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CN113024640B - 基于新冠病毒rbd与ace2受体结合结构域筛选的表位肽抗原检测中和抗体试剂盒 - Google Patents

基于新冠病毒rbd与ace2受体结合结构域筛选的表位肽抗原检测中和抗体试剂盒 Download PDF

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CN113024640B CN202011595065.7A CN202011595065A CN113024640B CN 113024640 B CN113024640 B CN 113024640B CN 202011595065 A CN202011595065 A CN 202011595065A CN 113024640 B CN113024640 B CN 113024640B
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Abstract

本发明公开了一种基于新冠病毒RBD与ACE2受体结合结构域筛选的表位肽抗原检测中和抗体试剂盒，其含有氨基酸序列如SEQ ID NO:1～4所示的基于新冠病毒RBD与ACE2受体结合结构域筛选的表位肽抗原。本发明采用ELISA技术对疫苗接种者及冠病毒感染患者体内中和抗体进行检测，该方法理论可靠，实际可行，在准确性和重复性方面提供了可靠的结果，只需在二级生物安全实验室就可完成。本发明的免疫分析技术灵敏度高、特异性强、操作简单、结果重复性好、干扰因素少。该试剂盒可有效地监测临床研究中的疫苗接种反应及作为后期疫苗效果的评价指标，并用于检测新冠康复病人体内中和抗体含量，以判断是否可以复工复产及是否存在再次感染风险。

Description

基于新冠病毒RBD与ACE2受体结合结构域筛选的表位肽抗原 检测中和抗体试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒技术领域，具体地，涉及基于新冠病毒RBD与ACE2受体结合结构域筛选的表位肽抗原检测中和抗体试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种新型β冠状病毒(β-coronavirus)，来自Sarbecovirus亚属，圆形或椭圆形，直径60～140nm，电镜下呈皇冠样形状。与SARS-CoV具有相似的受体结合结构域，依靠人细胞表面ACE2蛋白作为受体进入细胞。包膜刺突蛋白(S)介导受体结合和膜融合，同时也是抗体主要靶点。
新型冠状病毒中和抗体是新型冠状病毒肺炎患者在染病的数天或约一周后以及注射新冠疫苗后血液内产生的一种抗体。中和抗体(NAb)通常是针对S蛋白产生的，对病毒表面的S蛋白(spike protein)的受体结合域(receptor binding domain，RBD)表现出直接中和活性，阻止了刺突蛋白对表面ACE2受体的有效结合。在使用灭活病毒接种疫苗的方法中证明，SARS-CoV-2的S蛋白的受体结合结构域(RBD)是一种免疫优势病毒抗原。
虽然分子检测技术，如聚合酶链反应(PCR)和下一代测序在病毒的诊断和基因变化监测中发挥了重要作用，但还迫切需要可靠和多功能的血清学或抗体检测。抗体检测主要包括病毒中性化试验(cVNT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和侧流试验(LFA)快速试验。病毒中性化试验(cVNT)可检测病人血液中的中和抗体，但需要在三级生物安全实验室中检测，较为繁琐费时。酶联免疫吸附试验(ELISA)和侧流试验(LFA)快速试验，检测总结合抗体，因此无法区分总结合抗体和中和抗体。
中和抗体的检测可强化监测措施，如普遍检测、活动性病例发现、接触者追踪和联系群集；此外，中和抗体检测还能够有效地监测临床研究中的疫苗接种反应及作为疫苗效果的评价指标。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供基于新冠病毒RBD与ACE2受体结合结构域筛选的表位肽抗原检测中和抗体试剂盒。
本发明的第一个目的是提供一种新冠病毒的表位肽。
本发明的第二个目的是提供一种新冠病毒的表位肽。
本发明的第三个目的是提供一种新冠病毒的表位肽。
本发明的第四个目的是提供一种新冠病毒的表位肽。
本发明的第五个目的是提供编码任一所述表位肽的基因。
本发明的第六个目的是提供含有所述基因的载体。
本发明的第七个目的是提供含有所述载体的工程菌。
本发明的第八个目的是提供所述表位肽的任意一条或几条、所述基因、所述载体、或所述工程菌中的一种或几种在制备检测新冠肺炎中和抗体检测试剂盒中的应用。
本发明的第八个目的是提供一种新冠病毒中和抗体检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
经模拟新冠病毒RBD与ACE2受体结合结构域筛选出64条表位肽抗原，经实验验证筛选出8条有效表位肽抗原，其中4条表位肽抗原验证结果与SARS-CoV-2RBD结构域的特异性中和抗体竞争法ELISA试剂盒测试结果相一致，4条表位肽抗原包括：
因此本发明要求保护以下内容：
一条新冠病毒的表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：
PGQTGKIADYNYKLPDDFTGGGG。
优选地，所述新冠病毒中和抗体表位肽C端修饰-Lys-Biotin。
一条新冠病毒的表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示：
GGGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNY。
优选地，所述新冠病毒中和抗体表位肽N端修饰Biotin-Ahx-。
一条新冠病毒的表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示：
GGNYNYLYRLFRKSNLKPFEGGG。
优选地，所述新冠病毒中和抗体表位肽C端修饰-Lys-Biotin。
一条新冠病毒的表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示：
GGGAGSTPCNGVEGFNCYFPLQS。
优选地，所述新冠病毒中和抗体表位肽N端-修饰Biotin-Ahx-。
生物素标记使得表位肽能够与亲和素或链霉亲和素结合。
本发明还要求保护氨基酸序列如SEQ ID NO:1～4所示的表位肽的组合。
编码所述表位肽的基因。
含有所述基因的载体。
含有所述载体的工程菌。
所述表位肽的任意一条或几条、所述基因、所述载体、或所述工程菌中的一种或几种在制备检测新冠肺炎中和抗体检测试剂盒中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明还要求保护一种新冠病毒中和抗体检测试剂盒，含有所述表位肽的任意一条或几条。
优选地，含有所述表位肽。
优选地，含有所述表位肽包被的固相载体。
更优选地，所述固相载体为96孔板/48孔板。
进一步优选地，所述表位肽包被的96孔板/48孔板的制备方法为，所述表位肽，包被于96孔板/48孔板上，400ng/孔4℃过夜包被，并用3％脱脂奶粉封闭2h。
进一步优选地，还含有酶标二抗、显色液、终止液、样本稀释液、洗涤液和阴性对照品中的一种或几种。
进一步更优选地，所述酶标二抗为HRP标记的山羊抗人IgG(H+L)。
进一步更优选地，所述显色液含2mg/ml TMB、50mmol/L磷酸氢二钠、24.3mmol/L柠檬酸、和0.75％(v/v)过氧化氢。
进一步更优选地，所述终止液含2mol/L H2SO4。
进一步更优选地，所述样本稀释液含0.05％(v/v)吐温的PBST溶液，pH为7.4
进一步更优选地，所述洗涤液含0.05％(v/v)吐温的PBST溶液
进一步更优选地，所述阴性对照品为未感染过新冠病毒及其他冠状病毒，且未接种过新冠疫苗的健康体检者血清的混合物。
最优选地，一种新冠病毒中和抗体检测试剂盒，含有所述表位肽包被的96孔板/48孔板、酶标二抗、显色液、终止液、样本稀释液、洗涤液和阴性对照品；
其中，表位肽包被的96孔板/48孔板的制备方法为氨基酸序列如SEQ ID NO:1～4所示的表位肽，包被于96孔板/48孔板上，400ng/孔4℃过夜包被，并用3％脱脂奶粉封闭2h；
酶标二抗为HRP标记的山羊抗人IgG(H+L)。
显色液含2mg/ml TMB、50mmol/L磷酸氢二钠、24.3mmol/L柠檬酸、和0.75％(v/v)过氧化氢。
终止液含2mol/L H2SO4。
样本稀释液含0.05％(v/v)吐温的PBST溶液，pH为7.4
洗涤液含0.05％(v/v)吐温的PBST溶液。
阴性对照品未感染过新冠病毒及其他冠状病毒，且未接种过新冠疫苗的健康体检者血清的混合物。
其使用方法为：
1、样本处理：将血清用样本稀释液(含0.05％(v/v)吐温的PBST溶液，pH为7.4)按1：50稀释。
2、样本孵育：将步骤1中的样本加入到包被有新冠病毒RBD与ACE2受体结合结构域筛选的表位肽抗原(SEQ ID NO:1～4)的96孔板/48孔板中进行反应，加样100μl/孔，37℃孵育60min。
3、与酶标二抗反应：洗板后，每孔加入100μl山羊抗人IgG(H+L)-HRP进行反应，37℃条件下反应30min。
4、TMB显色：彻底洗板后，每孔加入100μl底物显色液，37℃避光显色15min。
5、终止：加入终止液50μl，酶标仪测定450/630nM处吸光值，微孔板中颜色的深浅与待测样本中和抗体浓度呈正相关。
6、计算标本(S)/阴性对照(N)比值：S/N＝(样品OD-空白OD)/(阴性对照OD-空白OD)。S/N>1.2的判为阳性，即血清中含有中和抗体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种新冠病毒中和抗体检测试剂盒，其利用4条新冠病毒表位肽，采用ELISA技术对疫苗接种者及冠病毒感染患者体内中和抗体进行检测，该方法理论可靠，实际可行，在准确性和重复性方面提供了可靠的结果，只需在二级生物安全实验室就可完成。本发明的免疫分析技术灵敏度高、特异性强、操作简单、结果重复性好、干扰因素少。该试剂盒可用于提高新冠检测率，一定程度上弥补核酸检测假阴性带来的漏检问题；可用于检测新冠康复病人体内中和抗体含量，以判断是否可以复工复产及是否存在再次感染风险；还可有效地监测临床研究中的疫苗接种反应及作为后期疫苗效果的评价指标；中和抗体测定可支持强化监测措施，如普遍检测、活动性病例发现、接触者追踪和联系群集。
具体实施方式
下面结合说明书及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1冠病毒RBD与ACE2受体结合结构域筛选的表位肽
一、实验方法
经计算机模拟新冠病毒RBD与ACE2受体结合结构域筛选出64条表位肽抗原，化学合成筛选出的表位肽，分别包被微孔板，经ELISA实验，验证筛选出8条有效表位肽抗原，其余表位肽ELISA实验均为阴性。
二、实验结果
其中4条表位肽抗原验证结果与SARS-CoV-2RBD结构域的特异性中和抗体竞争法ELISA试剂盒测试结果相一致，4条表位肽抗原包括：
E1：PGQTGKIADYNYKLPDDFTGGGG(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)；
E2：GGGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNY(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)；
E3：GGNYNYLYRLFRKSNLKPFEGGG(氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)；
E4：GGGAGSTPCNGVEGFNCYFPLQS(氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)。
实施例2一种新冠病毒中和抗体检测试剂盒
一、组成
针对基于新冠病毒RBD与ACE2受体结合结构域筛选的表位肽抗原检测中和抗体试剂盒的成分如下：
1、包被了新冠病毒RBD与ACE2受体结合结构域筛选的表位肽抗原(氨基酸序列如SEQ ID NO:1～4所示的表位肽E1、E2、E3、E4)的固相载体的96孔板/48孔板，每个表位肽抗原各400ng/孔(制备方法为：表位肽抗原(E1、E2、E3、E4)包被于微孔板中，每孔含4个表位肽各400ng，包被于酶联板上，4℃过夜包被，并用3％脱脂奶粉封闭2h)，
其中，E1：PGQTGKIADYNYKLPDDFTGGGG-Lys-Biotin(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)；
E2：Biotin-Ahx-GGGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNY(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)；
E3：GGNYNYLYRLFRKSNLKPFEGGG-Lys-Biotin(氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)；
E4：Biotin-Ahx-GGGAGSTPCNGVEGFNCYFPLQS(氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)，
以上表位肽经过化学合成得到。
2、阴性对照品：20个18周岁以上的未感染过新冠病毒及其他冠状病毒，且未接种过新冠疫苗的健康体检者血清的混合物。
3、酶标二抗：山羊抗人IgG(H+L)-HRP(Invitrogen,cat-A18811)，每孔用量100μL；
4、显色液：含2mg/ml3,3,5,5'-tetramethylbenzidine(TMB)、50mmol/L磷酸氢二钠、24.3mmol/L柠檬酸、0.75％(v/v)过氧化氢，每孔用量100μL；
5、终止液：含2mol/L H2SO4，每孔用量50μL；
6、样本稀释液：含0.05％(v/v)吐温的PBST溶液，pH为7.4；
7、洗涤液：含0.05％(v/v)吐温的PBST溶液。
二、使用方法
本针对基于新冠病毒RBD与ACE2受体结合结构域筛选的表位肽抗原检测中和抗体试剂盒的使用方法，步骤如下：
1、样本处理：将血清用样本稀释液(含0.05％(v/v)吐温的PBST溶液，pH为7.4)按1：50稀释。
2、样本孵育：将步骤1中的样本加入到包被有新冠病毒RBD与ACE2受体结合结构域筛选的表位肽抗原(E1、E2、E3、E4)的96孔板/48孔板中进行反应，加样100μl/孔，37℃孵育60min。
3、与酶标二抗反应：洗板后，每孔加入100μl山羊抗人IgG(H+L)-HRP进行反应，37℃条件下反应30min。
4、TMB显色：彻底洗板后，每孔加入100μl底物显色液，37℃避光显色15min。
5、终止：加入终止液50μl，酶标仪测定450/630nM处吸光值，微孔板中颜色的深浅与待测样本中和抗体浓度呈正相关。
6、计算标本(S)/阴性对照(N)比值：S/N＝(样品OD-空白OD)/(阴性对照OD-空白OD)。S/N>1.2的判为阳性，即血清中含有中和抗体。
实施例3临床样本的检测
一、实验方法
1、为检验实施例1的试剂盒在疫苗接种者中的检测效果，使用实施例1的试剂盒检测临床样本。本实施例纳入了5位疫苗接种者(均经中和抗体竞争实验证实血清中存在中和抗体)，与此同时还纳入了8例健康者作为对照。
2、检测结果
检测结果见表1，健康对照者S/N值均小于1.2，而疫苗接种者S/N值均大于2，即本试剂盒可检测出疫苗接种者血清中存在的中和抗体
表1：
Figure GDA0003654741880000071
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 广州中医药大学顺德医院（佛山市顺德区中医院）
<120> 基于新冠病毒RBD与ACE2受体结合结构域筛选的表位肽抗原检测中和抗体试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 1
Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp
1 5 10 15
Asp Phe Thr Gly Gly Gly Gly
20
<210> 2
<211> 23
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 2
Gly Gly Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys
1 5 10 15
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr
20
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 3
Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
1 5 10 15
Lys Pro Phe Glu Gly Gly Gly
20
<210> 4
<211> 23
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 4
Gly Gly Gly Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn
1 5 10 15
Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
20

Claims (6)

1.一种新冠病毒的表位肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.编码权利要求1所述表位肽的基因。
3.含有权利要求2所述基因的载体。
4.含有权利要求3所述载体的工程菌。
5.权利要求1所述表位肽、权利要求2所述基因、权利要求3所述载体、或权利要求4所述工程菌中的一种或几种在制备检测新冠病毒中和抗体检测试剂盒中的应用。
6.一种新冠病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述表位肽。
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