CN113029978A - 一种检测含镧试剂的磷结合能力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测含镧试剂的磷结合能力的方法，所述方法包括以下步骤：a)制备有机酸缓冲液：b)制备磷酸盐标准溶液；c)制备样品溶液并检测：称取样品，以有机酸缓冲液稀释，得到样品溶液；精密加入磷酸盐标准溶液，并振摇，取反应液，用水定容至一定体积，计为供试品溶液，使用钼锑抗法检测磷含量，测定吸光度；d)取与步骤c)等量的磷酸盐标准溶液，用水定容至与步骤c)等体积，计为对照品溶液，使用钼锑抗法检测磷含量；e)计算磷结合能力。本发明的方法操作简便，成本低，近似于消化道体液环境，可准确评价含镧试剂的磷结合能力。

Description

一种检测含镧试剂的磷结合能力的方法

技术领域

本发明属于化学检测领域，涉及一种检测含镧试剂的磷结合能力的方法。

背景技术

高磷血症是由于肾代谢异常，导致血液内磷酸盐含量超过正常水平的一种疾病；是慢性肾衰，尤其是终末期肾脏病患者的常见并发症，可见于80％的透析患者。大量资料显示：高磷血症刺激甲状旁腺分泌大量的甲状旁腺激素(PTH)，是引起继发性甲状旁腺功能亢进(SHPT)、钙磷乘积变化、维生素D代谢障碍、肾性骨病的重要因素。高磷血症与冠脉病变、心瓣膜钙化等严重心血管并发症亦密切相关，严重降低患者的生活质量，是死亡率增加的主要原因。

目前慢性肾衰高磷血症的治疗措施主要有限制磷摄入、充分透析、使用磷结合剂以及必要时采用甲状旁腺切除术。由于磷在自然界分布极为广泛，几乎存在于各种食物中，且蛋白质含量高者磷含量亦高，故限磷饮食不易实现，临床依从性差，也难以维持充分营养，有90％～95％的终末期肾病患者需要通过使用磷结合剂来减少肠道对磷的吸收以治疗高磷血症。

磷结合剂的一项重要质量指标是磷结合能力。CN96193918.4中建立了一种评价不同结晶水碳酸镧样品的磷结合能力的方法，包括以下的操作：

a)将13.75g无水Na₂HPO₄、8.5gNaCl溶解在1L去离子水中制备成基础溶液；

b)加入浓盐酸将100ml基础溶液调节至pH3；

c)取5ml试样通过0.02μm的过滤器，得到时间0的试样。用δ诊断比色磷试剂盒对其进行分析；

d)加入5ml新鲜的基础溶液使得重新达到100ml，并重新将pH值调到3左右；

e)加入一定量的干粉状碳酸镧水合物使镧比磷酸盐过剩两倍的摩尔数，并在室温下搅拌；

f)以0.5～10分钟的时间间隔进行取样，如上述c)的操作测定磷酸盐的百分比。

之后的专利文献CN103127042A、CN 103127041A、TW201613560A都基本用该方法检测磷结合能力。如CN103127042A公开的方法包括以下步骤：

1)磷酸盐溶液的配制：称取无水磷酸二氢钾0.2197g溶于水，将其移入1000ml容量瓶中，加5ml硫酸溶液，用水稀释定容至刻度，得含磷50.0μg/ml的磷酸盐溶液；

2)与磷的结合：称取以镧的量计为13.9mg的碳酸镧、乳酸镧半水合物、乳酸镧三水合物、乳酸镧四水合物、乳酸镧六水合物，分别加入至1～6号装有100ml步骤1)所得磷酸盐溶液的烧杯中，搅拌下充分与磷结合60分钟。

3)含量测定：将1～6号以未加入含镧化合物前的浓度计算，按比例稀释到5.0μg/ml，取5ml加入到25ml容量瓶中，加10ml水稀释，然后在容量瓶中加入1ml 10％抗坏血酸溶液，混匀，30秒后加2ml钼酸盐溶液，充分混匀，放置15分钟后离心分离，取上清液采用钼锑抗法测定，进一步可得各水样中剩余的含磷量。

然而，磷结合能力是磷结合剂有效性的重要评价指标，必须对其进行研究和评价。现有技术是否能够应用聚苯乙烯磺酸镧的测定尚不清楚，因此有必要进一步开发新的含镧的磷结合剂的检测方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种检测含镧试剂的磷结合能力的方法。发明人经过反复试验，开发了以有机酸缓冲液为标准液及样品制备体系的测定方法，在本发明提供的缓冲体系下可以更加准确的检测含镧试剂与磷的结合，通过计算除去磷的质量来评估含镧试剂与磷结合的能力。本发明检测方法以一定pH值的缓冲液作为标准液及样品制备体系，经验证，和现有技术相比能够更准确的测定磷结合能力，也更适用于聚苯乙烯磺酸镧样品的特性。

一方面，本发明提供了一种用于检测含镧试剂与磷结合能力的方法，所述方法包括以下步骤：

a)制备有机酸缓冲液：

b)制备磷酸盐标准溶液：以步骤a)的有机酸缓冲液配置得到磷酸盐标准溶液；

c)用步骤a)的有机酸缓冲液配置含镧样品溶液，加入磷酸盐标准溶液，计为供试品溶液，使用钼锑抗法检测磷含量；

d)取与步骤c)等量的磷酸盐标准溶液，用水定容至与步骤c)等体积，计为对照品溶液，使用钼锑抗法检测磷含量；

e)通过磷含量的降低计算单位量的镧结合磷的能力。

在一种优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：

a)制备有机酸缓冲液：称取有机酸的金属盐或铵盐，加水使之溶解，用酸调节pH值得到有机酸缓冲液；

b)制备磷酸盐标准溶液；称取磷酸盐，以步骤a)的有机酸缓冲液稀释，得到磷酸盐标准溶液；

c)制备样品溶液并检测：称取含镧试剂样品，以有机酸缓冲液稀释，得到含镧试剂样品溶液；精密加入磷酸盐标准溶液，并振摇，取反应液，用水定容至一定体积，计为供试品溶液，使用钼锑抗法，测定吸光度；

d)取与步骤c)等量的磷酸盐标准溶液，用水定容至与步骤c)等体积，计为对照品溶液，使用钼锑抗法检测磷含量；

e)通过磷含量的降低计算单位量的镧结合磷的能力。

根据本发明所述的方法，所述含镧磷结合剂为碳酸镧和/或聚苯乙烯磺酸镧，或者含有碳酸镧和/或聚苯乙烯磺酸镧的组合物。

根据本发明所述的方法，其中在步骤a)中，所述有机酸缓冲液使用有机酸的金属盐或铵盐制备，其中所述有机酸的金属盐或铵盐中的酸根选自甲酸根、乙酸根、丙酸根、烷基硫酸根、烷基磺酸根和枸橼酸根。其中，所述有机酸的金属盐中的金属离子选自钠离子和钾离子。

根据本发明所述的方法，具体采用以下公式计算：

其中，

A：供试品溶液吸光度；

A₀：对照溶液吸光度；

C₀：磷酸盐标准溶液中的磷浓度，单位为g/ml；

V：磷酸盐标准溶液的用量，单位为ml；

W：含镧试剂称样量，单位为g；

F：含镧试剂中镧的百分含量。

根据本发明所述的方法，其中在步骤a)中，所述有机酸的金属盐或铵盐的质量分数为0.5～10％。

根据本发明所述的方法，其中在步骤a)中，所述pH为3～8。

根据本发明所述的方法，其中在步骤a)中，使用盐酸、硫酸、甲酸、乙酸、丙酸、烷基硫酸、烷基磺酸或枸橼酸调节pH。

根据本发明所述的方法，其中在步骤b)中，所述磷酸盐选自磷酸钠、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾和磷酸铵以及它们的水合物中的一种或多种。

根据本发明所述的方法，其中在步骤c)和步骤d)中，所述钼锑抗法检测磷含量包括以下步骤：

①抗坏血酸溶液的配制：称取抗坏血酸，以水稀释；

②钼酸盐溶液的配制：将钼酸铵和酒石酸锑钾溶解于水中，在搅拌下，把钼酸铵溶液加到硫酸溶液中，再加入酒石酸锑钾溶液并混合均匀；

③取等量的步骤c)的供试品溶液和步骤d)的对照品溶液，分别加抗坏血酸溶液，混匀静置后加钼酸盐，分别使用紫外分光光度计在选定的波长处测定吸光度。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：通过聚苯乙烯磺酸镧释放体系的筛选，建立了聚苯乙烯磺酸镧磷结合能力的检测方法，实验证明操作简便，成本低，近似于消化道体液环境，可准确评价聚苯乙烯磺酸镧磷结合能力。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例1

a)制备的pH3.0甲酸钠缓冲液：称取甲酸钠41g，加水1000ml使之溶解，用甲酸调节pH3.0即得；

b)制备磷酸盐标准溶液：称取磷酸铵0.62g，以pH3.0甲酸钠缓冲液稀释至100ml；

c)制备样品溶液并检测：钼酸盐溶液的配制：分别溶解13g钼酸铵和0.35g酒石酸锑钾于100ml水中。在不断搅拌下，把钼酸铵溶液徐徐加到300ml 50％浓硫酸中，再加入酒石酸锑钾溶液并混合均匀。

抗坏血酸溶液的配制：称取抗坏血酸5g，以水稀释至50ml。

样品溶液的制备：称取样品约178mg，精密称定，于250ml锥形瓶中，加入pH6.8的醋酸钠溶液90ml，再精密加入磷酸盐标准溶液20.0ml，于37℃水浴振摇4h，取反应液1.0ml，12000rpm离心10min，取离心后上清液0.5ml，置25ml量瓶，用水稀释定容至刻度，取5.0ml置25ml容量瓶中，加1ml抗坏血酸溶液，混匀静置30s，加2ml钼酸盐溶液，用适量水定容至刻度，充分混合均匀，作为供试品溶液。

取磷酸盐标准溶液0.05ml，置25ml量瓶，用水稀释定容至刻度，取5ml置25ml容量瓶中，加1ml抗坏血酸溶液，混匀静置30s，加2ml钼酸盐溶液，用适量水定容至刻度，充分混合均匀，作为对照溶液。供试品溶液和对照溶液分别静置15min后，使用紫外分光光度计在600nm波长处，测定吸光度。测试结果见表1。

表1采用本发明方法得到的磷结合能力测定结果

从表1数据可以看出，采用本发明方法，能够测定碳酸镧和聚苯乙烯磺酸镧的磷结合能力，且重复性好、数值稳定。

对比例1

本对比例使用现有方法(CN96193918.4中所述的方法)测定碳酸镧和聚苯乙烯磺酸镧的磷结合能力，结果如表2所示。

表2采用现有方法得到的磷结合能力测定结果

从表2数据可以看出，使用现有方法能够测定碳酸镧的磷结合能力，三次测定结果较为一致，可重复性好。但是，使用该方法测定聚苯乙烯磺酸镧的磷结合能力，结果波动较大，重复性比较差，因此现有方法不适用于聚苯乙烯磺酸镧的检测。

申请人通过分析碳酸镧和聚苯乙烯磺酸镧的特点认为，出现这一结果的原因可能在于，现有技术中的检测方法均是根据无机酸镧盐而建立的，无机酸镧盐能够溶于浓盐酸，在pH3溶液中呈现离子态，镧离子和磷酸根立即生成磷酸镧沉淀。而聚苯乙烯磺酸镧是将镧离子与强酸性阳离子树脂相结合形成的有机酸镧盐，不溶于水和一般酸、碱溶液及有机溶剂，是一种有良好化学稳定性的高分子聚合物。离子交换树脂的离子交换有选择性，和溶液的pH值无关，在pH3溶液中不会完全释放出镧离子，其方法也就不能准确检测聚苯乙烯磺酸镧的磷结合能力；同时，聚苯乙烯磺酸镧还与其它阳离子存在交换，自胃(酸性环境)至肠道(中性环境)均有镧离子释放，有一定的除磷能力，以上磷结合能力的检测方法也不能检测聚苯乙烯磺酸镧在不同pH环境下的磷结合能力。因此需要进一步开发新的检测方法。

将表1与表2数据比较可知，本发明方法测定碳酸镧与现有技术测定结果相同，准确性较高，而且本发明方法也能够准确测定聚苯乙烯磺酸镧的磷结合能力。

实施例2

使用实施例1的方法对不同批次的聚苯乙烯磺酸镧样品进行检测，测定结果如下：

表3聚苯乙烯磺酸镧的磷结合能力测定结果

批号	1014	1018	1109	1114	1115
						1g镧除去磷(g)	0.259	0.256	0.239	0.234	0.244

从表3数据可以看出，不同批次的聚苯乙烯磺酸镧磷结合能力差异较小，证明该方法可用于聚苯乙烯氨磺酸镧磷结合能力的测定。

实施例3

本实施例采用本发明的方法在不同pH下检测聚苯乙烯磺酸镧的磷结合能力。

聚苯乙烯磺酸镧的特点是在不同pH下均能表现出磷结合能力，这一点是碳酸镧所不具备的，现有技术的检测方法也不能实现对不同pH下的磷结合能力进行测定，测定结果如表4所示。

中性条件下测定方法如下：

a)制备的pH6.8醋酸钠缓冲液：称取枸橼酸钾100g，加水1000ml使之溶解，用盐酸调节pH6.8即得。

b)制备磷酸盐标准溶液：称取磷酸二氢钠0.72g，以pH6.8枸橼酸钾缓冲液稀释至100ml。

c)制备样品溶液并检测：钼酸盐溶液的配制：分别溶解13g钼酸铵和0.35g酒石酸锑钾于100ml水中。在不断搅拌下，把钼酸铵溶液徐徐加到300ml 50％浓硫酸中，再加入酒石酸锑钾溶液并混合均匀。

抗坏血酸溶液的配制：称取抗坏血酸5g，以水稀释至50ml。

称取聚苯乙烯磺酸镧约178mg，精密称定，于250ml锥形瓶中，加入pH6.8的醋酸钠溶液90ml，再精密加入磷酸盐标准溶液15.0ml，于37℃水浴振摇4h，取反应液1.0ml，12000rpm离心10min，取离心后上清液0.5ml，置25ml量瓶，用水稀释定容至刻度，取5.0ml置25ml容量瓶中，加1ml抗坏血酸溶液，混匀静置30s，加2ml钼酸盐溶液，用适量水定容至刻度，充分混合均匀，作为供试品溶液。

取磷酸盐标准溶液0.05ml，置25ml量瓶，用水稀释定容至刻度，取5ml置25ml容量瓶中，加1ml抗坏血酸溶液，混匀静置30s，加2ml钼酸盐溶液，用适量水定容至刻度，充分混合均匀，作为对照溶液。供试品溶液和对照溶液分别静置15min后，使用紫外分光光度计在700nm波长处，测定吸光度。

表4聚苯乙烯磺酸镧磷结合能力测定结果

批号	1014	1018	1109	1114	1115
						1g镧除去磷(g)	0.244	0.266	0.234	0.234	0.251

可以看出，本发明方法可以实现对中性条件下聚苯乙烯磺酸镧的磷结合能力的检测。

实施例4

本实施例采用本发明的方法检测碱性条件下的磷结合能力。

a)制备的pH8.0醋酸钾缓冲液：称取醋酸钾5g，加水1000ml使之溶解，用醋酸调节pH8.0即得。

b)制备磷酸盐标准溶液：称取无水磷酸氢二钾0.85g，以pH8.0醋酸钾缓冲液稀释至100ml。

c)制备样品溶液并检测：钼酸盐溶液的配制：分别溶解13g钼酸铵和0.35g酒石酸锑钾于100ml水中。在不断搅拌下，把钼酸铵溶液徐徐加到300ml 50％浓硫酸中，再加入酒石酸锑钾溶液并混合均匀。

抗坏血酸溶液的配制：称取抗坏血酸5g，以水稀释至50ml。

样品溶液的制备：称取聚苯乙烯磺酸镧约178mg，精密称定，于250ml锥形瓶中，加入pH6.8的醋酸钠溶液90ml，再精密加入磷酸盐标准溶液5.0ml，于37℃水浴振摇4h，取反应液1.0ml，12000rpm离心10min，取离心后上清液0.5ml，置25ml量瓶，用水稀释定容至刻度，取5.0ml置25ml容量瓶中，加1ml抗坏血酸溶液，混匀静置30s，加2ml钼酸盐溶液，用适量水定容至刻度，充分混合均匀，作为供试品溶液。

取磷酸盐标准溶液0.05ml，置25ml量瓶，用水稀释定容至刻度，取5ml置25ml容量瓶中，加1ml抗坏血酸溶液，混匀静置30s，加2ml钼酸盐溶液，用适量水定容至刻度，充分混合均匀，作为对照溶液。供试品溶液和对照溶液分别静置15min后，使用紫外分光光度计在800nm波长处，测定吸光度。测试结果见表5。

表5聚苯乙烯磺酸镧的磷结合能力测定结果

批号	1014	1018	1109	1114	1115
						1g镧除去磷(g)	0.239	0.246	0.246	0.237	0.239

可以看出，本发明方法可以实现对碱性条件下聚苯乙烯磺酸镧的磷结合能力的检测。

综上，本发明给出了精确测定聚苯乙烯磺酸镧磷结合能力的方法，该方法同样适用于其他含镧试剂，而且能够测定不同pH条件下的磷结合能力，为磷结合试剂的大规模工业化生产的质量控制，临床应用检测提供了方法学保障。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种用于检测含镧试剂的磷结合能力的方法，所述方法包括以下步骤：

a)制备有机酸缓冲液：

b)制备磷酸盐标准溶液：以步骤a)的有机酸缓冲液配置得到磷酸盐标准溶液；

c)用步骤a)的有机酸缓冲液配置含镧样品溶液，加入磷酸盐标准溶液，计为供试品溶液，使用钼锑抗法检测磷含量；

d)取与步骤c)等量的磷酸盐标准溶液，用水定容至与步骤c)等体积，计为对照品溶液，使用钼锑抗法检测磷含量；

e)通过磷含量的降低计算单位量的镧结合磷的能力。

2.根据权利要求1的方法，所述含磷试剂为碳酸镧和/或聚苯乙烯磺酸镧，或者含有碳酸镧和/或聚苯乙烯磺酸镧的组合物。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤a)中，有机酸缓冲液使用有机酸的金属盐或铵盐制备，其中所述有机酸的金属盐或铵盐中的酸根选自甲酸根、乙酸根、丙酸根、烷基硫酸根、烷基磺酸根和枸橼酸根；所述有机酸的金属盐中的金属离子选自钠离子和钾离子。

4.根据权利要求1至3中任一所述的方法，具体采用以下公式计算：

其中，

A：供试品溶液吸光度；

A₀：对照溶液吸光度；

C₀：磷酸盐标准溶液中的磷浓度，单位为g/ml；

V：磷酸盐标准溶液的用量，单位为ml；

W：含镧试剂称样量，单位为g；

F：含镧试剂中镧的百分含量。

5.根据权利要求1至4中任一所述的方法，其中在步骤a)中，所述有机酸的金属盐或铵盐的质量分数为0.5～10％。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在步骤a)中，所述pH为3～8。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在步骤a)中，使用盐酸、硫酸、甲酸、乙酸、丙酸、烷基硫酸、烷基磺酸和/或枸橼酸调节pH。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在步骤b)中，所述磷酸盐选自磷酸钠、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾和磷酸铵以及它们的水合物中的一种或多种。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在步骤c)和步骤d)中，所述钼锑抗法检测磷含量包括以下步骤：

①抗坏血酸溶液的配制：称取抗坏血酸，以水稀释；

②钼酸盐溶液的配制：将钼酸铵和酒石酸锑钾溶解于水中，在搅拌下，把钼酸铵溶液加到硫酸溶液中，再加入酒石酸锑钾溶液并混合均匀；

③取等量的步骤c)的供试品溶液和步骤d)的对照品溶液，分别加抗坏血酸溶液，混匀静置后加钼酸盐，分别使用紫外分光光度计在选定的波长处测定吸光度。