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CN112980735B - 丁酸梭菌、菌剂及它们的应用以及菌剂的制备方法 - Google Patents

丁酸梭菌、菌剂及它们的应用以及菌剂的制备方法 Download PDF

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CN112980735B CN202110331624.1A CN202110331624A CN112980735B CN 112980735 B CN112980735 B CN 112980735B CN 202110331624 A CN202110331624 A CN 202110331624A CN 112980735 B CN112980735 B CN 112980735B
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Abstract

本发明涉及微生物领域，公开了丁酸梭菌、菌剂及它们的应用以及菌剂的制备方法。该丁酸梭菌（Clostridium butyricum）的保藏编号为CGMCC No.20417。该菌株来源于健康猪的盲肠内容物；具有较好的抑菌活性和产丁酸性能。该丁酸梭菌制成的微生态制剂对动物肠道具有调节作用，其代谢产生的丁酸能降低肠道pH并抑制有害菌生长；当与其他微生物共同使用作为调水剂时，能改善水质。

Description

丁酸梭菌、菌剂及它们的应用以及菌剂的制备方法
技术领域
本发明涉及微生物领域，公开了一株丁酸梭菌（Clostridium butyricum）、菌剂及它们的应用以及一种菌剂的制备方法。
背景技术
微生物菌剂是可通过改善动物肠道健康，调节肠道菌群平衡，对动物健康具有有利作用的活菌微生物饲料添加剂，具有无残留、无副作用、不污染环境、不产生耐药性、成本低、方便使用等优点。我国农业部2013版《饲料添加剂品种目录》中共收录35中微生物菌种，具体为乳酸菌（22种）、芽孢杆菌（6种）、酵母菌（2种）、光合细菌（1种）、霉菌（2种）、丙酸杆菌（1种）和丁酸梭菌（1种）。益生菌主要通过竞争性排斥、产生抑菌类物质等途径改善肠道微生物平衡，抑制病原菌入侵和生长，稳定肠道菌群；亦可产生短链脂肪酸、分泌多种消化酶等，供宿主直接利用或促进动物对营养物质的代谢吸收；亦可次级动物肠粘膜免疫反应，增强动物免疫功能；亦可降低动物肠道和血液中的氨水平，改善养殖环境；益生菌具有净化水质功能，改善水体。
丁酸梭菌是一种严格厌氧菌，主要存在于奶酪、天然酸奶、健康动物肠道、动物粪便及土壤中，其代谢产物主要有丁酸、乙酸、乳酸等，细胞在PYG肉汤中为直杆状，两端钝圆，运动且周生鞭毛，0.5~1.7 μm×2.4~7.6 μm。单个、成对或短链状，偶见丝状菌体，芽孢椭圆形，中生或次端生，一般不会使细胞膨大。丁酸梭菌为内生芽孢状态存在，具有较强的耐受低胃酸、耐胆汁等特性，对外界环境抵抗力强，经高温加工制粒等处理后仍能保持较高的活性和益生菌数量。
丁酸梭菌的功效：1、作为饲料添加剂可以提高动物消耗吸收能力，提高生长性能，提高饲料转化率。2、作为益生菌，其代谢产生的抑菌活性物质可以抑制致病菌及腐败菌的生长，减少胺类、吲哚类和硫化氢等有害物质的产生，亦可促进肠道有益菌的繁殖，改善动物肠道健康。3、代谢产生益生物质。肠道内丁酸梭菌可产生B族维生素和维生素K等物质，丁酸是其主要代谢产物，而丁酸是肠道上皮组织细胞再生和修复的主要营养物质。4、激活机体免疫系统，促使机体免疫力增强，进而维持动物健康。畜牧业中丁酸梭菌主要应用于饲料添加和兽药，可有效提高动物机体抗病原微生物的能力，抑制肠道腐败产物的产生，增加肠道内短链脂肪酸的生成，提高机体免疫力、生长性能、产品品质。水产养殖中，丁酸梭菌亦可分解水体中的有机物，亦可抑制有害细菌的生长，改善水质，维持水质稳定。
丁酸梭菌在发酵过程中常常因发酵条件的不稳定等问题而导致发酵前期出现菌种生长的迟滞期，此外该菌种在发酵过程中，常常出现发酵液菌数较少，菌种活力较低，芽孢率较低等问题。
发明内容
本发明的目的是为了提供一株丁酸梭菌（Clostridium butyricum）、菌剂及它们的应用以及一种菌剂的制备方法，该丁酸梭菌发酵过程中具有活力高、芽孢率高的优点，而且发酵工艺简单，有效减少发酵染菌以及降低发酵原料和时间成本，同时显著提高菌剂稳定性。
本发明一方面提供一株丁酸梭菌（Clostridium butyricum），所述丁酸梭菌的保藏编号为CGMCC No. 20417。
本发明第二方面提供一种菌剂，该菌剂含有如上所述的丁酸梭菌（Clostridium butyricum）。
本发明第三方面提供一种菌剂的制备方法，该方法包括：将丁酸梭菌接种到发酵培养基中发酵，得到发酵液；
可选地，将所述发酵液与保护剂和/或固体载体混合，得到菌剂；
其中，所述丁酸梭菌为如上所述的丁酸梭菌和/或如上所述的菌剂。
本发明第四方面提供如上所述的方法制备得到的菌剂。
本发明第五方面提供如上所述的丁酸梭菌和/或如上所述的菌剂在生产丁酸、制备微生态制剂、调水剂和饲料中的应用。
本发明可以取得如下的有益效果：
本发明所述的丁酸梭菌的保藏编号为CGMCC No. 20417。该菌株来源于健康猪的盲肠内容物；具有较好的抑菌活性和菌体活力。
该丁酸梭菌无毒无致病性，在饲料可添加微生物名单中，对人畜安全、对环境友好。
该丁酸梭菌制成的微生态制剂对动物肠道具有调节作用，其代谢产生的丁酸能降低肠道pH并抑制有害菌生长；该菌株与其他微生物共同使用作为调水剂，能改善水质。
本发明所述的微生态制剂的制备方法能够工艺简单，有效减少发酵染菌以及降低发酵原料和时间成本，同时显著提高产品质量稳定性。
生物保藏
本发明的菌株为丁酸梭菌（Clostridium butyricum），于2020年7月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101）（保藏单位的缩写为CGMCC），保藏编号为CGMCC No.20417。
附图说明
图1是本发明所述的丁酸梭菌在显微镜下的菌体形态图；
图2是本发明实施例6的发酵过程发酵液菌体浓度及丁酸产量的曲线。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明一方面提供一株丁酸梭菌（Clostridium butyricum），所述丁酸梭菌的保藏编号为CGMCC No. 20417。
本发明所述丁酸梭菌的筛选：采集健康猪的盲肠内容物，称取5.0 g溶解于25 mL无菌生理盐水，充分震荡制成10-1菌悬液；逐级稀释至10-6，厌氧工作站中将不同稀释梯度的菌悬液涂布于强化梭菌培养基（RCM）平板，培养24 h，挑取平板上典型性菌落进行镜检（见图1），初步判断菌株类型。将菌体形态为梭状的菌株进行划线纯化。
挑取分离得到的单菌落，接种于梭菌培养基中的离心管中，37℃厌氧培养24h后取少量菌液进行革兰氏染色镜检观察。
通过革兰氏染色镜检观察并参照《Bergey’s Manual of SystematicBacteriology》(第二版)，梭菌属形态特征描述，筛选相似菌株进行后续分子鉴定。
16srDNA测序鉴定得到菌株与丁酸梭菌（Clostridium butyricum）菌种同源性最高，其16S rDNA全序列如SEQ ID NO:1所示：
TGCAAGTCGAGCGATGAAGCTCCTTCGGGAGTGGATTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTCATAGAGGGGAATAGCCTTTCGAAAGGAAGATTAATACCGCATAAGATTGTAGTACCGCATGGTACAGCAATTAAAGGAGTAATCCGCTATGAGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGTGATGACGGTCTTCGGATTGTAAAGCTCTGTCTTTAGGGACGATAATGACGGTACCTAAGGAGGAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTACTGGGCGTAAAGGGAGCGTAGGTGGATATTTAAGTGGGATGTGAAATACCCGGGCTTAACCTGGGTGCTGCATTCCAAACTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGGAAAGGAGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTAGGAAGAATACCAGTGGCGAAGGCGCCTTTCTGGACTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATACTAGGTGTAGGGGTTGTCATGACCTCTGTGCCGCCGCTAACGCATTAAGTATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTAGACTTGACATCTCCTGAATTACTCTGTAATGGAGGAAGCCACTTCGGTGGCAGGAAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTAAGTCCCGCACGAGCGCACCCTTATTGTAGTTGCTCCAT。
本发明的菌株为丁酸梭菌（Clostridium butyricum），于2020年8月4日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101）（保藏单位的缩写为CGMCC），保藏编号为CGMCC No.20417。
经实验发现，本发明提供的丁酸梭菌（Clostridium butyricum）对条件致病菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有较好的抑菌活性，且针对革兰氏阴性（G-）细菌的抑制作用较革兰氏阳性（G+）细菌的抑制作用强。
本发明中丁酸梭菌制成的菌剂对动物肠道具有调节作用，其代谢产生的丁酸能降低肠道pH并抑制有害菌生长；该菌株与其他微生物共同使用作为调水剂，能改善水质。
在本发明中，所述RCM培养基的组成优选包括：酵母膏 1-5g，牛肉膏 5-15g，可溶性淀粉0.5-1.5g，葡萄糖 3-7g，半胱氨酸盐酸盐 0.1-1g，NaCl1-5g，NaAc 1-5g，刃天青1-5mg/L。调pH至8-9。
本发明第二方面提供一种菌剂，该菌剂含有如上所述的丁酸梭菌（Clostridium butyricum）。
优选地，该菌剂含有所述丁酸梭菌的活菌体。
优选地，所述菌剂中丁酸梭菌活菌数≥2亿cfu/g。
该菌剂能耐受85℃，3 min干热处理。
所述菌剂可以以固体、液体或半液体等形式存在。
本发明第三方面提供一种菌剂的制备方法，该方法包括：将丁酸梭菌接种到发酵培养基中发酵，得到发酵液；
可选地，将所述发酵液与保护剂和/或固体载体混合，得到菌剂；
其中，所述丁酸梭菌为如上所述的丁酸梭菌和/或如上所述的菌剂。
也即，所述菌剂可以是发酵液直接制备得到的，也可以是与其他物质混合制备得到的。
优选地，所述丁酸梭菌以种子液的形式接种。
所述种子液的制备方法可以本领域常规的制备方法，比如可以将如上所述丁酸梭菌或如上所述的菌剂接种到种子培养基中进行扩培，以获得种子液。
所述丁酸梭菌或所述菌剂在种子培养基中扩培前还可以经过活化处理，所述活化的培养基可以为第一方面所述的RCM培养基。
优选地，所述丁酸梭菌的活化条件包括：培养温度为30-37℃，pH为6.0-7.0，培养时间为10-24 h，无氧条件。
在本发明中，可以在本领域常规使用的种子培养基中进行培养，可以为本领域常规使用的培养基（如RCM培养基）。优选地，所述种子培养基包括碳源、氮源、磷酸二氢钾、碳酸钙和可选的硫酸镁。
在本发明中，所述碳源可以是本领域常用的碳源，包括但不限于淀粉、葡萄糖、甘油、蔗糖和糖蜜中的至少一种。
其中，淀粉可以包括可溶性淀粉。
在本发明中，所述氮源可以是本领域常用的氮源，包括但不限于酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵、硝酸铵等，优选地，所述氮源为酵母浸粉和/或硫酸铵。
在本发明的一种优选的情况下，所述种子培养基包括碳源、酵母浸粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、碳酸钙和可选的七水合硫酸镁；优选地，所述碳源选自淀粉、甘油和葡萄糖中的至少一种；优选地，所述种子培养基中，所述碳源的含量为15-30g/L，所述酵母浸粉的含量为5-15 g/L，所述硫酸铵的含量为1-5 g/L，所述磷酸氢二钾的含量为1-3g/L，所述七水合硫酸镁的含量为0-0.3 g/L，所述碳酸钙的含量为1-3 g/L。
在本发明中，所述种子培养基中还可以含有刃天青，刃天青可以以刃天青溶液的形式提供，其溶液的浓度可以为任意浓度，比如为0.1-1重量%。
优选地，所述种子培养基中，所述刃天青的含量为1-5 mg/L。
优选地，所述丁酸梭菌的培养条件包括：培养温度为30-37℃，pH为6-7，培养时间为18-24 h，无氧条件。
其中，所述无氧条件可以通过氮吹或石蜡液封提供。
所述培养可以为至少一级培养，只要能够获得种子液即可。
在本发明中的一种优选的实施方式中，所述丁酸梭菌以种子液的形式接种，所述种子液的制备方法包括：将丁酸梭菌分别接种到种子培养基中进行一级种子培养和二级种子培养，得到种子液。
应当理解的是，一级种子培养和二级种子培养的条件可以相同或不同。
在本发明中，所述发酵的方法优选包括：将丁酸梭菌种子液接种到发酵培养基中进行发酵，得到发酵液。
优选地，所述种子液中的活菌数为1×108-5×108cfu/mL。
优选地，接种量为1-10体积%。
在本发明中，优选地，所述发酵培养基的组成包括：所述发酵培养基包括碳源、氮源、磷酸二氢钾、硫酸镁和碳酸钙。
其中，碳源和氮源的种类在上述碳源和氮源中进行了说明，在此不再赘述。
在本发明的一种优选地实施方式中，所述发酵培养基包括葡萄糖、酵母浸粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、七水合硫酸镁和碳酸钙。
优选地，所述发酵培养基中，所述葡萄糖的含量为15-20 g/L，所述酵母浸粉的含量为10-15 g/L，所述硫酸铵的含量为2-5 g/L，所述磷酸氢二钾的含量为1-3g/L，所述七水合硫酸镁的含量为0.1-0.2 g/L，所述碳酸钙的含量为2-3 g/L。
在本发明中，所述发酵培养基中还可以含有刃天青，优选地，所述发酵培养基中，所述刃天青的含量为1-5 mg/L。
优选地，所述丁酸梭菌的发酵条件包括：温度为30-37℃，pH为6-7，时间为10-24h。所述发酵过程中的搅拌转速根据发酵罐的体积确定，本领域技术人员可以根据实际情况进行调整。
所述发酵优选在无氧条件下进行，所述无氧条件可以通过氮吹或石蜡液封提供。
本发明所述的丁酸梭菌在发酵过程中会代谢产生丁酸，优选地，所述发酵过程中还添加中和剂。通过所述中和剂中和丁酸，形成丁酸盐。对得到的发酵清液（比如经过固液分离得到的上清液）可以进行处理，制备得到丁酸盐（比如钠盐或钙盐），用作饲料添加剂。
所述中和剂可以是本领域常规使用的碱性物质，所述中和剂包括但不限于碳酸钠、氢氧化钠、碳酸钙等。优选地，所述中和剂为碳酸钠。
所述碳酸钠可以以溶液的形式添加，其浓度优选为100-250g/L。
发酵得到的发酵液可以直接作为菌剂，也可以通过对发酵液与可选的保护剂和/或固体载体混合并进行干燥处理，制备得到菌剂。
所述干燥处理的方式可以为本领域常规的制备方式，比如，可以为风干、冻干、喷雾干燥、烘干和真空干燥等方式，优选为喷雾干燥。
优选地，所述喷雾干燥的条件包括：喷雾压力0.008-0.012MPa，入口温度120-140℃，出口温度40-60℃。
在本发明中，所述喷雾干燥的风量和送液速度可以根据喷雾干燥设备的大小进行调整，优选地，风量0.3-0.5 m3/min，送液速度10-12 mL/min。
在本发明的一种实施方式中，将发酵得到的所述丁酸梭菌的发酵液进行浓缩处理，得到丁酸梭菌菌泥，将所述菌泥与保护剂混合并干燥，制备得到所述菌剂。
其中，所述浓缩处理的方法可以是本领域常规的浓缩方法，比如可以通过离心或过滤的方法进行浓缩，只要能够获得丁酸梭菌菌泥即可。
优选地，所述保护剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、海藻糖、柠檬酸钠、脱脂奶粉和麦芽糊精中的至少一种。
优选地，所述保护剂以保护剂溶液的形式添加。更优选地，所述保护剂溶液中，所述保护剂的含量为3-8重量％。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述保护剂包含水溶性淀粉和麦芽糊精。优选地，水溶性淀粉和麦芽糊精的重量比为1:0.5-15。
优选地，以保护剂溶液和丁酸梭菌菌泥的总重量为基准，所述保护剂的含量为3-5重量%。
在本发明的一种优选的实施方式中，将发酵得到的所述丁酸梭菌的发酵液与固体载体混合并干燥，制备得到所述菌剂。
应当理解的是，所述发酵液可以经过浓缩，也可以经过稀释，只要能够使得菌体与固体载体混合均匀即可。
所述固体载体包括但不限于麸皮、豆粕和玉米粉。
所述干燥可以在流化床上进行，具体的条件可以根据需要调整。
经喷雾干燥制备的菌剂能耐受85℃，3 min干热处理，菌体存活率大于90%。
在本发明的一种优选的实施方式中，菌剂的制备方法包括：
（1）种子液制备：将丁酸梭菌分别进行一级种子培养和二级种子培养，得到种子液；
（2）发酵培养：将所述种子液按照1-10体积%的接种量接入发酵培养基中，在温度为30-37℃，pH为6-7和无氧的条件下，培养10-24 h，得到发酵液；
（3）将所述发酵液与保护剂和/或固体载体混合，并进行喷雾干燥，得到菌剂。
本发明所述的丁酸梭菌菌剂，还可以包括外源条件的丁酸钠或丁酸钙等混合作为饲料添加剂。
本发明第四方面提供如上所述的方法制备得到的菌剂。
所述菌剂的性质在第二方面已经进行了详细的说明，在此不再赘述。
本发明第五方面提供如上所述的丁酸梭菌和/或如上所述的菌剂在生产丁酸、制备微生态制剂、调水剂和饲料中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
RCM培养基的组成为（1L）：酵母膏 3g，牛肉膏 10g，可溶性淀粉1g，葡萄糖 5g，半胱氨酸盐酸盐 0.5g，NaCl 3g，NaAc 3g，刃天青3mg/L。调pH至8.5，121℃湿热灭菌30min。
种子培养基的组成为：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，硫酸铵3 g/L，氯化钠2 g/L，硫酸镁0.2 g/L，磷酸氢二钾1.5 g/L。
发酵培养基的组成为：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，硫酸铵3 g/L，氯化钠2 g/L，硫酸镁0.2 g/L，磷酸氢二钾1.5 g/L。
以下实施例中，使用SPSS17.0（SPSS Inc.，USA）统计软件的单因素方法分析进行显著性分析，差异显著则进行Dunan氏法多重比较分析。数据用平均值±标准误表示。
实施例1
本实施例用于说明丁酸梭菌的分离。
采集健康猪的盲肠内容物，称取5.0 g溶解于25 mL无菌生理盐水，充分震荡制成10-1菌悬液；逐级稀释至10-6，厌氧工作站中将不同稀释梯度的菌悬液涂布于强化梭菌培养基（RCM）平板，培养24 h，挑取平板上典型性菌落进行镜检（见图1），初步判断菌株类型，将菌体形态为梭状的菌株进行平板划线纯化，获得目标菌株。
实施例2
本实施例用于说明菌株的鉴定。
1、细胞形态特征鉴定
挑取实施例1中分离得到的单菌落，接种于梭菌培养基中的离心管中，37℃厌氧培养24h后取少量菌液进行革兰氏染色镜检观察。
革兰氏染色试验：取适量菌滴加到载玻片上，通过火焰2-3次固定，滴加草酸铵结晶紫液，染于固定过的涂片染色1min。用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。吸去残留水，连续滴加95％乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。吸去残留水，连续滴加95％乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。
通过革兰氏染色镜检观察并参照《Bergey’s Manual of SystematicBacteriology》(第二版)，梭菌属形态特征描述，筛选相似菌株进行后续分子鉴定。
2、16S rDNA基因序列分析鉴定：
挑取细胞形态特征鉴定中分离得到的菌株，接种于RCM培养基中，37℃厌氧培养24h后取少量样品进行PCR扩增16S rDNA序列。采用27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（SEQID NO:2）作为正向引物，采用1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’（SEQ ID NO:3）作为反向引物，PCR反应体系(25μL)为：Takara PrimerSTARmix12.5μL；ddH2O 9.5μL；正反向引物各1μL；菌液1μL。PCR扩增程序：98℃预变性10min，98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸2min，进行30循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物利用1％琼脂糖凝胶电泳检测，片段为1500bp左右的阳性产物经纯化后进行序列测定。
测序结果表明，所挑选菌株的16SrRNA基因序列长度为1,047bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：
TGCAAGTCGAGCGATGAAGCTCCTTCGGGAGTGGATTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTCATAGAGGGGAATAGCCTTTCGAAAGGAAGATTAATACCGCATAAGATTGTAGTACCGCATGGTACAGCAATTAAAGGAGTAATCCGCTATGAGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGTGATGACGGTCTTCGGATTGTAAAGCTCTGTCTTTAGGGACGATAATGACGGTACCTAAGGAGGAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTACTGGGCGTAAAGGGAGCGTAGGTGGATATTTAAGTGGGATGTGAAATACCCGGGCTTAACCTGGGTGCTGCATTCCAAACTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGGAAAGGAGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTAGGAAGAATACCAGTGGCGAAGGCGCCTTTCTGGACTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATACTAGGTGTAGGGGTTGTCATGACCTCTGTGCCGCCGCTAACGCATTAAGTATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTAGACTTGACATCTCCTGAATTACTCTGTAATGGAGGAAGCCACTTCGGTGGCAGGAAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTAAGTCCCGCACGAGCGCACCCTTATTGTAGTTGCTCCAT。
运用NCBI上的BLAST，所筛选出的菌株与Clostridium butyricum菌种同源性最高。
也即，经鉴定，所述菌株应当为丁酸梭菌（Clostridium butyricum）。
实施例3
本实施例用于说明本发明所述的丁酸梭菌的耐高温检测
将甘油管保藏的丁酸梭菌菌株（CGMCC No. 20417和CICC23847）各取0.1 mL 接种到10 mL 液体RCM培养基中，厌氧培养48 h形成芽孢。将2株菌分别置于80℃，85℃，90℃，95℃烘箱中处理3 min，然后立即降温冷却，待检测活菌数。取5 g待测菌液，加入至45 mL生理盐水中，充分混匀后吸取1 mL转移至9 mL生理盐水中，混匀形成10-1稀释液，吸取10-1稀释液1 mL转移至9 mL生理盐水中，形成10-2稀释液，依次形成10-3，10-4，10-5，10-6稀释液，分别吸取10-4，10-5，10-6稀释液各100 μL涂布于丁酸梭菌培养基，37℃倒置厌氧培养48h，进行活菌计数并计算存活率，结果见表1。
存活率=（对照组活菌数-试验组活菌数）/对照组活菌数×100%。
结果发现丁酸梭菌CGMCC No. 20417的存活率显著高于丁酸梭菌CICC23847，丁酸梭菌CGMCC No. 20417具有良好的耐高温能力。
表1
Figure 381588DEST_PATH_IMAGE001
实施例4
本实施例用于说明本发明所述的丁酸梭菌的耐酸检测
将甘油管保藏的丁酸梭菌菌株取0.1 mL 接种到10 mL 液体RCM培养基中，厌氧培养18 h。将活化的菌株以2%接种于pH 1.5、pH 2.5、pH 3.5、pH4.5 的RCM培养基中，37℃静置培养。取接种 1h的培养液，平板稀释法进行活菌计数并计算存活率，结果见表2。
存活率=（对照组活菌数-试验组活菌数）/对照组活菌数×100%。
结果发现丁酸梭菌CGMCC No. 20417的存活率显著高于丁酸梭菌CICC23847，丁酸梭菌CGMCC No. 20417具有良好的耐酸能力，在低pH环境下存活率较高，有助于较多的丁酸梭菌通过胃部酸性环境到达肠道。
表2
Figure 784888DEST_PATH_IMAGE002
实施例5
本实施例用于说明本发明所述的丁酸梭菌的抑菌活性检测
将甘油管保藏的丁酸梭菌菌株取0.1 mL 接种到10 mL 液体RCM培养基中，厌氧培养18 h。将活化的菌株接种于RCM培养基，厌氧培养24 h，再按5%接种量接种于种子培养基，37℃厌氧培养48 h，得到种子液。对种子液14000 r/min离心5 min，收集上清液，经0.2 μm滤膜过滤除菌后备用。
大肠杆菌和金黄色葡萄球菌划线接种于LB固体培养基上37 ℃培养24 h，依次用无菌生理盐水洗脱菌体，制备菌悬液，并将菌悬液的菌浓度稀释为106CFU/mL，备用。
采用双层平板法制备靶标菌平板。取15 mLRCM培养基加入到培养皿，凝固后作为下层；取5 mL含2%不同靶标菌菌悬液的RCM培养基加入凝固后的下层培养基上作为上层，待用。
用牛津杯法测定抑菌活性。将牛津杯垂直放在制备好的不同靶标菌平板上，使其与培养基表面无空隙后，在牛津杯中加入150 μL丁酸梭菌发酵上清液，于37 ℃条件下培养16h，观察并测量抑菌圈直径。应用卡那霉素作为阳性对照，无菌水为阴性对照，每组测定两个重复。抑菌圈越大，表明抑菌活性越强。其结果见下表3。
按照上述所述的方法测定丁酸梭菌菌株（CICC23847）的抑菌效果，其结果见表3。
表3
Figure 434044DEST_PATH_IMAGE003
本发明所述的丁酸梭菌对条件致病菌（金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）均有较好的抑菌活性，针对革兰氏阴性（G-）细菌的抑制作用较革兰氏阳性（G+）细菌的抑制作用强。
实施例6
本实施例用于说明本发明所述的丁酸梭菌的发酵性能。
在2 L发酵罐对该丁酸梭菌进行放大实验，并检测培养过程中芽孢生成情况。
按照实施例5所述的方法准备种子液，并将种子液接种到发酵培养基中培养，装液量为60%，培养条件为：37℃，初始转速为200 r/min，采用氮气置换的方法控制厌氧环境，初始pH为6.0。
取样检测发酵液菌体浓度OD600值及丁酸产量，结果如图2所示。
检测发酵过程中丁酸的产量，检测方法：采用BioradAminex HPX-87H色谱柱，流动相：0.005 mol/L硫酸溶液，流速：0.5 mL/min，柱温：55℃，检测器：RID，进样量：20 μL。
通过镜检的方法检测芽孢生成率，判断发酵结束时间。在发酵20h后，丁酸梭菌芽孢生成率大于98%，活菌数为2.9×109CFU/mL，结束发酵。发酵终点时，发酵液的OD600值为9.98，丁酸产量为11.57mg/mL。
按照如上所述的方法测定CICC 23847的发酵性能，经测定，在发酵20h后，芽孢生成率大于94%，活菌数为1.1×109 CFU/mL，发酵液的OD600值为8.50，丁酸产量为10.24mg/mL。
实施例7
本实施例用于说明丁酸梭菌菌剂的制备方法。
将实施例6得到的丁酸梭菌发酵液6000 r/min，4℃，10 min离心处理后得到丁酸梭菌菌泥。丁酸梭菌菌泥中加入5 倍菌体重量的保护剂溶液（其中，可溶性淀粉的含量为3重量%，麦芽糊精的含量为2重量%），充分溶解使菌体均匀悬浮，检测pH值维持6.0左右，平衡60 min。通过喷雾干燥制备得到所述菌剂，喷雾条件包括：入口温度120℃，出口温度60℃，风量0.4m3/min，送液速度12 mL/min，喷雾压力为0.01 MPa，制备得到丁酸梭菌菌剂。
得到的菌剂中，活菌数为2×1010 CFU/g。
室温放置10个月，活菌数为1.3×1010CFU/g。
对得到的菌剂分别进行干热处理（烘箱85℃，3 min）和湿热处理（水浴锅85℃，3min），检测处理前后活菌数的变化情况。
所述菌剂的干热处理存活率为95%，湿热处理存活率为74%。
按照上述方法制备CICC 23847的菌剂，不同的是，将培养时间延长至22h，使其芽孢率＞98%，经测定，其活菌数为2.3×109 CFU/mL。测定其存活率，经测定，其活菌数为1.2×109 CFU/g。室温放置10个月，活菌数为5.7×108 CFU/g。所述菌剂的干热处理存活率为92%，湿热处理存活率为56%。
实施例8
本实施例用于说明丁酸梭菌在保育猪上的应用。
为评估丁酸梭菌对断奶仔猪生长性能的影响，选用体重7.33kg左右健康断奶公猪120只，按体重完全随机区组分为4组（正对照组、实验组、对比菌株组和负对照组），每个处理5个重复，每个重复6只断奶仔猪。其中，基础日粮的组成如下表4所示。各处理组中保持粗蛋白质、钙和总磷等营养水平保持一致，营养水平参照NRC（2012）和中国猪饲养标准（2004）。
表4
Figure 188373DEST_PATH_IMAGE004
Figure 722123DEST_PATH_IMAGE005
其中，正对照组的处理方式为：基础日粮+2000ppm 氧化锌。
其中，负对照组的处理方式为：基础日粮。
其中，实验组的处理方式为向基础日粮中添加本发明丁酸梭菌CGMCC No. 20417的菌剂（按照实施例7的方法制备），添加量为0.02重量%。
其中，对比菌株组的处理方式为向基础日粮中添加对比菌株CICC 23847的菌剂（按照实施例7的方法制备），添加量为0.02重量%。
在试验开始（0天），7天，21天与试验结束时（35天），分别称量断奶仔猪个体重以及饲料重量，每日上午9点统计腹泻仔猪数量，计算平均日增重（average daily gain，ADG）、平均日采食量（average daily feed intake，ADFI）和料重比（feed:gain，F/G），结果见表5。
平均日增重（ADG）=（试验末重-试验初重）/试验天数；
平均日采食量（ADFI）=（试验期内供料量-试验期内饲料剩余量）/试验天数。
料重比=平均日采食量/平均日增重。
腹泻率=腹泻猪头数/(试验猪头数×总天数）×100%
表5
Figure 979929DEST_PATH_IMAGE006
Figure 409773DEST_PATH_IMAGE007
注：标注不同小写字母表示组间差异显著（P<0.05）。
通过表5可以看出，添加丁酸梭菌，尤其是本发明的丁酸梭菌能够降低断奶仔猪的料重比和腹泻率，且具有显著的统计学意义。
实施例9
本实施例用于说明丁酸梭菌在肉鸡生产上的应用。
为评估丁酸梭菌对肉鸡生长性能的影响，选择健康1日龄白羽肉鸡，将576只肉鸡随机分为4个处理组，每组144只，组内随机分隔为8个重复栏，每个重复18只，全部为公鸡，生产试验期为42天。4个处理组分别为正对照组（基础日粮 + 20 g/t速大肥）、负对照组（基础日粮）、对比菌株组（基础日粮+实施例7制备的CICC 23847的菌剂）和实验组（基础日粮+实施例7制备的本发明丁酸梭菌的菌剂），其中，菌剂的添加量为0.02%。鸡饲料基础日粮组成及营养水平见表6。速大肥为购自美国辉宝有限公司的速大肥。
测量试验过程中各组肉鸡的平均日采食量ADFI、平均日增重ADG和料重比，结果见表7。
表6
Figure 323503DEST_PATH_IMAGE008
表7
Figure 333047DEST_PATH_IMAGE009
注：标注不同小写字母表示组间差异显著（P<0.05）。
从表7中能够看出，在基础日粮中添加丁酸梭菌，尤其是本发明的丁酸梭菌与负对照组相比，能够显著降低肉鸡的料重比，且具有显著的统计学意义，与正对照组（速大肥）相当，具有替抗潜力，提高了畜禽生产性能。
实施例10
本实施例用于说明本发明的丁酸梭菌在鲫鱼生产上的应用
为评估丁酸梭菌对鲫鱼生长性能的影响，采购大小一致、健康的同批孵化的芙蓉鲫鱼，初始体质量为2.0±0.05g。随机分成4组，即正对照组（基础饲料+市售益生菌产品）、负对照组（基础饲料）、对比菌株组（基础饲料+实施例7制备的CICC 23847的菌剂）和实验组（基础饲料+实施例7制备的本发明丁酸梭菌的菌剂），每个处理组3个重复，每个重复20尾鱼，生产试验期为56天。基础饲料组成见表8。市售益生菌产品为购自维诺种养有限公司的维诺复合益生菌产品。
每日早中晚每隔4小时饲喂一次，投喂量为鱼体质量的3-5%。试验用水族箱持续充氧气，温度控制在25℃，pH值为6-7，记录初始和终末鱼体质量，测定增重率，结果见表9。
增重率=（终末尾均重-初始尾均重）/初始尾均重×100%。
表8
Figure 773256DEST_PATH_IMAGE010
Figure 108422DEST_PATH_IMAGE011
表9
Figure 571764DEST_PATH_IMAGE012
注：标注不同小写字母表示组间差异显著（P<0.05）。
从表9中能够看出，在基础饲料中添加丁酸梭菌，尤其是本发明的丁酸梭菌对鲫鱼有明显的促生长作用，并显著提高了鲫鱼的增重率（P<0.05）。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 中粮营养健康研究院有限公司；中粮生物科技股份有限公司
<120> 丁酸梭菌、菌剂及它们的应用以及菌剂的制备方法
<130> 61605
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1047
<212> DNA
<213> Clostridium butyricum
<400> 1
tgcaagtcga gcgatgaagc tccttcggga gtggattagc ggcggacggg tgagtaacac 60
gtgggtaacc tgcctcatag aggggaatag cctttcgaaa ggaagattaa taccgcataa 120
gattgtagta ccgcatggta cagcaattaa aggagtaatc cgctatgaga tggacccgcg 180
tcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga 240
gagggtgatc ggccacattg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt 300
ggggaatatt gcacaatggg ggaaaccctg atgcagcaac gccgcgtgag tgatgacggt 360
cttcggattg taaagctctg tctttaggga cgataatgac ggtacctaag gaggaagcca 420
cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta 480
ctgggcgtaa agggagcgta ggtggatatt taagtgggat gtgaaatacc cgggcttaac 540
ctgggtgctg cattccaaac tggatatcta gagtgcagga gaggaaagga gaattcctag 600
tgtagcggtg aaatgcgtag agattaggaa gaataccagt ggcgaaggcg cctttctgga 660
ctgtaactga cactgaggct cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag 720
tccacgccgt aaacgatgaa tactaggtgt aggggttgtc atgacctctg tgccgccgct 780
aacgcattaa gtattccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ttaaaactca aaggaattga 840
cgggggcccg cacaagcagc ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 900
cctagacttg acatctcctg aattactctg taatggagga agccacttcg gtggcaggaa 960
gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtaa gtcccgcacg 1020
agcgcaccct tattgtagtt gctccat 1047
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificially synthesized
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificially synthesized
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (11)

1.一株丁酸梭菌Clostridium butyricum，其特征在于，所述丁酸梭菌的保藏编号为CGMCC No.20417。
2.一种菌剂，其特征在于，该菌剂含有权利要求1所述的丁酸梭菌Clostridiumbutyricum。
3.一种菌剂的制备方法，其特征在于，该方法包括：将丁酸梭菌接种到发酵培养基中发酵，得到发酵液；
将所述发酵液与保护剂和/或固体载体混合，得到菌剂；
其中，所述丁酸梭菌为权利要求1所述的丁酸梭菌和/或权利要求2所述的菌剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述发酵在无氧条件下进行；
所述发酵的条件包括：温度为30-37℃，pH为6-7，时间为10-24h。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述丁酸梭菌以种子液的形式接种，所述种子液的制备方法包括：将丁酸梭菌接种到种子培养基中进行扩培，得到种子液。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述种子液中的活菌数为1×108-5×108cfu/mL。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，种子液的接种量为1-10体积％。
8.根据权利要求3所述的方法，其中，所述保护剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、海藻糖、柠檬酸钠、脱脂奶粉和麦芽糊精中的至少一种。
9.根据权利要求3所述的方法，其中，所述固体载体选自麸皮、豆粕和玉米粉中的至少一种。
10.根据权利要求3-9中任意一项所述的方法制备得到的菌剂。
11.权利要求1所述的丁酸梭菌和/或权利要求2或10所述的菌剂在生产丁酸、制备菌剂和饲料中的应用。
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