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CN112986586A - 一种氨基末端脑尿钠肽检测方法和试剂盒 - Google Patents

一种氨基末端脑尿钠肽检测方法和试剂盒 Download PDF

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CN112986586A
CN112986586A CN202110192561.6A CN202110192561A CN112986586A CN 112986586 A CN112986586 A CN 112986586A CN 202110192561 A CN202110192561 A CN 202110192561A CN 112986586 A CN112986586 A CN 112986586A
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antibody
amino
natriuretic peptide
antibodies
brain natriuretic
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CN202110192561.6A
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刘春艳
崔琪瑶
邓盛花
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Guangdong Fapon Biotech Co Ltd
Original Assignee
Guangdong Fapon Biotech Co Ltd
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Abstract

本发明提供了一种氨基末端脑尿钠肽检测方法和试剂盒，采用双抗体夹心法检测氨基末端脑尿钠肽的含量；采用本发明的氨基末端脑尿钠肽检测方法和试剂盒，可以有效提高检测的特异性和/或检出率。

Description

一种氨基末端脑尿钠肽检测方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及蛋白检测领域。具体而言，本发明涉及氨基末端脑尿钠肽的检测方法和试剂盒。
背景技术
心力衰竭(心衰)是各种心脏疾病的严重和终末阶段，临床上主要表现为呼吸困难、乏力以及液体潴留等。据统计，我国目前心衰患病估计已达1.3％左右，现症患者约1000万，中国已成为世界上拥有最大心衰病患群体的国家。由于心血管疾病的可预防控制性，早期诊断至关重要。
血清标志物检测是临床上心衰早期诊断和预后判断的重要手段之一。其中包括脑尿钠肽(BNP)和氨基末端脑尿钠肽(NT-proBNP)，是国内外(ECS/ACC/AHA/HFSA/CSC)心力衰竭指南均推荐的心力衰竭首选血清标志物。
相比于BNP，NT-proBNP的半衰期更长、稳定性更好，因此NT-proBNP在检测早期或轻度心衰时的敏感度更高，更适用于临床应用。
发明内容
发明人经过大量理论研究和实验摸索，充分考虑氨基末端脑尿钠肽的结构特性，对各种待测NT-proBNP抗原区间和检测抗体进行分析研究，获得了能够用于氨基末端脑尿钠肽检测的氨基末端脑尿钠肽抗原区域组合。
在一些实施方案中，本发明可以包括下述一项或多项：
1.一种氨基末端脑尿钠肽检测试剂盒，其包括用于检测氨基末端脑尿钠肽的第一抗体和第二抗体，其中，第一抗体结合氨基末端脑尿钠肽的第27-31位氨基酸片段；第二片段结合氨基末端脑尿钠肽的第42-46位氨基酸片段。
2.项目1所述的试剂盒，第一抗体为标记抗体时第二抗体为包被抗体；或第二抗体为标记抗体时第一抗体为包被抗体。
3.项目1所述的试剂盒，进一步包括检测氨基末端脑尿钠肽的第三抗体，所述第三抗体结合氨基末端脑尿钠肽的第13-27位氨基酸片段；
例如用于配对的抗体分为第一组抗体和第二组抗体，其中第一组抗体和第二组抗体选自下组：
1)第一组抗体包括第一抗体，并且第二组抗体包括第二抗体和第三抗体；
2)第一组抗体包括第二抗体，并且第二组抗体包括第一抗体和第三抗体；
3)第一组抗体包括第三抗体，并且第二组抗体包括第一抗体和第二抗体。
4.项目1-3任一项所述的试剂盒，其中所述抗体的反应性为ELISA评价OD405≥0.5。
5.项目1-4任一项所述的试剂盒，其中所述标记抗体用可检测标记物和/或结合配偶体标记，可检测标记物例如金属粒子，荧光标记，发色团标记，电子致密标记，化学发光标记，放射性标记，或酶标记；例如可以是罗丹明，荧光素，荧光微球，胶体金，吖啶酯，荧光素酶，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记；结合配偶体例如是生物素/抗生物素蛋白，生物素/链霉抗生物素蛋白；例如标记抗体通过结合配偶体与可检测标记物进行标记。
6.项目1-5任一项所述的试剂盒，其中所述包被抗体连接至固相和/或结合配偶体，固相例如是磁性颗粒，胶乳粒子、微量滴定板、硝酸纤维素膜或微流控芯片；结合配偶体例如是生物素/抗生物素蛋白，生物素/链霉抗生物素蛋白；例如包被抗体通过结合配偶体与固相进行连接。
7.检测氨基末端脑尿钠肽的抗体组合，包括第一抗体和第二抗体；任选地，还包括第三抗体；其中第一抗体、第二抗体、第三抗体根据项目1-6中任一项所定义。
8.项目7所述的抗体组合在制备检测氨基末端脑尿钠肽的试剂盒中的用途。
9.项目8所述的用途，其中所述试剂盒用于1)对氨基末端脑尿钠肽含量进行检测，和/或2)对心力衰竭的预测、诊断、预后评估和治疗指导，心力衰竭包括例如急性心力衰竭。
10.一种制备项目7所述的抗体组合的方法，所述方法包括：
1)使用包含选自下述片段1-片段3作为抗原或半抗原免疫动物：
片段1：氨基末端脑尿钠肽氨基酸片段13-27；
片段2：氨基末端脑尿钠肽氨基酸片段27-31；
片段3：氨基末端脑尿钠肽氨基酸片段42-46；和
2)从所述动物获得分别结合所述片段1-片段3的抗体。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为在化学发光平台以重组抗原检测1+1配对的线性范围；
图2为以荧光微球检测方法检测2+1配对的线性范围。
具体实施方式
在一些实施方案中，本发明的试剂盒包括用于检测氨基末端脑尿钠肽的第一抗体和第二抗体，其中，第一抗体结合氨基末端脑尿钠肽的第27-31位氨基酸片段；第二抗体结合氨基末端脑尿钠肽的第42-46位氨基酸片段；结合以上氨基酸片段的抗体配对检测氨基末端脑尿钠肽可以提高检测特异性。例如第一抗体为标记抗体时第二抗体为包被抗体；或第二抗体为标记抗体时第一抗体为包被抗体。
本发明的试剂盒包括氨基末端脑尿钠肽检测试剂卡(试纸条)。在一些实施方案中，可以利用免疫荧光技术，将抗体标记在可检测标记如荧光微球上，利用双抗体夹心法原理检测样品中的NT-proBNP。在一些实施方案中，本发明的方法和试剂盒能提高特异性和/或减少漏检。
在一些实施方案中，本发明可以通过荧光免疫层析进行或包括进行荧光免疫层析的试剂。在一些实施方案中，免疫层析可以通过试纸条由双抗体夹心法实现。在一些实施方案中，进行双抗体夹心法的试剂和装置没有特别限制，可以采用任何适当的试剂和/或装置。例如，荧光免疫层析试纸条可以包括样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫。在一些实施方案中，结合垫上固定有至少一个荧光基团标记的抗体；在一些实施方案中，NC膜上可以包被两条线，例如分别是T线和C线；T线上可以包被至少一个抗体；能捕捉来自结合垫上的荧光基团标记抗体与样品中抗原形成复合物，从而形成双抗体夹心。在一些实施方案中，待测样本加入到检测试剂卡的加样口中，在侧向毛细管作用下，待检样本先经过结合垫，与结合垫上的荧光基团标记抗体发生特异的免疫结合，各自结合形成抗原-抗体荧光复合物，从而被固定在T线中。C线上包被有与游离的荧光基团标记抗体发生反应的物质，当游离的荧光基团标记抗体经过C线时，能够与C线上的物质发生特异的免疫结合，从而被固定在C线中。对照带(C)与测试带(T)的荧光强度成反比，从而可以校正样本个体差异。荧光免疫分析仪检测出的两条带的荧光强度以峰面积体现，并通过仪器自身的计算软件计算T/C值(T峰面积/C峰面积)，拟合至已设定的标准曲线，荧光免疫分析仪自动换算出相应待检样本中NT-proBNP的浓度值。
在一些实施方案中，本发明能够利用结合不同氨基酸片段的抗体识别抗原上的多个位置，降低漏检的风险，提高检出率。
在一些实施方案中，进一步包括检测氨基末端脑尿钠肽的第三抗体，所述第三抗体结合氨基末端脑尿钠肽的第13-27位氨基酸片段。在一些实施方案中，采用结合氨基末端脑尿钠肽的13-27aa片段的抗体作为第一组抗体，并用结合氨基末端脑尿钠肽的27-31aa片段的抗体和结合氨基末端脑尿钠肽的42-46aa片段的抗体作为第二组抗体；在一些实施方案中，采用结合氨基末端脑尿钠肽的27-31aa片段的抗体作为第一组抗体，并用结合氨基末端脑尿钠肽的13-27aa片段的抗体和结合氨基末端脑尿钠肽的42-46aa片段的抗体作为第二组抗体；在一些实施方案中，采用结合氨基末端脑尿钠肽的42-46aa片段的抗体作为第一组抗体，并用结合氨基末端脑尿钠肽的13-27aa片段的抗体和结合氨基末端脑尿钠肽的27-31aa片段的抗体作为第二组抗体。
本文中的术语“抗体”在最广义上使用。在一些实施方案中，本发明的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，可以采用本领域已知的方法制备本发明的抗体。在一些实施方案中，可以以包含本文描述的氨基酸片段的抗原免疫动物制备本发明的抗体。为了增加免疫原性，可以将载体蛋白(包括但不限于BSA、卵清蛋白、KLH等)与免疫反应性物质(例如表位肽)偶联。载体蛋白可以包括蛋白质或多肽，其可以起免疫原载体的作用。这些类型的多肽包括白蛋白、血清蛋白、球蛋白、晶状体蛋白、脂蛋白和/或其片段。在一些实施方案中，免疫反应性物质(例如氨基末端脑尿钠肽氨基酸片段，但不限于此)可以用于产生具有对NT-proBNP亲和力的抗体。
在一些实施方案中，抗体结合氨基末端脑尿钠肽对应的氨基酸片段结合可以指抗体能够结合所述氨基酸片段，但该氨基酸片段不一定是最小结合片段。
在一些实施方案中，可以使用任何适当的体外测定、基于细胞的测定、体内测定、动物模型等检测本发明抗体的效果如结合活性和/或交叉反应性。在一些实施方案中，所述测定可以包括例如ELISA，FACS结合测定，Biacore，竞争性结合测定等。在一些实施方案中，例如在ELISA中表征本发明的抗体与抗原(抗原肽)结合的反应性，例如通过过氧化物酶标记的ELISA法读取405nm处的反应值≥0.5确定为有较好反应性，可用于免疫测定。
在一些实施方案中，试剂盒中包括第一抗体、第二抗体；在一些实施方案中，试剂盒中还包括第三抗体；在一些实施方案中，还可以使用其他抗体作为包被抗体或标记抗体。
在一些实施方案中，所述包被抗体结合至固相。在一些实施方案中，所述包被抗体结合至固相的方式可以是直接或间接。在一些实施方案中，所述包被抗体可以用于包被固相支持物。在一些实施方案中，固相支持物没有特别限制，其可以是例如磁性颗粒，胶乳粒子、微量滴定板、硝酸纤维素膜或微流控芯片。在一些实施方案中，所述包被抗体结合至结合配偶体，结合配偶体例如是生物素/抗生物素蛋白，生物素/链霉抗生物素蛋白；在一些实施方案中，包被抗体通过结合配偶体与固相进行连接。
在一些实施方案中，所述标记抗体用可检测标记物标记。在一些实施方案中，所述标记抗体与可检测标记物可以是直接或间接结合。在一些实施方案中，可检测标记物例如金属粒子，荧光标记，发色团标记，电子致密标记，化学发光标记，放射性标记，或酶标记；在一些实施方案中，可检测标记物例如可以是罗丹明，荧光素，荧光微球，胶体金，吖啶酯，荧光素酶，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记。在一些实施方案中，所述标记抗体与结合配偶体连接，结合配偶体例如是生物素/抗生物素蛋白，生物素/链霉抗生物素蛋白。在一些实施方案中，标记抗体通过结合配偶体与可检测标记物进行标记。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒包括适合进行免疫测定的试剂。在一些实施方案中，本发明的试剂盒可以用于进行免疫测定，例如ELISA，间接免疫荧光测定IFA，放射免疫测定RIA以及其它非酶联抗体结合试验或方法。
在一些实施方案中，本发明提供用于检测氨基末端脑尿钠肽的抗体组合，包括前述定义的第一抗体和第二抗体；在一些实施方案中，还包括前述定义的第三抗体。
在一些实施方案中，本发明提供抗体组合在制备检测氨基末端脑尿钠肽的试剂盒中的用途。其中所述试剂盒用于1)对氨基末端脑尿钠肽含量进行检测，和/或2)对心力衰竭的预测、诊断、预后评估和治疗指导，心力衰竭包括例如急性心力衰竭。
本文中的术语“诊断”在最广义上使用。在一些实施方案中，本发明的诊断可以是健康状态的鉴别。在一些实施方案中，本发明的诊断可以是阴性样本的排除。在一些实施方案中，本发明的诊断可以是辅助诊断。在一些实施方案中，本发明的诊断可以是危险分层。
在一些实施方案中，本发明提供制备检测氨基末端脑尿钠肽的抗体的方法，所述方法包括将包含本文描述的氨基酸片段的免疫反应性多肽作为抗原或半抗原分别免疫动物，从而制备检测氨基末端脑尿钠肽的抗体如单克隆抗体或多克隆抗体。单克隆抗体或多克隆抗体可以通过本领域已知的方法进行。
在一些实施方案中，本发明提供包含本文描述的氨基酸片段的免疫反应性多肽在制备检测氨基末端脑尿钠肽的试剂或试剂盒中的用途。
在本文中，待检NT-proBNP的样品可以包括健康或病理状态的生物组织、细胞或体液，例如血液样品，例如血浆、血清、血制品。
下面主要结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。提供以下实施例以说明本发明的实施方案，并非意在限制本发明。本发明可以任选包括未通过实施例示出的实施方案。
一、氨基末端脑尿钠肽单克隆抗体的制备
1.免疫动物：取8～12周龄与骨髓瘤细胞同种系的BALB/c小鼠，以含蛋白质100μg/只的NT-proBNP抗原与等量福氏完全佐剂充分混匀，注入小鼠腹腔内，每隔2周100μg/只的NT-proBNP抗原与等量福氏不完全佐剂充分混匀，多次注入小鼠腹腔内加强免疫。经检测小鼠血清(间接ELISA法)，滴度在1:2000以上者可用于融合，融合前3天经小鼠腹腔内再次加强免疫，剂量为50μg/只。
2.饲养细胞的制备
以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c鼠拉颈处死，75％酒精全身浸泡，超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI 1640基础培养液5mL，反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm，离心5分钟，留沉淀，用RPMI1640筛选培养液(含HAT的RPMI 1640完全培养液中)重悬，调整细胞浓度1×105个/mL，加入96孔板，150μL/孔，37℃，5％CO2培养过夜。
3.免疫脾细胞的制备
小鼠末次免疫后三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI 1640基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清，RPMI 1640基础培养液重悬，如此重复三次，计数。
4.细胞融合
(1)取40mL HAT培养液，15mL DMEM无血清培养液和1mL 50％PEG(M12000)分别置于37℃水浴中预温；
(2)分别取小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(菲鹏生物股份有限公司保存)(2-5×107)、上述免疫脾细胞(108)悬液加入50mL离心管中混匀，并加DMEM无血清培养液至40mL。离心10分钟，倒尽上清液，混匀；
(3)将离心管置于37℃预温的水中，取0.7mL预温的50％PEG溶液，静置90秒钟。立即滴加37℃15mL预温的无血清培养液；
(4)补加DMEM无血清培养液至40mL，离心10分钟，倒尽上清液。加40mL含15％～20％胎牛血清的HAT培养液。用吸管混匀，滴加到已含有饲养细胞的4块96孔细胞培养板的小孔中，每孔2滴，置37℃、7％CO2的培养箱中培养。
5.杂交瘤细胞的选择培养
免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，经PEG处理后，形成多种细胞成分的混合体，其中包括未融合的骨髓瘤细胞和免疫脾细胞，骨髓瘤细胞的共核体和免疫脾细胞的共核体，以及骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的导核体。仅后者才能形成杂交瘤细胞。为此，在这多种细胞混合体中必须除去未融合的细胞和同种融合的共核体，并选择出真正的杂交细胞。因此，在细胞融合后第1，3，5，7天用前述的HAT培养液换液培养。
6.抗体的检测及杂交瘤细胞克隆化
吸取每个培养孔的上清液，用间接ELISA法检测出培养液中含NT-proBNP的抗体的培养孔。采用有限稀释法使杂交瘤细胞克隆化。经过培养后单个细胞可增殖为同源性细胞克隆；经通过反应性筛选得到反应性较好且稳定分泌抗NT-proBNP单克隆抗体的细胞株。
反应性筛选的方法：在室温下，在搅拌时微量滴定板(Nunc，Maxisorb)用100μL/孔含2.5μg/mL人NT-proBNP(作为抗原)的包被缓冲液包被1小时。包被后处理在PBS缓冲液和1％单克隆抗体中进行孵育30分钟。随后，用洗涤缓冲液进行洗涤。在室温下，在搅拌时将100μL/孔抗体样品孵育1小时。然后用洗涤溶液再洗涤2次。然后在室温下，在搅拌时再与100μL/孔按1:40000用PBS缓冲液稀释的检测抗体过氧化物酶缀合的羊抗鼠IgG孵育1小时。用洗涤缓冲液再次洗涤后，用常规方法测定过氧化物酶活性(例如用ELISA读板器读取405nm处的反应值)，得到OD405≥0.5(有较好反应性)的抗体。
二、抗体结合片段的鉴定
采用不同NT-proBNP抗原肽分别包被微孔，以PBS+20％NBS为稀释液，稀释单抗为一抗浓度到1μg/mL，以羊抗鼠IgG-HRP为二抗，依据各单抗对不同抗原的反应情况来确定单抗的结合片段。实施方式中所用的细胞株的结合片段鉴定结果如下表：
结合片段 细胞株
1-12aa 1NT-9；7NT-3
13-27aa 3NT-12-1；5NT-6；5NT-8
27-31aa 6NT-1；8NT-7
31-39aa 2NT-17；3NT-16
38-44aa 2NT-9-1；8NT-5
42-46aa 1NT-3-14；3NT-22
62-76aa 7NT-1-5；32NT-1
三、配对筛选
选取不同结合片段的抗体分别用于包被以及标记，进行交叉配对实验，筛选过程如下：
1.标记
(1)取荧光微球100uL，离心15000rpm/8min/4℃，离心完后去上清，重悬至100uL，超声2-3次；
(2)配置10mg/mL的EDC和NHS；
(3)活化：使用EDC和NHS活化荧光微球至终体积200uL，避光混匀18min，后离心15000rpm/10min/4℃，去上清；
(4)洗涤：重悬至100uL，超声2-3次，15000rpm/8min/4℃，去上清，重复2次；
(5)偶联：重悬至200uL，超声2-3次，将抗体加入荧光微球中，至终体积300uL，避光混匀，37℃反应2h；
(6)封闭：加入封闭剂100uL，避光混匀，37℃反应1h；
(7)洗涤：封闭完后离心15000rpm/12min/4℃，去上清。重悬至100uL，超声2-3次。再离心15000rpm/8min/4℃，去上清；
(8)保存：重悬至100uL，超声2-3次，4℃保存备用。
2.包被
(1)将硝酸纤维素膜与荧光PVC底板组装好备用；
(2)将抗体稀释至1.0-2.0mg/mL,用喷金画膜仪，在NC膜上均匀的画线，然后放入37℃恒温箱中进行干燥，至少干燥45min以上。组装切条，加样检测。
3.检测
(1)质控品：NT-proBNP抗原，使用PBS稀释至35000，10000，1000，500pg/mL；
(2)检测方法：使用荧光仪检测。仪器读值T/C表示T峰面积与C峰面积比值，反应配对活性，在质控以及阳性标本下T/C越高代表活性越高。
表1、第一轮筛选
Figure BDA0002945619880000091
Figure BDA0002945619880000101
交叉配对第一轮筛选中的以上配对均有活性，随即检测138份随机临床血清评价特异性，结果如表1所示：结合27-31aa的NT-proBNP抗体与结合42-46aa的NT-proBNP抗体配对特异性较好，显著优于其它结合片段的抗体配对。
四、化学发光平台验证
将优选配对(6NT-1和1NT-3-14)继续应用于化学发光平台，测试其线性范围、最低检出限等指标。操作步骤如下：
标记AE：(1)将0.5mg NT-proBNP抗体透析至20mM pH7.4 PB缓冲液中，4℃透析4小时；(2)向蛋白中加入溶解好的10mM吖啶酯，室温旋转反应15min；(3)加入10倍过量于AE的0.1M甘氨酸，室温旋转反应30min；(4)将标记物重新透析至20mM pH7.2 PB缓冲液中，4℃透析过夜；(5)将标记物取出，加入甘油避光保存。
标记磁珠：(1)取10mg羧基磁珠用50mM MES洗涤4次，每次1mL，之后加0.8mL活化缓冲液，超声分散，加入0.1mL NHS和0.1mL EDC，充分混匀，室温旋转(30rpm)反应10分钟；(2)磁分离，弃去上清，加入50mM MES及NT-proBNP抗体，室温旋转(30rpm)反应4小时；(3)洗涤2次，每次1mL并加入1mL封闭液，室温旋转(30rpm)反应4小时；(4)重悬至10mg/mL。
检测过程：(1)每孔加入50μL磁珠工作液、100μL待测样本及50μL标记的AE工作液，37℃孵育15min；(2)每孔加入洗液，洗涤4次；(3)每孔加入化学发光底物液，用化学发光自动仪器测量质控品的发光值。
检测结果如下：
如图1所示，配对线性范围较宽，在50000pg/mL时不出现hook效应，且最低检出限为4.3pg/mL；其它配对如以3NT-12-1作为标记抗体、6NT-1为包被抗体为例，在平行实验中最低检出限为7.9pg/mL。
五、第二轮配对筛选
为了降低漏检风险，下一步考虑引入其它结合片段的抗体进行测试。以96份阳性样本考察各配对漏检的情况。分别在标记端、包被端引入第三抗体，结果如表2及表3所示：向1+1模式中得到的优势组合，即结合27-31aa的NT-proBNP抗体与结合42-46aa的NT-proBNP抗体组合中引入结合13-27aa的NT-proBNP抗体能够识别NT-proBNP抗原的多个结合片段，补充各自检测的不足，较引入其它结合片段及结合相同片段的不同株抗体配对性能更优；在特异性好的基础上(表1)，进一步通过结合片段的补充减少漏检，提高了检出结果的准确性。
表2、2+1模式评估
Figure BDA0002945619880000111
表3、1+2模式评估
Figure BDA0002945619880000112
为进一步验证所述结合片段组合的高特异性及低漏检率并非由特定抗体带来，将同一结合片段的不同株抗体进行替换，其中，5NT-6、3NT-12-1为结合13-27aa片段的抗体，8NT-7、6NT-1为结合27-31aa片段的抗体，3NT-22、1NT-3-14为结合42-46aa的抗体，结果如表4所示。
表4、替换验证
标记 包被 漏检率
5NT-6+6NT-1 1NT-3-14 0/96
6NT-1 5NT-6+1NT-3-14 0/96
3NT-12-1+3NP-22 6NT-1 0/96
1NT-3-14 3NT-12-1+8NT-7 0/96
3NT-12-1 6NT-1+1NT-3-14 0/96
6NT-1+1NT-3-14 3NT-12-1 1/96
为进一步验证所述结合片段组合的优良性能，将2+1模式中得到的优势组合，即结合13-27aa的NT-proBNP抗体、结合27-31aa的NT-proBNP抗体及结合42-46aa的NT-proBNP抗体。
六、荧光微球平台验证
以5NT-6和6NT-1作为标记抗体进行混标、1NT-3-14为包被抗体为例，测试其线性范围、最低检出限等指标。
检测结果如下：
如图2所示，配对线性范围较宽，在50000pg/mL时不出现hook效应，且最低检出限为3.5pg/mL。
本发明还通过以上所述的抗体制备方案，以NT-proBNP氨基酸片段27-31偶联载体蛋白作为免疫原免疫制备得到结合27-31aa片段的抗体，例如经反应性筛选反应为ELISA评价OD405≥0.5的抗体NT30C-3等，与以NT-proBNP氨基酸片段42-46偶联载体蛋白作为免疫原免疫制备得到结合42-46aa片段的抗体，例如经反应性筛选反应为ELISA评价OD405≥0.5的抗体NT25D-7等配对特异性高于99.2％(前述荧光微球检测方法进行评价)；以NT-proBNP氨基酸片段13-27偶联载体蛋白作为免疫原免疫制备得到结合13-27aa片段的抗体，例如经反应性筛选反应为ELISA评价OD405≥0.5的抗体NT32A-9等，与前二者配对漏检率均不超过1.0％(前述荧光微球检测方法进行评价)。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种氨基末端脑尿钠肽检测试剂盒，其特征在于，其包括用于检测氨基末端脑尿钠肽的第一抗体和第二抗体，其中，第一抗体结合氨基末端脑尿钠肽的第27-31位氨基酸片段；第二抗体结合氨基末端脑尿钠肽的第42-46位氨基酸片段。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，第一抗体为标记抗体时第二抗体为包被抗体；或第二抗体为标记抗体时第一抗体为包被抗体。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括检测氨基末端脑尿钠肽的第三抗体，所述第三抗体结合氨基末端脑尿钠肽的第13-27位氨基酸片段；
例如用于配对的抗体分为第一组抗体和第二组抗体，其中第一组抗体和第二组抗体选自下组：
1)第一组抗体包括第一抗体，并且第二组抗体包括第二抗体和第三抗体；
2)第一组抗体包括第二抗体，并且第二组抗体包括第一抗体和第三抗体；
3)第一组抗体包括第三抗体，并且第二组抗体包括第一抗体和第二抗体。
4.如权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，其中所述抗体的反应性为ELISA评价OD405≥0.5。
5.如权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，其中所述标记抗体用可检测标记物和/或结合配偶体标记，可检测标记物例如金属粒子，荧光标记，发色团标记，电子致密标记，化学发光标记，放射性标记，或酶标记；例如可以是罗丹明，荧光素，荧光微球，胶体金，吖啶酯，荧光素酶，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记；结合配偶体例如是生物素/抗生物素蛋白，生物素/链霉抗生物素蛋白；例如标记抗体通过结合配偶体与可检测标记物进行标记。
6.如权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，其中所述包被抗体连接至固相和/或结合配偶体，固相例如是磁性颗粒，胶乳粒子、微量滴定板、硝酸纤维素膜或微流控芯片；结合配偶体例如是生物素/抗生物素蛋白，生物素/链霉抗生物素蛋白；例如包被抗体通过结合配偶体与固相进行连接。
7.检测氨基末端脑尿钠肽的抗体组合，其特征在于，包括第一抗体和第二抗体；任选地，还包括第三抗体；其中，第一抗体、第二抗体、第三抗体根据权利要求1-6中任一项所定义。
8.如权利要求7所述的抗体组合在制备检测氨基末端脑尿钠肽的试剂盒中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，其中所述试剂盒用于1)对氨基末端脑尿钠肽含量进行检测，和/或2)对心力衰竭的预测、诊断、预后评估和治疗指导，心力衰竭包括例如急性心力衰竭。
10.一种制备权利要求7所述的抗体组合的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)使用包含选自下述片段1-片段3作为抗原或半抗原免疫动物：
片段1：氨基末端脑尿钠肽氨基酸片段13-27；
片段2：氨基末端脑尿钠肽氨基酸片段27-31；
片段3：氨基末端脑尿钠肽氨基酸片段42-46；和
2)从所述动物获得分别结合所述片段1-片段3的抗体。
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