CN112980968A - 一种检测黄牛klf5基因cnv标记的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测黄牛KLF5基因CNV标记的方法及其应用：基于实时荧光定量PCR技术，以黄牛血液全基因组DNA为模板，利用一对特异引物扩增KLF5基因拷贝数变异区域部分片段，同时利用另外一对特异引物扩增BTF基因部分片段作为参照，然后利用2*2^‑ΔΔCt的方法鉴定个体的拷贝数变异类型，通过对拷贝数变异与生长性状进行的关联分析，表明本发明提供的方法可以用于检测与黄牛体重、体长、胸宽、胸围等生长性状优势相关的KLF5基因CNV标记，有利于加快黄牛分子标记辅助选择育种进程。该方法简单、快速，便于推广应用。

Description

一种检测黄牛KLF5基因CNV标记的方法及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传育种领域，具体涉及基于实时定量PCR技术检测黄牛KLF5基因拷贝数变异及鉴定CNV标记。

背景技术

肉牛产业是构成畜牧业的重要组成部分，在现代畜牧业转型升级过程中发挥着越来越重要的作用。牛肉消费促进了肉牛产业化进程。随着基因组学和生物信息学等相关学科的发展，人们不断通过基因组学来推动肉牛产业化的发展。拷贝数变异(Copy NumberVariations,CNVs)一般是指在全基因组范围大于50bp的缺失、复制和插入的结构变异，它可以通过剂量效应、位置效应、阻断功能基因、融合基因、暴露隐性等位基因和潜在的跃迁效应来影响基因的功能以及个体的表型。目前，基因组己知的CNV主要有两种检测方法，即基于PCR的检测技术和基于杂交的检测技术，其中使用最广泛的是实时荧光定量PCR(quantitive Real-Time PCR,qPCR)技术。qPCR操作方法简单、敏感性高、重复性好且检测速度快。目前已有大量的实验验证拷贝数变异可通过影响基因网络并调节相关基因的表达，从而对动物的重要经济性状产生影响，因此发现与体尺性状等相关的CNVs，有利于黄牛的肉用良种选育。

锌脂蛋白转录因子5(krüppel-like factor 5，KLF5)是KLFs(krüppel-likefactors)的成员之一，KLFs家族目前有17个成员，是真核生物中分布最多、最广的转录调节因子。KLFs家族羧基末端都具有3个高度保守的锌指蛋白(C2H2)结构域，该区域通过与靶基因启动子上的GC框或CACCC元件相结合而起到调控靶基因表达的作用。KLFs发挥不同功能调控作用还取决于氨基端结构域的不同，其通过结合不同的启动子，会产生不同的调控作用。KLFs主要在细胞代谢、生长、增殖等多种重要细胞过程中发挥调控作用。作为KLFs家族之一的KLF5参与细胞增殖、分化、凋亡和迁移。目前KLF5的差异表达在牛的生长发育过程中的影响机制还没有详细的研究，并且尚未见到关于牛KLF5基因拷贝数变异与黄牛生长性状关联的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测黄牛KLF5基因CNV标记的方法及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测黄牛KLF5基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：

利用实时荧光定量PCR，以黄牛个体的基因组DNA为模板，以引物对KLF5-CNV为引物，扩增KLF5基因的拷贝数变异区域的部分片段，同时以引物对BTF3-CNV为引物，扩增作为内参的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定黄牛个体KLF5基因的拷贝数变异类型；

所述的引物对KLF5-CNV为：

上游引物F1：5’-TTTAGACGCGATCGTAGGGC-3’

下游引物R1：5’-CTGCCGGGCAAGTGTAAAAG-3’

所述的引物对BTF3-CNV为：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。

优选的，所述KLF5基因的拷贝数变异区域位于牛KLF5基因参考基因组序列NC_040257.1的chr 12:48224301bp-48225800bp，共1500bp。

优选的，所述拷贝数变异类型是根据2*2^-ΔΔCt将定量结果分为的三类：插入型，2*2^-ΔΔCt>2；缺失型，0≤2*2^-ΔΔCt<2；正常型，2*2^-ΔΔCt＝2。

优选的，所述实时荧光定量PCR采用的扩增体系包括25ng/μL模板DNA 1μL以及10pmol/L的引物对KLF5-CNV或引物对BTF3-CNV所对应的上、下游引物各0.5μL。

优选的，所述实时荧光定量PCR采用的反应程序包括以下步骤：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。

优选的，基于引物对KLF5-CNV扩增的PCR产物片段大小为177bp，基于引物对BTF3-CNV扩增的PCR产物片段大小为166bp。

上述检测黄牛KLF5基因拷贝数变异的方法在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，所述KLF5基因的拷贝数变异类型可以作为提高黄牛生长性状的CNV标记。具体的，在秦川牛群体中，具有正常型拷贝数变异类型的个体在生长性状上优于具有缺失型拷贝数变异类型的个体；在皮南牛群体中，具有插入型拷贝数变异类型的个体在生长性状上优于具有正常型拷贝数变异类型的个体；在云岭牛群体中，具有插入型拷贝数变异类型个体在生长性状上优于具有缺失型或正常型拷贝数变异类型的个体。

优选的，所述生长性状为体重、体长、胸宽、胸围、胸深、腰角宽中的一种或多种。

一种检测黄牛KLF5基因拷贝数变异的试剂盒，该试剂盒包括上述引物对KLF5-CNV以及BTF3-CNV。

本发明的有益效果体现在：

本发明以待测黄牛的基因组DNA为模板，利用实时荧光定量PCR检测KLF5基因CNV，根据检测得到的拷贝数变异与生长性状(包括体重、胸围等重要经济性状)进行的关联分析，揭示了与生长性状优势明显相关的拷贝数变异类型，可以通过分子标记(CNV标记)快速建立黄牛的生长性状优势种群，从而有利于加快黄牛分子标记辅助选择育种进程。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明提供的黄牛KLF5基因拷贝数变异检测方法，不受年龄的限制，可用于母牛的早期选育。

(2)检测黄牛KLF5基因拷贝数变异的方法快速、准确、可靠，并且操作简便。

(3)为黄牛生长性状的分子标记辅助选择提供了科学基础。

附图说明

图1为KLF5基因及BTF3基因的PCR扩增产物电泳图；其中：泳道1为KLF5-CNV扩增结果，泳道2为MarkerⅠ。

图2为本发明实施例中进行qPCR(KLF5基因)绘制的扩增曲线图。

图3是本发明实施例中进行qPCR(KLF5基因)绘制的溶解曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明利用实时荧光定量PCR对黄牛KLF5基因的拷贝数变异进行检测并用于分子育种，包括以下步骤：

(1)根据NCBI数据库的牛KLF5基因序列，查找到重测序中筛选出的拷贝数变异区域的序列，利用Prime 5.0软件设计被包含在此区域的引物，并用普通PCR检测引物；

(2)采用实时荧光定量PCR技术检测候选位点在群体中的拷贝数变异情况；

(3)利用SPSS 23.0软件将拷贝数变异类型与黄牛生长性状进行关联分析，筛选到与黄牛生长性状优势相关的CNV标记；

(4)根据检测的拷贝数变异类型快速建立黄牛的生长性状优势种群，从而加快生长性状优异的黄牛选育进程。

1、黄牛样本采集

本发明具体以秦川牛(n＝159)、皮南牛(n＝86)、夏南牛(n＝118)和云岭牛(n＝154)作为检测对象，其中秦川牛的血样采集自陕西省宝鸡市秦川肉牛良种繁育中心，夏南牛血样来自河南省驻马店市泌阳县夏南牛科技有限公司，云岭牛血样采集自云南省昆明市小哨乡，皮南牛血样采自河南省南阳市新野县(具体见表1)。

表1.黄牛样本信息表

2、血液全基因组DNA的提取

1)取50μL血样，加入450μL裂解液和10μL的蛋白酶K(20mg/mL)，短暂涡旋后于60℃水浴消化过夜(12-16小时)，消化过程中振荡2-3次，涡旋1次；

2)加入0.4mL平衡酚(pH＝7.9左右)，轻缓摇匀10min，然后12000r/min、4℃离心10min，转移上清液至另一个1.5mL离心管内，重复两次；

3)向上清液中加入400μL 24:1氯仿:异戊醇，轻缓摇匀10min，然后12000r/min、4℃离心10min，转移上清液至另一个1.5mL离心管内；

4)加入上清液两倍体积的4℃预冷的无水乙醇，摇匀，至出现絮状沉淀，继续振荡至沉淀凝结，然后用枪头将沉淀挑出至另一1.5mL离心管内；

5)将沉淀用1mL 4℃预冷75％乙醇漂洗两遍，每次轻摇10min，然后12000r/min、4℃离心10min，弃上清液；

6)将1.5mL离心管倒置于干净吸水纸上，放置在通风橱内，室温干燥30min；

7)加入100μL灭菌双蒸馏水溶解DNA，4℃下保存2-3天，使其完全溶解；

8)使用分光光度计测定DNA浓度，加入灭菌双蒸馏水，调整浓度，-80℃保存。

3、目标序列及内参序列的扩增

以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛KLF5基因(目的基因)序列(GenBank Accession No.NC_040257.1)为参考序列，根据牛KLF5基因候选区域Chr12：48224301bp-48225800bp的拷贝数变异，利用Primer 5.0设计实时荧光定量PCR引物对KLF5-CNV检测KLF5基因拷贝数变异，扩增的目标序列片段大小为177bp，内参序列为已知的不存在拷贝数变异的序列，即利用引物对BTF3-CNV扩增的BTF3基因(内参基因)中的一段166bp的序列。KLF5-CNV和BTF3-CNV的引物序列见表2，利用普通PCR进行了检验，结果参见图1。

表2.实时荧光定量PCR的引物信息

注：引物设计时间为2018年5月

qPCR的扩增体系以10μL计为：25ng/μL模板DNA(提取自血样的基因组DNA)1μL、10pmol/L的上、下游引物各0.5μL、2×SYBR Green qPCR Mix 5.0μL，及ddH₂O 3.0μL。

qPCR的扩增反应程序为：1)预变性：95℃10min；2)扩增反应：95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。绘制溶解曲线(Bio Rad CFX96 3.1)。

通过绘制扩增曲线(图2)和溶解峰确定引物适用于qPCR分析。根据绘制的溶解曲线(图3)，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰。

4、拷贝数变异的推断

每个样品分别用目标序列和内参序列的引物进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2*2^-ΔΔCt方法进行拷贝数变异类型的分析鉴定，ΔΔCt＝ΔCt_(实验组)-ΔCt_(参照组)，ΔCt_(实验组)＝Ct_{(实验组目的基因)}-Ct_{(实验组内参基因)}，ΔCt_(参照组)＝Ct_{(参照组目的基因)}-Ct_{(参照组内参基因)}，其中，实验组即为待检测有无CNVs的样本，参照组即为已知无拷贝数变异的样本，C_t即Cycle threshold，为PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

根据2*2^-ΔΔCt将定量结果分为三类：插入型，2*2^-ΔΔCt>2；缺失型，0≤2*2^-ΔΔCt<2；正常型，2*2^-ΔΔCt＝2。

5、KLF5基因CNV位点与生长性状的关联分析

生长性状：尻长、体高、十字部高、体重、体长、胸围、腰角宽、坐骨端宽、管围、胸宽和胸深。

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS 23.0软件分析各基因型间的生长性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijk＝μ+A_i+CNV_j+e_ijk

其中：Y_ijk为性状观察值，μ为总体均值，A_i为第i头个体的年龄，CNV_j为第j个拷贝数变异类型的固定效应，e_ijk为随机误差。

各组数据间的差异性采用LSD多重比较进行检验，结果以Mean±SE形式表示，参见表3、表4、表5及表6。

表3.秦川牛KLF5基因拷贝数变异与其生长性状之间的相关性分析

注：在同一行中的数值上标为a、b和*表明差异显著(P<0.05)；在同一行中的数值上标为A、

B和**表明差异极显著(P<0.01)。

表4.夏南牛KLF5基因拷贝数变异与其生长性状之间的相关性分析

表5.皮南牛KLF5基因拷贝数变异与其生长性状之间的相关性分析

注：在同一行中的数值上标*表明差异显著(P<0.05)。

表6.云岭牛KLF5基因拷贝数变异与其生长性状之间的相关性分析

注：在同一行中的数值上标为**表明差异极显著(P<0.01)。

结果表明，在秦川牛群体中，正常型的个体在腰角宽、体长、体重和胸宽方面明显优于缺失型的个体；在皮南牛群体中，插入型的个体在腰角宽和胸围方面明显优于正常型的个体；在云岭牛群体中，插入型的个体在胸深方面明显优于正常型、缺失型的个体。因此，KLF5基因CNV位点(Chr12：48224301bp-48225800bp)的拷贝数变异类型可以作为提高黄牛生长性状的候选分子遗传标记(CNV标记)。

6、上述CNV标记在黄牛选育中的应用

以上获得的候选分子遗传标记可以用于寻找与其相关或紧密连锁的影响黄牛生长性状的数量性状基因座。同时，通过对黄牛KLF5基因CNV位点不同基因型(拷贝数变异类型)的检测，可以针对不同的地方黄牛品种提供具有特定分子标记的基础材料，以对黄牛进行分子标记辅助选择，从而能够加快黄牛品种改良的选育进程。

<110> 河南省畜牧总站

<120> 一种检测黄牛KLF5基因CNV标记的方法及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tttagacgcg atcgtagggc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ctgccgggca agtgtaaaag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

aaccaggaga aactcgccaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ttcggtgaaa tgccctctcg 20

Claims (10)

1.一种检测黄牛KLF5基因拷贝数变异的方法，其特征在于：包括以下步骤：

以黄牛的基因组DNA为模板，以引物对KLF5-CNV以及引物对BTF3-CNV为引物，分别通过实时荧光定量PCR扩增KLF5基因的拷贝数变异区域以及作为内参的BTF3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定黄牛KLF5基因的拷贝数变异类型；

所述的引物对KLF5-CNV为：

上游引物F1：5’-TTTAGACGCGATCGTAGGGC-3’

下游引物R1：5’-CTGCCGGGCAAGTGTAAAAG-3’

所述的引物对BTF3-CNV为：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。

2.根据权利要求1所述一种检测黄牛KLF5基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述KLF5基因的拷贝数变异区域位于牛KLF5基因参考基因组序列NC_040257.1的chr12:48224301bp-48225800bp。

3.根据权利要求1所述一种检测黄牛KLF5基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述拷贝数变异类型是根据2*2^-ΔΔCt将定量结果分为的三类：插入型，2*2^-ΔΔCt>2；缺失型，0≤2*2^-ΔΔCt<2；正常型，2*2^-ΔΔCt＝2。

4.根据权利要求1所述一种检测黄牛KLF5基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的扩增体系包括25ng/μL模板DNA 1μL以及10pmol/L的引物对KLF5-CNV或引物对BTF3-CNV所对应的上、下游引物各0.5μL。

5.根据权利要求1所述一种检测黄牛KLF5基因拷贝数变异的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的反应程序包括以下步骤：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。

6.根据权利要求1所述一种检测黄牛KLF5基因拷贝数变异的方法，其特征在于：基于引物对KLF5-CNV扩增的PCR产物片段大小为177bp，基于引物对BTF3-CNV扩增的PCR产物片段大小为166bp。

7.如权利要求1-6中任意一项所述的方法在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述拷贝数变异类型中存在与个体生长性状优势相关的CNV标记。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述生长性状为体重、体长、胸宽、胸围、胸深、腰角宽中的一种或多种。

10.一种检测黄牛KLF5基因拷贝数变异的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于扩增KLF5基因拷贝数变异区域以及作为内参的BTF3基因的部分片段的实时荧光定量PCR引物，所述引物具体包括引物对KLF5-CNV以及引物对BTF3-CNV；

所述的引物对KLF5-CNV为：

上游引物F1：5’-TTTAGACGCGATCGTAGGGC-3’

下游引物R1：5’-CTGCCGGGCAAGTGTAAAAG-3’

所述的引物对BTF3-CNV为：

上游引物F2：5’-AACCAGGAGAAACTCGCCAA-3’

下游引物R2：5’-TTCGGTGAAATGCCCTCTCG-3’。

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