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CN112986346A - 一种基于BiVO4/Ag2S异质结的光电化学生物传感器及其应用 - Google Patents

一种基于BiVO4/Ag2S异质结的光电化学生物传感器及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于BiVO4/Ag2S异质结增敏的光电化学生物传感器及其应用；本发明的技术方案是利用磁珠作为载体制备银簇，在外切酶三的协助下释放目标响应的银簇，经氧化释放银离子。银离子与浸泡过硫离子的BiVO4反应形成BiVO4/Ag2S异质结，实现增敏的光电信号，应用于抑癌基因P53的检测。该光电传感器可以拓展到其他生物分子的检测，为疾病的早期诊断和临床研究提供了一种新渠道。

Description

一种基于BiVO4/Ag2S异质结的光电化学生物传感器及其应用
技术领域：
本发明涉及一种基于BiVO4/Ag2S异质结增敏的光电化学生物传感器；以及所述光电化学生物传感器的制备方法及其检测肿瘤抑制基因P53的分析应用。
背景技术：
光电化学(PEC)生物传感技术因其低背景信号、低成本、仪器简单、易于小型化等优点而受到人们的广泛关注[Tang,Y.F.；Chai,Y.；Liu,X.Q.；Li,L.L.；Yang,L.W.；Liu,P.P.；Zhou,Y.M.；Ju,H.X.；Cheng,Y.Z.Biosensors and Bioelectronics 2018,117,224-231.]。钒酸铋(BiVO4)具有带隙窄、无毒、高稳定性和可见光吸收性能等优点，是一种很有前途的光敏材料[Baral,B.；Reddy,K.H.；Parida,K.M.Journal of Colloid andInterface Science 2019,554,278-295.]。然而，单纯的BiVO4由于光生载流子的快速重组，限制了其光电转换效率[Grigioni,I.；Stamplecoskie,K.G.；Selli,E.；Kamat,P.V.J.Phys.Chem.C 2015,119,20792-20800.]。为了促进光生载流子的有效分离，采用两种能级匹配的半导体形成异质结，提高电荷转移速率，改善光电化学性能[Zang,Y.；Lei,J.P.；Hao,Q.；Ju,H.X.；Biosensors and Bioelectronics 2016,77,557-564.]。肿瘤抑制基因p53是迄今为止发现的与人类癌症高度相关的基因,它在调节细胞周期、凋亡、细胞分化、DNA修复等生物学功能中起着至关重要的作用[Han,D.；Wei,C.Y.；RSC Adv.2018,8,25611-25616.]。
本文利用BiVO4作为基底材料，采用离子层吸附反应构建BiVO4/Ag2S异质结，制备了一种简便、实用的光电化学生物传感器，实现了对肿瘤抑癌基因P53的灵敏检测。
发明内容：
本发明的目的之一是利用磁珠(MB)和富含胞嘧啶的DNA链(CP)合成银簇。
具体包括以下步骤：
步骤1.组装CP-MB：10μL 5mg/mL的磁珠(MB)用等体积的乙磺酸(MES)缓冲溶液纯化后，加入50μL 0.5M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧基1小时，然后加入30μL 4μM的带氨基的CP DNA链反应过夜，利用磁性分离除去未反应的DNA链，重新分散到等体积的二次水中得到CP-MB，保存在4℃下备用。
步骤2.制备银簇：将30μL 4μM的富含胞嘧啶的CR DNA链加入到制备好的CP-MB中孵育2h，经过磁性分离得到CR-CP-MB。然后将30μL 20mM硝酸银(AgNO3)加入到上述溶液中剧烈搅拌1分钟，放在4℃下孵育1小时。再将新鲜制备的30μL 20mM还原剂硼氢化钠(NaBH4)加入到上述溶液中，剧烈搅拌1分钟，在4℃下避光反应过夜制备银簇。最后利用磁性分离除去多余的未反应的核酸序列和反应试剂，重新分散到等体积二次水中备用。
本发明的目的之二是利用离子层吸附反应制备BiVO4/Ag2S异质结光电化学生物传感器，并将传感器应用于肿瘤抑癌基因P53的分析检测。
具体包括如下步骤：
步骤1.制备基底材料BiVO4：将0.2925g钒酸铵(NH4VO3)和1.2125g硝酸铋(Bi(NO3)3·5H2O)分散到50mL二次水中，不断搅拌得到黄色沉淀，接着过滤沉淀并用水纯化，在60℃下干燥过夜，然后在马弗炉中500℃下加热4小时得到BiVO4。
步骤2.制备BiVO4/Ag2S异质结：将1mg BiVO4粉末分散到1mL含0.2％的壳聚糖水溶液中，超声分散半小时得到富含氨基的BiVO4溶液。然后取10μL该溶液滴到羟基化处理后的氧化铟锡电极(ITO)上自然干燥，再将该电极浸泡到50mM的硫化钠(Na2S)溶液中吸附1分钟，最后用二次水润洗去掉多余的硫离子。
步骤3.构建基于BiVO4/Ag2S异质结的光电化学生物传感器并应用于抑癌基因P53的检测。
将10U外切酶三和不同浓度的目标P53加入到30μL制备好的银簇中在37℃下孵育70分钟，然后通过磁性分离释放银簇。将5μL 30％的双氧水(H2O2)加入到释放的银簇中得到银离子，然后将银离子滴到制备好的电极上反应形成BiVO4/Ag2S异质结。自然干燥后用于PEC信号检测。
附图说明：
图1基于BiVO4/Ag2S异质结检测人类肿瘤抑制基因P53的PEC生物传感原理示意图。
图2基底材料BiVO4：(A)XRD谱图，(B)紫外可见漫反射谱图，(C)红外谱图，(D)光电信号图，(E)TEM图，(F)HRTEM图。
图3(A)(B)为BiVO4的SEM图；(C)(D)为异质结BiVO4/Ag2S的SEM图。
图4异质结BiVO4/Ag2S的(A)XPS总谱图、(B)S 2p谱图、(C)Ag 3d谱图；(D)BiVO4的EDS谱图；(E)异质结BiVO4/Ag2S的EDS谱图。
图5(A)BiVO4和异质结BiVO4/Ag2S光电信号对比图；不同阶段(B)循环伏安图和(C)阻抗图。
图6(A)制备的银簇和DNA的紫外可见吸收对照图；(B)银簇的荧光发射图；(C)银簇的TEM图(附图为HRTEM图)；(D)银簇与加双氧水后的紫外-可见吸收对照图。
图7聚丙烯酰胺凝胶电泳表征图。
图8(A)不同目标浓度下的光电流信号响应曲线:0、1fM、10fM、100fM、1.0pM、10pM、100pM、1.0nM、10nM、100nM(从a到k)，附图为目标浓度为0和100nM时的光电信号对比；(B)ΔI光电流变化与目标的浓度之间的线性关系。
具体实施方式：
实施例1.基于BiVO4/Ag2S异质结的光电化学传感器对肿瘤抑制基因P53的灵敏检测。
将1mg BiVO4粉末分散到1mL含0.2％的壳聚糖水溶液中，超声分散半小时得到富含氨基的BiVO4溶液。然后取10μL该溶液滴到羟基化处理后的氧化铟锡电极(ITO)上自然干燥，然后将该电极浸泡到50mM硫化钠(Na2S)溶液中吸附1分钟，然后用二次水润洗去掉多余的硫离子，干燥备用。
10μL 5mg/mL的磁珠(MB)用等体积的乙磺酸(MES)缓冲溶液纯化后，加入50μL0.5M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧基1小时，然后加入30μL 4μM的带氨基的CP DNA链反应过夜，利用磁性分离除去未反应的DNA链，重新分散到等体积的二次水中得到CP-MB，保存在4℃下备用。
将30μL 4μM的富含胞嘧啶的CR DNA链加入到制备好的CP-MB中孵育2h，后经过磁性分离得到CR-CP-MB。然后将30μL 20mM硝酸银(AgNO3)加入到上述溶液中剧烈搅拌1分钟后放在4℃下孵育1小时，然后将新鲜制备的30μL 20mM还原剂硼氢化钠(NaBH4)加入到上述溶液中，剧烈搅拌1分钟，在4℃下避光反应过夜制备银簇，最后利用磁性分离除去多余的未反应的核酸序列和反应试剂，重新分散到等体积二次水中备用。
将10U外切酶三和不同浓度的目标P53加入到30μL制备好的银簇中在37℃下孵育70分钟，然后通过磁性分离释放银簇。将5μL 30％的双氧水(H2O2)加入到释放的银簇中得到银离子，然后将银离子滴到制备好的电极上反应形成BiVO4/Ag2S异质结。自然干燥后用于PEC信号检测。
实施例2.基于BiVO4/Ag2S异质结的光电化学传感器对肿瘤抑制基因P53的灵敏检测。
将“将该电极浸泡到50mM硫化钠(Na2S)溶液中吸附1分钟。”改为“将该电极浸泡到50mM硫化钠(Na2S)溶液中吸附3分钟”制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的PEC生物传感器。对抑癌基因P53的检测结果同实施例1。
实施例3.基于BiVO4/Ag2S异质结的光电化学传感器对肿瘤抑制基因P53的灵敏检测。
将“将30μL 4μM的富含胞嘧啶的CR DNA链加入到制备好的CP-MB中孵育2h。”,改为“将30μL 4μM的富含胞嘧啶的CR DNA链加入到制备好的CP-MB中孵育3h。”制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的生物传感平台。对抑癌基因P53的检测的结果同实施例1。
实施例4.基于BiVO4/Ag2S异质结的光电化学传感器对肿瘤抑制基因P53的灵敏检测。
将“将新鲜制备的30μL 20mM还原剂硼氢化钠(NaBH4)加入到上述溶液中”改为“将新鲜制备的40μL 20mM还原剂硼氢化钠(NaBH4)加入到上述溶液中”制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的生物传感平台。对抑癌基因P53的检测的结果同实施例1。
实施例5基于BiVO4/Ag2S异质结的光电化学传感器对肿瘤抑制基因P53的灵敏检测。
将“将10U外切酶三和不同浓度的目标P53加入到30μL制备好的银簇中在37℃下孵育70分钟。”改为“将15U外切酶三和不同浓度的目标P53加入到30μL制备好的银簇中在37℃下孵育70分钟。”制备的其他条件同实施例1，得到形貌与性质类似于实施例1的生物传感平台。对抑癌基因P53的检测的结果同实施例1。

Claims (2)

1.一种利用BiVO4/Ag2S异质结的光电化学(PEC)生物传感器，其特征是：BiVO4具有能带隙能量小、无毒、高稳定性和可见光吸收性能等优点，是一种很有前途的光敏材料。然而，单纯的BiVO4由于光生载流子的快速重组，限制了其光电转换效率，因此通过巧妙设计构建了一种新型异质结BiVO4/Ag2S。与单纯BiVO4的光电流相比，异质结的光电信号增敏幅度为112倍。基于光电流信号增强的BiVO4/Ag2S生物传感器可应用于基因P53的灵敏检测，检测的线性检测范围(1fM-100nM)宽，检出限(0.42fM)低。本研究为BiVO4/Ag2S异质结在光电生物传感中的应用开辟了新途径，为肿瘤的早期诊断提供了新技术。
2.一种制备权利要求1所述的利用BiVO4/Ag2S异质结研制光电化学生物传感器的方法和应用，其特征方法由下列步骤组成：
步骤1.制备CP-MB：10μL 5mg/mL羧基磁珠(MB)用等体积的乙磺酸(MES)缓冲溶液纯化后，加入50μL 0.5M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧基1小时，然后加入30μL 4μM的带氨基的CP DNA链反应过夜，利用磁性分离除去未反应的DNA链，重新分散到等体积的二次水中得到CP-MB，保存在4℃下备用。
步骤2.制备银簇：将30μL 4μM的富含胞嘧啶的CR DNA链加入到制备好的CP-MB中孵育2h，后经磁性分离后得到CR-CP-MB。然后将30μL 20mM硝酸银(AgNO3)加入到上述溶液中剧烈搅拌1分钟，放在4℃下孵育1小时，然后将新鲜制备的30μL 20mM还原剂硼氢化钠(NaBH4)加入到上述溶液中，剧烈搅拌1分钟，在4℃下避光反应过夜制备银簇。最后利用磁性分离除去多余的未反应的核酸序列和反应试剂，重新分散到等体积二次水中备用。
步骤3.制备BiVO4：将0.2925g钒酸铵(NH4VO3)和1.2125g硝酸铋(Bi(NO3)3·5H2O)分散到50mL二次水中，不断搅拌得到黄色沉淀，接着过滤沉淀并用水纯化，在60℃下干燥过夜，然后在马弗炉中500℃下加热4小时得到BiVO4。
步骤4.基于BiVO4/Ag2S异质结传感器制备过程：将1mg BiVO4粉末分散到1mL含0.2％的壳聚糖水溶液中，超声分散半小时得到富含氨基的BiVO4溶液。然后取10μL该溶液滴到羟基化处理后的氧化铟锡电极(ITO)上自然干燥，然后将该电极浸泡到50mM硫化钠(Na2S)溶液中吸附1分钟，然后用二次水润洗去掉多余的硫离子。将10U外切酶三和不同浓度的目标P53加入到30μL制备好的银簇中在37℃下孵育70分钟，然后通过磁性分离释放银簇。将5μL30％的双氧水(H2O2)加入到释放的银簇中得到银离子，然后将银离子滴到制备好的电极上反应形成BiVO4/Ag2S异质结。自然干燥后用于PEC信号检测。
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