“比较窗”是指具有至少约20个(通常30至约75或40至约50个)连续位置的区段，其中在两个序列经优化比对后，可将序列与具有相同数量连续位置的参考序列进行比较。

用于比较的序列的优化比对可使用生物信息学软件 (Inc.,Madison,WI)的套件中的程序，使用默认参数进行。此程序实施下列参考文献中描述的数种比对方案：Dayhoff,M.O.,1978,A model of evolutionarychange in proteins-Matrices for detectingdistant relationships.In Dayhoff,M.O.(编)Atlas of Protein Sequence andStructure,National Biomedical ResearchFoundation,Washington DC，第5 卷，增刊3，第345至358页；Hein J.,1990,UnifiedApproach to Alignment and Phylogenes，第626至645页，Methods in Enzymology，第183 卷，Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.及 Sharp,P.M.,1989,CABIOS 5:151-153；Myers,E.W.及Muller W.,1988,CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11:105； Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4:406-425；Sneath,P.H.A.及 Sokal,R.R.,1973,Numerical Taxonomythe Principles and Practice of NumericalTaxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.及 Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:726-730。

在一些实施方式中，“序列同一性的百分比”是通过在具有至少20 个位置的比较的窗上比较两个经优化比对的序列进行测定，其中比较窗中的多核苷酸或多肽序列的部分相较于针对两个序列的优化比对的参考序列(其不包含添加或删除)可包含20％或以下、通常5％至15％或10％至12％的添加或删除(即，间隙)。该百分比是通过以下计算：通过测定其中两个序列中均出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数量以产生具有匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以参考序列中的位置的总数量(即，窗尺寸)及使所述结果乘以100以产生序列同一性的百分比。

或者，变体亦可与天然基因或其的部分或补体基本上同源。这些多核苷酸变体可在中度严格的条件下与编码天然抗体(或互补序列)的天然生成的DNA序列杂交。

合适的“中度严格的条件”包括在5X SSC，0.5％SDS，1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中预洗；在50℃至65℃，5X SSC下杂交整夜；接着在65℃下清洗两次，历时20分钟，及每次清洗使用含有0.1％SDS 的2X、0.5X及0.2X SSC。

如本文使用，“高度严格的条件”或“高严格性条件”是那些下列者： (1)针对清洗采用低离子强度及高温，例如在50℃下用0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交期间采用变性剂，诸如甲酰胺，例如，具有在pH 6.5下的0.1％牛血清白蛋白/0.1％聚蔗糖/0.1％聚乙烯吡咯啶酮/50mM磷酸钠缓冲剂及在42℃下的 750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠的50％(v/v)甲酰胺；或(3)在42℃下采用50％甲酰胺、5X SSC(0.75MNaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5X Denhardt杂交溶液、经声处理的鲑鱼精子DNA(50μg/mL)、0.1％SDS及10％硫酸葡聚糖，及在42℃下于0.2X SSC(氯化钠/柠檬酸钠)及在55℃下于50％甲酰胺中清洗，接着在55℃下于由含有EDTA的0.1X SSC组成的高严格性清洗液中进行清洗。本领域技术人员将知晓为适应诸如探针长度及类似物的因素，如何任选地调节温度、离子强度等。

本领域普通技术人员将知晓由于遗传密码子的简并性，因此存在许多编码如本文描述的多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与具有任何天然基因的核苷酸序列具有最小同源性。然而，本发明具体预期因密码子使用中的差异而改变的多核苷酸。此外，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因是于本发明的范围内。等位基因是由于核苷酸的一个或更多个突变诸如删除、添加及/或取代而变化的内源性基因。所得mRNA及蛋白质可(但无需)具有经改变的结构或功能。等位基因可使用标准技术(诸如杂交、扩增及/或数据库序列比较)进行识别。

本发明的多核苷酸可使用化学合成、重组方法或PCR获得。化学多核苷酸合成的方法是本领域中熟知及本文中无需详细描述。本领域技术人员可使用本文提供的序列及市售DNA合成剂以产生所需 DNA序列。

就使用重组方法制备多核苷酸而言，可将包含所需序列的多核苷酸插入合适的载体内，及可将该载体进一步引入合适的宿主细胞内，以用于复制及扩增，如本文进一步讨论。多核苷酸可通过本领域中已知的任何方式插入宿主细胞内。细胞是通过直接摄取、内吞作用、转染、F-杂交或电穿孔以引入外源性多核苷酸而进行转化。一经引入，外源性多核苷酸可作为非整合性载体(诸如质粒)维持于细胞内或整合于宿主细胞基因体内。经如此扩增的多核苷酸可通过本领域内熟知的方法自宿主细胞分离。参见，例如，Sambrook等人，1989。

或者，PCR容许DNA序列的复制。。

RNA可通过在合适的载体中使用经分离的DNA及将其插入于合适的宿主细胞内获得。当细胞复制及将DNA转录成RNA时，该RNA 可然后使用本领域技术人员公知的方法进行分离。

合适的克隆及表达载体可包括各种组件，诸如启动子、增强子及其他转录调节序列。该载体亦可经构建以容许接着将抗体可变结构域克隆至不同载体内。

合适的克隆载体可根据标准技术进行构建或可选择自本领域中可获得的大量克隆载体。尽管所选克隆载体可根据预期使用的宿主细胞而改变，但有用的克隆载体将通常具有自我复制的能力，可具有针对特定限制核酸内切酶的单一靶及/或可携载针对可用于选择含有该载体的克隆中的标记物的基因。合适的实例包括质粒及细菌病毒，例如，pUC18、pUC19、Bluescript(例如，pBS SK+)及其衍生物，mp18、 mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA及穿梭载体(诸如pSA3及pAT28)。这些及许多其他克隆载体是可获得自商业供货商(诸如BioRad、Strategene及Invitrogen)。

进一步提供表达载体。表达载体通常是可复制多核苷酸构建体，其含有根据本发明的多核苷酸。其暗示表达载体必须于宿主细胞中可复制，以游离基因的形式或以染色体DNA的整体部分的形式。合适的表达载体包括(但不限于)质粒、病毒载体，其包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、黏质粒及揭示于PCT公开第WO 87/04462号中的表达载体。载体组件可通常包括(但不限于)下列中的一或更多者：信号序列；复制起点；一个或更多个标记基因；合适的转录控制组件 (诸如启动子、增强子及终止子)。就表达(即，翻译)而言，亦通常需一个或更多个转录控制组件，诸如核糖体结合位点、翻译起始位点及终止密码子。

含有目的多核苷酸的载体及/或所述多核苷酸本身可通过许多适当方式中的任何一者引入宿主细胞内，所述方式包括电穿孔、采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质的转染；微粒轰击 (microprojectile bombardment)；脂质转染；及感染(例如，其中该载体是感染剂，诸如痘疮病毒)。引入载体或多核苷酸的选择将通常取决于该宿主细胞的特征。

本发明的抗体包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的人抗体，例如利用转染入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体(在以下部分II中进一步介绍)、从重组组合人抗体文库分离的抗体(在以下部分 III中进一步介绍)、从人免疫球蛋白基因转基因动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如(Taylor，L.D.等(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295) 或者涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接为其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有人种系免疫球蛋白序列来源的可变区和恒定区(参见Kabat，E.A.，et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，FifthEdition， U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)。

可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链基因和重链基因，制备本发明的抗体或抗体部分。为了重组表达抗体，用一个或多个携带编码所述抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，使得所述轻链和重链在宿主细胞中表达，而且优选分泌入培养所述宿主细胞的培养基中，从该培养基中可回收所述抗体。标准重组DNA方法学用来获得抗体重链基因和抗体轻链基因，使这些基因导入重组表达载体中，然后使所述载体导入宿主细胞中，所述标准方法例如为以下文献介绍的方法：Sambrook，Fritsch和 Maniatis(编辑)，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第二版， Cold SpringHarbor，N.Y.，(1989)，Ausubel，F.M.等(编辑)CurrentProtocols in Molecuar Biology，Greene Publishing Associates， (1989)和Boss等的美国专利第4,816,397号。

抗体或其抗原结合片段可使用合适的宿主细胞重组制造。编码该抗体或其抗原结合片段的核酸可克隆至表达载体内，其可然后引入宿主细胞诸如大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、类人猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞内，其中该细胞不另外产生免疫球蛋白，以于重组宿主细胞中获得抗体的合成。在本领域熟知的许多细胞中，优选的宿主细胞包括CHO细胞、人类胚胎肾(HEK)293细胞或Sp2.0细胞。

抗体片段可通过重组方法或通过化学合成由全长抗体的蛋白质水解或其他降解产生。抗体的多肽片段(尤其多达约50个氨基酸的较短多肽)可通过化学合成便利地制成。用于蛋白质及肽的化学合成的方法是本领域中已知及是可购买获得。

本发明的抗体或其抗原结合片段可经亲和力成熟。例如，经亲和力成熟的抗体可由本领域中已知的程序(Marks等人，1992,Bio/Technology,10:779-783；Barbas等人，1994,Proc Nat.Acad.Sci,USA 91:3809-3813；Schier等人，1995,Gene,169:147-155；Yelton等人，1995,J.Immunol.,155:1994-2004；Jackson等人， 1995,J.Immunol.,154(7):3310-9；Hawkins等人， 1992,J.Mol.Biol.,226:889-896；及WO2004/058184)产生。

抗体变体

在某些实施方式中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除，和/或插入和/或替代。可以进行删除，插入，和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如，抗原结合。

a)替代，插入，和删除变体

在某些实施方式中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表A中在" 优选的替代"的标题下显示。更实质的变化在表A中在"例示性替代" 的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。

表A

初始残基	例示性替代	优选的替代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Asp，Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu；Asn	Glu
			Cys(C)	Ser；Ala	Ser
Gln(Q)	Asn；Glu	Asn
			Glu(E)	Asp；Gln	Asp
Gly(G)	Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸	Leu
			Leu(L)	正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Tyr
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Val；Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸	Leu

依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：

(1)疏水性的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，IIe；

(2)中性，亲水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gin；

(3)酸性的：Asp，Glu；

(4)碱性的：His，Lys，Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；

(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。

非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。

一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力，降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。

可以对HVR做出变化(例如，替代)，例如以改善抗体亲和力。可以对HVR"热点"，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(见例如Chowdhury，Methods Mol.Biol. 207:179-196(2008))，和/或接触抗原的残基做出此类变化，其中对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom等，于Methods in Molecular Biology 178:l_37(0'Brien等编，Human Press，Totowa， NJ，(2001))。在亲和力成熟的一些实施方式中，通过多种方法(例如，易错PCR，链改组，或寡核苷酸指导的诱变)将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的方法，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的 HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。

在某些实施方式中，可以在一个或多个HVR内发生替代，插入，或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对HVR做出保守变化(例如，保守替代，如本文中提供的)，其不实质性降低结合亲和力。例如，此类变化可以在HVR中的抗原接触残基以外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方式中，每个HVR是未改变的，或者含有不超过1，2或3处氨基酸替代。

一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作"丙氨酸扫描诱变"，如由Cunningham和Wells(1989)Science, 244:1081-1085所描述的。在此方法中，将残基或靶残基的组(例如，带电荷的残基诸如arg，asp，his，lys，和glu)鉴定，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。

氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。

b)糖基化变体

在某些实施方式中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。

在抗体包含Fc区的情况中，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的，双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。见例如Wright等， TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，半乳糖，和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构"主干"中的GIcNAc的岩藻糖。在一些实施方式中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。

在一个实施方式中，提供了抗体变体，其具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1％至80％，1％至65％，5％至65％或20％至40％。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如，复合的，杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO 2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fe区残基的 Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294 位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。见例如美国专利公开文本No.US 2003/0157108(Presta，L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及"脱岩藻糖基化的" 或"岩藻糖缺乏的"抗体变体的出版物的例子包括:US 2003/0157108；W0 2000/61739；W0 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US2004/0110704； US 2004/0110282；US 2004/0109865；W0 2003/085119；W0 2003/084570；W0 2005/035586；TO 2005/035778；TO2005/053742；TO2002/031140；0kazaki等，J.Mol.Biol. 336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等, Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的LecI 3 C H O细胞(Ripka等， Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请No US 2003/0157108A1，Presta，L；及WO 2004/056312A1，Adams等)，和敲除细胞系，诸如α-l，6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞 (见例如Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng·87:614(2004)；Kanda， Y.等，Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；及W02003/085107)。

进一步提供了具有两分型寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体 Fc区的双触角寡糖是通过GIcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利No.6，602，684(Umana等)；及US 2005/0123546(Umana等)。还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju，S.)；及WO 1999/22764(Raju，S·)。

c)Fc区变体

在某些实施方式中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如，人IgGl，IgG2，IgG3或IgG4Fc区)。

在某些实施方式中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体和ADCC) 是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认 CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达 FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和 Kinet,Annu.Rev.Tmmunol·9:457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No.5,500,362(见例如 Hellstrom,I·等，Proc.Nat'I Acad.Sci USA 83:7059-7063(1986))和 Hellstrom，I等，Proc.Nat'I Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5，821， 337(见Bruggemann，Μ·等，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(见例如用于流式细胞术的ACT I^TM非放射性细胞毒性测定法(Cell Technology，Inc.Mountain View，CA；和CytoTox96非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison，WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC 活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes等，Proc Nat'I Acad Sci USA 95:652-656(1998)的。也可以实施Clq结合测定法以确认抗体不能结合Clq，并且因此缺乏CDC活性。见例如WO 2006/029879和 WO 2005/100402中的Clq和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法(见例如Gazzano-Santoro等，J·Immunol. Methods 202:163(1996)；Cragg，ΜS.等，Blood 101:1045-1052(2003)；及Cragg，Μ·S·和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定 (见例如Petkova，S.B.等，Int'I.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。

具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238，265， 269，270，297，327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No. 6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265，269，270，297 和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297 替代成丙氨酸的所谓的"DANA"Fc突变体(美国专利No.7，332，581)。

描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(见例如美国专利No.6,737,056；WO 2004/056312,及Shields等， J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。

在某些实施方式中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区的位置298,333,和/或334(残基的EU编号方式)的替代的Fc区。

在一些实施方式中，对Fc区做出改变，其导致改变的(即，改善的或降低的)Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No.6,194,551，WO 99/51642，及Idusogie等， J.Tmmunol·164:4178-4184(2000)的。

具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)，新生儿Fc受体(FcRn) 负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等，J.Immunol·117:587(1976) 及Kim等J.Immunol·24:249(1994))。那些抗体包含其中具有改善 Fc区对FcRn结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238,256，265,272,286,303,305,307,311,312,317,340, 356,360,362,376,378,380,382,413,424或434中的一处或多处具有替代，例如，Fc区残基434的替代的(美国专利No.7,371,826)。

还可见Duncan和Winter，Nature 322:738-40(1988)；美国专利No 5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO 94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。

d)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体

在某些实施方式中，可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如，"thioMAb"，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方式中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块缀合，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方式中，可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个:轻链的 V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。

e)抗体衍生物

在某些实施方式中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，右旋糖苷，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊环，聚-1，3， 6-三口恶烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)，和右旋糖苷或聚(η-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能，抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。

在另一个实施方式中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方式中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，并且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。

测定法

可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗OX40抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。

1.结合测定法和其它测定法

一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA，Western印迹，等来进行。可使用本领域已知方法来测定OX40结合，本文中公开了例示性方法。在一个实施方式中，使用放射免疫测定法测量结合。例示了一种例示性放射免疫测定法。将OX40抗体碘化，并制备含有固定浓度的碘化抗体和递减浓度的连续稀释的未标记OX40抗体的竞争反应混合物。将表达OX40的细胞 (例如经人OX40稳定转染的BT474细胞)添加至反应混合物。温育后，清洗细胞将游离的碘化OX40抗体与结合至细胞的OX40抗体分开。测定结合的碘化OX40抗体的水平，例如通过对与细胞联合的放射性计数来进行，并使用标准方法测定结合亲和力。在另一个实施方式中，使用流式细胞术评估OX40抗体结合表面表达的OX40(例如在 T细胞子集上)的能力。获得外周白血球(例如来自人，食蟹猴，大鼠或小鼠)，并用血清封闭细胞。以连续稀释液添加经标记的OX40抗体，还对T细胞染色以鉴定T细胞子集(使用本领域已知方法)。样品温育和清洗后，使用流式细胞仪分选细胞，并使用本领域公知方法分析数据。在另一个实施方式中，可使用表面等离振子共振来分析 OX40结合。例示了一种例示性表面等离振子共振方法。

另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与本文中公开的任何抗 OX40抗体竞争对OX40的结合的抗体。在某些实施方式中，此类竞争性抗体结合与本文中公开的任何抗OX40抗体所结合表位相同的表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法见Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”，Methods in Molecular Biologyvol.66(Humana Press，Totowa，NJ)。例示了一种竞争测定法。

在一种例示性竞争测定法中，在包含第一经标记抗体(其结合 OX，例如mab1A7.gr.1，mab 3C8.gr5)和第二未标记抗体(其要测试与第一抗体竞争对OX40的结合的能力)的溶液中温育固定化OX40。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一经标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定化OX40。在允许第一抗体结合OX40的条件下温育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定化OX40联合的标记物的量。如果测试样品中与固定化OX40联合的标记物的量与对照样品相比实质性降低，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对OX40的结合。参见Harlow and Lane(1988) Antibodies:ALaboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,NY)。

2.活性测定法

一方面，提供用于鉴定具有生物学活性的抗OX40抗体的测定法。生物学活性可以包括例如结合OX40(例如结合人和/或食蟹猴OX40)，提高OX40介导的信号转导(例如提高NFkB介导的转录)，消减表达人OX40的细胞(例如T细胞)，通过ADCC和/或吞噬消减表达人OX40的细胞，增强T效应细胞功能(例如CD4+效应T细胞)(例如通过提高效应T细胞增殖和/或提高效应T细胞的细胞因子生成(例如γ干扰素))，增强记忆T细胞功能(例如CD4+记忆T细胞)(例如通过提高记忆T细胞增殖和/或提高记忆T细胞的细胞因子生成(例如γ干扰素))，抑制调节T细胞功能(例如通过降低效应T细胞功能(例如CD4+效应T细胞功能))的Treg遏制)，结合人效应细胞。还提供在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。

在某些实施方式中，对本发明的抗体测试此类生物学活性。

可以使用本领域已知的方法来测定T细胞共刺激，而且本文中公开了例示性方法。例如，可以自外周白血球获得T细胞(例如记忆或效应T细胞)(例如使用Ficoll梯度离心自人全血分离)。可以使用本领域已知的方法自PBMC分离记忆T细胞(例如CD4+记忆T细胞) 或效应T细胞(例如CD4+Teff细胞)。例如，可以使用MiItenyiCD4+ 记忆T细胞分离试剂盒或Miltenyi幼稚CD4+T细胞分离试剂盒。在抗原呈递细胞(例如经过照射的表达CD32和CD80的L细胞)存在下培养分离的T细胞，并通过在OX40激动性抗体存在或缺失下添加抗 CD3抗体来活化。可以使用本领域公知的方法来测量激动性OX40抗体对T细胞增殖的影响。例如，可以使用Cell Titer Glo试剂盒 (Promega)，并在多标记物读数仪(Perkin Elmer)上读取结果。还可以通过分析由T细胞生成的细胞因子来测定激动性OX40抗体对T细胞功能的影响。在一个实施方式中，测定CD4+T细胞的干扰素γ生成，例如通过测量细胞培养物上清液中的干扰素γ。用于测量干扰素γ的方法是本领域公知的。

可以使用本领域已知的方法来测定Treg细胞功能，而且本文中公开了例示性方法。在一个例子中，测定Treg遏制效应T细胞增殖的能力。使用本领域已知的方法自人全血分离T细胞(例如分离记忆 T细胞或幼稚T细胞)。标记纯化后的CD4+幼稚T细胞(例如用CFSE)，并用不同试剂标记纯化后的Treg细胞。将经过照射的抗原呈递细胞 (例如表达CD32和CD80的L细胞)与经过标记的纯化后的幼稚 CD4+Τ细胞和纯化后的Treg共培养。使用抗CD3抗体活化共培养物，并在激动性OMO抗体存在或缺失下测试。合适时间(例如共培养6天)后，使用FACS分析通过降低的标记物染色(例如降低的CFSE标记物染色)中的染料稀释来跟踪CD4+幼稚T细胞增殖的水平。

可以使用本领域公知的方法来测定OX40信号传导，而且本文中公开了例示性方法。在一个实施方式中，生成表达人OX40和报告基因(包含融合至报告基因(例如β萤光素酶)的NFkB启动子)的转基因细胞。对细胞添加OX40激动性抗体导致NFkB转录升高，这使用针对报告基因的测定法来检测。

可以例如通过使用单核细胞衍生的巨噬细胞或U937细胞(一种具有成熟巨噬细胞的形态和特征的人组织细胞性淋巴瘤细胞系)来测定吞噬作用。在抗OX40激动性抗体存在或缺失下将表达OX40的细胞添加至单核细胞衍生的巨噬细胞或U937细胞。将细胞培养合适时间段后，通过检查针对1)巨噬细胞或U937细胞和2)表达OX40的细胞的标志物双重染色的细胞的百分比，并将此除以显示表达OX40的细胞的标志物(例如GFP)的细胞的总数来测定吞噬百分比。可以通过流式细胞术来进行分析。在另一个实施方式中，可以通过荧光显微术分析来进行分析。

可以例如使用本领域公知的方法测定ADCC。定义部分中描述了例示性方法。在一些实施方式中，表征在ADCC测定法中用于测试的表达OX40的细胞上的OX40水平。将细胞用可检测标记的抗OX40 抗体(例如PE标记的)染色，然后使用流式细胞术测定荧光水平，并以中值荧光强度(MFI)呈现结果。在另一个实施方式中，可以通过 CellTiter Glo测定法试剂盒来分析ADCC，而且可以通过化学发光来测定细胞存活力/细胞毒性。

可以使用相应重组Fcγ受体在基于ELISA的配体结合测定法中测量各种抗体对FcγRIA，FcγRIIA，FcγRIIB，和FcγRIIIA的两种同种异型(F158和V158)的结合亲和力。以含有连接至C端Gly/6xHis/ 谷胱甘肽S-转移酶(GST)多肽标签的受体γ链胞外域的融合蛋白表达纯化后的人Fcγ受体。如下测定抗体对那些人Fcγ受体的结合亲和力。对于低亲和力受体，即FcγRIIA(CD32A)，FcγRIIB(CD32B)，和 FeγRIIIA(CD16)的两种同种异型，F-158和V-158,可以通过用山羊抗人卡帕链的F(ab')2片段(ICN Biomedical；Irvine，CA)交联(以近似摩尔比1:3抗体：交联用F(ab')2)作为多聚体测试抗体。将板用抗GST 抗体(Genentech)包被，并用牛血清清蛋白(BSA)封闭。用含有 0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲盐水(PBS)及ELx405^TM洗板仪(Biotek Instruments；Winooski，VT)清洗后，以25ng/孔将Fcγ受体添加至板，并于室温温育1小时。清洗板后，作为多聚体复合物添加测试抗体的系列稀释液，并将板于室温温育2小时。清洗板以去除未结合的抗体后，用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗人F(ab')2的F(ab')2片段 (Jackson ImmunoResearch Laboratories；WestGrove，PA)检测结合至 Fcγ受体的抗体，接着添加底物，四甲基联苯胺(TMB)(Kirkegaardand Perry Laboratories；Gaithersburg，MD)。取决于所测试的Fcγ受体，将板于室温温育5-20分钟以容许显色。用IM H3PO4终止反应，并用微量板读数仪(

190，Molecular Devices；Sunnyvale，CA) 测量450nm处的吸光度。通过将来自一式两份抗体稀释液的均值吸光值针对抗体浓度绘图，生成剂量-响应结合曲线。使用SoftMax 190(Molecular Devices)用四参数方程拟合结合曲线后确定检测到来自结合Fcγ受体的最大响应50％时的有效抗体浓度的值(EC50)。

为了选择诱导细胞死亡的抗体，可相对于对照评估通过例如碘化丙啶(PI)，锥虫蓝或7AAD摄取显示的膜完整性丧失。PI摄取测定法可在补体和免疫效应细胞缺失下实施。在单独的培养基或含有浓度为例如约10μg/ml的适宜单克隆抗体的培养基中温育表达OX40的细胞。将细胞温育某个时段(例如1或3天)。每次处理后，将细胞清洗并等分。在一些实施方式中，将细胞等分到35mm盖有滤网 (strainer-capped)的12x75管中(每管1ml，每个处理组3管)以除去细胞团块。然后向管中加入PI(10μg/ml)。可以使用FACSCAN^TM流式细胞仪和FACSCONVERT^TM CellQuest软件(Becton Dickinson)分析样品。

供任何上述体外测定法使用的细胞包括天然表达OX40或经改造而表达OX40的细胞或细胞系。此类细胞包括天然表达OX40的活化后的T细胞，Treg细胞和活化后的记忆T细胞。此类细胞还包括表达OX40的细胞系和并非正常情况下表达OX40但已经用编码OX40 的核酸转染的细胞系。本文中提供的供任何上述体外测定法使用的例示性细胞系包括表达人OX40的转基因BT474细胞(一种人乳腺癌细胞系)。

理解的是，可以使用本发明的免疫缀合物替换或补充抗OX40抗体来进行任何上述测定法。

理解的是，可以使用抗OX40抗体和别的治疗剂来进行任何上述测定法。

配方及用途

本发明的抗体或其抗原结合片段可调配成药物组合物。该药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂及/或稳定剂 (Remington:The Science and practiceofPharmacy，第20版， 2000,Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover)，以冻干配方或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在剂量及浓度下对接受者是无毒的，及可包含缓冲剂诸如磷酸、柠檬酸及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六羟季铵；杀藻胺；氯化本索宁；酚醇、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(小于约 10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单醣、二醣及其他醣，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属络合物(例如， Zn-蛋白质络合物)；及/或非离子型表面活性剂，诸如TWEEN^TM、 PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。本文进一步描述药学上可接受的赋形剂。

本发明的抗体或其抗原结合片段可用于各种治疗或诊断目的。例如，本发明的抗体或其抗原结合片段可用作亲和力纯化剂(例如，用于活体外纯化)；用作诊断剂(例如，用于检测特异性细胞、组织或血清中的表达)。

本发明的抗体或其抗原结合片段的例示性治疗用途包括治疗癌症。本发明的抗体或其抗原结合片段亦可用于预防性治疗。

就治疗应用而言，本发明的抗体或其抗原结合片段可通过常规技术向哺乳动物、尤其人类施用，所述技术诸如静脉内(作为推注或通过经时的连续输注)、肌内、腹腔内、脑内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、经口、局部或通过吸入。本发明的抗体或其抗原结合片段亦可适当通过肿瘤内、肿瘤周围、病灶内或病灶周围途径施用。

在某些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段是经皮下施用。在某些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段是经静脉内施用。

药物组合物可以可随疾病的严重性变化的频率向有此需要的受试者施用。在预防治疗的情况下，该频率可取决于该受试者疾病的易发性或倾向而变化。

所述组合物可作为推注或通过连续输注向有此需要的患者施用。例如，以Fab片段呈现的抗体的推注施用可以自0.0025至100mg/kg 体重、0.025至0.25mg/kg、0.010至0.10mg/kg或0.10至0.50mg/kg 的量进行施用。就连续输注而言，以Fab片段呈现的抗体可以0.001 至100mg/kg体重/分钟、0.0125至1.25mg/kg/min、0.010至 0.75mg/kg/min、0.010至1.0mg/kg/min或0.10至0.50mg/kg/min的量施用，持续1至24小时、1至12小时、2至12小时、6至12小时、 2至8小时或1至2小时。

就以全长抗体(具有完整恒定区)呈现的抗体的施用而言，剂量可为自约1mg/kg至约10mg/kg、自约2mg/kg至约10mg/kg、自约3mg/kg 至约10mg/kg、自约4mg/kg至约10mg/kg、自约5mg/kg至约10mg/kg、自约1mg/kg至约20mg/kg、自约2mg/kg至约20mg/kg、自约3mg/kg至约20mg/kg、自约4mg/kg至约20mg/kg、自约5mg/kg至约20mg/kg、约1mg/kg或更多、约2mg/kg或更多、约3mg/kg或更多、约4mg/kg 或更多、约5mg/kg或更多、约6mg/kg或更多、约7mg/kg或更多、约8mg/kg或更多、约9mg/kg或更多、约10mg/kg或更多、约11mg/kg 或更多、约12mg/kg或更多、约13mg/kg或更多、约14mg/kg或更多、约15mg/kg或更多、约16mg/kg或更多、约17mg/kg或更多、约19mg/kg 或更多或约20mg/kg或更多。施用的频率将取决于病症的严重性。频率可在自每周三次至每两周或三周一次的范围内变化。

另外，所述组合物可经由皮下注射向患者施用。例如，1至100mg 抗OX40抗体的剂量可经由皮下或静脉内注射以一周两次、一周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每十周一次、一个月两次、一个月一次、每两个月一次或每三个月一次的频率向患者施用。

在某些实施方式中，抗OX40抗体于人类中的半衰期是约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19 天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约 26天、约27天、约28天、约29天、约30天、自约5天至约40天、自约5天至约35天、自约5天至约30天、自约5天至约25天、自约10天至约40天、自约10天至约35天、自约10天至约30天、自约10天至约25天、自约15天至约40天、自约15天至约35天、自约15天至约30天、或自约15天至约25天。

在某些实施方式中，该药物组合物是以以下的剂量每2至6周进行皮下或静脉内施用：自约0.1mg/kg至约10mg/kg、自约0.5mg/kg 至约10mg/kg、自约1mg/kg至约10mg/kg、自约1.5mg/kg至约10mg/kg、自约2mg/kg至约10mg/kg、自约0.1mg/kg至约8mg/kg、自约0.5mg/kg 至约8mg/kg、自约1mg/kg至约8mg/kg、自约1.5mg/kg至约8mg/kg、自约2mg/kg至约8mg/kg、自约0.1mg/kg至约5mg/kg、自约0.5mg/kg 至约5mg/kg、自约1mg/kg至约5mg/kg、自约1.5mg/kg至约5mg/kg、自约2mg/kg至约5mg/kg、约0.5mg/kg、约1.0mg/kg、约1.5mg/kg、约2.0mg/kg、约2.5mg/kg、约3.0mg/kg、约3.5mg/kg、约4.0mg/kg、约4.5mg/kg、约5.0mg/kg、约5.5mg/kg、约6.0mg/kg、约6.5mg/kg、约7.0mg/kg、约7.5mg/kg、约8.0mg/kg、约8.5mg/kg、约9.0mg/kg、约9.5mg/kg或约10.0mg/kg。

在某些实施方式中，该药物组合物是以约2.0mg/kg的剂量每2 至6周进行皮下注射或静脉内施用。在某些实施方式中，该药物组合物是以自约2.0mg/kg至约10.0mg/kg的剂量每2至6周进行皮下注射或静脉内施用。

在一个例示性实施方式中，药物组合物是每2周皮下施用。

本发明的抗体或其抗原结合片段可用作单药疗法或与其他疗法组合以治疗癌症。

定义

除非本文另有定义，否则结合本发明使用的科学及技术术语应具有本领域普通技术人员通常所了解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数及复数术语应包括单数。通常，结合本文描述的细胞及组织培养物、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白质及核酸化学及杂交使用的术语表及技术是那些本领域中熟知及常用者。

抗体的“抗原结合片段”是指全长抗体的保留特异性结合至抗原的能力的片段(优选地，具有基本上相同的结合亲和力)。抗原结合片段的实例包括(i)Fab片段，其为由VL、VH、CL及CH1域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其为包含于铰链区通过双硫键连接的两个 Fab片段的二价片段；(iii)由VH及CH1域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL及VH域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人， (1989)Nature 341:544-546)，其由VH域组成；及(vi)经分离的互补决定区(CDR)、经双硫键连接的Fvs(dsFv)及抗-特应(抗-Id)抗体及胞内抗体。此外，尽管Fv片段的两个域(VL及VH)是由不同基因编码，但其可使用重组方法通过合成连接体连接，该合成连接体使得其被制成单一蛋白链，其中VL及VH区配对以形成单价分子(称为单链 Fv(scFv))；参见例如，Bird等人Science 242:423-426(1988)及Huston 等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。单链抗体的其他形式(诸如双抗体)亦包含于本发明中。双抗体是二价双特异性抗体，其中VH及VL域是表达于单一多肽链上，但使用太短以致于无法容许在相同链上的两个链之间配对的连接体，藉此迫使所述域与另一链的互补域配对，及产生两个抗原-结合位点(参见例如，Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)；Poljak等人， 1994,Structure 2:1121-1123)。

抗体“可变域”是指抗体轻链(VL)的可变区或抗体重链(VH)的可变区，单独或组合。如本领域中已知，重链及轻链的可变区各由三个互补决定区(CDR)组成，及由四个框架区(FR)连接，及有助于抗体的抗原结合位点的形成。

可变域中的残基是根据Kabat编号，Kabat是用于抗体的编译的重链可变域或轻链可变域的编号系统。参见Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD.(1991))。使用此编号系统，实际直链氨基酸序列可含有较少或额外的氨基酸，其对应于可变域的FR或CDR的缩短或插入。对于给定抗体，残基的Kabat编号可通过于该抗体的序列与“标准”Kabat编号的序列具有同源性的区域的比对来测定。用于分配Kabat编号的各种算法是可获得的。除非本文另有说明，否则本文使用2012年发布的Abysis(www.abysis.org)中执行的算法将Kabat编号分配至可变区。

抗体中的具体氨基酸残基位置(诸如互补位残基)是亦根据Kabat 编号。

“互补决定区”(CDR)可根据本领域中熟知的Kabat、Chothia、Kabat 及Chothia两者的聚集、AbM、接触(contact)及/或构形定义或CDR测定的任何方法的定义加以识别。参见例如Kabat等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版(高度可变区)；Chothia 等人，1989,Nature 342:877-883(结构性环结构)。CDR的AbM定义是在Kabat与Chothia之间折衷及使用Oxford Molecular的AbM抗体建模软件CDR的“接触”定义是基于阐述于MacCallum等人， 1996,J.Mol.Biol.,262:732-745中的可见抗原接触。CDR的“构象”定义是基于制造有助于抗原结合的焓的残基(参见，例如，Makabe等人， 2008,Journal of Biological Chemistry,283:1156-1166)。又其他CDR边界定义可非严格遵守上文方法中的一者，但虽然如此仍将与Kabat CDR的至少一部分重叠，然而其可根据特定残基或残基组或甚至全部 CDR不显著影响抗原结合的预测或实验发现而经缩短或延长。如本文使用，CDR可是指通过本领域中已知的任何方法(包括方法的组合)定义的CDR。

“抗原决定基”是指抗原(Ag)中抗体特异性结合的范围或区域，例如，包含与该抗体(Ab)相互作用的氨基酸残基的范围或区域。抗原决定基可为直链或非直链(例如，构象)的。

当相应的抗体或其抗原结合片段的结合呈互相排外性时，抗体或其抗原结合片段基本上结合与另一抗体或其抗原结合片段相同的抗原决定基。即，一种抗体或其抗原结合片段的结合排除其他抗体或其抗原结合片段的同时或连续结合。若该抗原可适应两种相应的抗体或其抗原结合片段的同时结合，则认为抗原决定基是独一无二的或不是实质性地相同。

术语“互补位”是通过扭转角度衍生自“抗原决定基”的上文定义，及是指抗体分子中涉及抗原结合的范围或区域，例如，包含与该抗原相互作用的残基的范围或区域。互补位可为直链或构象的(诸如CDR 中的不连续残基)。

给定抗体/抗原结合对的抗原决定基/互补位可使用各种实验及计算抗原决定基定位方法在不同细节层次下经定义及特征分析。实验方法包括诱变、X射线晶体学、核磁共振(NMR)光谱学、氢/氘交换质谱法(HX-MS)及各种竞争结合方法。因为各方法依赖于独一无二的原则，所以抗原决定基的描述是与已测定该抗原决定基的方法紧密联系。因此，给定抗体/抗原对的抗原决定基/互补位将取决于采用的定位方法而不同地定义。

在其最细节层次下，用于抗体(Ab)与抗原(Ag)间相互作用的抗原决定基/互补位可通过界定存在于Ag-Ab相互作用中的原子接触的空间坐标及有关其对结合热力学的相对贡献的信息进行定义。在一种程度下，抗原决定基/互补位残基可通过界定Ag与Ab间原子接触的空间坐标进行特征分析。在一个方面，该抗原决定基/互补位残基可通过特定标准，例如Ab及Ag中原子间的距离(例如，距同源抗体的重原子及该抗原的重原子等于或小于约界定。在另一方面，抗原决定基/ 互补位残基的特征为参与与同源抗体/抗原，或与亦经氢结合至同源抗体/抗体(经水介导的氢结合)的水分子的氢键相互作用。在另一方面，抗原决定基/互补位残基的特征为与同源抗体/抗原的残基形成盐桥。在又另一方面，抗原决定基/互补位残基的特征可为因与同源抗体/抗原的相互作用而于掩蔽表面积(BSA)中具有非零变化的残基。在较为不详细的程度下，抗原决定基/互补位可通过函数进行特征描述，例如，通过与其他Ab的竞争结合。该抗原决定基/互补位亦可更一般地定义为包含氨基酸残基，其中通过另一氨基酸的取代将变更于Ab与Ag 之间的相互作用的特征(例如，丙氨酸扫描)。

自抗原决定基的描述及定义依赖于所用抗原决定基作图 (mapping)方法及在不同细节层次下获得的事实，推断于相同Ag上不同Ab的抗原决定基的比较可在不同细节层次下类似地进行。例如，于氨基酸层面描述，例如自X射线结构测定的抗原决定基，若其含有相同氨基酸残基组，则认为其是相同的。若相应抗体的结合是相互排他性的，即，一种抗体的结合排除其他抗体的同时或连续结合，则认为以竞争结合为特征的抗原决定基为重叠的；及若该抗原可适应两个相应抗体同时结合，则认为抗原决定基是各别(独特)的。

给定抗体/抗原对的抗原决定基及互补位可通过例行方法鉴别。例如，抗原决定基的一般位置可通过评估抗体结合至不同片段或变体多肽的能力测定，如本文先前更充分地描述。可与抗体内的特异性残基接触的OX40内的特异性残基亦可使用例行方法测定。例如，抗体/ 抗原复合体可经结晶。该晶体结构可经测定及用以鉴别在抗体与抗原之间相互作用的特异性位点。

术语“特异性结合”是本领域中熟知的术语，且本领域中亦熟知用以测定这些特异性结合的方法。若分子与特定细胞或物质反应或结合比该分子与替代细胞或物质反应或结合更频繁、更快速、更久持续时间及/或更大亲和力，则认为该分子显示“特异性结合”。若抗体或其抗原结合片段结合靶相较于结合其他物质以更大亲和力、结合性、更容易及/或更久持续时间，则该抗体或其抗原结合片段“特异性结合”至靶。

例如，特异性结合OX40的抗体或其抗原结合片段是抗体结合其同源抗原相较于结合其他抗原，以更大亲和力、结合性、更容易及/ 或更久持续时间。例如，在标准结合分析条件下，抗OX40抗体可特异性结合样本中的人类OX40，但基本上不识别或结合该样本中的其他分子。亦了解特异性结合第一靶的抗体或其抗原结合片段可或可不特异性结合至第二靶。因此，“特异性结合”不一定要求(虽然其可包括) 排他性结合。通常，但未必，“结合”的提及意谓特异性结合。

可使用各种分析模式以选择特异性结合目的分子的抗体或其抗原结合片段。例如，在许多测定中，固相ELISA免疫测定、免疫沈淀、Biacore^TM(GE Healthcare)、KinExA、荧光活化的细胞分选(FACS)、 Octet^TM(FortéBio,Inc.)及Western印迹分析可用以识别特异性结合抗原的抗体或其抗原结合片段。通常，特异性结合将是背景信号或噪音的至少两倍，更通常是背景的至少10倍、背景的至少50倍、背景的至少100倍、背景的至少500倍、背景的至少1000倍或背景的至少10,000 倍。

抗体结合的特异性可通过测定抗体与OX40之间的特异性结合的 K_D值及比较该K_D值与已知不结合至OX40的对照抗体的K_D值来评估。一般而言，当该K_D是约×10^-5M或更小时，认为抗体”、“特异性”结合抗原。

当相较于抗体或其抗原结合片段结合其他抗原，该抗体或其抗原结合片段不以更大亲和力、结合性、更容易及/或以更久持续时间结合至一抗原时，该抗体或其抗原结合片段“基本上不结合”至该抗原。通常，该结合将不大于背景信号或噪音的两倍。一般而言，其以1×10^-4M 或更大、1×10^-3M或更大、1×10^-2M或更大或1×10^-1M或更大的K_D结合该抗原。

如本文关于抗体使用的术语“竞争”意谓第一抗体或其抗原-结合部分结合至抗原减少后续第二抗体或其抗原-结合部分对相同抗原的结合。一般而言，第一抗体的结合产生空间位阻、构象变化或结合至共同抗原决定基(或其部分)，使得第二抗体对相同抗原的结合是减少。可使用标准竞争性结合分析以判定两种抗体是否相互竞争。

用于抗体竞争的一种合适的分析涉及使用Biacore技术，该技术可使用表面等离子共振(SPR)技术，通常使用生物传感器系统(诸如系统)测量相互作用的程度。例如，SPR可用于活体外竞争性结合抑制分析中以测定一种抗体抑制第二抗体的结合的能力。用于测量抗体竞争的另一分析使用基于ELISA的方法。此外，一种基于抗体的竞争来“分级”抗体的高通量方法是描述于WO2003/48731中。若一种抗体或其抗原结合片段减少另一抗体或其抗原结合片段对OX40的结合，则存在竞争。例如，可使用顺序结合竞争分析，及顺序添加不同抗体。可添加第一抗体以达成接近饱和的结合。然后，添加第二抗体。若第二抗体对OX40的结合无法检测到或相较于在缺乏该第一抗体的情况下(其中值可设定为100％)的平行分析是显著减少(例如，至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％减少)，则所述两个抗体视为互相竞争。

亦可进行竞争性结合分析，其中抗体对抗原的结合是相较于靶对具该靶的另一结合配偶体(诸如原本结合该靶的另一抗体或可溶受体) 的结合。50％抑制发生时的浓度被称为K_i。在理想条件下，该K_i是等于K_D。因此，一般而言，K_i的测量可便利地经取代以提供K_D的上限值。与不同分子相互作用相关联的结合亲和力(例如，不同抗体针对给定抗原的结合亲和力的比较)可通过针对个别抗体/抗原复合体的 K_D值的比较而进行比较。针对抗体或其他结合配偶体的K_D值可使用本领域中业已建立的方法进行测定。

“Fc融合”蛋白是其中一个或更多个多肽以可操作方式连接至Fc 多肽的蛋白质。Fc融合组合免疫球蛋白的Fc区及融合配偶体。该“Fc 区”可为天然序列Fc区或变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可改变，该人类IgG重链Fc区通常被定义为自位置Cys226的氨基酸残基或自Pro230延伸至其羧基端。Fc区中的残基的编号是具有 EU指数的编号，如描述于Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991中。免疫球蛋白的Fc区通常包含两个恒定域(CH₂及CH₃)。如本领域中已知，Fc区可以二聚物或单体形式存在。

术语“治疗有效量”意谓抗OX40抗体或其抗原结合片段或包含此抗体或其抗原结合片段的组合足以达成预期目的的量。精确量将取决于许多因素，包括(但不限于)治疗组合物的组分及物理特征、预期患者群体、个别患者注意事项等，及可由本领域技术人员判定。

术语“治疗”包括预防性及/或治疗性治疗。若在疾病、失调症或病症的临床表现前施用，则认为该治疗是预防性的。治疗性治疗包括(例如)减轻或减弱疾病、失调症或病症的严重性或缩短疾病、失调症或病症的长度。

如本文使用，术语“约”是指值的+/-10％。

治疗性方法和组合物

本文中提供的任何抗人OX40抗体可以在治疗方法中使用。

在一个方面，提供抗人OX40激动性抗体，其用作药物。在又一些方面，提供抗人OX40激动性抗体，其用于治疗癌症。在某些实施方式中，提供抗人OX40激动性抗体，其用于治疗方法。在某些实施方式中，提供抗人OX40激动性抗体，其用于治疗具有癌症的个体的方法，包括对该个体施用有效量的该抗人OX40激动性抗体。在一个此类实施方式中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如下文所述。

在一个方面，提供的是抗人OX40激动性抗体，其用于在具有癌症的个体中增强免疫功能(例如通过上调细胞介导的免疫应答)，包括对该个体施用有效量的该抗人OX40激动性抗体。在一个方面，提供的是抗人OX40激动性抗体，其用于在具有癌症的个体中增强T细胞功能，包括对该个体施用有效量的该抗人OX40激动性抗体。在一个方面，提供的是抗人OX40激动性抗体，其用于消减表达人OX40 的细胞(例如表达OX40的T细胞，例如表达OX40的Treg)，包括对该个体施用有效量的该抗人OX40激动性抗体。在一些实施方式中，消减是通过ADCC进行的。在一些实施方式中，消减是通过吞噬进行的。提供的是抗人OX40激动性抗体，其用于治疗具有肿瘤免疫的个体。

在又一些方面，提供抗人OX40激动性抗体，其用于治疗感染(例如细菌或病毒或其它病原体感染)。在某些实施方式中，本发明提供抗人OX40激动性抗体，其用于治疗具有感染的个体的方法，包括对该个体施用有效量的该抗人OX40激动性抗体。在一些实施方式中，感染是病毒和/或细菌感染。在一些实施方式中，感染是病原体感染。

在又一个方面，本发明提供抗OX40抗体制造或制备药物的用途。在一个实施方式中，该药物用于治疗癌症。在又一个实施方式中，该药物用于治疗癌症的方法，其包括对具有癌症的个体施用有效量的该药物。在一个此类实施方式中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如下文所述。

在一个方面，该药物用于在具有癌症的个体中增强免疫功能(例如通过上调细胞介导的免疫应答)，其包括对该个体施用有效量的该药物。在一个方面，该药物用于在具有癌症的个体中增强T细胞功能，其包括对该个体施用有效量的该药物。在一些实施方式中，该T细胞功能障碍性病症是癌症。在一个方面，该药物用于消减表达人OX40 的细胞(例如表达高OX40的细胞，例如表达OX40的T细胞)，其包括对该个体施用有效量的该药物。在一些实施方式中，消减是通过 ADCC进行的。在一些实施方式中，消减是通过吞噬进行的。在一个方面，该药物用于治疗具有肿瘤免疫的个体。

在又一些方面，提供药物，其用于治疗感染(例如细菌或病毒或其它病原体感染)。在某些实施方式中，该药物用于治疗具有感染的个体的方法，包括对该个体施用有效量的该药物。在一些实施方式中，感染是病毒和/或细菌感染。在一些实施方式中，感染是病原体感染。

在又一个方面，本发明提供用于治疗癌症的方法。在一个实施方式中，该方法包括对具有此类癌症的个体施用有效量的抗OX40抗体。在一个此类实施方式中，该方法进一步包括对该个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如下文所述。依照任何上述实施方式的“个体”可以是人。

在一个方面，提供的是用于在具有癌症的个体中增强免疫功能 (例如通过上调细胞介导的免疫应答)的方法，包括对该个体施用有效量的该抗人OX40激动性抗体。在一个方面，提供的是用于在具有癌症的个体中增强T细胞功能的方法，包括对该个体施用有效量的该抗人OX40激动性抗体。在一个方面，提供的是用于消减表达人OX40 的细胞(例如表达高水平OX40的细胞，例如表达OX40的T细胞)的方法，包括对该个体施用有效量的该抗人OX40激动性抗体。在一些实施方式中，消减是通过ADCC进行的。在一些实施方式中，消减是通过吞噬进行的。提供的是抗人OX40激动性抗体，其用于治疗具有肿瘤免疫的个体。

在一些实施方式中，癌症的例子进一步包括但不限于B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，小淋巴细胞性 (SL)NHU中级/滤泡性NHL，中级弥漫性NHL，高级成免疫细胞性 NHL，高级成淋巴细胞性NHL，高级小无核裂细胞性NHL，贮积病 (bulkydisease)NHL，套细胞淋巴瘤，AIDS相关淋巴瘤，和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，毛细胞性白血病，慢性成髓细胞性白血病，和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)，以及与瘢痣病 (phakomatoses)，水肿(诸如与脑瘤有关的)，B细胞增殖性病症，和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖。更具体例子包括但不限于复发性或顽固性NHL，前线(front line)低级NHL，阶段III/IV NHL，化疗耐受性NHL，前体B成淋巴细胞性白血病和/或淋巴瘤，小淋巴细胞性淋巴瘤，B细胞慢性淋巴细胞性白血病和/或前淋巴细胞性白血病和/或小淋巴细胞性淋巴瘤，B细胞前淋巴细胞性淋巴瘤，免疫细胞瘤和/或淋巴浆细胞性(lymphoplasmacytic)淋巴瘤，淋巴浆细胞性淋巴瘤，边缘区B细胞淋巴瘤，脾边缘区淋巴瘤，节外边缘区(extranodalmarginal zone)_MALT淋巴瘤，节边缘区(nodal marginal zone)淋巴瘤，毛细胞性白血病，衆细胞瘤和/或浆细胞骨髓瘤，低级/滤泡淋巴瘤，中级/滤泡NHL，套细胞淋巴瘤，滤泡中心淋巴瘤(滤泡的)，中级弥漫性NHL，弥漫性大B细胞淋巴瘤，攻击性(agressive)NHL(包括攻击性前线NHL和攻击性复发性NHL)，自体干细胞移植后复发性或顽固性NHL，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤，原发性渗出性淋巴瘤，高级成免疫细胞NHL，高级成淋巴细胞NHL，高级小无核裂细胞NHL，贮积病(bulky disease)NHL，伯基特氏(Burkitt)淋巴瘤，前体(外周) 大粒状淋巴细胞白血病，蕈样肉芽肿病和/或塞扎里(Sezary)综合征，皮肤淋巴瘤，间变性大细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤。

在一些实施方式中，癌症的例子进一步包括但不限于B细胞增殖性病症，其进一步包括但不限于淋巴瘤(例如B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL))和淋巴细胞性白血病。此类淋巴瘤和淋巴细胞性白血病包括例如a)滤泡性淋巴瘤，b)小无核裂细胞淋巴瘤(small Non-Cleaved Cell Lymphoma)/伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤(包括地方性伯基特氏淋巴瘤，散发性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特氏淋巴瘤)，c)边缘区淋巴瘤(包括结外边缘区B细胞淋巴瘤(粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，MALT)，结边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区淋巴瘤)，d)套细胞淋巴瘤(MCL)，e)大细胞淋巴瘤(包括B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)，弥漫性混合细胞淋巴瘤，免疫母细胞性淋巴瘤，原发性纵隔B细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤-肺B细胞淋巴瘤)，f)毛细胞白血病，g)淋巴细胞性淋巴瘤，瓦尔登斯特伦(waldenstrom)氏巨球蛋白血症，h)急性淋巴细胞性白血病(ALL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤 (SLL)，B细胞幼淋巴细胞白血病，i)浆细胞赘生物，浆细胞骨髓瘤，多发性骨髓瘤，浆细胞瘤，和/或j)霍奇金氏病。

在任何方法的一些实施方式中，该癌症是B细胞增殖性病症。在一些实施方式中，该B细胞增殖性病症是淋巴瘤，非霍奇金(Hodgkin) 氏淋巴瘤(NHL)，攻击性NHL，复发性攻击性NHL，复发性无痛性 NHL，顽固性NHL，顽固性无痛性NHL，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，小淋巴细胞淋巴瘤，白血病，毛细胞白血病(HCL)，急性淋巴细胞性白血病(ALL)，或套细胞淋巴瘤。在一些实施方式中，该B细胞增殖性病症是NHL，诸如无痛性NHL和/或攻击性NHL。在一些实施方式中，该B细胞增殖性病症是无痛性滤泡性淋巴瘤或弥漫性大B细胞淋巴瘤。

在又一个方面，本发明提供药物配制剂，其包含本文中提供的任何抗OX40抗体，例如用于任何上述治疗方法。在一个实施方式中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗OX40抗体和药学可接受载剂。在另一个实施方式中，药物配制剂包含本文中提供的任何抗OX40抗体和至少一种别的治疗剂，例如下文所述。

在本发明的任何方法的一些实施方式中，该抗人OX40激动性抗体通过抑制Treg功能(例如抑制Treg的遏制性功能)，杀死表达OX40 的细胞(例如表达高水平OX40的细胞)，提高效应T细胞功能和/或提高记忆T细胞功能来抑制肿瘤免疫。在本发明的任何方法的一些实施方式中，该抗人OX40激动性抗体通过抑制Treg功能(例如抑制 Treg的遏制性功能)，杀死表达OX40的细胞(例如表达高水平OX40 的细胞)，提高效应T细胞功能和/或提高记忆T细胞功能来治疗癌症。在本发明的任何方法的一些实施方式中，该抗人OX40激动性抗体通过抑制Treg功能(例如抑制Treg的遏制性功能)，杀死表达OX40 的细胞(例如表达高水平OX40的细胞)，提高效应T细胞功能和/或提高记忆T细胞功能来增强免疫功能。在本发明的任何方法的一些实施方式中，该抗人OX40激动性抗体通过抑制Treg功能(例如抑制 Treg的遏制性功能)，杀死表达OX40的细胞(例如表达高水平OX40 的细胞)，提高效应T细胞功能和/或提高记忆T细胞功能来增强T 细胞功能。

在任何方法的一些实施方式中，该抗人OX40激动性抗体是消减性抗人OX40激动性抗体。在一些实施方式中，该抗人OX40激动性抗体处理导致细胞消减(例如消减表达OX40的细胞，例如消减表达高水平OX40的细胞)。在一些实施方式中，消减是通过ADCC进行的。在一些实施方式中，消减是通过吞噬进行的。

在任何方法的一些实施方式中，相对于施用该OX40激动性抗体之前的Treg功能，该抗人OX40激动性抗体例如通过抑制效应和/或记忆T细胞功能(在一些实施方式中，效应T细胞和/或记忆T细胞增殖和/或细胞因子分泌)的Treg遏制来抑制Treg功能。在任何方法的一些实施方式中，相对于施用该OX40激动性抗体之前的效应T细胞增殖，该抗人OX40激动性抗体提高效应T细胞增殖。在任何方法的一些实施方式中，相对于施用该OX40激动性抗体之前的记忆T细胞增殖，该抗人OX40激动性抗体提高记忆T细胞增殖。在任何方法的一些实施方式中，相对于施用该OX40激动性抗体之前的效应T细胞细胞因子生成，该抗人OX40激动性抗体提高效应T细胞细胞因子生成(例如γ-干扰素生成)。在任何方法的一些实施方式中，相对于施用该OX40激动性抗体之前的记忆T细胞细胞因子生成，该抗人OX40 激动性抗体提高记忆T细胞细胞因子生成(例如γ-干扰素生成)。在任何方法的一些实施方式中，相对于施用该OX40激动性抗体之前的 CD4+效应T细胞增殖和/或CD8+效应T细胞增殖，该抗人OX40激动性抗体提高CD4+效应T细胞增殖和/或CD8+效应T细胞增殖。在任何方法的一些实施方式中，相对于施用该OX40激动性抗体之前的记忆T细胞增殖，该抗人OX40激动性抗体提高记忆T细胞增殖(例如CD4+记忆T细胞增殖)。在一些实施方式中，相对于施用该抗人 OX40激动性抗体的之前的增殖，细胞因子分泌和/或溶胞活性，个体中的CD4+效应T细胞具有增强的增殖，细胞因子分泌和/或溶胞活性。

在本发明的任何方法的一些实施方式中，CD4+效应T细胞的数目相对于施用该抗人OX40激动性抗体之前升高。在一些实施方式中， CD4+效应T细胞细胞因子分泌相对于施用该抗人OX40激动性抗体之前升高。在任何方法的一些实施方式中，个体中的CD8+效应T细胞具有相对于施用该抗人OX40激动性抗体之前增强的增殖，细胞因子分泌和/或溶胞活性。在一些实施方式中，CD8+效应T细胞的数目相对于施用该抗人OX40激动性抗体之前升高。在一些实施方式中， CD8+效应T细胞细胞因子分泌相对于施用该抗人OX40激动性抗体之前升高。

在本发明的任何方法的一些实施方式中，该抗人OX40激动性抗体结合人效应细胞，例如结合由人效应细胞表达的FcγR。在一些实施方式中，该人效应细胞实施ADCC效应器功能。在一些实施方式中，该人效应细胞实施吞噬效应器功能。

在本发明的任何方法的一些实施方式中，包含变异IgG1Fc多肽 (其包含消除对人效应细胞的结合的突变，例如DANA或N297G突变) 的抗人OX40激动性抗体具有相对于包含天然序列IgG1Fc部分的抗人OX40激动性抗体降低的活性(例如CD4+效应T细胞功能，例如增殖)。在一些实施方式中，包含变异IgG1Fc多肽(其包含消除对人效应细胞的结合的突变，例如DANA或N297G突变)的抗人OX40 激动性抗体并不拥有实质性活性(例如CD4+效应T细胞功能，例如增殖)。

在本发明的任何方法的一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体功能需要抗体交联。在一些实施方式中，功能是刺激CD4+效应T细胞增殖。在一些实施方式中，抗体交联是通过提供粘附至固体表面(例如细胞培养板)的抗人OX40激动性抗体而测定的。在一些实施方式中，抗体交联是通过在该抗体的IgG1Fc部分中引入突变(例如DANA或 N297S突变)并测试突变体抗体的功能而测定的。

在任何方法的一些实施方式中，个体中的记忆T细胞具有相对于施用该抗人OX40激动性抗体之前增强的增殖和/或细胞因子分泌。在一些实施方式中，记忆T细胞的数目相对于施用该抗人OX40激动性抗体之前升高。在一些实施方式中，记忆T细胞细胞因子分泌(水平) 相对于施用该抗人OX40激动性抗体之前升高。在任何方法的一些实施方式中，个体中的Treg具有相对于施用该抗人OX40激动性抗体之前降低的效应T细胞功能(例如增殖和/或细胞因子分泌)抑制。在一些实施方式中，效应T细胞的数目相对于施用该抗人OX40激动性抗体之前升高。在一些实施方式中，效应T细胞细胞因子分泌(水平) 相对于施用该抗人OX40激动性抗体之前升高。

在本发明的任何方法的一些实施方式中，肿瘤内(浸润性)CD4+ 效应T细胞的数目(例如CD4+效应T细胞的总数，或例如CD45+细胞中CD4+细胞的百分比)相对于施用该抗人OX40激动性抗体之前升高。在本发明的任何方法的一些实施方式中，表达γ-干扰素的肿瘤内(浸润性)CD4+效应T细胞的数目(例如总的表达γ-干扰素的CD4+ 细胞，或例如总的CD4+细胞中表达γ-干扰素的CD4+细胞的百分比) 相对于施用抗人OX40激动性抗体之前升高。

在本发明的任何方法的一些实施方式中，肿瘤内(浸润性)CD8+ 效应T细胞的数目(例如CD8+效应T细胞的总数，或例如CD45+细胞中CD8+的百分比)相对于施用抗人OX40激动性抗体之前升高。在本发明的任何方法的一些实施方式中，表达γ-干扰素的肿瘤内(浸润性)CD8+效应T细胞的数目(例如总的CD8+细胞中表达γ-干扰素的CD8+细胞的百分比)相对于施用抗人OX40激动性抗体之前升高。

在本发明的任何方法的一些实施方式中，肿瘤内(浸润性)Treg 的数目(例如Treg的总数或例如CD4+细胞中Fox3p+细胞的百分比) 相对于施用抗人OX40激动性抗体之前降低。

在本发明的任何方法的一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体的施用与肿瘤抗原的施用组合。在一些实施方式中，该肿瘤抗原包含蛋白质。在一些实施方式中，该肿瘤抗原包含核酸。在一些实施方式中，该肿瘤抗原是肿瘤细胞。

在本发明的任何方法的一些实施方式中，该癌症展示人效应细胞 (例如受到人效应细胞浸润)。用于检测人效应细胞的是方法本领域公知的，包括例如通过IHC。在一些实施方式中，该癌症展示高水平的人效应细胞。在一些实施方式中，人效应细胞是NK细胞，巨噬细胞，单核细胞中的一项或多项。在一些实施方式中，该癌症是本文中描述的任何癌症。在一些实施方式中，该癌症是非小细胞肺癌 (NSCLC)，成胶质细胞瘤，成神经细胞瘤，黑素瘤，乳腺癌(例如三重阴性乳腺癌)，胃癌，结直肠癌(CRC)，或肝细胞癌。

在本发明的任何方法的一些实施方式中，该癌症展示表达FcR的细胞(例如受到表达FcR的细胞浸润)。用于检测FcR的方法是本领域公知的，包括例如通过IHC。在一些实施方式中，该癌症展示高水平的表达FcR的细胞。在一些实施方式中，FcR是FcγR。在一些实施方式中，FcR是活化性FcγR。在一些实施方式中，该癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)，成胶质细胞瘤，成神经细胞瘤，黑素瘤，乳腺癌(例如三重阴性乳腺癌)，胃癌，结直肠癌(CRC)，或肝细胞癌。

依照任何上述实施方式的"个体"优选是人。

可以单独或与疗法中的其它药剂组合使用本发明的抗体。例如，可以与至少一种别的治疗剂共施用本发明的抗体。

上文记录的此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用别的治疗剂和/或药剂之前，同时，和/或之后发生本发明的抗体的施用。在一个实施方式中，抗OX40抗体的施用和别的治疗剂的施用彼此在约一个月内，或约一，两或三周内，或约1，2，3，4， 5，或6天内发生。也可以与放射疗法组合使用本发明的抗体。

在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与化疗或化疗剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与放疗或放疗剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与靶向疗法或靶向治疗剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与免疫疗法或免疫治疗剂，例如单克隆抗体联合施用。

在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与PARP抑制剂(例如Olaparanib，Rucaparib，Niraparib，Cediranib，BMN673， Veliparib)，Trabectedin，nab-paclitaxel(清蛋白结合的帕利他赛， ABRAXANE)，Trebananib，Pazopanib，Cediranib，Palbociclib，everolimus，氟尿嘧啶(例如FOLFOX，F0LFIRI)，IFL，regorafenib， Reolysin，Alimta，Zykadia，Sutent，Torisel(temsirolimus)，Inlyta(axitinib， Pfizer)，Afinitor(everolimus，Novartis)，Nexavar(sorafenib，Onyx/Bayer)， Votrient，Pazopanib，axitinib，IMA-901，AGS_003，cabozantinib， Vinflunine，Hsp90抑制剂(例如apatorsin)，Ad-GM-CSF(CT-0070)， Temazolomide，IL-2，IFNa，vinblastine，Thalomid，dacarbazine，cyclophosphamide，lenalidomide，azacytidine，lenalidomide， bortezomid(VELCADE)，amrubicine，carfilzomib，pralatrexate，和/ 或enzastaurin联合施用。

在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与PD-1轴结合拮抗剂联合施用。PD-1轴结合拮抗剂包括但不限于PD-1结合拮抗剂， PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。“PD-1”的备选名称包括 CD279和SLEB2。“PD-L1”的备选名称包括B7-Hl，B7-4，CD274和 B7-H。“PD-L2”的备选名称包括B7-DC，Btdc，和CD273。在一些实施方式中，PD-l，PD-Ll，和PD-L2是人PD-1，PD-L1和PD-L2。在一些实施方式中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1结合其配体结合配偶的分子。在一个具体方面，PD-1配体结合配偶是PD-Ll和/或PD-L2。在另一个实施方式中，PD-Ll结合拮抗剂是抑制PD-Ll结合其结合配偶的分子。在一个具体方面，PD-Ll结合配偶是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方式中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2结合其结合配偶的分子。在一个具体方面，PD-L2结合配偶是PD-1。拮抗剂可以是抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，或寡肽。在一些实施方式中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如人抗体，人源化抗体，或嵌合抗体)。在一些实施方式中，抗PD-1抗体选自下组： MDX-1106(nivolumab，0PDIV0)，Merck 3475(MK-3475， pembrolizumab，KEYTRUDAWPCT-011(Pidilizumab)。在一些实施方式中，PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如包含融合至恒定区(例如免疫球蛋白序列的Fc区)的，PD-L1或PD-L2的胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方式中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。在一些实施方式中，PD-Ll结合拮抗剂是抗PD-Ll抗体。在一些实施方式中，抗PD-Ll结合拮抗剂选自下组:YW243.55.S70，MPDL3280A，MEDI4736和MDX-1105。MDX-1105，也称作BMS-936559，是 WO2007/005874中记载的抗PD-Ll抗体。抗体YW243.55.S70是WO 2010/077634 A1中记载的抗PD-Ll。MDX-1106，也称作MDX-1106-04， 0N0-4538，BMS-936558或nivolumab，是WO2006/121168中记载的抗PD-1抗体。Merck 3475，也称作MK-3475，SCH-900475或 pembrolizumab，是WO2009/114335中记载的抗PD-1抗体。CT-011，也称作hBAT，hBAT-1或pidil izumab，是WO2009/101611中记载的抗PD-1抗体。AMP-224，也称作B7-DCIg，是WO2010/027827 和WO2011/066342中记载的PD-L2-Fc融合可溶性受体。在一些实施方式中，抗PD-1抗体是MDX-1106。“MDX-1106”的备选名称包括MDX-1106-04，0N0-4538，BMS-936558或nivoIumab。在一些实施方式中，抗PD-1抗体是nivolumab(CAS注册号：946414-94-4)。

在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与针对活化性共刺激分子的激动剂联合施用。在一些实施方式中，活化性共刺激分子可包括CD40，CD226，CD28，GITR，CD137，CD27,HVEM，或CD127。在一些实施方式中，针对活化性共刺激分子的激动剂是结合CD40，CD226，CD28，OX40，GITR，CDl37，CD27，HVEM，或CDl27的激动性抗体。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与针对抑制性共刺激分子的拮抗剂联合施用。在一些实施方式中，抑制性共刺激分子可包括CTLA-4(也称作CD152)，PD-1，′I′IΜ-3，BTLA，VISTA， LAG-3，B7-H3，B7-H4，IDO，TIGIT，MICA/B，或精氨酸酶。在一些实施方式中，针对抑制性共刺激分子的拮抗剂是结合CTLA-4，PD-1，′I′IΜ-3，BTLA，VISTA，LAG-3(例如LAG-3-IgG融合蛋白(IMP321))， B7-H3，B7-H4，IDO，TIGIT，MICA/B，或精氨酸酶的拮抗性抗体。

在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与针对 CTLA_4(也称作CD152)的拮抗剂，例如阻断性抗体联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与ipiIimumab(也称作MDX-010，MDX-101，或

)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与tremelimumab(也称作ticilimumab或 CP-675，206)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与针对B7-H3(也称作CD276)的拮抗剂，例如阻断性抗体联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与MGA271联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与针对TGFP 的拮抗剂，例如metelimumaM也称作CAT-192)，fresoIimumab(也称作GC1008)，或LY2157299联合施用。

在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与包含过继转移表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞(例如细胞毒性T细胞或CTL)的治疗联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与 UCART19联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与WT128z联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与KTE-C19(Kite)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与CTL019(Novartis)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与包含过继转移包含显性阴性TGFI3受体，例如，显性阴性TGFWI型受体的T细胞的治疗联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与包含HERCREEM方案的治疗(参见例如ClinicalTrials.gov Identifier NCT00889954)联合施用。

在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与针对CD19的拮抗剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与 M0R00208联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与针对CD38的拮抗剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40 激动性抗体可以与daratumumab联合施用。

在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与针对CD137(也称作TNFRSF9，4-1BB，或ILA)的激动剂，例如活化性抗体联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与urelumab(也称作BMS-663513)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与针对CD40的激动剂，例如活化性抗体联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与CP-870893联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与针对OX40(也称作 CDl34)的激动剂，例如活化性抗体联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与不同的抗OX40抗体(例如AgonOX)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与针对CD27 的激动剂，例如活化性抗体联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40 激动性抗体可以与CDX-1127联合施用。在一些实施方式中，抗人 OX40激动性抗体可以与针对吲哚胺-2，3_双加氧酶(IDO)的拮抗剂联合施用。在一些实施方式中，该IDO拮抗剂是1-甲基-D-色氨酸(也称作I-D-MT)。

在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与针对CD137(也称作TNFRSF9，4-1BB，或ILA)的激动剂，例如活化性抗体联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与urelumab(也称作BMS-663513)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与针对CD40的激动剂，例如活化性抗体联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与CP-870893或R07009789 联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与针对 OX40(也称作CD134)的激动剂，例如活化性抗体联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与针对CD27的激动剂，例如活化性抗体联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与CDX-1127(也称作varlilumab)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与针对吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO)的拮抗剂联合施用。在一些实施方式中，该IDO拮抗剂是1-甲基-D-色氨酸 (也称作1-D-MT)。在一些实施方式中，该IDO拮抗剂是 W02010/005958(通过此处记录明确收录其内容)中所示IDO拮抗剂。在一些实施方案中，该IDO诘抗剂是4_({2_[(氨基磺酰基)氨基]乙基} 氨基)-N_(3-溴-4-氟苯基)-Ν'-羟基-1，2，5-口恶二唑-3-甲脒(例如如 W02010/005958实施例23中记载的)。在一些实施方式实施方式中，该IDO拮抗剂是

在一些实施方式中，该IDO拮抗剂是INCB24360。在一些实施方式中，该IDO拮抗剂是Indoximod(l-甲基-色氨酸的D异构体)。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与抗体-药物缀合物联合施用。在一些实施方式中，该抗体-药物缀合物包含mertansine或单甲基奥瑞司他汀E(MMAE)。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与抗NaPi2b抗体-MMAE缀合物(也称作DNIB0600A， RG7599或Iifastuzumab vedotin)联合施用。在一些实施方式中，抗人 OX40激动性抗体可以与trastuzumab emtansine(也称作T-DM1， ado_trastuzumab emtansine，或KADCYL.

Genentech)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与抗MUC16抗体 -MMAE缀合物，DMUC5754A联合施用。在一些实施方式中，抗人 OX40激动性抗体可以与抗MUC16抗体-MMAE缀合物，DMUC4064A 联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与靶向内皮缩血管肽B受体(EDNBR)的抗体-药物缀合物，例如缀合有MMAE 的针对EDNBR的抗体联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与靶向淋巴细胞抗原6复合物，基因座E(Ly6E)的抗体- 药物缀合物，例如缀合有MMAE的针对Ly6E的抗体(也称作 DLYE5953A)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与polatuzumab vedotin联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40 激动性抗体可以与靶向CD30的抗体-药物缀合物联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与ADCETRIS(也称作 brentuximab vedotin)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与polatuzumab vedotin联合施用。

在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与血管发生抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与针对 VEGF，例如VEGF-A的抗体联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40 激动性抗体可以与贝伐珠单抗(也称作

Genentech)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与针对血管生成素2(也称作Ang2)的抗体联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40 激动性抗体可以与MEDI3617联合施用。在一些实施方式中，抗人 OX40激动性抗体可以与针对VEGFR2的抗体联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与ramucirumab联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与VEGF受体融合蛋白联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与aflibercept 联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与 ziv-aflibercept(也称作VEGF陷阱或

)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与针对VEGF和Ang2的双特异性抗体联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与RG7221(也称作vanucizumab)联合施用。在一些实施方式中，抗人 OX40激动性抗体可以与血管发生抑制剂联合和与PD-1轴结合拮抗剂(例如PD-1结合拮抗剂诸如抗PD-1抗体，PD-Ll结合拮抗剂诸如抗PD-Ll抗体，和PD-L2结合拮抗剂诸如抗PD-L2抗体)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与贝伐珠单抗和PD-1轴结合拮抗剂(例如PD-1结合拮抗剂诸如抗PD-1抗体，PD-L1结合拮抗剂诸如抗PD-Ll抗体，和PD-L2结合拮抗剂诸如抗PD-L2抗体) 联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与贝伐珠单抗和MDX-1106(nivolumab，OPDIVO)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与贝伐珠单抗和Merck 3475(MK-3475， pembrolizumab，KEYTRUDA)联合施用。在一些实施方式中，抗人 OX40激动性抗体可以与贝伐珠单抗和CT-011(Pidilizumab)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与贝伐珠单抗和YW243.55.S70联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与贝伐珠单抗和MPDL3280A联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与贝伐珠单抗和MEDI4736联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与贝伐珠单抗和 MDX-1105联合施用。

在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与抗肿瘤剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与靶向 CSF-1R(也称作M-CSFR或CD115)的药剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与抗CSF-1R抗体(也称作IMC-CS4 或LY3022855)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与抗CSF-1R抗体，RG7155(也称作R05509554或emactuzumab) 联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与干扰素，例如干扰素-α或干扰素-γ联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40 激动性抗体可以与Roferon-A(也称作重组干扰素a-2a)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与GM-CSF(也称作重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，rhu GM-CSF，sargramostim，或

)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与IL-2(也称作aldesleukin或

)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与IL-12联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与IL27联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与IL-15联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与ALT-803联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与靶向CD20的抗体联合施用。在一些实施方式中，靶向CD20的抗体是奥奴珠单抗(也称作GAlO 1 或

)或利妥昔单抗。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与靶向GITR的抗体联合施用。在一些实施方式中，靶向 GITR的抗体是TRX518。在一些实施方式中，靶向GITR的抗体是MK04166(Merck)。

在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与Bruton氏酪氨酸激酶(BTK)的抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与ibrutinib联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40 激动性抗体可以与疫苗脱氢酶I(IDH1)和/或疫苗脱氢酶2(IDH2)的抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与 AG-120(Agios)联合施用。

在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与奥奴珠单抗和 PD-1轴结合拮抗剂(例如PD-1结合拮抗剂诸如抗PD-1抗体，PD-Ll 结合拮抗剂诸如抗PD-Ll抗体，和PD-L2结合拮抗剂诸如抗PD-L2 抗体)联合施用。

在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与癌症疫苗联合施用。在一些实施方式中，该癌症疫苗是肽癌症疫苗，其在一些实施方式中是个性化肽疫苗。在一些实施方式中，该肽癌症疫苗是多价长肽，多重肽，肽混合物，杂合肽，或经肽脉冲的树突细胞疫苗(参见例如Yamada et al.，Cancer Sci，104:14-21,2013)。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与佐剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与包含TLR激动剂，例如Poly-ICLC(也称作

)，LPS，MPL，或CpG ODN的治疗联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与肿瘤坏死因子(TNF)a联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与IL-1联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与HMGBl联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与IL-10拮抗剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与IL-4 拮抗剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与 IL-13拮抗剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与IL-17拮抗剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与HVEM拮抗剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40 激动性抗体可以与ICOS激动剂(例如通过施用ICOS-L，或针对ICOS 的激动性抗体)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与靶向CX3CL1的治疗联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40 激动性抗体可以与靶向CXCL9的治疗联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与靶向CXCLl0的治疗联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与靶向CCL5的治疗联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与LFA-I或ICAM1 激动剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与选择蛋白激动剂联合施用。

在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与B-Raf的抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与维罗非尼(也称作

)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40 激动性抗体可以与dabrafenib(也称作

)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与encorafenib(LGX818)联合施用。

在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与EGFR抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与 erlotinib(也称作

)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40 激动性抗体可以与EGFR-T790M的抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与gefitinib联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与afatinib联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与西妥昔单抗(也称作

) 联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与panitumumab(也称作

)联合施用。在一些实施方式中，抗人 OX40激动性抗体可以与rociletinib联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与AZD9291联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与MEK，诸如MEK1(也称作MAP2K1) 和/或MEK2(也称作MAP2K2)的抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与cobimetinib(也称作CDC-0973或 XL-518)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与trametinib(也称作

)联合施用。在一些实施方式中，抗人 OX40激动性抗体可以与binimetinib联合施用。

在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与B-Raf的抑制剂(例如维罗非尼或dabrafenib)和MEK(例如MEKl和/或MEK2)的抑制剂(例如cobimetinib或trametinib)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与ERK(例如ERK1/2)的抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与GDC-0994联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与B-Raf的抑制剂，MEK的抑制剂，和ERK1/2的抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与EGFR的抑制剂，MEK的抑制剂，和ERK1/2的抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与一种或多种MAP激酶途径抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与CK127联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与K-Ras的抑制剂联合施用。

在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与c-Met的抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与 onartuzumab(也称作MetMAb)联合施用。在一些实施方式中，抗人 OX40激动性抗体可以与anaplatic淋巴瘤激酶(ALK)的抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与AF802(也称作 CH5424802或alectinib)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与crizotinib联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40 激动性抗体可以与ceritinib联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与buparlisib(BKM-120) 联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与 pictilisib(也称作GDC-0941)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与buparlisib(也称作BKM-120)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与perifosine(也称作KRX-0401) 联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的δ选择性抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与idelalisib(也称作GS-1101或CAL-101) 联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与 taselisib(也称作GDC-0032)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40 激动性抗体可以与BYL-719联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与Akt的抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人 OX40激动性抗体可以与MK2206联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与GSK690693联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与ipatasertib(也称作CDC-0068)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与mTOR的抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与 sirolimus(也称作rapamycin)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40 激动性抗体可以与temsirolimus(也称作CCI-779或

)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与everolimus(也称作RADOO1)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与ridaforoIimus(也称作AP-23573，MK_8669，或deforolimus) 联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与0SI-027 联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与 AZD8055联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与INK128联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与双重PI3K/mT0R抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40 激动性抗体可以与XL765联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40 激动性抗体可以与GDC-0980联合施用。在一些实施方式中，抗人 OX40激动性抗体可以与BEZ235(也称作NVP-BEZ235)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与BGT226联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与GSK2126458联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与PF-04691502 联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与 PF-05212384(也称作PKI-587)联合施用。

在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与选择性降解雌激素受体的药剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与GDC-0927联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与HER3的抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与duligotuzumab联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与LSDl的抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与MDM2的抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与BCL2的抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与venetoclax 联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与CHKl 的抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与CDC-0575联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与激活的hedgehog信号传导途径的抑制剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与ERIVEDGE联合施用。

在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与放射疗法联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与吉西他滨联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与 nab-pacIitaxeI(ABRAXANE)联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40 激动性抗体可以与曲妥珠单抗联合施用。在一些实施方式中，抗人 OX40激动性抗体可以与TVEC联合施用。在一些实施方式中，抗人 OX40激动性抗体可以与IL27联合施用。在一些实施方式中，抗人 OX40激动性抗体可以与环磷酰胺联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与募集T细胞至肿瘤的药剂联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与 lirilumab(IPH2102/BMS-986015)联合施用。在一些实施方式中，抗人 OX40激动性抗体可以与Idelalisib联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与靶向CD3和CD20的抗体联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与REGN1979联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与靶向CD3和CD19 的抗体联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与 blinatumomab联合施用。

在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与溶瘤病毒联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与卡钼和nab-paclitaxel联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与卡铂和帕利他赛联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与顺铂和培美曲塞联合施用。在一些实施方式中，抗人 OX40激动性抗体可以与顺铂和吉西他滨联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与FOLFOX联合施用。在一些实施方式中，抗人OX40激动性抗体可以与F0LFIRI联合施用。

上文记录的此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用别的治疗剂和/或佐剂之前，同时，和/或之后发生本发明抗体的施用。也可以与放射疗法组合使用本发明抗体。

可以通过任何合适的手段(包括胃肠外，肺内，和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用)来施用本发明抗体(和任何别的治疗剂)。胃肠外输注包括肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适的路径(例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射)来进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用，推注施用，和脉冲输注。

本发明抗体会以一种符合优秀的医学实践的方式配制，定剂量和施用。在此背景中考虑的因素包括所治疗的特定病症，所治疗的特定哺乳动物，患者个体的临床状况，病症的起因，药剂投递部位，施用方法，施用日程表及医学从业人员知道的其它因素。抗体无需但任选与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。此类其它药物的有效量取决于配制剂中存在的抗体的量，病症或治疗的类型，及上文所述其它因素。这些通常以本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以约1-99％的本文所述剂量使用，或以凭经验/临床上确定为适宜的任何剂量和任何途径使用。

为了预防或治疗疾病，本发明抗体(当单独或与一种或多种其它别的治疗剂组合使用时)的适宜剂量会取决于要治疗的疾病的类型，抗体的类型，疾病的严重性和病程，施用抗体是预防还是治疗目的，之前的疗法，患者的临床史和对抗体的响应，及主治医师的斟酌。抗体适合于在一次或一系列的治疗中施用于患者。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg至40mg/kg的抗体可以作为初始候选剂量施用于患者，无论是例如通过一次或多次分开的施用或者是通过连续输注。根据上文所述因素，一种典型的日剂量可以在约lμg/kg至100mg/kg 或更多的范围中。对于几天或更长时间上的重复施用，根据状况，治疗通常会持续直至疾病症状发生期望的阻抑。此类剂量可间歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2至约20剂，或例如约6剂抗体)。可以施用较高的初始加载剂，接着是较低的一或多剂。然而，其它剂量方案可能是有用的。此疗法的进展易于通过常规技术和测定法来监测。

应当理解，可以使用本发明的免疫缀合物代替或补充抗OX40抗体来实施任何上述配制剂或治疗性方法。

实施例

实施例1.抗OX40抗体的制备和筛选

实施例1.1构建报告细胞系Jurkat/NF-κB-GFP+hOX40

NF-κB-GFP报告基因慢病毒系统(QIAGEN，CCS-013G)的启动子中有多个NF-κB转录因子结合元件，该启动子可以驱动GFP表达。根据试剂盒的说明书，用NF-κB-GFP报告基因慢病毒感染Jurkat细胞(ATCC，TIB-152)，并用嘌呤霉素(InvivoGen，ant-pr-1) 筛选感染慢病毒的Jurkat细胞。加入10ng/ml TNFα蛋白(Sino Biological，10602-HNAE)刺激利用嘌呤霉素筛选到的细胞，24h后用流式细胞仪(BD，FACSAria III)分选表现GFP荧光的细胞亚群，获得Jurkat/NF-κB-GFP细胞。

将人OX40 CDS(Sino Biological，HG10481-UT)构建至慢病毒核心质粒pCDH(System Biosciences)中，使用标准步骤用PEI (polyscience，24885-2)向293FT细胞(Thermo Fisher Scientific，R70007)中按1：1：1：1共转染所获得的慢病毒核心质粒和辅助质粒pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSVG(均来自System Biosciences)，转染6h后换液，37℃培养于含10％胎牛血清(Biological Industries，04-001-1A)的DMEM培养基(Lifetechnologies， C11995500CP)中，继续培养48h收集含有人OX40慢病毒的上清。

本文所用阳性对照OX40L和HEL的DNA序列在金唯智公司进行全基因合成。对于OX40L和HEL纯化，将DNA序列插入真核表达载体pFUSE(InvivoGen，pfuse-hg1fc1)中，使用标准步骤用PEI 转染至293F细胞(Thermo Fisher Scientific，R79007)；利用Freestyle培养基(Lifetechnologies，12338026)在37℃摇床培养细胞。培养7 天后收集上清液，并在AKTA系统(GE)上使用Superdex^TM 200 Increase预装柱(GE，28-9909-44)纯化。

OX40信号转导可以激活NF-κB通路，如果OX40成功表达于 Jurkat/NF-κB-GFP细胞膜表面，OX40L刺激将会诱导GFP的表达。将如上所述分选获得的构建好的Jurkat/NF-κB-GFP细胞用上述获得的人OX40慢病毒上清感染，16h后加入100nM上述获得的OX40L 蛋白(作为阳性对照)和HEL(作为阴性对照)进行刺激，24h后用流式细胞仪单细胞分选GFP荧光最强的细胞至96孔板中。

将上述96孔板中的细胞在含有10％胎牛血清(Biological Industries，04-001-1A)的RPMI 1640培养基(Lifetechnologies， C11875500CP)中培养2周，待单细胞长起来后分别加入100nM上述获得三聚化OX40L蛋白(作为阳性对照)和HEL(作为阴性对照)，挑选OX40L强阳性、HEL阴性的单克隆作为Jurkat/NF-κB-GFP +hOX40(简称NF-κB-GFP+hOX40)细胞，用于后续实验。结果如图1，OX40L刺激后Jurkat/NF-κB-GFP+hOX40单克隆GFP阳性率为70.7％，HEL刺激无激活。

实施例1.2从噬菌体展示抗体库中筛选抗OX40抗体

从天津市血液中心及上海秒通生物公司购买30例健康成人外周血，利用ficoll分离液(灏洋，LDS1075)离心获取PBMC，离心条件：20℃，2000rpm，升5降0模式30分钟。使用如上所述获得的 PBMC构建人天然抗体库，库的构建为常规方法(phage display，TimClackson and Henry B.Lowman)。将获得抗体重链和轻链可变区随机组合以单链抗体scFv的形式展示于噬菌体衣壳蛋白pIII的N端，获得噬菌体展示抗体库，库容达到10¹⁰。

噬菌体筛选为常规技术(Phage Display:A Laboratory Manual， Carlos FBarbas III)。首先，将生物素化OX40蛋白(acrobiosystems) 与如上所述获得的噬菌体展示抗体库室温孵育2h。孵育结束后直接加入150ul链霉亲和素磁珠Dynabeads M280(Lifetechnologies， 11205D)，在室温混匀仪上孵育30min。用0.05％PBS-tween(PBS：Lifetechnologies，70011044；Tween：Sigma-Aldrich，9005-64-5)洗去不与抗原结合的噬菌体，最后用0.2M甘氨酸-盐酸(PH2.2)洗脱与抗原结合的噬菌体。应用洗脱的噬菌体感染大肠杆菌XL1-blue (Agilent，200236)，加入辅助噬菌体VCSM13(Agilent，200251) 扩增后用于下一轮筛选。共进行三轮筛选。三轮后，富集与CD40结合的抗体噬菌体，筛选结果如表1。

表1利用噬菌体展示技术从人天然抗体库中筛选抗OX40抗体

为了初步评估筛选到的抗OX40抗体的阳性率，我们分别挑取第二、三轮22个噬菌体单克隆，进行噬菌体ELISA分析。噬菌体ELISA 为常规技术，具体如下：从深孔板中培养的噬菌体单克隆中各挑取第二、三轮22个噬菌体单克隆，在37℃300rpm下振摇培养至OD＝0.5～0.8，加入辅助噬菌体VCSM13扩增后30℃过夜诱导噬菌体，用于抗体表达。在ELISA板(Corning，3690)上包被1μg/ml的人源 OX40(Acrobiosystems，OX0-H5224)，4℃过夜孵育。向过夜孵育后的ELISA板上加入过夜诱导的噬菌体上清，室温孵育1h，0.05％ PBST洗8次。利用BSA(Solarbio，A8020-100)作为阴性对照。加入HRP偶联的抗-M13(GE，27-9421-01，M13为噬菌体衣壳蛋白) 检测结合的抗体噬菌体。将OX40结合信号是BSA对照的3倍以上定义为阳性克隆。结果如图2，其中第二轮筛选、第三轮筛选的阳性率分别为4.5％、40.9％。

实施例1.3共刺激受体OX40的激动剂抗体的筛选

首先，我们将从第三轮噬菌体展示富集到的抗体亚克隆到分泌型慢病毒载体pCDH中，同时将N27 ScFv克隆到分泌型慢病毒载体 pCDH中作为阴性对照。向293FT细胞中按1：1：1：1共转染慢病毒核心质粒和辅助质粒pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSVG，转染6h后换液，37℃培养于含10％胎牛血清(Biological Industries， 04-001-1A)的DMEM培养基中，继续培养48h收集含有抗OX40抗体慢病毒文库的上清；用50000pg所获得的抗OX40抗体的慢病毒文库感染HEK293细胞，感染16h后，离心去除含有慢病毒的培养基，添加新鲜培养基，利用流式分选技术将感染的HEK293细胞分选到96 孔板中，使每个孔仅含有1个感染HEK293细胞，培养细胞3周，待细胞达到一定数量后取上清。上清中加入如上所述获得的 Jurkat/NF-κB-GFP+hOX40报告细胞3×10⁵个，同时加入2.5μg/ml山羊抗人Fc(SouthernBiotech，SBA-2048-01)的二抗，交联细胞分泌的抗体以增强激动剂抗体的激活强度；培养24h后测试细胞上清的活性，阳性抗体的检测结果如图3；从细胞上清活性为阳性的HEK293 细胞中提取抗体基因，构建至pFUSE载体进行测序，获得阳性抗体 11-1、2-1和2-2-1的序列。

实施例1.4抗OX40抗体的表达和纯化

根据筛选出的抗OX40抗体的序列，合成抗OX40抗体的重链和轻链编码核苷酸序列(各自的恒定区和可变区编码核苷酸序列参见 SEQ ID NO:49-60)(金唯智公司)，将其分别克隆至载体pFUSE中，用PEI将分别含有重链和轻链的质粒二者按1：1瞬时共转染至293F 悬浮细胞，以表达全长抗体。培养1周后在AKTA系统上使用 Superdex^TM 200 Increase预装柱纯化。

SDS-PAGE法鉴定纯化抗体，应用分子排阻预装柱Superdex 200 分析抗体的聚集。结果如图4，其中2-2-1的洗脱峰形对称且洗脱时的保留时间与单个分子量的单克隆抗体保持一致，同时抗体中存在少量聚集体。

实施例2.抗OX40抗体的结合性质

实施例2.1抗OX40抗体与OX40蛋白的结合动力学

Biacore T200(GE Healthcare)用于检测抗OX40抗体的亲和力。将抗体以10μL/min流过Protein A芯片，捕获在芯片上。用Running buffer(HBS-EP+，GE)梯度稀释待测抗原人OX40重组蛋白 (Acrobiosystems，CD0-H5228)，浓度设置为2μM、1μM、500nM、 250nM、125nM、62.5nM、31.25nM。将上述不同浓度OX40按30 μL/min流速流过捕获有抗体的芯片，结合120s，然后芯片以30μL/min 的流速流过Running buffer，240s，抗原逐渐从捕获抗体的芯片上解离。数据处理使用Biacore T200仪器配套软件BIAevaluation software S200进行，计算结合常数(Ka)、解离常数(Kd)和平衡解离常数(KD)。结果如表2所示。

表2应用表面等离子共振技术平台测量抗OX40抗体与人OX40的亲和力

实施例2.2抗OX40抗体阻断OX40L蛋白与OX40蛋白结合

用ELISA评价抗OX40抗体对OX40L与OX40结合的作用。首先，使用蛋白生物素化试剂盒(GeneCopoeia，BI001)，根据说明书生物素化OX40L。在ELISA板上包被1μg/ml的人源OX40，4℃过夜孵育。加入如实施例1.4获得的PBS稀释至不同浓度的抗OX40抗体，HEL为对照抗体，室温孵育1h后，加入2.5μg/ml生物素化的 OX40L，室温孵育30min后，0.05％PBS-Tween洗8次。加入 Streptavidin-HRP使用酶标仪(SpectraMax i3x)读取OD405数值，检测结合OX40L与OX40的结合量。结果，所测试的抗OX40抗体阻断OX40与OX40L的结合。

实施例3.抗OX40抗体的体内抗肿瘤效力

5只人源化OX40敲入C57BL/6小鼠购自上海南方模式生物研究中心。隔离5天后，用100μl PBS中的8×10⁵个MC38肿瘤细胞(由南开大学张宏恺教授提供)背部皮下接种每只小鼠。当肿瘤大小达到 70-100mm³时，通过以100μl PBS中10mg/kg和q3dx3(每三天治疗一次，共治疗3次)向小鼠腹膜内施用抗OX40抗体(n＝5)而开始抗OX40抗体治疗，或者IgG1对照(n＝5)。每周两次测量肿瘤尺寸和小鼠体重，使用卡尺在两个方向上测量肿瘤尺寸，并且使用以下公式以mm3表述体积：V＝0.5a×b²，其中a和b分别是肿瘤的长直径和短直径。当对照组的肿瘤大小达到1000mm³时，处死小鼠。

如图5所示，所测试的抗OX40抗体相对于IgG1对照显著抑制肿瘤生长。OX40激动剂抗体在OX40人源化小鼠结肠癌模型中抑制肿瘤生长。将0.8×10⁵小鼠结肠癌细胞MC38移植到OX40人源化 C57BL/6小鼠背部皮下，待肿瘤体积到70-100mm³时腹腔注射 10mg/kg OX40激动剂抗体2-2-1，11-1和IgG对照抗体(n＝5)，每三天治疗一次，共治疗3次。

实施例4.抗OX40抗体的T细胞调节效果

剥离小鼠的脾脏和肿瘤，脾脏直接通过研磨，200目尼龙网过滤制备成单细胞悬液，肿瘤组织切成小块后置于2ml酶混合液中(每 ml酶含胶原蛋白酶1500U,透明质酸酶1000U和DNA酶2.5ul)，在培养箱中150rpm，37℃振荡1h。用200目尼龙网过滤并研磨没有消化完全的组织块制备成单细胞悬液，350g离心7分钟，用2ml红细胞裂解液重悬细胞，冰上孵育15分钟，用PBS洗2遍并计数。

取1×10⁷细胞，用兔抗鼠CD16/CD32抗体冰上封闭15分钟，PBS 洗一遍。取1×10⁶细胞重悬在100ul PBS中，分别加入CD45，CD3， CD4和CD45，CD3，CD8抗体各1ul，4℃避光染色30分钟，PBS 洗两遍后流式细胞仪分析CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞比例。CD45+ CD3+CD4+定义为CD4⁺T细胞，CD45+CD3+CD8+定义为CD8⁺T 细胞。

如图6所示，所测试的抗OX40抗体相对于对照在脾和肿瘤中明显上调辅助CD4+ T细胞和细胞毒性CD8+ T细胞。剥离小鼠的脾脏和肿瘤并制备单细胞悬液，CD45、CD3、CD4和CD8抗体染色，流式细胞仪分析CD4+和CD8+T细胞的比例，CD45+CD3+CD4+定义为CD4+T细胞，CD45+CD3+CD8+定义为CD8+T细胞。

实施例5.交联和可溶性抗OX40抗体的剂量依赖性作用

抗OX40抗体按照其激动方式不同可分两类，第一类OX40激动活性不依赖Fc受体的交联；另一类需要Fc受体交联才具有CD40激动活性。肿瘤组织及周围引流淋巴结有更多肿瘤相关炎性细胞的存在,Fc受体FcγR2b在肿瘤细胞周围有更多聚集。因此，“交联抗体”激动剂就具有了更高的组织选择性,在肿瘤微环境中抗体才能产生明显的激动作用,而在身体正常组织部位,作用能力会保持在低水平,这样就能提高治疗的安全窗。

分别取3×10⁵个/管如实施例1.1中获得的NF-κB-GFP+hOX40报告细胞，分别加入如实施例1.4中获得的稀释至不同浓度的抗OX抗体，利用HEL抗体做阴性对照；为了交联，各组同时加入2.5μg/ml 浓度的二抗，即山羊抗人Fc。在含有10％胎牛血清(BiologicalIndustries，04-001-1A)的RPMI 1640培养基(Lifetechnologies， C11875500CP)中37℃共同培养24h后，PBS洗三次，应用流式细胞仪进行分析。获得的数据使用GraphPad Prism 6.0拟合曲线并计算 EC50。结果如图7所示，其中2-2-1对OX40的激活依赖二抗交联，以交联形式激活NF-κB-GFP+hOX40报告细胞系(图7)。

虽然上文已经结合优选实施方式描述了本发明的原理，但应当清楚地理解，该描述仅通过示例的方式进行，而非作为对本发明的范围的限制。

序列表

Claims

1.一种分离的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含：

(a)具有SEQ ID NO:1所示重链CDR1结构域，SEQ ID NO:2所示重链CDR2结构域，和SEQID NO:3所示重链CDR3结构域的重链可变区；和具有SEQ ID NO:9所示轻链CDR1结构域，SEQID NO:10所示轻链CDR2结构域，和SEQ ID NO:11所示轻链CDR3结构域的轻链可变区；

(b)具有SEQ ID NO:17所示重链CDR1结构域，SEQ ID NO:18所示重链CDR2结构域，和SEQ ID NO:19所示重链CDR3结构域的重链可变区；和具有SEQ ID NO:25所示轻链CDR1结构域，SEQ ID NO:26所示轻链CDR2结构域，和SEQ ID NO:27所示轻链CDR3结构域的轻链可变区；或

(c)具有SEQ ID NO:33所示重链CDR1结构域，SEQ ID NO:34所示重链CDR2结构域，和SEQ ID NO:35所示重链CDR3结构域的重链可变区；和具有SEQ ID NO:41所示轻链CDR1结构域，SEQ ID NO:42所示轻链CDR2结构域，和SEQ ID NO:43所示轻链CDR3结构域的轻链可变区。

2.根据权利要求1所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含：

(a)SEQ ID NO:4所示重链可变区，或与SEQ ID NO:4所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；和SEQ ID NO:12所示轻链可变区，或与SEQID NO:12所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区；

(b)SEQ ID NO:20所示重链可变区，或与SEQ ID NO:20所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；和SEQ ID NO:28所示轻链可变区，或与SEQID NO:28所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区；或

(c)SEQ ID NO:36所示重链可变区，或与SEQ ID NO:36所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变区；和SEQ ID NO:44所示轻链可变区，或与SEQID NO:44所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变区。

3.根据权利要求1或2所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其进一步包含重链恒定区和轻链恒定区；

优选地，所述重链恒定区为SEQ ID NO:5或21所示重链恒定区，或与SEQ ID NO:5所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链恒定区；和/或

优选地，所述轻链恒定区为SEQ ID NO:13所示轻链恒定区，或与SEQ ID NO:13所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链恒定区。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其进一步包含连接到所述重链可变区的重链信号肽和/或连接到所述轻链可变区的重链信号肽；

优选地，所述重链信号肽为SEQ ID NO:6所示重链信号肽，或与SEQ ID NO:6所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链信号肽；和/或

优选地，所述轻链信号肽为SEQ ID NO:14所示轻链信号肽，或与SEQ ID NO:14所示序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链信号肽。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其为IgG抗体或其抗原结合片段，优选为IgG1抗体或其抗原结合片段。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其为单克隆抗体或其抗原结合片段。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段为Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv或sdAb。

8.一种抗体-药物缀合物，其包含根据权利要求1-7中任一项所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段和另外的治疗剂；优选地，所述抗OX40抗体或其抗原结合片段与所述另外的治疗剂通过接头连接。

9.一种核酸，其编码根据权利要求1-7中任一项所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段。

10.根据权利要求9所述的核酸，其包含：

11.一种表达载体，其包含根据权利要求9或10所述的核酸。

12.一种宿主细胞，其包含根据权利要求9或10所述的核酸或根据权利要求11所述的表达载体。

13.一种用于产生根据权利要求1-7中任一项所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在适合于抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养根据权利要求12所述的宿主细胞，和从培养基中回收表达的抗体或其抗原结合片段。

14.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-7中任一项所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求8所述的抗体-药物缀合物，或根据权利要求9或10所述的核酸，或根据权利要求11所述的表达载体，及药学上可接受的载体。

15.根据权利要求1-7中任一项所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求8所述的抗体-药物缀合物，或根据权利要求14所述的药物组合物，其用于治疗癌症。

16.根据权利要求15所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段或者抗体-药物缀合物或者药物组合物，其中所述癌症选自鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌，肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端黑素瘤、结节性黑素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病、水肿(例如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖、脑瘤和脑癌、以及头颈癌，及相关转移。

17.一种用于治疗癌症的方法，其包括向需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-7中任一项所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求8所述的抗体-药物缀合物，或根据权利要求14所述的药物组合物，从而治疗所述癌症。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述癌症选自鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌，肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端黑素瘤、结节性黑素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病、水肿(例如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖、脑瘤和脑癌、以及头颈癌，及相关转移。

19.根据权利要求1-7中任一项所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求8所述的抗体-药物缀合物，或根据权利要求14所述的药物组合物，在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

20.根据权利要求19所述的用途，其中所述癌症选自鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌，肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端黑素瘤、结节性黑素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病、水肿(例如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖、脑瘤和脑癌、以及头颈癌，及相关转移。

21.根据权利要求1-7中任一项所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求8所述的抗体-药物缀合物，或根据权利要求14所述的药物组合物，其用于下述一项或多项：抑制Treg功能(例如抑制Treg的遏制性功能)、杀死表达OX40的细胞(例如表达高水平OX40的细胞)、提高效应T细胞功能和/或提高记忆T细胞功能、降低肿瘤免疫、增强T细胞功能和/或消减表达OX40的细胞。

22.根据权利要求1-7中任一项所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求8所述的抗体-药物缀合物，或根据权利要求14所述的药物组合物，在制备用于治疗下述一项或多项的药物中的用途：抑制Treg功能(例如抑制Treg的遏制性功能)、杀死表达OX40的细胞(例如表达高水平OX40的细胞)、提高效应T细胞功能和/或提高记忆T细胞功能、降低肿瘤免疫、增强T细胞功能和/或消减表达OX40的细胞。

23.一种药物组合，其包含根据权利要求1-7中任一项所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求8所述的抗体-药物缀合物，或根据权利要求14所述的药物组合物，以及一种或多种另外的治疗剂。

24.一种试剂盒，其包括根据权利要求1-7中任一项所述的抗OX40抗体或其抗原结合片段，或根据权利要求8所述的抗体-药物缀合物，或根据权利要求14所述的药物组合物，优选其进一步包括给药装置。