CN113025688A

CN113025688A - 一种基于定制的纳米孔直接RNA测序逆转录接头检测全长非poly(A)转录本的方法

Info

Publication number: CN113025688A
Application number: CN202110347673.4A
Authority: CN
Inventors: 席飞虎; 胡凯强; 陈凯; 高鹏飞; 周裕涵; 顾连峰
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2021-03-31
Filing date: 2021-03-31
Publication date: 2021-06-25

Abstract

本发明名公开了一种基于Oxford Nanopore Technologies的序列特异性直接RNA测序文库构建方法及应用，属于三代高通量测序技术领域。其构建方法为：总RNA的提取和质量控制；从总RNA中去除rRNA和质量控制；设计序列特异性逆转录接头的设计、构建和质量控制；基于Oxford Nanopore Technologies的直接RNA测序文库构建；序列特异性RNA的检测。本方法重新设计ssRTA并将其应用于基于Oxford Nanopore Technologies的直接RNA测序文库，主要应用于测定不带ploy(A)尾的线性转录本，这是以往任何流程无法做到的。

Description

一种基于定制的纳米孔直接RNA测序逆转录接头检测全长非 poly(A)转录本的方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于Oxford Nanopore Technologies的序列特异性直接RNA测序文库构建方法及应用。

背景技术

基于Oxford Nanopore Technologies的直接RNA测序是目前唯一能够直接对天然的RNA分子进行全长单分子测序的技术，其标准文库构建流程是先通过将含有Oligo d(T)的逆转录接头（RTA）连接至所有3’末端具备Poly(A)结构的待测RNA分子，接着进行逆转录生成cDNA第一链，然后将测序接头（RMX）连接至RTA末端后完成文库构建，具有超长读长、单分子实时测序、直接读取RNA分子天然碱基修饰信息等特点。但局限于RTA的序列，目前的方法仅能够对3’末端具备Poly(A)结构的RNA分子测序。

本发明基于Oxford Nanopore Technologies直接RNA测序技术，设计开发了序列特异性逆转录接头（ssRTA），实现了专门针对不具备3’ Poly（A）结构的RNA进行全长单分子直接测序，丰富了直接RNA测序所能检测到的转录本的种类。

发明内容

本发明提供了一种基于Oxford Nanopore Technologies的序列特异性直接RNA测序文库构建方法及应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种基于Oxford Nanopore Technologies的序列特异性直接RNA测序文库构建方法及应用，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）总RNA的提取和质量控制；（2）从总RNA中去除rRNA和质量控制；（3）序列特异性逆转录接头（ssRTA）的设计、构建和质量控制；（4）基于Oxford Nanopore Technologies的直接RNA测序文库构建；（5）序列特异性RNA的检测。可选地，所述总RNA样本来源于植物、动物或人。

上述步骤（1），总RNA的提取和质量控制包括：

将毛竹实生苗处理洁净，如图1所示。

进一步的，用TIANGEN RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA试剂盒提取样本总RNA。

更进一步的，用1.0%琼脂糖凝胶电泳（6V/cm）检测总RNA样本降解程度，如图2所示。

更进一步的，用Qubit荧光计精确定量总RNA样本。

更进一步的，用Nanodrop 2000c分光光度计检测总RNA样本纯度，以A 260/280和A260/230表征。

更进一步的，用Agilent 2100生物分析仪测定总RNA样本RIN值，用RIN值 > 8.0的样本进行后续实验，如图3所示。

上述步骤（2），从总RNA中去除rRNA和质量控制包括：

用RiboMinus^TM Plant kit for RNA-seq（ThermoFisher, Cat. No. A1083808）从总RNA样本中去除rRNA，得到Ribo- RNA样本。

进一步的，用1.0%琼脂糖凝胶电泳（6V/cm）检测去除rRNA效果，如图4所示。

上述步骤（3），序列特异性逆转录接头（ssRTA）的设计、构建和质量控制：

合成2条引物，SEQ ID NO.1:

5’ - /PHOS/ GGCTTCTTCTTGCTCTTAGGTAGTAGGTTC - 3’，

SEQ ID NO.2:

5’ - GAGGCGAGCGGTCAATTTTCCTAAGAGCAAGAAGAAGCCNNNNNNNNNN - 3’，下划线部分为2条引物20 bp的互补区域；

进一步的，将2条引物干粉用无菌的去离子水溶解，等量混匀，置于PCR仪95℃保持10 min，然后以0.1℃/s的速度缓慢退火至30℃。

更进一步的，取5 μL制备好的ssRTA，用PCR仪在98℃孵育2 min，后立即置于冰上，然后用Nanodrop 2000c分光光度计测定孵育前后的ssRTA在260 nm处吸光值的变化，如图5所示。

上述步骤（4），基于Oxford Nanopore Technologies的直接RNA测序文库构建包括：

用快速连接缓冲液（NEB, B6058）和T4 DNA连接酶（NEB, M0202），将序列特异性逆转录接头（ssRTA）连接至Ribo- RNA末端。

进一步的，用SuperScript III逆转录酶（ThermoFisher, 18080044）逆转录合成cDNA第一链。

更进一步的，用直接RNA测序试剂盒（ONT, SQK-RNA002）和T4 DNA连接酶将测序接头（RMX）连接至待测RNA样本末端。

更进一步的，用R9.4.1测序芯片（ONT）承载文库，在MinION MK 1B设备（ONT）上测序，用MinKNOW软件（ONT，版本: 19.06.7）控制直接RNA测序进程，如图6所示。

本发明的优点在于：

基于Oxford Nanopore Technologies直接RNA测序技术，设计开发了序列特异性逆转录接头（ssRTA），实现不具备3’ Poly（A）结构的RNA的全长单分子直接测序，丰富了直接RNA测序转录本种类信息。

附图说明：

图1为毛竹实生苗。

图2为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA样本降解程度结果；其中M表示Marker；1，2，3泳道分别为同一材料粉末的三个不同的技术重复；28 s和18 s rRNA条带清晰可见，肉眼未观察到更小条带或拖带现象，表明总RNA样本未降解。

图3为总RNA样本RIN值测定结果；其中左侧为Agilent 2100生物分析仪得到的RNA片段大小峰图，右侧为Agilent 2100生物分析仪得到的RNA琼脂糖凝胶电泳模拟图。

图4为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测去除rRNA效果；其中M表示Marker，Ribo+表示总RNA样本，Ribo-表示去除rRNA之后的RNA样本，去除rRNA的RNA样本的28 s和18 s rRNA条带明显消减。

图5为经高温变性后的ssRTA由于双链解开而导致的核酸分子增色效应，A260较未经高温变性的ssRTA有明显提升，故双链处理的ssRTA可用于下游文库构建。

图6为MinKNOW软件实时显示每个测序通道的运行状态；458个通道处于测序状态，44个通道处于待测序状态，2个通道处于阻塞状态，3个通道处于失活关闭状态，5个通道处于非上述四种状态的未分类状态。

图7为基于本专利方法检测毛竹实生苗中环状RNA的效果。

具体实施方式

以下以毛竹（Phyllostachys edulis）实生苗为例，对本发明具体实施方案进行详述，实施例仅以阐明本发明为目的，不视为限制本发明的适用范围。实施例中涉及实验设备及试剂均可通过市场购买。

实施例1 总RNA的提取和质量控制

（1）毛竹实生苗总RNA的提取

将毛竹实生苗处理至如图1所示的洁净状态用于总 RNA提取。用TIANGEN公司RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（Cat. No. DP441）提取总RNA。所有EP管,移液枪头均为RNase-free。

a. 将材料用锡纸包裹后用液氮速冻，10 min后迅速装填入液氮预冷的组织研磨罐（QIAGEN, Cat. No. 69985），用高通量组织研磨仪（QIAGEN, Cat. No. 85300）在30次/s震动频率下，充分研磨90 s。

b. 取约100 mg粉末转入1.5 mL RNase-free的EP管，加入500 μL SL（含有10% β-巯基乙醇），立即通过涡旋振荡器剧烈震荡混匀20 s。

c. 以13000 rpm转速离心2 min。

d. 将上清液转移至CS过滤柱（过滤柱置于收集管中），13000 rpm离心2 min，吸取收集管中上清液至新的RNase-free EP管（约350 μL，用移液枪量取精确体积），避免枪头接触沉淀。

e. 缓慢加入0.4倍上清液体积的无水乙醇，轻柔混匀（可观察到混匀过程中慢慢出现白色絮状沉淀），将管内所有内含物转移至CR3吸附柱中，13000 rpm离心30 s，弃收集管中废液，将CR3吸附柱放回收集管。

f. 向吸附柱中加入350 μL RW1去蛋白液，13000 rpm离心30 s，弃收集管中废液，将CR3吸附柱放回收集管。

g. 用70 μL RDD溶液和10 μL DNase I储存液混合制成DNase I工作液，将其加入CR3吸附柱中央，室温下孵育15 ~ 20 min。

h. 重复步骤f。

i. 向吸附柱中加入500 μL RW漂洗液，13000 rpm离心30 s，弃收集管中废液，将CR3吸附柱放回收集管。

j. 重复步骤i。

k. 13000 rpm空离2 min，将CR3吸附柱放入新的RNase-free EP管，向吸附膜中央滴加35 ~ 55 μL RNase-free 水，室温放置2 min，13000 rpm离心1 min。

l. 将步骤k得到的RNA溶液再加入CR3吸附柱中央，回溶1次，室温放置2 min，13000 rpm离心5 min，得到最终总RNA溶液，迅速置于冰上备用。

（2）琼脂糖凝胶电泳检测总RNA样本降解程度

吸取1 μL总RNA溶液，用RNase-free 水稀释5倍，与1 μL 6× loading buffer混匀后，在6 V/cm电压下运行琼脂糖凝胶电泳25 min，质量控制结果如图2所示。

（3）Qubit荧光计精确定量总RNA样本

使用和Qubit™ RNA HS Assay Kit（ThermoFisher, Cat. No. Q32855）对总RNA样本进行精确定量。定量浓度上限100 ng/μL，开始以下步骤前，将总RNA用RNase-free水稀释。

a. 为标准品和样品设置所需数量的0.5 mL测定管。Qubit™ RNA HS Assay Kit需要2个标准品。

特别地，仅使用薄壁，透明，0.5 mL管。可用的测定管包括Qubit™ Assay Tube（ThermoFisher, Cat. No. Q32856），Axygen^TM PCR-05-C试管（Axygen, Cat. No. 10011-830）。优选地，使用Qubit™ Assay Tube。

b. 标记管盖。

特别地，勿标记管的侧面，这可能会干扰样品读数。Qubit荧光计的校准要求将标准品以正确的顺序插入仪器中。

c. 通过在Qubit^TM RNA HS缓冲液中稀释Qubit^TM RNA HS试剂1：200来制备Qubit^TM工作溶液。每次准备Qubit^TM工作溶液时，使用干净的塑料管，不要将工作溶液混入玻璃容器中。

特别地，每个管中的最终体积必须为200 μL。每个标准管需要190 μL Qubit^TM工作溶液，每个样品管需要180-199 μL。准备足够的Qubit^TM工作液，以适应所有标准和样品。

d. 在每个用于标准品的试管中加入190 μL Qubit^TM工作溶液。

e. 将10 μL每种Qubit^TM标准品加入适当的试管中，然后涡旋混合2-3秒。小心不要产生气泡。

特别地，仔细移液对于确保在190 μL Qubit^TM工作溶液中添加10 μL每种Qubit^TM标准品至关重要。

f. 将Qubit^TM工作溶液添加到各个试管中，以便添加样品后每个试管中的最终体积为200 μL。

特别地，样品可以是1-20 μL。在每个试管中添加相应体积的Qubit^TM工作溶液：180-199 μL。

g. 将每个样品加入含有正确体积Qubit^TM工作溶液的测定管中，然后涡旋混合2-3秒。每管中的最终体积应为200 μL。

h. 让所有测定管在室温下避光孵育2分钟。

i. 在Qubit荧光计显示屏上点击选择RNA样本，进一步选择RNA：Highsensetivity作为测定类型，屏幕显示“Standards”。

特别地，如果已对所选分析模式执行了标准曲线构建，仪器会提示在构建新的标准曲线和用之前的标准曲线进行样品测定之间进行选择。如果要使用先前的标准曲线，按No并跳至步骤m。否则，继续执行步骤j。

j. 在标准屏幕上，按Yes以测定标准品。

k. 将包含标准品＃1的试管插入样品室，关闭盖子，然后按Read。读数完成后（约3秒），取出标准品＃1。

l. 将含有标准品＃2的试管插入样品室，关闭盖子，然后按Read。读数完成后，取出标准品＃2。校准完成，屏幕显示“Sample”。

m. 将样品管插入样品室，关闭盖子，然后按Read。读数完成后（约3秒），取下样品管。仪器在“Sample”选项下显示定量结果。

n. 重复步骤m，直到对所有样本完成定量。

（4）Nanodrop 2000c分光光度计检测总RNA样本纯度

打开Nanodrop 2000c分光光度计测定软件，点击“Nucleic Acid”，待仪器自检后选择RNA测定模式，用RNase-free水作为空白对照，对总RNA样本纯度进行测定。

优选地，总RNA样本的A 260/280应在2.0左右，A 260/230应在2.0 ~ 2.2。

一般地，A 260/280低于2.0表示可能存在DNA污染，低于1.8表示可能存在蛋白或酚类物质污染。A 260/230低于2.0表示总RNA样本需要额外的纯化。

（5）Agilent 2100生物分析仪测定总RNA样本RIN值

使用Agilent 2100生物分析仪和RNA 6000 Nano Kit（Agilent, Cat. No. 5067-1511）对1 μL总RNA样本分析。结果如图3所示。

优选地，取RIN值 > 8.0的样本进行后续实验。

实施例2 从总RNA中去除rRNA和质量控制

（1）从总RNA样本中去除rRNA

用RiboMinus^TM Plant kit for RNA-seq（ThermoFisher, Cat. No. A1083808）从总RNA样本总去除rRNA。

a. 探针杂交

1). 设置2个水浴锅，1个温度为70℃，1个温度为37℃。

2). 在无菌且RNase-free的1.5 mL EP管中加入下表组分：

3). 70℃水浴锅中孵育5 min以使RNA变性。

4). 变性后的总 RNA样本放入37℃水浴锅缓慢降温30 min，每隔10 min轻弹一次。

5). 在总 RNA样本降温过程中，准备磁珠。

b. 准备磁珠

1). 通过涡旋以彻底重悬RiboMinus^TM磁珠。

2). 吸取750 μL磁珠至无菌且RNase-free的1.5 mL EP管（1号管）中。

3). 管子置于磁力架上1 min，等待磁珠聚集后，吸弃上清液。

4). 向管子中加入750 μL 无菌的DEPC水清洗磁珠，通过缓慢涡旋以重悬磁珠。

5). 将管子放回磁力架，等待1 min后磁珠聚集，吸弃上清液。

6). 重复步骤4)，5)。

7). 向管子中加入750 μL Hybirdization Buffer，通过缓慢涡旋以重悬磁珠，后转移250 μL到一个新的无菌且RNase-free的1.5 mL EP管（2号管）中，将2号管始终置于37℃水浴锅直至使用。

8). 将1号管置于磁力架上1 min，待500 μL磁珠聚集后，吸弃上清液。

9). 吸取200 μL Hybirdization Buffer轻轻吸打以重悬1号管磁珠，将1号管始终置于37℃水浴锅直至使用.

c. 去除rRNA

1). 将37℃水浴锅中缓慢降温孵育的总 RNA样本取出，置于微型离心机上短暂离心2 s。

2). 转移120 μL与探针杂交了的总 RNA样本至1号管中，通过吸打以混匀样本和磁珠。

3). 将1号管置于37℃水浴锅孵育15 min，期间每5 min轻弹混匀一次。

4). 将2号管从37℃水浴锅取出，置于磁力架上1 min待磁珠聚集，吸弃上清液。

5). 将孵育好的1号管从37℃水浴锅取出，置于磁力架上1 min待磁珠聚集，小心吸取上清液约320 μL至2号管中，轻轻吸打以重悬磁珠并混匀各组分。

6). 将2号管置于37℃水浴锅孵育15 min，期间每5 min轻弹混匀一次。

7). 将孵育好的2号管从37℃水浴锅取出，置于磁力架上1 min待磁珠聚集，小心吸取上清液至新的无菌且RNase-free的1.5 mL EP管（3号管）。

d. 收集去除rRNA之后的RNA

1). 在3号管中加入以下组分，每加一种组分，吸打混匀后再加入下一种：

2). 将3号管内组分混匀，置于-80℃冰箱静置最少30 min。优选地，静置过夜。

3). 将静置完毕的3号管取出，12000g，4℃条件下离心20 min，小心吸弃上清。

4). 向3号管中加入500μL -20℃预冷的70%乙醇，轻轻吸打重悬RNA沉淀。

5). 将3号管在12000g，4℃条件下离心20 min，小心吸弃上清。

6). 重复步骤4)，5)。

7). 室温下自然风干3号管，约5 min后，用10 ~ 30 μL DEPC水完全溶解去除rRNA的RNA样本（Ribo- RNA），。

8). 将Ribo- RNA样本用实施例1-（3）中所述方法精确定量，后将样本置于-80℃冰箱保存备用。

（2）琼脂糖凝胶电泳检测去除rRNA效果

分别吸取等质量的去除rRNA之前的总 RNA样本（Ribo+ RNA）和Ribo- RNA样本与6× loading buffer混匀后，在6 V/cm电压下运行琼脂糖凝胶电泳25 min，质量控制结果如图4所示，Ribo+ RNA样本的28 s和18 s rRNA条带清洗可见，肉眼未观察到Ribo- RNA的28s和18 s rRNA条带。

实施例4 序列特异性逆转录接头（ssRTA）的设计、构建和质量控制

（1）ssRTA的设计

设计2条引物：

SEQ ID NO.1:

5’ - /PHOS/ GGCTTCTTCTTGCTCTTAGGTAGTAGGTTC - 3’

SEQ ID NO.2:

5’ - GAGGCGAGCGGTCAATTTTCCTAAGAGCAAGAAGAAGCCNNNNNNNNNN - 3’

下划线为2条引物互补区域。

（2）ssRTA的构建

将2条引物干粉用无菌的去离子水溶解，等量混匀，置于PCR仪95℃保持10 min，然后以0.1℃/s的速度缓慢退火至30℃。

（3）ssRTA的质量控制

取5 μL制备好的ssRTA，用PCR仪在98℃孵育2 min，后立即置于冰上，然后用Nanodrop 2000c分光光度计测定孵育前后的ssRTA在260 nm处吸光值的变化。结果如图5所示，经高温变性后的ssRTA由于双链解开而导致的核酸分子增色效应，A260较未经高温变性的ssRTA有明显提升，故双链处理的ssRTA可用于下游文库构建。

实施例4 基于Oxford Nanopore Technologies的直接RNA测序文库构建

（1）将序列特异性逆转录接头（ssRTA）连接至Ribo- RNA末端

a. 取500 ng Ribo- RNA至无菌无核酸酶的1.5 mL EP管，用无核酸酶水（ThermoFisher, Cat. No. AM9937）调节至终体积9.0 μL，颠倒混匀。

b. 在0.2 mL薄壁PCR管中依顺序加入试剂，吸打混匀。

c. 室温下孵育10 min。

（2）逆转录合成第一链

a. 在无菌无核酸酶的1.5 mL EP管中混匀以下组分。

b. 将上述23.0 μL液体加入步骤（1）-b的0.2 mL薄壁PCR管中，吸打混匀。

c. 加入2.0 μL SuperScript III逆转录酶（ThermoFisher, 18080044），吸打混匀。

d. 将上述40.0 μL逆转录反应体系置于PCR仪中，条件设置为50℃ 50 min，70℃10 min，完成后取出立即置于冰上。

e. 逆转录反应完成后，将其转至菌无核酸酶的1.5 mL EP管中，用72.0 μLRNAClean XP磁珠（Beckman Coulter, Cat. No. A63987）与之混匀，在混样器上室温下孵育5 min。

f．将1.5 mL EP管置于磁力架上，待磁珠聚集液体澄清，吸弃上清液，用新鲜配制的70%乙醇清洗磁珠2遍后，将1.5 mL EP管离心5 s，放回磁力架上待磁珠聚集，吸弃任何残留液体。

g. 用20.0 μL无核酸酶水重悬磁珠，并在室温下静置孵育5 min后，放回磁力架，待磁珠聚集，将上清液转移至新的无菌无核酸酶1.5 mL EP管。

（3）测序接头（RMX）连接

a. 在无菌无核酸酶的1.5 mL EP管中混匀以下组分，吸打混匀。

b. 室温下孵育10 min。

c. 用40.0 μL RNAClean XP磁珠与之混匀，在混样器上室温下孵育5 min。

d. 将1.5 mL EP管置于磁力架上，待磁珠聚集液体澄清，吸弃上清液，用150.0 μLWSB（ONT, SQK-RNA002）清洗磁珠2遍后，将1.5 mL EP管离心5 s，放回磁力架上待磁珠聚集，吸弃任何残留液体。

e. 用21.0 μL ELB（ONT, SQK-RNA002）重悬磁珠，并在室温下静置孵育10 min后，放回磁力架，待磁珠聚集，将上清液转移至新的无菌无核酸酶1.5 mL EP管，置于冰上备用。

f. 将RNA文库用实施例1-（3）中所述方法精确定量，200 ng左右为宜。

（4）上机开始直接RNA测序

将R9.4.1测序芯片安装至连接了USB 3.0及以上接口的MinION MK 1B设备，将RNA文库加载至R9.4.1测序芯片，使用MinKNOW软件（版本：19.06.7）设置测序参数并控制测序进程。

a. 在MinKNOW UI中点击“New experiment”新建测序实验。

b. 在Experiment选项卡中设置实验和样本名称。

c. 在Kit选项卡中设置建库试剂盒型号。

d. 在Basecalling选项卡中设置开启实时碱基识别。

e. 在Run Option选项卡中设置测序实验运行时间。

f. 在Output选项卡中设置数据存储路径。

g. 点击“Start run”开始测序实验。

测序期间可监控每个测序通道的运行状态，如图6所示。

图7A表示含有m6A修饰的环状RNA的数量。外圈表示基于ssRTA方法检测到的样本中所有的环状RNA数量（428），中间圈表示可能具有RRACH motif的环状RNA数量（425），内圈表示从测序原始信号得到的含有m6A修饰的环状RNA数量（46）。图7B左上部分表示m6Amotif RRACH围绕反向拼接位点富集，图7B左下部分表示RRACH motif与5’反向拼接位点或3’反向拼接位点之间的距离，图7B右侧部分表示一个实例，PH02Gene43295基因的一个m6A位点，该位点靠近反向拼接位点。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种基于定制的纳米孔直接RNA测序逆转录接头检测全长非poly(A)转录本的

方法

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggcttcttct tgctcttagg tagtaggttc 30

<210> 2

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaggcgagcg gtcaattttc ctaagagcaa gaagaagccn nnnnnnnnn 49

Claims

1.一种基于Oxford Nanopore Technologies的序列特异性直接RNA测序文库构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）总RNA的提取和质量控制；（2）从总RNA中去除rRNA和质量控制；（3）序列特异性逆转录接头ssRTA的设计、构建和质量控制；（4）基于Oxford Nanopore Technologies的直接RNA测序文库构建；（5）序列特异性RNA的检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述总RNA的提取和质量控制包括以下步骤：

将毛竹实生苗处理洁净；

用TIANGEN RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA试剂盒提取样本总RNA；

用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA样本降解程度；

用Qubit荧光计精确定量总RNA样本；

用Nanodrop 2000c分光光度计检测总RNA样本纯度，以A 260/280和A260/230表征；

用Agilent 2100生物分析仪测定总RNA样本RIN值，用RIN值 > 8.0的样本进行后续实验。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述从总RNA中去除rRNA和质量控制包括以下步骤：用RiboMinus^TM Plant kit for RNA-seq从总RNA样本中去除rRNA，得到Ribo- RNA样本；用1.0%琼脂糖凝胶电泳（6V/cm）检测去除rRNA效果。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）所述序列特异性逆转录接头ssRTA的设计、构建和质量控制包括以下步骤：

ssRTA的设计：合成2条引物：

SEQ ID NO.1: 5’ - /PHOS/ GGCTTCTTCTTGCTCTTAGGTAGTAGGTTC - 3’；

SEQ ID NO.2:

ssRTA的构建：将2条引物干粉用无菌的去离子水溶解，等体积混匀，置于PCR仪95℃保持10 min，然后以0.1℃/s的速度缓慢退火至30℃；

ssRTA的质量控制：取5 μL制备好的ssRTA，用PCR仪在98℃孵育2 min，后立即置于冰上，然后用Nanodrop 2000c分光光度计测定孵育前后的ssRTA在260 nm处吸光值的变化。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）所述基于Oxford NanoporeTechnologies的直接RNA测序文库构建，包括以下步骤：

用快速连接缓冲液和T4 DNA连接酶，将序列特异性逆转录接头ssRTA连接至Ribo- RNA末端；

用SuperScript III逆转录酶逆转录合成cDNA第一链；

用直接RNA测序试剂盒和T4 DNA连接酶将测序接头连接至待测RNA样本末端；

用R9.4.1测序芯片承载文库，在MinION MK 1B设备上测序，用MinKNOW软件控制直接RNA测序进程。

6.一种利用权利要求1所述方法构建得到的文库在不具备3’ Poly（A）结构的RNA的全长单分子直接测序中的应用。