CN113004579A - 一种基于苯硼酸共聚物固定颗粒凝胶的生物墨水、用途及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于苯硼酸共聚物固定颗粒凝胶的生物墨水、用途及制备方法。该生物墨水包含两个组分，第一个组分为颗粒凝胶，第二个组分为由硼酸酯键形成的共聚物水凝胶体系，第一个组分通过混合的方式被第二组分固定，形成剪切变稀、可自愈合的生物墨水。本发明制备的生物墨水不仅具有剪切稀化、可自愈合、良好的生物相容性等特点，还提高了生物活性物质的负载密度、防止微生物的剪切受损，增大了比表面积和传质速率，使得该方法制备的生物墨水在3D打印生物催化剂、生物活体材料、可穿戴的柔性电子传感器件、软体机器人、生物医学等领域具有极为广阔的应用前景。

Description

一种基于苯硼酸共聚物固定颗粒凝胶的生物墨水、用途及制 备方法

技术领域

本发明涉及墨水制备方法，特别涉及一种基于苯硼酸共聚物固定颗粒凝胶的生物墨水、用途及制备方法。

背景技术

3D打印技术是快速成型技术的一种，又称增材制造，它是一种以计算机辅助设计软件或断层扫描技术的数字模型为基础，以材料的逐层堆积微特征，快速制造三维结构物体的一种技术。随着该技术的发展，将3D打印技术应用于生物制造逐渐成为研究的热点。生物3D打印技术是以生物材料、生物因子、细胞等为原料，在空间尺度上实施精准操作，实现复杂生物功能的组织或器官再造的一种方法。由于制备的三维结构具有与组织和器官形态功能相近的生物活性，3D打印构建的结构在组织工程、再生医学、药物测试和病理模型等领域具有广阔的应用前景。

生物3D打印的一个关键因素是生物墨水的设计，其要点在于如何在保证生物墨水功能的基础上也不影响墨水的可打印性。维持生物墨水的功能性在于如何在材料中固定细胞，并在一定条件下保持细胞的长期活性和功能；生物墨水的可打印性则取决于墨水材料本身的动力学性质和静力学性质，包括：可挤出、挤出后可定型、沉积后结构稳定。目前生物墨水根据材料分为天然高分子材料如胶原、纤维蛋白、透明质酸、基质胶、明胶海藻酸、壳聚糖和琼脂糖等；非天然合成类高分子材料如丙烯酰胺(PAAM)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、普朗尼克F127等。同时，为了更好的仿生体内组织和器官的细胞外基质环境，并达到所相应的功能性、机械性能等要求，生物墨水材料一般应具有一定的材料组分组合和梯度分布。此外，为了适应打印工艺过程，常常需要对墨水材料进行改性和组分设计，针对特定应用场景的新墨水开发也是未来的重要工作之一。

水凝胶是一种具有三维网状结构的亲水性聚合物材料。聚合物分子通过交联形成可固定大量水的固体结构，它在水中溶胀但不溶解，具有良好的保水性和物理化学性质可调性。最近，利用许多水凝胶含水量高、生物相容性好等优异的特征，其被广泛的应用于组织工程的支架和细胞递送的载体。特别在生物3D打印领域，水凝胶可以作为细胞固定化和生长的支架，以生物墨水的形式应用于体外组织或器官模型的构建。尽管如此，传统的水凝胶生物墨水一般是细胞和水凝胶基质材料的简单共混，在3D打印的过程中不可避免的出现细胞在剪切过程中受到损伤。采用颗粒凝胶对细胞进行胶囊化保护是解决这一问题的有效办法。但是，直接将颗粒凝胶作为生物墨水存在可打印性差、操作复杂、打印不连续等诸多问题，导致其应用受限。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供是针对现有颗粒凝胶作为生物墨水存在的不足，提供一种基于苯硼酸共聚物固定颗粒凝胶的生物墨水、及制备方法，在达到生物墨水高强度、剪切稀化和自愈合性能的特征基础上，实现细胞生物3D打印的高存活率、易操作等目标。

技术方案：本发明提供一种基于苯硼酸共聚物固定颗粒凝胶的生物墨水，包含两个组分，第一个组分为颗粒凝胶，第二个组分为由硼酸酯键形成的共聚物水凝胶体系，第一个组分通过混合的方式被第二组分固定，形成剪切变稀、可自愈合的生物墨水。由大量的水凝胶微球组成的离散体系，尺寸分布从50纳米到1000微米。当水凝胶微球的尺寸大于1微米时，主导其运动和性质的主要为水凝胶微球之间的摩擦力和碰撞；当水凝胶微球的堆积密度在0.55到0.74之间时，颗粒凝胶表现出阻塞(Jamming)行为。该体系由含有硼酸改性的具有优异生物相容性的高分子聚合物与可双键改性的具有优异生物相容性的多元醇高分子聚合物反应获得，两种高分子间为动态化学作用力。该生物墨水在剪切作用下，分子网络的硼酸酯键断裂使得生物墨水的黏度变小；该生物墨水受到外力损伤后，分子网络的硼酸酯键断裂和部分共价键断裂，但硼酸酯键可以重新连接使得生物墨水愈合。

进一步地，包含两个组分，第一个组分为颗粒凝胶，第二个组分为由硼酸酯键形成的共聚物水凝胶体系，第一个组分通过混合的方式被第二组分固定，形成剪切变稀、可自愈合的生物墨水。

进一步地，所述的可双键改性的多元醇高分子聚合物是不同分子量的聚乙烯醇、聚乙二醇、聚丙烯酰胺-丙烯酸羟乙酯、聚多巴胺、壳聚糖、纤维素、甲壳素等中的一种或几种，聚合物可以与硼酸形成动态的硼酸酯共价键。

进一步地，所述苯硼酸功能化的高分子可以是硼酸化的海藻酸钠、硼酸化的透明质酸钠、硼酸化的PEG、硼酸化的丙烯酰胺等中的一种或几种。

进一步地，所述的共聚物水凝胶体系可以聚合形成双网络结构，该双网络结构的第一层为苯硼酸化的高分子聚合物和多元醇高分子聚合物形成的硼酸酯键的动态共价键，第二层网络结构为双键功能化的多元醇本身的共价键交联网络。

进一步地，凝胶液中细胞或微生物的浓度为0.5百万个/mL-300百万个/mL。

进一步地，可以负载具有生物活性的组分。

进一步地，所述生物活性的组分包括动物细胞、植物细胞、真菌、细菌中的一种或几种。

所述的基于苯硼酸共聚物固定颗粒凝胶的生物墨水在生物3D打印的领域中的用途。

所述的基于苯硼酸共聚物固定颗粒凝胶的生物墨水的制备方法，包括如下步骤：

(9)功能化改性一种、两种或多种具有生物相容性的高分子聚合物；

(10)合成双键改性的多元醇高分子聚合物；

(11)合成苯硼酸化的高分子聚合物；

(12)将(1)样品配置成含生物细胞或微生物的PBS缓冲液；

(13)制备包封微生物的颗粒凝胶微球并固化后洗出；

(14)将(2)(3)样品配置成一定浓度的PBS缓冲液；

(15)将(5)中颗粒凝胶微球以同等体积分别分散在(6)中的两个溶液；

将(7)中分散微球的两个溶液交联混合制备生物活体材料。

本发明首先采用光交联、迈克尔加成、二硫键形成、席夫碱反应、酶交联、离子交联或点击化学交联形成单交联水凝胶，利用油包水乳化分散法制备颗粒凝胶，将生物细胞或细胞生长因子固定在颗粒凝胶内部；进一步采用基于苯硼酸共聚物体系作为颗粒凝胶外基质，将离散的颗粒凝胶固定为含多级孔结构的生物墨水。该生物墨水不仅具有良好的生物相容性、保护并提高了打印过程中挤压造成的细胞活性降低、减少了微生物的逃逸的优势，还具有以下特征：一方面其优异的力学性能和粘弹性能使得该生物墨水更有利于三维结构的构建和调控，另一方面多级孔结构和良好的自愈合性能拓展了生物墨水的应用范围。本发明中，使用基于苯硼酸共聚物体系固定载微生物的颗粒凝胶制备生物墨水，使得生物墨水不仅具有多级孔结构，而且具有高强韧的力学性能、剪切变稀行为和自愈合性能。

该方法采用颗粒凝胶可以对不同的细胞进行包裹，起到保留细胞活性，减少打印过程对细胞的剪切伤害；采用苯硼酸共聚物体系固定颗粒凝胶，可增强生物墨水的粘弹性能以提高生物墨水的可打印性；利用苯硼酸共聚物固定颗粒凝胶微球体系的多组分特征，可以用于多细胞共培养、多酶催化的体系；进一步的，生物墨水还可以在光或者热固化条件下进行二次交联，进一步提高生物3D打印构件的形状保真度。

有益效果：本发明使用基于苯硼酸共聚物双交联体系固定负载微生物的颗粒凝胶制备生物墨水，不仅能进一步保护并提高细胞活性、防止微生物的逃逸，且能使生物墨水具备较高的力学性能、粘弹性能、结构稳定性和自愈合性能，形成多级孔隙，改善生物活体材料的性能，方便营养物质的运输和传递，为生物墨水的制备提供了新思路。本发明中，所制备的生物墨水具有高粘弹的力学性能、剪切烯化性能和自愈合性能，拓展了生物墨水的应用范围，有望用于双菌共培养、3D打印生物贴片材料、可穿戴的柔性电子器件、软体机器人、生物医学等领域。本发明中，生物墨水制备方法简单易行，且所用的材料具有良好的生物相容性。

附图说明

图1生物墨水制备过程示意图；

图2生物3D打印实物图；

图3颗粒凝胶微球示意图；

图4生物墨水流体力学性能图，其中，a：生物墨水应变-模量性能曲线 b：生物墨水角速度-模量性能曲线 c：生物墨水剪切速率-粘度性能曲线 d：生物墨水自愈合性能

图5生物3D打印材料微观SEM图，其中，a：生物3D打印材料SEM结构示意图b：生物3D打印材料水凝胶孔隙结构示意图。

具体实施方式

实施例1

(1)HA-SH与HB-PEGDA制备载酵母菌颗粒凝胶微球

将安琪活性干酵母加入种子培养基活化，稀释菌液浓度至OD600值在0.2-0.8之间；将表面活性剂(FE-surf)溶于氟油中配制成质量分数为3％，记为连续相P1(油相)；将20mg巯基化透明质酸钠溶于1mL PBS缓冲液中，配制成2％(w/v)，记为分散相P3；将100mgHB-PEGDA、100μL酵母菌液、溶于PBS缓冲液中，配制成10％(w/v)，记为分散相P4。将上面制备的溶液通过PET管道与微流控芯片连接起来；调节P1油相流速为12μL/min，P3流速为2μL/min，P4流速为2μL/min，制备出尺寸150μm左右的单分散包裹酵母菌的微球，固化8h后洗出微球。

(2)SA-PBA与PVA-GMA制备苯硼酸共聚物体系前体溶液

将40mg硼酸酯化的海藻酸钠溶于1mL PBS缓冲液中，配制成4％(w/v)，记为分散相P5；将50mg双键PVA溶于1mLPBS缓冲液中，配制成5％(w/v)，记为分散相P6。

(3)制备生物墨水

将(1)中制备的微球洗出后置于滤布上，过滤除去水分得到颗粒凝胶微球，各取一半体积分散在(2)中的P5、P6的溶液中混合均匀，通过如图1所示的装置将分散颗粒凝胶微球的P5、P6溶液混合均匀，制备出生物墨水。

实施例2

(1)SA-SH与HB-PEGDA制备载酵母菌颗粒凝胶微球

将安琪活性干酵母加入种子培养基活化，稀释菌液浓度至OD600值在0.2-0.8之间；将表面活性剂(FE-surf)溶于氟油中配制成质量分数为3％，记为连续相P1(油相)；将20mg巯基化海藻酸钠溶于1mL PBS缓冲液中，配制成2％(w/v)，记为分散相P3；将100mg HB-PEGDA、100μL酵母菌液、溶于PBS缓冲液中，配制成10％(w/v)，记为分散相P4。取油相1.5mL，将两相分散相按2∶1(P3：P4)混合成500μL前体溶液加入到油相中，通过机械震荡形成乳液并静固化8h，再经过洗涤得到1～5000μm范围的微球。

(2)(3)同实施例1

实施例3

(1)GelMA制备载大肠杆菌颗粒凝胶微球

将大肠杆菌加入种子培养基活化，稀释菌液浓度至OD600值在0.2-0.8之间；将表面活性剂(FE-surf)溶于氟油中配制成质量分数为3％，记为连续相P1(油相)；将150mgGelMA、5mg 405光引发剂、100μL大肠杆菌菌液溶于1mL PBS缓冲液中，配制成15％(w/v)，记为分散相P2；取油相1.5mL，将P2前体溶液加入到油相中，通过机械震荡形成乳液并在405nm蓝光下固化60S，静置2h后再经过洗涤得到1～5000μm范围的微球。

(2)HA-PBA与双键化壳聚糖制备苯硼酸共聚物体系前体溶液

将40mg硼酸酯化的透明质酸钠溶于1mL PBS缓冲液中，配制成4％(w/v)，记为分散相P5；将50mg双键化壳聚糖溶于1mL PBS缓冲液中，配制成5％(w/v)，记为分散相P6。

(3)同实施例1

实施例4

(1)丙烯酰胺明胶制备载青霉菌颗粒凝胶微球

将青霉菌加入种子培养基活化，稀释菌液浓度至OD600值在0.2-0.8之间；将表面活性剂(FE-surf)溶于氟油中配制成质量分数为3％，记为连续相P1(油相)；将150mg丙烯酰胺明胶、5mg 405光引发剂、100μL青霉菌菌液溶于1mL PBS缓冲液中，配制成15％(w/v)，记为分散相P2；取油相1.5mL，P2前体溶液加入到油相中，通过机械震荡形成乳液并在405nm蓝光下固化60S，静置2h，再经过洗涤得到1～5000μm范围的微球。

(2)HA-PBA与双键化壳聚糖制备苯硼酸共聚物体系前体溶液

将40mg硼酸酯化的透明质酸钠溶于1mL PBS缓冲液中，配制成4％(w/v)，记为分散相P5；将50mg双键化壳聚糖溶于1mL PBS缓冲液中，配制成5％(w/v)，记为分散相P6。

(3)同实施例1

实施例5

(1)OSA与Gel-NH2制备载酵母菌颗粒凝胶微球

将安琪活性干酵母加入种子培养基活化，稀释菌液浓度至OD600值在0.2-0.8之间；将表面活性剂(FE-surf)溶于氟油中配制成质量分数为3％，记为连续相P1(油相)；将20mg氧化海藻酸钠溶于1mL PBS缓冲液中，配制成2％(w/v)，记为分散相P3；将100mg Gel-NH2、100μL酵母菌液、溶于PBS缓冲液中，配制成10％(w/v)，记为分散相P3。将上面制备的溶液通过PET管道与微流控芯片连接起来；调节P1油相流速为12μL/min，P2流速为2μL/min，P3流速为2μL/min，制备出尺寸150μm左右的单分散包裹酵母菌的微球，固化8h后洗出微球。

(2)PBA-PEG与双键化纤维素制备苯硼酸共聚物体系前体溶液

将40mg硼酸酯化的聚乙烯醇溶于1mL PBS缓冲液中，配制成4％(w/v)，记为分散相P5；将50mg双键化纤维素溶于1mL PBS缓冲液中，配制成5％(w/v)，记为分散相P6。

(3)同实施例1

实施例6

(1)OHA与Gel-NH2制备载大肠杆菌颗粒凝胶微球

将大肠杆菌加入种子培养基活化，稀释菌液浓度至OD600值在0.2-0.8之间；将表面活性剂(FE-surf)溶于氟油中配制成质量分数为3％，记为连续相P1(油相)；将20mg氧化透明质酸钠溶于1mL PBS缓冲液中，配制成2％(w/v)，记为分散相P3；将100mg Gel-NH2、100μL大肠杆菌菌液、溶于PBS缓冲液中，配制成10％(w/v)，记为分散相P3。将上面制备的溶液通过PET管道与微流控芯片连接起来；调节P1油相流速为20μL/min，P2流速为2μL/min，P3流速为2μL/min，制备出尺寸100μm左右的单分散包裹酵母菌的微球，固化8h后洗出微球。

(2)PBA-PEG与双键化聚多巴胺制备苯硼酸共聚物体系前体溶液

将40mg硼酸酯化的聚乙烯醇溶于1mL PBS缓冲液中，配制成4％(w/v)，记为分散相P5；将50mg双键化聚多巴胺溶于1mL PBS缓冲液中，配制成5％(w/v)，记为分散相P6。

(3)同实施例1

实施例7

(1)HA-NR与四巯基-PEG制备载木醋杆菌颗粒凝胶微球

将木醋杆菌加入种子培养基活化，稀释菌液浓度至OD600值在0.2-0.8之间；将表面活性剂(FE-surf)溶于氟油中配制成质量分数为3％，记为连续相P1(油相)；将20mg降冰片烯透明质酸钠溶于1mL PBS缓冲液中，配制成2％(w/v)，记为分散相P2；将100mg四巯基-PEG、100μL木醋杆菌菌液、溶于PBS缓冲液中，配制成10％(w/v)，记为分散相P3。将上面制备的溶液通过PET管道与微流控芯片连接起来；调节P1油相流速为16μL/min，P2流速为2μL/min，P3流速为2μL/min，制备出尺寸120μm左右的单分散载木醋杆菌的颗粒凝胶微球，固化8h后洗出微球。

(2)3-APBA与双键化PVA制备苯硼酸共聚物体系前体溶液

将40mg硼酸酯化的丙烯酰胺溶于1mL PBS缓冲液中，配制成4％(w/v)，记为分散相P5；将50mg双键化PVA溶于1mLPBS缓冲液中，配制成5％(w/v)，记为分散相P6。

(3)同实施例1

实施例8

(1)Gel-NR与四巯基-PEG制备载假单胞菌颗粒凝胶微球

将假单胞菌加入种子培养基活化，稀释菌液浓度至OD600值在0.2-0.8之间；将表面活性剂(FE-surf)溶于氟油中配制成质量分数为3％，记为连续相P1(油相)；将20mg降冰片烯明胶溶于1mL PBS缓冲液中，配制成2％(w/v)，记为分散相P2；将100mg四巯基-PEG、100μL假单胞菌溶于PBS缓冲液中，配制成10％(w/v)，记为分散相P3。将上面制备的溶液通过PET管道与微流控芯片连接起来；调节P1油相流速为16μL/min，P2流速为2μL/min，P3流速为2μL/min，制备出尺寸120μm左右的单分散载假单胞菌的颗粒凝胶微球，固化8h后洗出微球。

(2)3-APBA与双键化聚丙烯酰胺-丙烯酸羟乙酯(GMA-(AAm-co-HEA))制备苯硼酸共聚物体系前体溶液

将40mg硼酸酯化的丙烯酰胺溶于1mL PBS缓冲液中，配制成4％(w/v)，记为分散相P5；将50mgGMA-(P(AAm-co-HEA))溶于1mL PBS缓冲液中，配制成5％(w/v)，记为分散相P6。

(3)同实施例1

实施例9(共生菌共培养体系)

(1)HA-SH与HB-PEGDA制备载A菌颗粒凝胶微球

将A菌加入种子培养基活化，稀释菌液浓度至OD600值在0.2-0.8之间；将表面活性剂(FE-surf)溶于氟油中配制成质量分数为3％，记为连续相P1(油相)；将20mg巯基化透明质酸钠溶于1mL PBS缓冲液中，配制成2％(w/v)，记为分散相P3；将100mg HB-PEGDA、100μLA菌菌液、溶于PBS缓冲液中，配制成10％(w/v)，记为分散相P4。将上面制备的溶液通过PET管道与微流控芯片连接起来；调节P1油相流速为12μL/min，P3流速为2μL/min，P4流速为2μL/min，制备出尺寸150μm左右的单分散包裹A菌的微球，固化8h后洗出微球。

(2)SA-PBA与PVA-GMA制备载B菌的苯硼酸共聚物体系前体溶液

将40mg硼酸酯化的海藻酸钠溶于1mL PBS缓冲液中，配制成4％(w/v)，记为分散相P5；将50mgPVA-GMA、100μL B菌菌液溶于1mL PBS缓冲液中配制成5％(w/v)，记为分散相P6。

(3)制备生物墨水。

将(1)中制备的微球洗出后置于滤布上，过滤除去水分得到颗粒凝胶微球，各取一半体积分散在(2)中的P5、P6的溶液中混合均匀，通过如图1所示的装置将分散颗粒凝胶微球的P5、P6溶液混合均匀，制备出双菌共培养体系的生物墨水。

乳化分散法可以是机械搅拌法、机械与手动震荡法、电喷射法、悬浮分散、微流控法、膜乳化法。

Claims (10)

1.一种基于苯硼酸共聚物固定颗粒凝胶的生物墨水，其特征在于：包含两个组分，第一个组分为颗粒凝胶，第二个组分为由硼酸酯键形成的共聚物水凝胶体系，第一个组分通过混合的方式被第二组分固定，形成剪切变稀、可自愈合的生物墨水。

2.根据权利要求1所述的基于苯硼酸共聚物固定颗粒凝胶的生物墨水，其特征在于：包含两个组分，第一个组分为颗粒凝胶，第二个组分为由硼酸酯键形成的共聚物水凝胶体系，第一个组分通过混合的方式被第二组分固定，形成剪切变稀、可自愈合的生物墨水。

3.根据权利要求2所述的基于苯硼酸共聚物固定颗粒凝胶的生物墨水，其特征在于：所述的可双键改性的多元醇高分子聚合物是不同分子量的聚乙烯醇、聚乙二醇、聚丙烯酰胺-丙烯酸羟乙酯、聚多巴胺、壳聚糖、纤维素、甲壳素等中的一种或几种，聚合物可以与硼酸形成动态的硼酸酯共价键。

4.根据权利要求2所述的基于苯硼酸共聚物固定颗粒凝胶的生物墨水，其特征在于：所述苯硼酸功能化的高分子可以是硼酸化的海藻酸钠、硼酸化的透明质酸钠、硼酸化的PEG、硼酸化的丙烯酰胺等中的一种或几种。

5.根据权利要求2所述的基于苯硼酸共聚物固定颗粒凝胶的生物墨水，其特征在于：所述的共聚物水凝胶体系可以聚合形成双网络结构，该双网络结构的第一层为苯硼酸化的高分子聚合物和多元醇高分子聚合物形成的硼酸酯键的动态共价键，第二层网络结构为双键功能化的多元醇本身的共价键交联网络。

6.根据权利要求2所述的基于苯硼酸共聚物固定颗粒凝胶的生物墨水，其特征在于：凝胶液中细胞或微生物的浓度为0.5百万个/mL-300百万个/mL。

7.根据权利要求1所述的基于苯硼酸共聚物固定颗粒凝胶的生物墨水，其特征在于：可以负载具有生物活性的组分。

8.根据权利要求7所述的基于苯硼酸共聚物固定颗粒凝胶的生物墨水，其特征在于：所述生物活性的组分包括动物细胞、植物细胞、真菌、细菌中的一种或几种。

9.权利要求1所述的基于苯硼酸共聚物固定颗粒凝胶的生物墨水在生物3D打印的领域中的用途。

10.权利要求1-7任一项所述的基于苯硼酸共聚物固定颗粒凝胶的生物墨水的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)功能化改性一种、两种或多种具有生物相容性的高分子聚合物；

(2)合成双键改性的多元醇高分子聚合物；

(3)合成苯硼酸化的高分子聚合物；

(4)将(1)样品配置成含生物细胞或微生物的PBS缓冲液；

(5)制备包封微生物的颗粒凝胶微球并固化后洗出；

(6)将(2)(3)样品配置成一定浓度的PBS缓冲液；

(7)将(5)中颗粒凝胶微球以同等体积分别分散在(6)中的两个溶液；

(8)将(7)中分散微球的两个溶液交联混合制备生物活体材料。

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