CN113004390A

CN113004390A - Adam17在作为猪瘟病毒的受体中的应用

Info

Publication number: CN113004390A
Application number: CN201911327967.XA
Authority: CN
Inventors: 郑爱华; 袁菲; 李丹丹
Original assignee: Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2021-06-22
Anticipated expiration: 2039-12-20
Also published as: CN113004390B

Abstract

本发明涉及病毒领域，特别涉及ADAM17在作为猪瘟病毒(CSFV)的受体中的应用。本发明利用免疫共沉淀技术筛选到了CSFV E2囊膜糖蛋白特异性结合蛋白ADAM17，通过CRISPR‑Cas9技术敲除ADAM17可完全阻断CSFV感染。纯化的重组E2蛋白和ADAM17可以特异结合。以上，都证明ADAM17是猪瘟病毒的特异受体。ADAM17将是抗猪瘟病毒疫苗以及药物设计和筛选的重要靶点，也是抗猪瘟病毒猪育种的重要靶点。

Description

ADAM17在作为猪瘟病毒的受体中的应用

技术领域

本发明涉及病毒领域，特别涉及ADAM17在作为猪瘟病毒的受体中的应用。

背景技术

猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)以前称为猪霍乱(Hog Cholera，HC)，猪瘟是一种高传染性，是造成养猪业巨大经济损失的主要传染病之一，被列入世界动物卫生组织名录。1810年猪瘟在美国田纳西州得到了首次确认，随后迅速席卷全球，广泛分布于亚洲、东欧、俄罗斯和南美；1888年猪瘟在日本发现；第一次在中国发现的确切时间没有记录，但是1925年中国科学家已经利用抗血清治疗猪瘟。目前猪瘟主要有扑杀(非疫苗)和系统预防(疫苗)两种预防政策，基于C-株研发的兔弱化活疫苗，成功控制了猪瘟疫情，因此在过去的几十年没有爆发大范围的疫情，但是随着病毒亚型的变化，C株疫苗的有效性逐渐降低，近年猪瘟疫情不断上升。

猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)是导致猪瘟的病原体，属于黄病毒科 (Flaviviridae)，瘟病毒属(Pestivirus)，瘟病毒属病毒还包括牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV)、边界病病毒(Border Disease Virus，BDV)。CSFV通过口腔和鼻腔粘膜进入宿主体内，首先被感染的是扁桃体细胞，然后通过血液和淋巴循环扩散至全身。CSFV对免疫系统有明显的组织嗜性，如胸腺、脾脏、淋巴结、骨髓等，并造成导致严重的白细胞减少。

CSFV有3个基因型(I，II，III)，每个基因型有3到4个亚型，中国境内流行的石门株(Shimen)与SXCDK株分别属于I型和II型。

CSFV是一种具有包膜、正链RNA病毒，病毒粒子直径大约为50nm，CSFV的基因组由5’非编码区、一个开放阅读框和3’非编码区组成。其中开放阅读框被翻译成一个由 3398个氨基酸组成的前体多聚蛋白质，此前体多聚蛋白质会被切割成4个结构蛋白(C， E^rns，E1，和E2)及8个非结构蛋白(N^pro，P7，NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B)。

CSFV的结构蛋白包括一个衣壳蛋白(C)，三个囊膜糖蛋白(E^rns，E1，E2)，糖蛋白是以多聚蛋白的形式在宿主核糖体上翻译的，而后在宿主信号肽酶的作用下分裂成E^rns (也称为E0)。其中，E^rns对于具有感染能力的病毒粒子的产生是必需的，同时，E^rns也是中和抗体的靶蛋白。E^rns通过带正电荷的氨基酸与细胞表面的粘多糖(比如：硫酸乙酰肝素、层粘连蛋白受体)相互作用，进而介导病毒粒子与宿主间的黏附。然而，2004年研究发现E^rns对于病毒入侵宿主细胞是非必需的，仅表达E1、E2的逆转录假病毒粒子就可以感染宿主。

E1属于I型跨膜蛋白，具有N-端胞外域和C-端疏水螺旋域，并通过C-端将E1锚定于病毒囊膜表面。E1和E2可通过半胱氨酸残基间的二硫键形成异源二聚体，且E2-E1异源二聚体调控CSFV入侵宿主的过程。

E2也属于I型跨膜蛋白，具有N-端胞外域和C-端疏水螺旋域，并通过C-端将E2锚定于病毒囊膜表面。E2有两种二聚体形式：E2-E2、E2-E1；在病毒组装过程中E2-E2同源二聚体最先形成，E2-E1异源二聚体在E1从内质网释放后再形成。E2是CSFV糖蛋白中最主要的免疫原，包含抗原表位，可根据E2研制CSFV抗体及疫苗，突变E2糖基化位点可显著减低E2的免疫原性。

CSFV侵入宿主过程是由糖蛋白E^rns和E2介导的，其中E2是不可缺少的。同时，E^rns和E2也是中和抗体的主要目标，但是抗E2的抗体能完全的中和CSFV的感染，而抗E^rns的抗体只能中和一部分的感染。

病毒与宿主因子的结合，是病毒感染宿主细胞最关键的一步。2004年鉴定出CD46是 BVDV的一个宿主因子，但是，对CSFV宿主因子的研究一直没有突破。已有研究报道硫酸乙酰肝素和层粘连蛋白受体是CSFV感染宿主过程的黏附因子，事实是，硫酸乙酰肝素是很多囊膜病毒的的黏附因子；而且虽然层粘连蛋白受体可以和CSFV E^rns蛋白相互作用，但是抗层粘连蛋白受体的抗体仅能部分抑制CSFV感染宿主。这是因为虽然CSFV进入宿主过程由E^rns和E2蛋白介导，但是E^rns是非必需的，而E2是不可缺少的，然而和E2蛋白结合的宿主因子仍然是个谜。因此猪瘟药物和疫苗的筛选以及抗病毒猪的定向选育缺乏特异的靶点。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了ADAM17在作为猪瘟病毒的受体中的应用。本发明发现了猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)感染猪的关键受体ADAM17，可用于抗病毒的疫苗以及药物的设计和筛选，以及抗病毒猪的开发的靶点。利用免疫共沉淀技术筛选到了CSFV E2囊膜糖蛋白特异性结合蛋白ADAM17，通过CRISPR-Cas9技术敲除ADAM17 可完全阻断CSFV感染。纯化的重组E2蛋白和ADAM17可以特异结合。以上结果证明 ADAM17是猪瘟病毒感染猪的特异受体。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了ADAM17在作为E2蛋白或猪瘟病毒的受体中的应用；所述ADAM17 具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

(II)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

(III)、与(Ⅰ)或(II)所述序列至少有80％同一性的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，编码所述ADAM17的核苷酸具有

(IV)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

(V)、如SEQ ID 2所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或

(VI)、与(IV)或(V)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(IV)或(V)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(VII)、与(IV)、(V)或(VI)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(IV)、(V)或(VI)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(VIII)、与(IV)、(V)、(VI)或(VII)所述核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。

在上述研究的基础上，本发明还提供了ADAM17的抑制剂在制备预防和/或治疗猪瘟的药物中的应用；所述ADAM17具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

(III)、与(Ⅰ)或(II)所述序列至少有80％同一性的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述ADAM17的抑制剂为抑制ADAM17表达或抑制ADAM17的活性；

所述抑制ADAM17表达为敲低ADAM17的表达；

所述抑制ADAM17的活性为螯合和/或去除ADAM17的金属蛋白酶域活性中心的锌离子。

在本发明的一些具体实施方案中，所述ADAM17的抑制剂包括ADAM17的siRNA(如SEQ ID No.5～8所示)、1,10-phenanthroline、aderbasib中的一种或多种。

其中，siRNA的序列如下所示：

此外，本发明还提供了ADAM17的敲除在制备或筛选预防和/或治疗猪瘟的药物中的应用；所述ADAM17具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

(III)、与(Ⅰ)或(II)所述序列至少有80％同一性的氨基酸序列。

在上述研究的基础上，本发明还提供了预防和/或治疗猪瘟的药物，能够抑制ADAM17 表达或抑制ADAM17的活性的核酸、蛋白、化合物或其盐、组合物、络合物或混合物；所述ADAM17具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

(III)、与(Ⅰ)或(II)所述序列至少有80％同一性的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的药物中所述抑制ADAM17表达为敲低ADAM17的表达；

此外，本发明还提供了ADAM17在制备或筛选预防猪瘟的疫苗中的应用；所述ADAM17具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

(III)、与(Ⅰ)或(II)所述序列至少有80％同一性的氨基酸序列。

本发明还提供了预防猪瘟的疫苗，能够抑制ADAM17表达或抑制ADAM17的活性的核酸、蛋白、化合物或其盐、组合物、络合物或混合物；所述ADAM17具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

(III)、与(Ⅰ)或(II)所述序列至少有80％同一性的氨基酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的疫苗中所述抑制ADAM17表达为敲低ADAM17的表达；

本发明利用免疫共沉淀技术筛选到了CSFV E2囊膜糖蛋白特异性结合蛋白ADAM17，通过CRISPR-Cas9技术敲除ADAM17可完全阻断CSFV感染。纯化的重组E2蛋白和ADAM17可以特异结合。以上，都证明ADAM17是猪瘟病毒的特异受体。ADAM17将是抗猪瘟病毒疫苗以及药物设计和筛选的重要靶点，也是抗猪瘟病毒猪育种的重要靶点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示sgRNA识别位点；其中，图1(A)示ADAM17基因序列中sgRNA识别位点；图1 (B)示ADAM10基因序列中sgRNA识别位点；

图2示敲除检测引物位置；

图3示ADAM17是CSFV入侵PK15必需的；其中，图3(A)示sE2与PK15的结合依赖于ADAM17；FACS分析sE2与PK15、Hela、PK15 ADAM17敲除细胞系(PK15 ADAM17-KO)、 PK15ADAM10敲除细胞系(PK15 ADAM10-KO)和PK15 ADAM17-KO猪ADAM17过表达细胞系(PK15ADAM17-KO-pADAM17)的结合；图3(B)示没有ADAM17的细胞系不感染CSFVpp；上述细胞系分别感染具有GFP报告基因的SXCDK和石门株，VSVpp用作阳性对照，不编码囊膜蛋白的HIV-1是阴性对照；误差线代表标准方差；图3(C)示CSFVcc在有无ADAM17表达的细胞系中的感染性；上述细胞分别感染具有GFP报告基因的重组VSV (rVSV-GFP)和CSFV石门株，并用anti-CSFV E2进一步染色(n＝3)，误差线代表标准方差；

图4示ADAM17是猪胚胎成纤维细胞感染CSFV必需的；用两条针对ADAM17的siRNA(siADAM17-1、siADAM17-3)及阴性对照(siCon.)转染PEFs；其中，图4(A)示使用定量PCR检测ADAM17 mRNA表达水平，并计算占阴性对照的百分比(n＝3)；误差线代表标准方差；图4(B)示使用定量PCR法检测CSFVcc石门株的病毒RNA水平以测定病毒感染性，并计算占阴性对照的百分比；误差线代表标准方差，以上数据代表三次独立的实验；

图5示ADAM17通过金属蛋白酶域与CSFV E2结合；其中，图5的左图示金属蛋白酶域锌离子的螯合降低了sE2与PK15细胞的结合；不同浓度的1,10-phenanthroline处理PK15，并利用FACS检测与sE2的结合；图5的右图示aderbasib通过占用金属蛋白酶域的活性中心阻断sE2与PK15细胞的结合；不同浓度的aderbasib处理PK15细胞，然后利用FACS检测与sE2的结合；以上数据代表三次独立的实验；

图6示ADAM17与sE2直接结合；其中，图6(A)示在没有锌离子的条件下纯化的可溶性ADAM17与sE2结合的表面等离子共振图；图6(B)示在锌离子存在的条件下可溶性 ADAM17与sE2结合的表面等离子共振图。

具体实施方式

本发明公开了ADAM17在作为猪瘟病毒的受体中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的ADAM17在作为猪瘟病毒的受体中的应用涉及的原料及试剂均可由市场购得。

术语解释：

猪瘟是一种严重威胁养猪业的烈性猪传染疾病，猪瘟的病原体是猪瘟病毒，是一种黄病毒科瘟病毒属病毒，宿主限于家猪和野猪。

病毒受体是指能特异性与病毒结合并介导病毒入侵细胞的宿主因子，大多数属于跨膜蛋白。受体是病毒感染宿主的关键宿主因子，阻断病毒和受体的结合可以有效抑制病毒的感染。因此受体是药物和疫苗等抗病毒策略的重要靶点，同时也是动物育种中筛选选抗病毒动物的重要靶点。

ADAM17是去整合素基质金属蛋白酶17(A disintegrin and metalloprotease17， ADAM17)也叫肿瘤坏死因子转化酶(tumor necrosis factor-converting enzyme，TACE)是锌离子依赖的去整合素金属蛋白酶ADAM家族的一员。

CRISPR Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR； CRISPR-associated，Cas)是细菌和古细菌进化出的一种RNA介导的适应性防御系统，可以保护有机体免受病毒和质粒的入侵。来自化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)的II 型CRISPR系统可以指导Cas9蛋白进行序列特异性切割与crRNA配对的靶点，2013年 CRISPR/Cas系统改造为基因组编辑工具。

SPR在物理上指表面等离子体共振，全称为Surface Plasmon Resonance，表面(一般是固相和液相间的界面)等离子体共振是用于表征表面折射系数改变的光学专业技术，可被用来实时跟踪天然状态下生物分子间的相互作用。

表1主要实验仪器

表2主要商品试剂及耗材

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1纯化和鉴定CSFV E2-Fc蛋白(sE2)

1.纯化sE2蛋白

表达sE2蛋白的质粒为pCAGGS-CSFV-E2-Fc，保存于本实验室。

(1)传293T于10cm细胞培养皿，共30盘，培养基为含有8％FBS、1％青霉素-链霉素、1％左旋谷氨酰胺的DMEM，培养在37℃，5％CO₂的细胞培养箱内；

(2)次日，待293T细胞长到约90％，开始转染；转染方法为磷酸钙转染，试剂包括2.5M CaCl₂、2′HBS(pH7.0)、ddH₂O，并提前在37℃水浴锅预热；

(3)转染体系一：

表3

将体系一配置于流式管内，并在振荡器上彻底混匀1分钟；

(4)向“体系一”内一滴一滴的滴加500μl 2′HBS，在振荡器上彻底混匀30秒；

(5)将上述混合体系，一滴一滴的滴加到293T细胞内，并上下左右小心混匀；

(6)将293T细胞放置在37℃，5％CO₂的细胞培养箱内继续培养12小时；

(7)在37℃水浴锅内，预热含有2％FBS、1％青霉素-链霉素、1％左旋谷氨酰胺的DMEM 培养基；

(8)更换为上述培养基，37℃，5％CO₂继续培养36小时；

(9)收集培养基，加入十分之一体积的1.0M的Tris(pH8.0)混匀并，第一次4℃、5000rpm、10分钟离心，第二次4℃、12000rpm、15分钟离心，以彻底去掉细胞碎片；

(10)以下在4℃低温实验室操作；

(11)取500μl Protein A beads于柱子内，5mL 10mM Tris(pH8.0)平衡Protein Abeads；

(12)将培养基通过Protein A beads，流速<1mL/min；

(13)用5mL的100mM Tris(pH8.0)洗涤protein A beads；

(14)用5mL的10mM Tris(pH8.0)洗涤protein A beads；

(15)用50mM甘氨酸(pH3.0)洗脱蛋白，每次5mL；

(16)取若干个1.5mL离心管，并在其中加入50μl 1M Tris(pH8.0)，每管接约250μl的甘氨酸洗脱液，迅速混匀；

(17)取20μl 1′Bradford于PCR管中，加5μl甘氨酸为对照；取洗脱下来的溶液5μl于20μl 1′Bradford中，混匀，放在白纸上查看颜色是否变蓝，变蓝则有蛋白存在；

(18)洗脱至1′Bradford不变色；

(19)将洗脱下来的溶液按照先后顺序编号为1～n号；

2.SDS-PAGE分析sE2蛋白

(1)配置SDS-PAGE胶，10％分离胶；

(2)煮样：5μl 5′SDS-PAGE loading buffer+20μl蛋白洗脱液，100℃金属浴，10分钟；

(3)电泳

(4)考马斯亮蓝染色，脱色。

实施例2建立CRISPR Cas9敲除细胞系

1.sgRNA合成

(1)利用http://www.rgenome.net/cas-designer/在线设计网站设计分别针对猪ADAM17 (NC_010445.4，NM_001099926.1)第二个外显子上下游的sgRNA，以敲除ADAM17第二个外显子；同理利用网站设计分别针对ADAM10(NC_010443.5)的第二个外显子上游和第三个外显子下游的sgRNA，以敲除ADAM10第二、三个外显子(图1)，并在正向引物5’端添加CACC，反向引物5’端添加AAAC以与经BbsI酶切的pX330质粒形成粘性末端(表4)。交于上海捷瑞生物公司合成。

表4 sgRNA序列

(2)合成sgRNA双链：

a.用RNase/DNase free的水溶解sgRNA引物至100μM；

b.配制一下体系于600μl离心管，并混匀：

表5

c.用磁力搅拌器加热装有超纯水的烧杯，直至沸腾；

d.将600μl离心管固定于泡沫浮板，放入沸水中，并继续加热保持沸腾10分钟；

e.将烧杯转移至密封的泡沫盒子中，使水温慢慢降至室温；

f.双链合成，保存于-20℃。

2.pX330线性化

pX330全称为pX330-GFP-U6-chimeric_BB+85-CBh-NLS-hSpCsn1-NLS_HW，是经人密码子优化的SpCas9和嵌合sgRNA表达质粒(Cong et al.2013)，且具有GFP报告基因。

(1)酶切体系：

表6

37℃水浴锅，酶切3小时。

(2)胶回收

配置浓度为1％琼脂糖凝胶，待酶切反应结束后，将酶切体系进行琼脂糖凝胶电泳，电压为130V，电泳时间为30min；电泳结束之后，将大小正确的特异性条带用干净的手术刀切下，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Promega)回收目的DNA片段，操作步骤为：

a.将切下的含目的条带的凝胶，置于1.5mL离心管内；称取凝胶重量，每10mg加入10μl membrane binding solution；

b.在65℃金属浴中加热孵育，直至凝胶完全溶解；

c.将SV微型柱置于收集管内；

d.转移胶混合液于微型柱内，室温孵育1min；

e.经16000′g，1min离心后，弃掉流出液；

f.加700μl membrane wash solution于微型柱内，16000′g，1min离心，弃掉流出液；

g.加500μl membrane wash solution于微型柱内，16000′g，1min离心，弃掉流出液；

h.16000′g，离心5min；

i.室温晾5min，使剩余的乙醇蒸发干净；

j.将微型柱转移至干净的1.5mL离心管内；

k.向微型柱内加50μl核酸酶—free的水，室温孵育2min；

l.16000′g，1min离心后，得到目的DNA；

m.使用NonoDrop测量DNA浓度；

n.保存于-20℃。

3.T4 DNA连接酶连接

将线性化的pX330和合成的双链sgRNA进行连接，连接体系如下，混匀，16℃ PCR仪连接过夜：

表7

4.转化

(1)从-80℃冰箱中取出stbl3感受态细胞，置于冰上；

(2)待stbl3感受态细胞融化后，取10μl连接产物加入100μl感受态细胞中，手指轻轻弹几下，混匀，在冰上孵育30分钟；

(3)42℃热激90秒，立即转移至冰上，孵育2分钟；

(4)在超净工作台内，加入1mL无抗生素LB(蛋白胨、酵母提取物、氯化钠)培养基，转移至摇床上，在37℃孵育50分钟；

(5)在室温，4000rpm条件下离心3分钟，在超净工作台内吸走大部分上清，只保留100μl左右上清；

(6)使用移液器混匀菌体和剩余的上清，重悬菌体，使用涂布棒均匀涂布在氨苄霉素平板上，在37℃培养箱内倒置培养约12小时。

5.菌检

由于连接效率很高，并且插入片段很短仅28bp，所以我们采用直接挑菌，小摇，送公司测序的方法进行鉴定。

(1)挑单菌落于含氨苄霉素的10mL LB培养基中，37℃摇床，培养过夜；

(2)小提质粒：

a.离心得沉淀：超净台内取5mL过夜培养的菌液，室温12000rpm离心3分钟，吸走上清，留细菌沉淀物；

b.重悬：用250μl Buffer P1重悬细菌沉淀物，并转移至1.5mL离心管内；

c.裂解：加入250μl Buffer P2，上下颠倒混匀4-6次，裂解时间不要超过5分钟；

d.中和：加入350μl Buffer N3，立即上下颠倒混匀4-6次；

e.离心：在桌面离心机离心10分钟，转速为13000rpm；

f.过柱：取800μl“步骤e”中得到的上清加到离心柱内，13000rpm离心1分钟，丢弃流出液；

g.洗离心柱：取750μl Buffer PE加入到离心柱内，13000rpm离心1分钟，丢弃流出液；

h.去掉残余Buffer PE：13000rpm离心2分钟，丢弃流出液，室温晾5分钟；

i.洗脱：将离心柱放入新的1.5mL离心管内，加50μl Buffer EB(10mM TrisCl，pH8.5) 于离心柱内，室温孵育2分钟，13000rpm，1分钟；

j.使用NanoDrop测量DNA浓度，送北京擎科新业生物公司测序；

k.分析测序结果；

(3)选择测序正确无突变的单菌落菌液，进行大量培养：取1mL菌液于含氨苄霉素的200mL LB培养基中，37℃摇床，培养过夜。

6.大提质粒

(1)离心得沉淀：收取过夜培养的菌液，4℃高速离心机6000′g离心15min，弃上清；

(2)重悬：用10mL Buffer P1重悬菌体，转移至50mL高速离心管内；

(3)裂解：加10mL Buffer P2，上下颠倒4-6次彻底混匀，室温孵育5分钟；

(4)中和：加10mL预冷的Buffer P3，上下颠倒4-6次彻底混匀，冰上孵育20分钟；

(5)离心：4℃，22000′g离心30min，得到上清，4℃再次离心22000′g、15分钟；

(6)平衡：加10mL Buffer QBT于吸附柱内，靠重力自然滴下；

(7)过柱子-吸附：将“步骤5”中得到的上清加到柱子内，使上清靠重力自然滴下；

(8)洗柱子：加30mL Buffer QC于柱子内，靠重力自然滴下，重复2次；

(9)洗脱：将柱子放到新的50mL高速离心管内，加15mL Buffer QF于柱子内，靠重力自然滴下；

(10)沉淀质粒：加10.5mL异丙醇于洗脱下来的DNA内，混匀；4℃，15000′g，30 分钟；可见白色DNA沉淀，弃上清；

(11)洗涤DNA：加5mL70％乙醇4℃，15000′g，10分钟，弃上清，洗DNA沉淀；

(12)溶解DNA：晾干DNA沉淀，加适量的Buffer EB溶解DNA；

(13)使用NanoDrop测量DNA浓度，-20℃保存备用。构建的质粒分别命名为：pX330-pig ADAM17 KO-up、pX330-pig ADAM17 KO-down、pX330-pig ADAM10 KO-up、pX330-pig ADAM10 KO-down。

7.转染PK15

(1)传PK15于6cm细胞培养皿，培养基为含8％FBS、1％青霉素-链霉素、1％左旋谷氨酰胺的DMEM，培养于37℃、5％CO₂细胞培养箱内；

(2)次日待细胞长至约90％满，开始做转染，转染试剂为Fugene 6(PromegaE2691)；

(3)取300μl opti-MEM培养基于1.5mL离心管内，然后加入60μl Fugene 6，振荡器混匀，短暂离心，室温孵育5分钟；

(4)取pX330-up、pX330-down各6μg于上述体系中，振荡器混匀，短暂离心，室温孵育15分钟；

(5)将转染体系一滴一滴的滴加到细胞中，上下左右小心混匀；

(6)继续培养细胞48小时；

8.细胞分选

由于pX330质粒有GFP报告基因，所以可以通过流式细胞仪分选带有绿色荧光的细胞于96孔板中，每孔1个细胞，以获得单克隆细胞系。

(1)使用胰酶消化转染过的PK15细胞至单细胞；

(2)细胞计数仪计数，稀释至细胞浓度为2′10⁶cells/mL；

(3)细胞筛过滤细胞于流式管内；

(4)提前在96孔细胞培养板内，加好含8％FBS、1％青霉素-链霉素、1％左旋谷氨酰胺的DMEM培养基；

(5)Beckman MoFlo XDP多色荧光流式细胞仪分选绿色荧光阳性细胞于96孔细胞培养板内，每孔一个细胞；

(6)将分选好的细胞，放置于37℃、5％CO₂培养；

(7)约一周后，将可见单克隆细胞的孔，消化，转移至12孔板继续培养；之后再转移至6孔板继续培养；

(8)长满6孔板后，取2′10⁵个细胞提取基因组DNA，剩余的传至6cm培养皿继续培养；

(9)同时取无操作的正常PK15 2′10⁵个细胞提取基因组DNA，以作对照。

9.提取基因组DNA

(1)将Spin Column置于收集管中，加入250μl Buffer BL，12000′g离心1分钟，活化硅胶膜；

(2)取20μl蛋白酶K至1.5mL离心管底部，然后加入200μl高纯水悬浮细胞沉淀，涡旋振荡10秒；再加入200μl Buffer gA1，涡旋振荡10秒，56℃孵育1小时，直至细胞完全消化；

(3)孵育结束后加入200μl无水乙醇，涡旋振荡混匀；

(4)将步骤3所得溶液全部转入Spin Column中，12000′g离心1分钟，弃废液；

(5)向Spin Column中加入500μl Buffer PW，12000′g离心1分钟，弃废液；

(6)重复步骤5一次；

(7)向Spin Column中加入500μl Wash Buffer，12000′g离心1分钟，弃废液；

(8)将Spin Column放回收集管中，12000′g离心2分钟，开盖晾干1分钟；

(9)取出Spin Column，放入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜的中央

处加50μl TE Buffer，室温放置2min，12000′g离心2min；

(10)NanoDrop测定DNA溶液溶度，-20℃保存备用。

10.PCR检测

(1)检测引物设计位置见图2。

(2)配置如下PCR体系：

表8

(3)PCR程序：

(4)配置浓度为1％琼脂糖凝胶，待酶切反应结束后，将酶切体系进行琼脂糖凝胶电泳，电压为130V，电泳时间为30min；

(5)分析条带大小：敲除成功的条带比正常细胞系条带要小。

实施例3流式细胞术(Flow cytometry，FACS)

(1)使用胰酶消化各细胞系至单细胞；

(2)细胞筛过滤细胞于流式管内；

(3)细胞计数仪计数，每个细胞系取两个2′10⁵个细胞于两个1.5mL离心管分别定义为Assay(A)管、Control(C)管；

(4)配置工作液：1％FBS的PBS，放于冰上；

(5)300g离心2分钟，去上清；200μl工作液重悬，放于冰上；

(6)每个细胞系的A管加入2μg sE2(终浓度为10μg/ml)，混匀；C管加入相应体积的PBS，混匀；在冰上孵育50分钟，中间混匀5次；

(7)洗细胞：每次1mL工作液，300g、4℃离心2分钟，洗三次；

(8)配置二抗溶液：用工作液1:200稀释Alexa-Fluor 488 goat anti-human IgG(Thermo Fisher Scientific)，每管200μl，重悬细胞，冰上孵育45分钟，中间混匀5次；

(9)洗细胞：每次1mL工作液，300g、4℃离心2分钟，洗三次；

(10)每管500μl工作液重悬细胞，并转移至流式管内，放于冰上；

(11)使用BD FACSCalibur流式细胞仪分析检测。

实施例4建立过表达细胞系

1.慢病毒质粒构建

(1)利用同源重组的方法将ADAM17同源基因克隆到慢病毒载体中；

(2)猪ADAM17是从PK15的cDNA中扩增而得；

(3)人ADAM17是从Hela细胞扩增所得；

(4)鼠ADAM17、原鸡ADAM17及斑马鱼ADAM17b是委托北京盛元科萌生物科技有限公司合成；

(5)构建过程：PCR扩增目的片段，线性化慢病毒载体，同源重组连接，转化，菌检，测序，大量提取；

2.建立过表达细胞系

(1)传293T于10cm培养皿，培养基为含8％FBS、1％青霉素-链霉素、1％左旋谷氨酰胺的DMEM，37℃、5％CO₂培养；

(3)转染体系一：

表9

将体系一配置于流式管内，并在振荡器上彻底混匀1分钟；

(7)在37℃水浴锅内，预热含有8％FBS、1％青霉素-链霉素、1％左旋谷氨酰胺的DMEM 培养基；

(8)更换为上述培养基，37℃，5％CO₂继续培养36小时；

(9)转染后的第二天，传PK15 ADAM17-KO细胞系于6cm细胞培养皿；

(10)转染后48小时收集293T上清，并加入8μg/mL的polybrene，混匀；4℃、12000g、10分钟离心，去掉细胞碎片；

(11)去PK15 ADAM17-KO上清，加入含慢病毒粒子上清，37℃，5％CO₂继续培养 3小时；

(12)为PK15 ADAM17-KO更换新鲜培养基，37℃，5％CO₂继续培养2天；

(13)加3μg/mL puromycin筛选5天；

(14)更换为新鲜培养基，继续培养，之后传代、冻存。

3.检测过表达细胞系

建立细胞系之后，利用Western-Blot(anti-Flag Tag)或免疫荧光(anti-humanADAM17) 检测基因过表达情况。

实施例5假病毒包装

1.质粒构建

已知CSFV包含三个亚型(1、2、3)，本发明委托北京盛元科盟生物技术有限公司合成人缘密码子优化的石门株(1型)(GenBank:AF333000.1)、SXCDK株(2型) (Genbank:GQ923951.1)囊膜蛋白E^rnsE1E2基因片段，并利用同源重组构建至XbaI、EcoRI 线性化的pCAGGS载体中，质粒分别命名为pCAGGS-CSFV/Shimen-E012、 pCAGGS-CSFV/SXCDK-E012。

2.假病毒包装

(3)转染体系一：

表10

将体系一配置于流式管内，并在振荡器上彻底混匀1分钟；其中VSV-G表达VSV糖蛋白，用作阳性对照假病毒；或者不加任何病毒的糖蛋白表达质粒，用作阴性对照 (Non-envelope)；

(8)更换为上述培养基，37℃，5％CO₂继续培养36小时；

(9)转染后48小时收集293T上清，并加入8μg/mL的polybrene，混匀；4℃、12000g、10分钟离心，取上清，冻存于-80℃待用。

3.假病毒滴度测定

(1)传PK15于96孔板，每孔8000个细胞；

(2)24小时后，10倍梯度稀释假病毒，100μl/孔，感染细胞，37℃，5％CO₂孵育3 小时；

(3)更换为新鲜培养基，37℃，5％CO₂继续培养45小时

(4)在荧光显微镜下计数，病毒的滴度是以每毫升GFP-阳性数来计算的(FFU/mL)。实施例6细胞培养株(CSFVcc)病毒滴度测定

(1)传PK15于96孔板中，每孔8000个细胞；

(2)24小时后，10倍梯度稀释病毒，100μl/孔，感染细胞，37℃，5％CO₂孵育3小时；

(3)更换为含20mM NH₄Cl的培养基，37℃，5％CO₂继续培养45小时；

(4)用-20℃预冷的甲醇固定细胞；

(5)用含1％Gelatin的PBS洗两遍细胞；

(6)用含1％BSA的PBS室温封闭细胞2小时；

(7)1:500稀释鼠单抗WH303(抗CSFV E2蛋白)，每孔50μl；

(8)用含1％Gelatin的PBS洗三遍细胞；

(9)1:500稀释Alexa-Fluor 488goat anti-mouse IgG(Thermo FisherScientific)，每孔50μl；

(10)用含1％Gelatin的PBS洗三遍细胞；

(11)在荧光显微镜下计数。

实施例7RNA干涉

1.RNA干涉

(1)利用http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/设计基因特异siRNAs 3对及物种无意义siRNA，提交给上海生工生物科技公司合成；

序列如下所示：

(2)传细胞于6cm细胞培养皿；

(3)待细胞长到约95％满时，开始做转染；

(4)配置转染体系一：取300μl Opti-MEM Medium于1.5mL离心管，向内加入18μlLipofectamine RNAimax，混匀；

(5)配置转染体系而二：取300μl Opti-MEM Medium于1.5mL离心管，向内加入siRNA 使其终浓度为50nM，混匀；

(6)混合体系一、二，混匀，短暂离心，室温孵育5分钟；

(7)将步骤6所得，一滴一滴的加入细胞内，上下左右小心混匀，放于37℃培养36小时；

2.提取细胞RNA

siRNA转染36小时后，分别取2′10⁵个细胞，500μl Trizol裂解细胞，提取RNA，具体操作步骤如下：

(1)500μl Trizol室温裂解细胞5分钟；

(2)加100μl氯仿，上下颠倒混匀，室温孵育2分钟；

(3)离心：4℃，12000g，15分钟；

(4)可见分层，小心取上清于新的1.5mL离心管内；

(5)加250μl异丙醇，上下颠倒混匀，室温孵育10分钟；

(6)离心：4℃，12000g，10分钟；

(7)可见白色沉淀，小心吸走上清；

(8)加1mL75％乙醇，上下颠倒几次；

(9)离心：4℃，7500g，5分钟；

(10)去掉上清，室温晾干沉淀；

(11)用RNase-free water溶解沉淀，NanoDrop测RNA溶液浓度，立即使用或-80℃保存备用。

3.反转录PCR

使用TAKARA PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行反转录PCR，操作过程如下：

(1)去除基因组DNA反应：按如下成分于冰上配置反应混合液，然后42℃孵育2分钟；

表11

(2)反转录反应：反应液在冰上配置，反应成分如下：

表12

然后在PCR仪上进行一下程序，即得到cDNA，保存于-20℃备用。

表13

37℃	15min
		85℃	5s
4℃

4.定量PCR

使用Takara one step SYBR PrimerScript reverse transcription(RT)-PCRkit，仪器为 Applied Biosystems QuantStudio，β-actin基因做为内参。

RT-PCR程序为：

效果例

1、为了筛选鉴定猪瘟病毒特异性宿主因子，我们将编码CSFV 1亚型石门株的糖蛋白 E2的胞外域序列(基因库登录号AFF333000.1)克隆到pPUR-TPA-Fc载体中，并转染293T细胞，收集上清并纯化猪瘟病毒E2可溶性蛋白sE2。通过用sE2蛋白进行免疫共沉淀实验，并结合质谱，得到了猪ADAM17蛋白。

E2胞外域的DNA序列(如SEQ ID No.4所示)：

cggctagcctgcaaggaagattacaggtacgcaatatcatcaaccaatgagatagggctactcggggccggaggtctcactaccac ctggaaagaatacagccacgatttgcaactgaatgacgggaccgttaaggccatttgcgtggcaggttcctttaaaatcacagcacttaatgt ggtcagtaggaggtatttggcatcattgcataagggggctttactcacttccgtgacattcgagctcctgttcgacgggaccaacccatcaac cgaagaaatgggagatgacttcgggttcgggctgtgcccgtttgatacgagtcctgttgtcaagggaaagtacaatacaaccttgttgaacg gtagtgctttctatcttgtctgcccaatagggtggacgggtgttatagagtgcacagcagtgagcccaacaactctgagaacagaagtggta aagaccttcaggagagagaagcctttcccacacagaatggattgtgtgaccaccacagtggaaaatgaagatctattctactgtaagttggg gggcaactggacatgtgtgaaaggtgaaccagtggtctacacaggggggcaagtaaaacaatgcaaatggtgtggcttcgacttcaacga gcctgacggactcccacactaccccataggtaagtgcattttggcaaatgagacaggttacagaatagtagattcaacggactgtaacagag atggcgttgtaatcagcgcaaaggggagccatgagtgcttgatcggcaacacaactgtcaaggtgcatgcatcagatgaaagactgggccctatgccatgcagacctaaagagattgtctctagtgcaggacctgtaaggaaaacttcctgtacattcaactacgcaaaaactttgaagaaca agtactatgagcccagggacagctacttccagcaatatatgctcaagggcgagtatcagtactggtttgacctggacgtg

蛋白序列(如SEQ ID No.3所示)：

RLACKEDYRYAISSTNEIGLLGAGGLTTTWKEYSHDLQLNDGTVKAICVAGSFKIT ALNVVSRRYLASLHKGALLTSVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFGFGLCPFDTSPVVKGKY NTTLLNGSAFYLVCPIGWTGVIECTAVSPTTLRTEVVKTFRREKPFPHRMDCVTTTVENE DLFYCKLGGNWTCVKGEPVVYTGGQVKQCKWCGFDFNEPDGLPHYPIGKCILANETG YRIVDSTDCNRDGVVISAKGSHECLIGNTTVKVHASDERLGPMPCRPKEIVSSAGPVRKTSCTFNYAKTLKNKYYEPRDSYFQQYMLKGEYQYWFDLDV

猪ADAM17编码区DNA序列(如SEQ ID No.2所示)：

atgaggcagtgtgcgctcttcctgaccagcttggttcctatcgtgctggcgccgcgaccgccggacgagccgggcttcggctcccc tcagcgactcgaaaagcttgattctctgctctcagactacgacatcctctctttatccagcattcgccagcactccgtaaggaaaagggatctg caggcctcaacacacctagagacactactaactttttcagccttgaacaggcattttaaattatacctgacatcaagtactgaacgcttctccca gaatttcaaagtcgtggtggtcgatggggaagatgaaagtgagtaccccgtcaagtggcaggacttcttcagtggacacgtggttggtgaa cctgactctagggttctcgcccacataggagatgatgatattacagtaagaatcaacacagatggggcagaatataatatagagccactttgg agactaattaatgatactaaagacaaaagagtgttagtttataagtctgaagatatcaagaatgtttcacgtttgcagtctccaaaagtgtgtggt tatataaaggcggataatgaagagttgcttcctaaagggctagtagacagagagccgcctgatgagcttgttcaccgggtgaagagaagag ccgaccccaatcccctgaggaacacgtgtaaattattggtggtggcagatcatcgcttttataagtacatgggcagaggggaagagagcac gaccacaaactacctgatagagctaattgacagagttgatgacatctatcggaacacttcatgggacaatgcaggttttaaaggttatggaata cagatagagcagattcgcattctcaagtctccacaagaggtaaaacctggtgaaaggcactacaatatggcaaaaagttacccaaatgaag aaaaggatgcttgggatgtgaagatgttgctagagcaatttagctttgatatagctgaagaagcatctaaagtctgcctggcacatcttttcacc taccaagattttgatatgggaactcttggattagcttatgttggttctcccagagcaaacagtcatggaggtgtttgtccaaaggcttattatagtc caattggaaagaaaaatatctatttaaatagtggtttgaccagcacaaaaaattatggtaaaaccatccttacaaaggaagctgaccttgtgac aactcatgaattggggcacaattttggagcagaacacgatccagatggtttagcagaatgtgccccaaacgaggaccagggaggaaaata cgtcatgtatcccatagccgtgagtggtgatcatgagaacaacaagatgttttcaaactgcagtaaacagtccatctataagaccattgaaagt aaggcccaggagtgttttcaagagcgcagcaacaaagtgtgtggcaactccagggtggatgagggggaggagtgcgaccccggcatca tgtacctgaacaacgacacctgctgcaacagcgactgcaccctgaggccgggcgtccagtgcagtgataggaacagtccttgctgtaaaa actgtcagttcgagacggcccagaagaagtgccaggaggctattaatgccacttgcaaaggcgtgtcttactgcacaggtaacagcagtga gtgcccccctccgggaaacgccgaggacgacacggtgtgcctggacctgggcaggtgcaaggacggcaagtgcgtgcccttctgcgag cgggagcagcggctggagtcctgcgcgtgtaacgaaaccgaccactcgtgcaaggtgtgctgccgggccccctcgggccgttgcctgc cctacgtggacgccgaacagaagaacttgtttttgaggaaggggaagccctgtacagtaggattttgtgacatgaatggcaagtgtgagaa gcgagtgcaggacgtcatcgagcggttctgggagttcattgacaagctgagcatcaatactttcgggaagttcctggcagacaacatcgtg ggctccgtcctggtgttctccctgatgctctggatccccgtcagcatcctcgtccactgcgtggataagaagctggataagcagtacgaatcc ctgtctctgctgcaccccagcaacgtggagatgctaagcagcatggattcagcatccgttcgcatcatcaagccctttcctgcgccccagac cccaggccgcctgcagcccctgcagcccctgcagcccggccccgtgctgccctctgcgccttcggtgcccgtggctccaaaactggacc accagcggatggacaccatccaggaggaccccagcacggactcgcacgtggacgaggacggcttcgagaaggaccctttccccaaca gcagtgccgctgccaagtcatttgaggatctcacggaccatccggtcacgagaagtgaaaaggcctcgtcctttaagctgcagcgccagagtcgcgttgacagcaaggaaacggagtgc

猪ADAM17蛋白序列(如SEQ ID No.1所示)：

MRQCALFLTSLVPIVLAPRPPDEPGFGSPQRLEKLDSLLSDYDILSLSSIRQHSVRKR DLQASTHLETLLTFSALNRHFKLYLTSSTERFSQNFKVVVVDGEDESEYPVKWQDFFSG HVVGEPDSRVLAHIGDDDITVRINTDGAEYNIEPLWRLINDTKDKRVLVYKSEDIKNVSR LQSPKVCGYIKADNEELLPKGLVDREPPDELVHRVKRRADPNPLRNTCKLLVVADHRF YKYMGRGEESTTTNYLIELIDRVDDIYRNTSWDNAGFKGYGIQIEQIRILKSPQEVKPGE RHYNMAKSYPNEEKDAWDVKMLLEQFSFDIAEEASKVCLAHLFTYQDFDMGTLGLAY VGSPRANSHGGVCPKAYYSPIGKKNIYLNSGLTSTKNYGKTILTKEADLVTTHELGHNF GAEHDPDGLAECAPNEDQGGKYVMYPIAVSGDHENNKMFSNCSKQSIYKTIESKAQEC FQERSNKVCGNSRVDEGEECDPGIMYLNNDTCCNSDCTLRPGVQCSDRNSPCCKNCQF ETAQKKCQEAINATCKGVSYCTGNSSECPPPGNAEDDTVCLDLGRCKDGKCVPFCERE QRLESCACNETDHSCKVCCRAPSGRCLPYVDAEQKNLFLRKGKPCTVGFCDMNGKCEK RVQDVIERFWEFIDKLSINTFGKFLADNIVGSVLVFSLMLWIPVSILVHCVDKKLDKQYE SLSLLHPSNVEMLSSMDSASVRIIKPFPAPQTPGRLQPLQPLQPGPVLPSAPSVPVAPKLD HQRMDTIQEDPSTDSHVDEDGFEKDPFPNSSAAAKSFEDLTDHPVTRSEKASSFKLQRQS RVDSKETEC

2、为了验证ADAM17的功能，我们在CSFV的易感细胞PK15上用CRISPR-Cas9技术敲除了ADAM17的表达。结果如图3所示：敲除的细胞系不能同sE2结合，也不能不CSFV的假病毒和真病毒感染。而重新过表达ADAM17后sE2结合和CSFV病毒的感染都完全恢复。

具体的，图3(A)：

仪器：流式细胞仪BD FACSCalibur

软件：FlowJo 7.6

实验方法：FACS(流式细胞术)

分析过程：蓝色阴影为加sE2实验组，红色为对照组。野生型PK15(猪瘟病毒易感细胞系，猪肾细胞)与sE2发生结合，可检测到强荧光信号，对照组基本没有荧光信号，两者经FlowJo 7.6软件分析，重叠两者直方图，可见完全的位移。而对照细胞即Hela(猪瘟病毒不易感细胞系)不能与sE2结合，不能检测到荧光信号，对照组也没有荧光信号，两者经FlowJo 7.6软件分析，重叠两者直方图，没有发生位移。以上说明sE2可特异性的与猪瘟病毒易感细胞系PK15结合，而不与不易感细胞系Hela结合，证明了特异性。

经FACS分析CRISPR Cas9敲除PK15细胞系ADAM17基因后同sE2结合变化，发现ADAM17敲除后PK15不能与sE2结合，不能检测到荧光信号，对照组也没有荧光信号，两者经FlowJo 7.6软件分析，重叠两者直方图，没有发生位移。在ADAM17敲除细胞系上重新导入猪ADAM17 cDNA，重塑ADAM17表达后，经FACS分析可恢复与sE2发生结合，可检测到强荧光信号，且对照组基本没有荧光信号，两者经FlowJo 7.6软件分析，重叠两者直方图，可见完全的位移。ADAM家族有四十多个基因，ADAM10是与ADAM17最相似的一个，氨基酸相似率为22.6％，但是经FACS分析CRISPR Cas9敲除PK15细胞系ADAM10基因后同sE2结合变化，发现ADAM10敲除后PK15仍能与sE2结合，可检测到强荧光信号，且对照组基本没有荧光信号，两者经FlowJo 7.6软件分析，重叠两者直方图，可见完全的位移。证明了ADAM17对于PK15与猪瘟病毒E2蛋白的结合不可缺少。

表14图3(A)数据

具体的，图3(B)：

仪器：Nikon荧光显微镜

软件：Excel及GraphPad Prism6

实验方法：假病毒滴度测定

分析过程：假病毒是一种重组病毒颗粒，它们的core/backbone和囊膜蛋白来源于不同的病毒；此外，假病毒内部的基因通常被改变或者修饰，使它们无法单独产生病毒表面蛋白。因此，需要一个额外的质粒或表达表面蛋白的稳定细胞系来包装假病毒。假病毒能够感染易感细胞系，但是它们只能在受感染的宿主细胞中复制一轮。与野生型病毒相比，假病毒可以在生物安全级别为2(BSL-2)的实验室安全操作而且一般更容易操作。更重要的是，假病毒囊膜表面蛋白的蛋白质构像与野生型病毒一致，这些表面蛋白可有效的介导病毒进入宿主细胞内，因此假病毒被广泛应用于病毒的细胞趋向、受体识别、病毒抑制研究以及抗体和疫苗的开发、评估。而且已经证实假病毒体外、体内实验都和野生型病毒产生的实验结果有很好的相关性。

不同细胞系感染假病毒48小时后，计数并换算病毒滴度(FFU/ml)。利用Excel将数据换算成以10为底的对数函数，将得到的数据用GraphPad Prism6继续处理以柱状图的形式呈现最后结果。结果显示敲除ADAM17的PK15完全不感染两种基因型的猪瘟病毒，重新导入猪ADAM17 cDNA后又可恢复感染至野生PK15水平，而敲除ADAM10没有变化。同时 VSV-G(水疱性口炎病毒)因其几乎感染所有细胞类型，常作为对照病毒，结果显示各种实验操作基本不影响VSV-G感染。证明了ADAM17对于猪瘟病毒入侵PK15不可缺少。

表15图3(B)数据

具体的，图3(C)：

仪器：Nikon荧光显微镜

软件：Excel及GraphPad Prism6

实验方法：细胞培养株(CSFVcc)病毒滴度测定

分析过程：不同细胞系感染病毒48小时后，做免疫荧光实验，计数并换算病毒滴度(FFU/ml)。利用Excel将数据换算成以10为底的对数函数，将得到的数据用GraphPadPrism6继续处理以柱状图的形式呈现最后结果。结果显示敲除ADAM17的PK15完全不感染CSFVcc，重新导入猪ADAM17 cDNA后又可恢复感染至野生PK15水平，而敲除 ADAM10没有变化。同时rVSV-eGFP-G(重组水疱性口炎病毒)因其几乎感染所有细胞类型，常作为对照病毒，结果显示各种实验操作基本不影响rVSV-eGFP-G感染。证明了 ADAM17对于猪瘟病毒感染PK15不可缺少。

表16图3(C)数据

3、为了进一步研究ADAM17在CSFV感染猪中的作用，在猪原代胚胎成纤维细胞(primary embryonic fibroblast，PEFs)中利用siRNA干涉ADAM17的表达，并检测对CSFV感染PEFs的影响。设计合成两条RNAi引物分别转染PEFs。

仪器：Thermo fisher定量PCR仪

软件：Excel及GraphPad Prism6

实验方法：RNA干涉、提取细胞RNA、反转录PCR、定量PCR

分析过程：通过定量PCR分析原代猪胚胎成纤维细胞转染ADAM17特异引物 (si-ADAM17)、无关引物(siCtrl)ADAM17及内参基因β-actin，达到阈值所需的PCR 循环数(Ct值)。利用Excel初步处理转染ADAM17特异引物(si-ADAM17)相对于转染无关引物(siCtrl)ADAM17的表达量(％)，将得到的数据用GraphPad Prism6继续处理以柱状图的形式呈现最后结果。结果显示ADAM17的RNA水平分别降低了70.9％和 78.9％。

将RNA干涉36后原代猪成纤维细胞感染CSFVcc，2天后用定量PCR检测病毒感染水平，测定达到阈值所需的PCR循环数(Ct值)。利用Excel初步处理转染ADAM17特异引物(si-ADAM17)相对于转染无关引物(siCtrl)CSFVcc含量(％)，将得到的数据用GraphPadPrism6继续处理以柱状图的形式呈现最后结果。结果显示两条RNAi引物敲低ADAM17表达分别使病毒感染水平显著的减少89.2％和92.4％。

结果如图4所示：36小时后应用荧光定量PCR检测ADAM17 RNA水平，ADAM17的 RNA水平分别降低了70.9％和78.9％。同时，将RNA干涉36小时后的PEFs细胞感染CSFVcc， 2天后用定量PCR检测病毒感染水平。两条RNAi引物敲低ADAM17表达分别使病毒感染水平显著的减少89.2％和92.4％。这个结果说明ADAM17对CSFV感染原代猪细胞至关重要。

表17图4(A)

表18图4(B)

4、ADAM17是一个锌离子依赖的金属蛋白酶，在其金属蛋白酶域活性中心有一个锌离子。1,10-phenanthroline可以通过螯合和去除锌离子来抑制其活性。

仪器：流式细胞仪BD FACSCalibur

软件：FlowJo 7.6

实验方法：FACS(流式细胞术)

结果如图5所示：不同浓度的1,10-phenanthroline与胰酶处理后的PK15在冰上孵育 30分钟，接着通过FACS检测PK15与sE2的结合，发现随着浓度的增高sE2结合减少，且在1,10-phenanthroline浓度为25mM时结合减少74.3％。说明了CSFV E2蛋白与ADAM17 的活性位点结合。

一类包括aderbasib在内的ADAM17抑制剂通过与金属蛋白酶域的活性位点结合来抑制金属肽酶的活性，aderbasib又称为INCB007839，是ADAM10和ADAM17的选择性抑制剂，目前正在进行癌症治疗的临床试验。为了检测aderbasib是否可以抑制ADAM17与 sE2之间的结合，不同浓度的aderbasib与胰酶处理后的PK15冰上孵育30分钟，同样通过 FACS检测PK15与sE2的结合，发现随着浓度的增高sE2结合减少，且在aderbasib浓度为100μm时，几乎检测不到结合(图5B)。这进一步说明CSFV E2蛋白通过金属蛋白酶域与ADAM17结合。

表19图5(A)数据

表20图5(B)数据

5、为了ADAM17可以直接和CSFV E2结合，本发明纯化了可溶性猪ADAM17蛋白(sADAM17)，利用表面等离子共振技术(SPR)进一步验证sADAM17与sE2之间的相互作用。因为生物体内的ADAM17必须在锌离子的存在的状态下才能发挥生物作用，所以分别在锌离子存在和缺失的两种环境下检测sADAM17与sE2之间的亲和力。

仪器：表面等离子体共振仪

软件：Excel

实验方法：表面等离子分析

分析过程：将sE2键合在传感器表面，再将表达纯化的不同浓度的sADAM17溶液注入并流经传感器表面(分别在有锌离子环境环境和无锌离子环境)，收集数据。数据经Excel 分析，得到折线图。

结果如图6所示：显示sADAM17与sE2在缺失锌离子的环境下亲和力为3.250×10^- ⁶mol，在锌离子存在的环境下亲和力为1.122×10^-7mol。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院动物研究所

<120> ADAM17在作为猪瘟病毒的受体中的应用

<130> MP1929873

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 833

<212> PRT

<213> 猪ADAM17(Pig ADAM17)

<400> 1

Met Arg Gln Cys Ala Leu Phe Leu Thr Ser Leu Val Pro Ile Val Leu

1 5 10 15

Ala Pro Arg Pro Pro Asp Glu Pro Gly Phe Gly Ser Pro Gln Arg Leu

20 25 30

Glu Lys Leu Asp Ser Leu Leu Ser Asp Tyr Asp Ile Leu Ser Leu Ser

35 40 45

Ser Ile Arg Gln His Ser Val Arg Lys Arg Asp Leu Gln Ala Ser Thr

50 55 60

His Leu Glu Thr Leu Leu Thr Phe Ser Ala Leu Asn Arg His Phe Lys

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Thr Glu Arg Phe Ser Gln Asn Phe Lys Val

85 90 95

Val Val Val Asp Gly Glu Asp Glu Ser Glu Tyr Pro Val Lys Trp Gln

100 105 110

Asp Phe Phe Ser Gly His Val Val Gly Glu Pro Asp Ser Arg Val Leu

115 120 125

Ala His Ile Gly Asp Asp Asp Ile Thr Val Arg Ile Asn Thr Asp Gly

130 135 140

Ala Glu Tyr Asn Ile Glu Pro Leu Trp Arg Leu Ile Asn Asp Thr Lys

145 150 155 160

Asp Lys Arg Val Leu Val Tyr Lys Ser Glu Asp Ile Lys Asn Val Ser

165 170 175

Arg Leu Gln Ser Pro Lys Val Cys Gly Tyr Ile Lys Ala Asp Asn Glu

180 185 190

Glu Leu Leu Pro Lys Gly Leu Val Asp Arg Glu Pro Pro Asp Glu Leu

195 200 205

Val His Arg Val Lys Arg Arg Ala Asp Pro Asn Pro Leu Arg Asn Thr

210 215 220

Cys Lys Leu Leu Val Val Ala Asp His Arg Phe Tyr Lys Tyr Met Gly

225 230 235 240

Arg Gly Glu Glu Ser Thr Thr Thr Asn Tyr Leu Ile Glu Leu Ile Asp

245 250 255

Arg Val Asp Asp Ile Tyr Arg Asn Thr Ser Trp Asp Asn Ala Gly Phe

260 265 270

Lys Gly Tyr Gly Ile Gln Ile Glu Gln Ile Arg Ile Leu Lys Ser Pro

275 280 285

Gln Glu Val Lys Pro Gly Glu Arg His Tyr Asn Met Ala Lys Ser Tyr

290 295 300

Pro Asn Glu Glu Lys Asp Ala Trp Asp Val Lys Met Leu Leu Glu Gln

305 310 315 320

Phe Ser Phe Asp Ile Ala Glu Glu Ala Ser Lys Val Cys Leu Ala His

325 330 335

Leu Phe Thr Tyr Gln Asp Phe Asp Met Gly Thr Leu Gly Leu Ala Tyr

340 345 350

Val Gly Ser Pro Arg Ala Asn Ser His Gly Gly Val Cys Pro Lys Ala

355 360 365

Tyr Tyr Ser Pro Ile Gly Lys Lys Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Gly Leu

370 375 380

Thr Ser Thr Lys Asn Tyr Gly Lys Thr Ile Leu Thr Lys Glu Ala Asp

385 390 395 400

Leu Val Thr Thr His Glu Leu Gly His Asn Phe Gly Ala Glu His Asp

405 410 415

Pro Asp Gly Leu Ala Glu Cys Ala Pro Asn Glu Asp Gln Gly Gly Lys

420 425 430

Tyr Val Met Tyr Pro Ile Ala Val Ser Gly Asp His Glu Asn Asn Lys

435 440 445

Met Phe Ser Asn Cys Ser Lys Gln Ser Ile Tyr Lys Thr Ile Glu Ser

450 455 460

Lys Ala Gln Glu Cys Phe Gln Glu Arg Ser Asn Lys Val Cys Gly Asn

465 470 475 480

Ser Arg Val Asp Glu Gly Glu Glu Cys Asp Pro Gly Ile Met Tyr Leu

485 490 495

Asn Asn Asp Thr Cys Cys Asn Ser Asp Cys Thr Leu Arg Pro Gly Val

500 505 510

Gln Cys Ser Asp Arg Asn Ser Pro Cys Cys Lys Asn Cys Gln Phe Glu

515 520 525

Thr Ala Gln Lys Lys Cys Gln Glu Ala Ile Asn Ala Thr Cys Lys Gly

530 535 540

Val Ser Tyr Cys Thr Gly Asn Ser Ser Glu Cys Pro Pro Pro Gly Asn

545 550 555 560

Ala Glu Asp Asp Thr Val Cys Leu Asp Leu Gly Arg Cys Lys Asp Gly

565 570 575

Lys Cys Val Pro Phe Cys Glu Arg Glu Gln Arg Leu Glu Ser Cys Ala

580 585 590

Cys Asn Glu Thr Asp His Ser Cys Lys Val Cys Cys Arg Ala Pro Ser

595 600 605

Gly Arg Cys Leu Pro Tyr Val Asp Ala Glu Gln Lys Asn Leu Phe Leu

610 615 620

Arg Lys Gly Lys Pro Cys Thr Val Gly Phe Cys Asp Met Asn Gly Lys

625 630 635 640

Cys Glu Lys Arg Val Gln Asp Val Ile Glu Arg Phe Trp Glu Phe Ile

645 650 655

Asp Lys Leu Ser Ile Asn Thr Phe Gly Lys Phe Leu Ala Asp Asn Ile

660 665 670

Val Gly Ser Val Leu Val Phe Ser Leu Met Leu Trp Ile Pro Val Ser

675 680 685

Ile Leu Val His Cys Val Asp Lys Lys Leu Asp Lys Gln Tyr Glu Ser

690 695 700

Leu Ser Leu Leu His Pro Ser Asn Val Glu Met Leu Ser Ser Met Asp

705 710 715 720

Ser Ala Ser Val Arg Ile Ile Lys Pro Phe Pro Ala Pro Gln Thr Pro

725 730 735

Gly Arg Leu Gln Pro Leu Gln Pro Leu Gln Pro Gly Pro Val Leu Pro

740 745 750

Ser Ala Pro Ser Val Pro Val Ala Pro Lys Leu Asp His Gln Arg Met

755 760 765

Asp Thr Ile Gln Glu Asp Pro Ser Thr Asp Ser His Val Asp Glu Asp

770 775 780

Gly Phe Glu Lys Asp Pro Phe Pro Asn Ser Ser Ala Ala Ala Lys Ser

785 790 795 800

Phe Glu Asp Leu Thr Asp His Pro Val Thr Arg Ser Glu Lys Ala Ser

805 810 815

Ser Phe Lys Leu Gln Arg Gln Ser Arg Val Asp Ser Lys Glu Thr Glu

820 825 830

Cys

<210> 2

<211> 2499

<212> DNA

<213> 猪ADAM17(Pig ADAM17)

<400> 2

atgaggcagt gtgcgctctt cctgaccagc ttggttccta tcgtgctggc gccgcgaccg 60

ccggacgagc cgggcttcgg ctcccctcag cgactcgaaa agcttgattc tctgctctca 120

gactacgaca tcctctcttt atccagcatt cgccagcact ccgtaaggaa aagggatctg 180

caggcctcaa cacacctaga gacactacta actttttcag ccttgaacag gcattttaaa 240

ttatacctga catcaagtac tgaacgcttc tcccagaatt tcaaagtcgt ggtggtcgat 300

ggggaagatg aaagtgagta ccccgtcaag tggcaggact tcttcagtgg acacgtggtt 360

ggtgaacctg actctagggt tctcgcccac ataggagatg atgatattac agtaagaatc 420

aacacagatg gggcagaata taatatagag ccactttgga gactaattaa tgatactaaa 480

gacaaaagag tgttagttta taagtctgaa gatatcaaga atgtttcacg tttgcagtct 540

ccaaaagtgt gtggttatat aaaggcggat aatgaagagt tgcttcctaa agggctagta 600

gacagagagc cgcctgatga gcttgttcac cgggtgaaga gaagagccga ccccaatccc 660

ctgaggaaca cgtgtaaatt attggtggtg gcagatcatc gcttttataa gtacatgggc 720

agaggggaag agagcacgac cacaaactac ctgatagagc taattgacag agttgatgac 780

atctatcgga acacttcatg ggacaatgca ggttttaaag gttatggaat acagatagag 840

cagattcgca ttctcaagtc tccacaagag gtaaaacctg gtgaaaggca ctacaatatg 900

gcaaaaagtt acccaaatga agaaaaggat gcttgggatg tgaagatgtt gctagagcaa 960

tttagctttg atatagctga agaagcatct aaagtctgcc tggcacatct tttcacctac 1020

caagattttg atatgggaac tcttggatta gcttatgttg gttctcccag agcaaacagt 1080

catggaggtg tttgtccaaa ggcttattat agtccaattg gaaagaaaaa tatctattta 1140

aatagtggtt tgaccagcac aaaaaattat ggtaaaacca tccttacaaa ggaagctgac 1200

cttgtgacaa ctcatgaatt ggggcacaat tttggagcag aacacgatcc agatggttta 1260

gcagaatgtg ccccaaacga ggaccaggga ggaaaatacg tcatgtatcc catagccgtg 1320

agtggtgatc atgagaacaa caagatgttt tcaaactgca gtaaacagtc catctataag 1380

accattgaaa gtaaggccca ggagtgtttt caagagcgca gcaacaaagt gtgtggcaac 1440

tccagggtgg atgaggggga ggagtgcgac cccggcatca tgtacctgaa caacgacacc 1500

tgctgcaaca gcgactgcac cctgaggccg ggcgtccagt gcagtgatag gaacagtcct 1560

tgctgtaaaa actgtcagtt cgagacggcc cagaagaagt gccaggaggc tattaatgcc 1620

acttgcaaag gcgtgtctta ctgcacaggt aacagcagtg agtgcccccc tccgggaaac 1680

gccgaggacg acacggtgtg cctggacctg ggcaggtgca aggacggcaa gtgcgtgccc 1740

ttctgcgagc gggagcagcg gctggagtcc tgcgcgtgta acgaaaccga ccactcgtgc 1800

aaggtgtgct gccgggcccc ctcgggccgt tgcctgccct acgtggacgc cgaacagaag 1860

aacttgtttt tgaggaaggg gaagccctgt acagtaggat tttgtgacat gaatggcaag 1920

tgtgagaagc gagtgcagga cgtcatcgag cggttctggg agttcattga caagctgagc 1980

atcaatactt tcgggaagtt cctggcagac aacatcgtgg gctccgtcct ggtgttctcc 2040

ctgatgctct ggatccccgt cagcatcctc gtccactgcg tggataagaa gctggataag 2100

cagtacgaat ccctgtctct gctgcacccc agcaacgtgg agatgctaag cagcatggat 2160

tcagcatccg ttcgcatcat caagcccttt cctgcgcccc agaccccagg ccgcctgcag 2220

cccctgcagc ccctgcagcc cggccccgtg ctgccctctg cgccttcggt gcccgtggct 2280

ccaaaactgg accaccagcg gatggacacc atccaggagg accccagcac ggactcgcac 2340

gtggacgagg acggcttcga gaaggaccct ttccccaaca gcagtgccgc tgccaagtca 2400

tttgaggatc tcacggacca tccggtcacg agaagtgaaa aggcctcgtc ctttaagctg 2460

cagcgccaga gtcgcgttga cagcaaggaa acggagtgc 2499

<210> 3

<211> 331

<212> PRT

<213> E2胞外域(E2 extracellular domain)

<400> 3

Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asn

1 5 10 15

Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Leu Thr Thr Thr Trp Lys Glu

20 25 30

Tyr Ser His Asp Leu Gln Leu Asn Asp Gly Thr Val Lys Ala Ile Cys

35 40 45

Val Ala Gly Ser Phe Lys Ile Thr Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg

50 55 60

Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Gly Ala Leu Leu Thr Ser Val Thr Phe

65 70 75 80

Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro Ser Thr Glu Glu Met Gly Asp

85 90 95

Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr Ser Pro Val Val Lys

100 105 110

Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val

115 120 125

Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro

130 135 140

Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Arg Arg Glu Lys Pro

145 150 155 160

Phe Pro His Arg Met Asp Cys Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Glu Asp

165 170 175

Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly Glu

180 185 190

Pro Val Val Tyr Thr Gly Gly Gln Val Lys Gln Cys Lys Trp Cys Gly

195 200 205

Phe Asp Phe Asn Glu Pro Asp Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys

210 215 220

Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Ile Val Asp Ser Thr Asp

225 230 235 240

Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Ala Lys Gly Ser His Glu Cys

245 250 255

Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His Ala Ser Asp Glu Arg Leu

260 265 270

Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile Val Ser Ser Ala Gly Pro

275 280 285

Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Ala Lys Thr Leu Lys Asn

290 295 300

Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys

305 310 315 320

Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp Val

325 330

<210> 4

<211> 993

<212> DNA

<213> E2胞外域(E2 extracellular domain)

<400> 4

cggctagcct gcaaggaaga ttacaggtac gcaatatcat caaccaatga gatagggcta 60

ctcggggccg gaggtctcac taccacctgg aaagaataca gccacgattt gcaactgaat 120

gacgggaccg ttaaggccat ttgcgtggca ggttccttta aaatcacagc acttaatgtg 180

gtcagtagga ggtatttggc atcattgcat aagggggctt tactcacttc cgtgacattc 240

gagctcctgt tcgacgggac caacccatca accgaagaaa tgggagatga cttcgggttc 300

gggctgtgcc cgtttgatac gagtcctgtt gtcaagggaa agtacaatac aaccttgttg 360

aacggtagtg ctttctatct tgtctgccca atagggtgga cgggtgttat agagtgcaca 420

gcagtgagcc caacaactct gagaacagaa gtggtaaaga ccttcaggag agagaagcct 480

ttcccacaca gaatggattg tgtgaccacc acagtggaaa atgaagatct attctactgt 540

aagttggggg gcaactggac atgtgtgaaa ggtgaaccag tggtctacac aggggggcaa 600

gtaaaacaat gcaaatggtg tggcttcgac ttcaacgagc ctgacggact cccacactac 660

cccataggta agtgcatttt ggcaaatgag acaggttaca gaatagtaga ttcaacggac 720

tgtaacagag atggcgttgt aatcagcgca aaggggagcc atgagtgctt gatcggcaac 780

acaactgtca aggtgcatgc atcagatgaa agactgggcc ctatgccatg cagacctaaa 840

gagattgtct ctagtgcagg acctgtaagg aaaacttcct gtacattcaa ctacgcaaaa 900

actttgaaga acaagtacta tgagcccagg gacagctact tccagcaata tatgctcaag 960

ggcgagtatc agtactggtt tgacctggac gtg 993

<210> 5

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcaacaaagu guguggcaat t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

uugccacaca cuuuguugct t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gguguuuguc caaaggcuut t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aagccuuugg acaaacacct t 21

<210> 9

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caccgagttc ccgccagaca ctac 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaacgtagtg tctggcggga actc 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caccagtgct atcaacctta tacg 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaaccgtata aggttgatag cact 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

caccacaggg ctgggtgata gatt 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaacaatcta tcacccagcc ctgt 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cacctgcgtt gaccaaactc tcac 24

<210> 16

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aaacgtgaga gtttggtcaa cgca 24

<210> 17

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

acgugacacg uucggagaat t 21

Claims

1.ADAM17在作为猪瘟病毒的受体中的应用；所述ADAM17具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

(Ⅱ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

(III)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述序列至少有80％同一性的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述ADAM17的核苷酸具有

(IV)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

(V)、如SEQ ID 2所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或

3.ADAM17的抑制剂在制备预防和/或治疗猪瘟的药物中的应用；所述ADAM17具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述ADAM17的抑制剂为抑制ADAM17表达或抑制ADAM17的活性；

所述抑制ADAM17表达为敲低ADAM17的表达；

5.ADAM17的敲除在制备或筛选预防和/或治疗猪瘟的药物中的应用；所述ADAM17具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

6.预防和/或治疗猪瘟的药物，其特征在于，能够抑制ADAM17表达或抑制ADAM17的活性的核酸、蛋白、化合物或其盐、组合物、络合物或混合物；所述ADAM17具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

7.如权利要求6所述的药物，其特征在于，所述抑制ADAM17表达为敲低ADAM17的表达；

8.ADAM17在制备或筛选预防猪瘟的疫苗中的应用；所述ADAM17具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

9.预防猪瘟的疫苗，其特征在于，能够抑制ADAM17表达或抑制ADAM17的活性的核酸、蛋白、化合物或其盐、组合物、络合物或混合物；所述ADAM17具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

10.如权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述抑制ADAM17表达为敲低ADAM17的表达；