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CN112979800A - 检测磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体制备方法 - Google Patents

检测磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体制备方法 Download PDF

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CN112979800A
CN112979800A CN202110212920.XA CN202110212920A CN112979800A CN 112979800 A CN112979800 A CN 112979800A CN 202110212920 A CN202110212920 A CN 202110212920A CN 112979800 A CN112979800 A CN 112979800A
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CN
China
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cells
cell
antibody
mouse
hybridoma
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Withdrawn
Application number
CN202110212920.XA
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Inventor
张磊
缪连军
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Anhui Global Gene Technology Co ltd
Original Assignee
Anhui Global Gene Technology Co ltd
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Publication date
Application filed by Anhui Global Gene Technology Co ltd filed Critical Anhui Global Gene Technology Co ltd
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

本发明公开一种检测磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体制备方法，包括如下步骤：第一步、动物免疫及筛选方法的建立，包括动物免疫、细胞筛选条件的优化和效价检验；第二步、杂交瘤细胞株的制备，包括骨髓瘤细胞的准备、饲养细胞的准备、脾细胞的准备、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选和杂交瘤细胞的克隆化培养；第三步、杂交瘤细胞的扩大培养及冻存；第四步、单克隆抗体的批量制备；第五步、单克隆抗体的纯化；第六步、单克隆抗体的鉴定，包括腹水及抗体效价测定、抗体亚类鉴定、抗体配对实验；本发明结合传统杂交瘤技术制备检测磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体，提供了一种简便有效单克隆抗体筛选制备方案，持续稳定向诊断试剂盒提供必要原料。

Description

检测磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体制备方法
技术领域
本发明属于生物科技技术领域，具体涉及检测磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体制备方法。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)占痴呆患者的70％，AD是以进行性加重的智能衰退为临床特征的神经变性疾病，是老年性痴呆发生的最主要原因，也是引起老年人死亡的重要原因之一。AD致病的主要原因是由于大脑中tau蛋白过度磷酸化导致神经元缠结和大脑中β淀粉样蛋白大量沉积构成老年斑，进而导致神经元功能异常。
1975年由美国科学家克勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)发明的杂交瘤抗体技术证明将免疫的小鼠脾淋巴细胞(B细胞)与小鼠骨髓瘤细胞融合在一起，会得杂交瘤细胞，该细胞既具备B细胞能够产生抗体的特性，又具备肿瘤细胞能够无限传代(永生性)的特点。因此通过杂交瘤细胞的不断传代，就会得到所需种类的单克隆抗体。
本研究通过利用杂交瘤抗体技术筛选出检测磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体，为AD患者早期临床诊断提供重要依据。
发明内容
本发明提供检测磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体制备方法。
本发明要解决的技术问题：
当前阿尔茨海默病的诊断过程中存在取样困难，价格昂贵，依赖精密设备等诸多问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
测磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体制备方法，包括如下步骤：
第一步、动物免疫及筛选方法的建立，包括动物免疫、细胞筛选条件的优化和效价检验；
第二步、杂交瘤细胞株的制备，包括骨髓瘤细胞的准备、饲养细胞的准备、脾细胞的准备、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选和杂交瘤细胞的克隆化培养；
第三步、杂交瘤细胞的扩大培养及冻存；
第四步、单克隆抗体的批量制备；
第五步、单克隆抗体的纯化；
第六步、单克隆抗体的鉴定，包括腹水及抗体效价测定、抗体亚类鉴定、抗体配对实验。
进一步地，动物免疫及筛选方法的建立包括如下步骤：
步骤S11、动物免疫：取人工合成偶联载体蛋白的p-tau-181多肽和未磷酸化tau重组蛋白加入等量弗氏完全佐剂混匀，其中p-tau-181多肽和未磷酸化tau重组蛋白用量相等，充分乳化，50μg/只的剂量分别免疫Balb/c小鼠，背部皮下多点注射；第3周进行第二次免疫，取人工合成偶联载体蛋白的p-tau-181多肽和未磷酸化tau重组蛋白加入等量弗氏不完全佐剂混匀，充分乳化，25μg/只免疫Balb/c小鼠，背部皮下多点注射；每次免疫间隔2周，最后一次无佐剂完全抗原腹腔注射加强免疫一次；
步骤S12、细胞筛选条件的优化：采用间接ELISA检测法，以p-tau-181多肽和tau重组蛋白过量包被1.0μg/mL聚苯乙烯反应板，辣根过氧化酶标记的羊抗小鼠IgG作为二抗，梯度稀释酶标二抗，确定酶最佳工作浓度，然后以最佳酶稀释度进行测定；
步骤S13、效价检验：用建立的间接ELISA方法测定免疫小鼠的血清抗体效价；选取效价最高的免疫小鼠，腹腔注射加强免疫一次，三日后摘取小鼠脾脏进行细胞融合。
进一步地，杂交瘤细胞株的制备，包括如下步骤：
步骤S21、骨髓瘤细胞的准备：
于融合前两周复苏骨髓瘤细胞：将冻存管自液氮中取出，立即放到37℃温水中，用DMEM培养液轻轻混悬，混匀后加入细胞培养瓶中，置37℃、含5％CO2培养箱中进行传代培养；培养过程中在培养液中加入8-氮鸟嘌呤，8-氮鸟嘌呤的添加量为2mg/mL，每日处理1次，连续处理3次，传至8瓶，并使融合当日的骨髓瘤细胞处于对数生长期，备用；
步骤S22、饲养细胞的准备：
细胞融合当日准备饲养细胞：取一只12-16周龄健康Balb/c小鼠，摘眼球取血，制备阴性血清；断颈处死，用体积分数75％的酒精消毒处理；将小鼠置于超净工作台中，腹面向上，用镊子提起小鼠腹部皮肤，在下腹部剪一小口，纵向剥离，充分暴露腹膜，并用酒精消毒；用一次性灭菌注射器抽取5mL的HAT培养液注入小鼠腹腔内，右手注射器保持不动，轻摇小鼠，随后抽取细胞悬液；将细胞悬液加入60mL的HAT培养基中，混匀后计数，调整细胞浓度至1×105-5×105个/mL；按100μL/孔转入到96孔细胞培养板中，置37℃、含5％CO2培养箱中培养备用；
步骤S23、脾细胞的准备：
选取ELISA检测效价最高的免疫小鼠，腹腔注射追加免疫一次，三日后对该鼠摘眼球取血，制备阳性血清；断颈处死，体积分数75％的酒精腹部消毒，在超净工作台内，无菌摘取脾脏，去除脂肪和结缔组织，置于200目灭菌金属网上，用灭菌玻璃注射器芯轻轻研磨脾脏，同时缓慢滴加无血清DMEM培养液；收集脾细胞悬液，并转移到50mL离心管中，以1000r/min离心5min，弃去上清，重悬于5mL无血清DMEM培养液中，脾细胞计数后备用；
步骤S24、细胞融合：
利用聚乙二醇对免疫小鼠脾细胞和Sp2/0进行融合，选择状态良好且呈对数生长的Sp2/0细胞6-8瓶，将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来并转移到50mL离心管中，以1000r/min离心10min，弃去上清，用5mL无血清DMEM培养液悬浮，普通光学显微镜下用细胞计数板计数；将Sp2/0细胞和免疫脾细胞悬液混匀，脾细胞数与骨髓瘤细胞数的比例应维持在5：1到10：1之间；以1000r/min离心10min，弃去上清；轻轻弹击融合管底，使细胞块松散；用滴管往管中缓慢加入1mL37℃预热的50％聚乙二醇，60S内加完，静置90S；在5min内先慢后快逐滴加入37℃预热的无血清DMEM培养液，共加10mL，轻摇混匀后，以1000r/min离心10min，弃去上清；用HAT培养液重悬细胞，随即移入60mL的HAT培养液中，轻轻混匀，然后按100μL/孔转入96孔细胞培养板中，置37℃、含5％CO2培养箱中培养；
步骤S25、杂交瘤细胞的筛选：
融合后注意观察杂交瘤细胞生长状况，第六日用HAT培养液进行第1次半量换液，第8-10日左右，待细胞长到孔底的1/4-1/3时吸出上清进行间接ELISA检测；以S/N≥2.1作为阳性判断标准，用Sp2/0细胞培养上清及正常小鼠血清作阴性对照，免疫阳性血清作阳性对照；用包被缓冲液将p-tau-181多肽和tau重组蛋白稀释至1μg/mL分别包被酶标板中，每孔100μL，37℃温育2h，洗板3次，加入封闭液37℃温育2h，洗板待用；加入杂交瘤细胞培养上清100μL，用三次免疫后的小鼠血清1：1000稀释做阳性对照，用无血清的DMEM及正常小鼠血清作阴性对照，37℃反应30min洗板3次，加入100μL羊抗鼠酶标二抗，反应30min后洗板3次，加入100μLTMB显色液37℃温育10min，加入50μL终止液，450nm测定吸光度，cutoff值等于2.1×阴性值；
步骤S26、杂交瘤细胞的克隆化培养：
制备饲养细胞；HT培养液中制备饲养细胞层100μL/孔；用移液器将ELISA检测具有特异性反应的阳性杂交瘤细胞轻轻吹打混匀，取样，细胞计数，然后用HT培养液调整细胞数；首次亚克隆时调整细胞数至15-20个/mL，第二、第三次亚克隆时调整细胞数至10个/mL；将杂交瘤细胞悬液接种于含饲养细胞层的96孔细胞培养板中，100μL/孔、置37℃、含5％CO2培养箱中进行培养；每日观察并记录每孔细胞克隆数，待细胞长到孔底的1/4-1/3时半量换液，并对细胞上清进行间接ELISA检测；选择克隆数少、吸光度450nm值高的阳性孔，将其再次克隆；经3-4次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率达100％时，即可确定获得分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株。
进一步地，杂交瘤细胞的扩大培养及冻存，包括如下步骤：
步骤S31、杂交瘤细胞的扩大培养：
单克隆细胞株经过几次克隆后，阳性率达到100％时，将细胞从96孔培养板转入24孔培养板中，再由24孔板转入细胞培养瓶进行扩大培养；
步骤S32、杂交瘤细胞的冻存：
杂交瘤细胞扩大培养后，一部分进行小鼠的腹腔注射，生产腹水；另一部分可进行冻存，即选择状态良好且呈对数生长的细胞，将其从瓶壁上轻轻吹打下来并转移到50mL离心管中，以1000r/min离心10min，弃去上清，用冻存液将细胞悬浮，按1.5mL/管分装于冻存管中，注明细胞名称及冻存日期，液氮中冻存。
进一步地，单克隆抗体的批量制备，包括如下步骤：
采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体，12-16周龄健康Balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5mL，7-10日后每只小鼠腹腔接种1×106-5×106个杂交瘤细胞，经7-10日后可见小鼠腹部明显膨大，无菌操作采集腹水，腹水经以8000r/min，离心10min，弃去上层脂肪层，收集中层腹水，-70℃冻存备用。
进一步地，单克隆抗体的纯化包括如下步骤：
步骤S41、腹水的预处理：将采集的腹水在2-8℃条件下，以8000r/min离心30min，除去细胞残渣以及小颗粒物质；
步骤S42、向1份预处理过的腹水中加入2份0.06mol/L，pH值为5的乙酸缓冲液，用0.1mol/L的HCl溶液调pH值至4.5；
步骤S43、于室温搅拌下在30min内逐滴加入辛酸，按每毫升稀释前的腹水加33μL，在2-8℃静置2h，以8000r/min离心30min，弃沉淀；
步骤S44、上清经砂芯漏斗过滤，加入1/10腹水体积的0.1mol/L，pH值7.4的PBS，用1mol/L的NaOH溶液调pH值至7.4；
步骤S45、在2-8℃冰浴下静置30min，加入0.277g/mL的硫酸铵，硫酸铵的用量为腹水体积的1/5，静置1h以上，以8000r/min离心30min，弃去上清；
步骤S46、沉淀溶于1/3腹水体积的PBS中，2-8℃条件下置于50-100倍体积的上述PBS液中透析12h，在2-8℃条件下，以8000r/min离心30min，除去不溶性沉淀。
进一步地、单克隆抗体的鉴定包括如下步骤：
步骤S51、腹水及抗体效价测定：
对筛选腹水及纯化后抗体用间接ELISA进行测定效价，腹水从1：1×103开始做梯度稀释，以Sp2/0细胞培养上清和阴性小鼠血清作为阴性对照，抗体效价不低于1：1×105；
步骤S52、抗体亚类鉴定：
亚类鉴定采用Sigma公司的免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒进行鉴定，具体步骤按试剂盒的说明书操作；将分泌特异性单克隆抗体的细胞培养上清加入已包被抗原的酶标板中，100μL/孔，37℃作用2h，洗板3次；同型特异试剂IgM、IgA、lgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3，分别用0.01mol/L的PBS，1000倍稀释后，按100μL/孔加样，37℃作用30min，洗板3次；辣根过氧化物酶标记的鼠抗猪IgG，用0.01mol/LPBS2500倍稀释后，按100μL/孔加样，室温下作用15min，洗板3次；加入底物溶液，100μL/孔，37℃作用10-15min；终止液100μL/孔终止反应，观察结果；
步骤S53、抗体配对实验：
对筛选的抗体偶联HRP，利用双抗体夹心ELISA法，将针对磷酸化位点的抗体与针对非磷酸化位点的抗体进行两两配对，选择灵敏度最高抗体对。
本发明的有益效果：
本发明结合传统杂交瘤技术制备检测磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体，从动物免疫方案，细胞融合方案，抗体筛选方案等多方面进行优化改进，提供一种简便有效单克隆抗体筛选制备方案，筛选出分泌磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体对的杂交瘤细胞株作为工程细胞株，持续稳定向诊断试剂盒提供必要原料。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
测磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体制备方法，包括如下步骤：
第一步、动物免疫及筛选方法的建立，包括动物免疫、细胞筛选条件的优化和效价检验；
第二步、杂交瘤细胞株的制备，包括骨髓瘤细胞的准备、饲养细胞的准备、脾细胞的准备、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选和杂交瘤细胞的克隆化培养；
第三步、杂交瘤细胞的扩大培养及冻存；
第四步、单克隆抗体的批量制备；
第五步、单克隆抗体的纯化；
第六步、单克隆抗体的鉴定，包括腹水及抗体效价测定、抗体亚类鉴定、抗体配对实验。
杂交瘤细胞株的制备，包括如下步骤：
步骤S21、骨髓瘤细胞的准备：
于融合前两周复苏骨髓瘤细胞：将冻存管自液氮中取出，立即放到37℃温水中，用DMEM培养液轻轻混悬，混匀后加入细胞培养瓶中，置37℃、含5％CO2培养箱中进行传代培养；培养过程中在培养液中加入8-氮鸟嘌呤，每日处理1次，连续处理3次，传至8瓶，并使融合当日的骨髓瘤细胞处于对数生长期，备用；
步骤S22、饲养细胞的准备：
细胞融合当日准备饲养细胞：取一只12周龄健康Balb/c小鼠，摘眼球取血，制备阴性血清；断颈处死，用体积分数75％的酒精消毒处理；将小鼠置于超净工作台中，腹面向上，用镊子提起小鼠腹部皮肤，在下腹部剪一小口，纵向剥离，充分暴露腹膜，并用酒精消毒；用一次性灭菌注射器抽取5mL的HAT培养液注入小鼠腹腔内，右手注射器保持不动，轻摇小鼠，随后抽取细胞悬液；将细胞悬液加入60mL的HAT培养基中，混匀后计数，调整细胞浓度至1×105个/mL；按100μL/孔转入到96孔细胞培养板中，置37℃、含5％CO2培养箱中培养备用；
步骤S23、脾细胞的准备：
选取ELISA检测效价最高的免疫小鼠，腹腔注射追加免疫一次，三日后对该鼠摘眼球取血，制备阳性血清；断颈处死，体积分数75％的酒精腹部消毒，在超净工作台内，无菌摘取脾脏，去除脂肪和结缔组织，置于200目灭菌金属网上，用灭菌玻璃注射器芯轻轻研磨脾脏，同时缓慢滴加无血清DMEM培养液；收集脾细胞悬液，并转移到50mL离心管中，以1000r/min离心5min，弃去上清，重悬于5mL无血清DMEM培养液中，脾细胞计数后备用；
步骤S24、细胞融合：
利用聚乙二醇对免疫小鼠脾细胞和Sp2/0进行融合，选择状态良好且呈对数生长的Sp2/0细胞6瓶，将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来并转移到50mL离心管中，以1000r/min离心10min，弃去上清，用5mL无血清DMEM培养液悬浮，普通光学显微镜下用细胞计数板计数；将Sp2/0细胞和免疫脾细胞悬液混匀，脾细胞数与骨髓瘤细胞数的比例应维持在5：1到10：1之间；以1000r/min离心10min，弃去上清；轻轻弹击融合管底，使细胞块松散；用滴管往管中缓慢加入1mL37℃预热的50％聚乙二醇，60S内加完，静置90S；在5min内先慢后快逐滴加入37℃预热的无血清DMEM培养液，共加10mL，轻摇混匀后，以1000r/min离心10min，弃去上清；用HAT培养液重悬细胞，随即移入60mL的HAT培养液中，轻轻混匀，然后按100μL/孔转入96孔细胞培养板中，置37℃、含5％CO2培养箱中培养；
步骤S25、杂交瘤细胞的筛选：
融合后注意观察杂交瘤细胞生长状况，第六日用HAT培养液进行第1次半量换液，第8日左右，待细胞长到孔底的1/4时吸出上清进行间接ELISA检测；以S/N≥2.1作为阳性判断标准，用Sp2/0细胞培养上清及正常小鼠血清作阴性对照，免疫阳性血清作阳性对照；用包被缓冲液将p-tau-181多肽和tau重组蛋白稀释至1μg/mL分别包被酶标板中，每孔100μL，37℃温育2h，洗板3次，加入封闭液37℃温育2h，洗板待用；加入杂交瘤细胞培养上清100μL，用三次免疫后的小鼠血清1：1000稀释做阳性对照，用无血清的DMEM及正常小鼠血清作阴性对照，37℃反应30min洗板3次，加入100μL羊抗鼠酶标二抗，反应30min后洗板3次，加入100μLTMB显色液37℃温育10min，加入50μL终止液，450nm测定吸光度，cutoff值等于2.1×阴性值；
步骤S26、杂交瘤细胞的克隆化培养：
制备饲养细胞；HT培养液中制备饲养细胞层100μL/孔；用移液器将ELISA检测具有特异性反应的阳性杂交瘤细胞轻轻吹打混匀，取样，细胞计数，然后用HT培养液调整细胞数；首次亚克隆时调整细胞数至15个/mL，第二、第三次亚克隆时调整细胞数至10个/mL；将杂交瘤细胞悬液接种于含饲养细胞层的96孔细胞培养板中，100μL/孔、置37℃、含5％CO2培养箱中进行培养；每日观察并记录每孔细胞克隆数，待细胞长到孔底的1/4时半量换液，并对细胞上清进行间接ELISA检测；选择克隆数少、吸光度450nm值高的阳性孔，将其再次克隆；经3-4次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率达100％时，即可确定获得分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株。
杂交瘤细胞的扩大培养及冻存，包括如下步骤：
步骤S31、杂交瘤细胞的扩大培养：
单克隆细胞株经过几次克隆后，阳性率达到100％时，将细胞从96孔培养板转入24孔培养板中，再由24孔板转入细胞培养瓶进行扩大培养；
步骤S32、杂交瘤细胞的冻存：
杂交瘤细胞扩大培养后，一部分进行小鼠的腹腔注射，生产腹水；另一部分可进行冻存，即选择状态良好且呈对数生长的细胞，将其从瓶壁上轻轻吹打下来并转移到50mL离心管中，以1000r/min离心10min，弃去上清，用冻存液将细胞悬浮，按1.5mL/管分装于冻存管中，注明细胞名称及冻存日期，液氮中冻存。
单克隆抗体的批量制备，包括如下步骤：
采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体，12周龄健康Balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5mL，7日后每只小鼠腹腔接种1×106个杂交瘤细胞，经7日后可见小鼠腹部明显膨大，无菌操作采集腹水，腹水经以8000r/min，离心10min，弃去上层脂肪层，收集中层腹水，-70℃冻存备用。
单克隆抗体的纯化包括如下步骤：
步骤S41、腹水的预处理：将采集的腹水在2℃条件下，以8000r/min离心30min，除去细胞残渣以及小颗粒物质；
步骤S42、向1份预处理过的腹水中加入2份0.06mol/L，pH值为5的乙酸缓冲液，用0.1mol/L的HCl溶液调pH值至4.5；
步骤S43、于室温搅拌下在30min内逐滴加入辛酸，按每毫升稀释前的腹水加33μL，在2℃静置2h，以8000r/min离心30min，弃沉淀；
步骤S44、上清经砂芯漏斗过滤，加入1/10腹水体积的0.1mol/L，pH值7.4的PBS，用1mol/L的NaOH溶液调pH值至7.4；
步骤S45、在2℃冰浴下静置30min，加入0.277g/mL的硫酸铵，硫酸铵的用量为腹水体积的1/5，静置1h以上，以8000r/min离心30min，弃去上清；
步骤S46、沉淀溶于1/3腹水体积的PBS中，2℃条件下置于50倍体积的上述PBS液中透析12h，在2℃条件下，以8000r/min离心30min，除去不溶性沉淀。
实施例2
杂交瘤细胞株的制备，包括如下步骤：
步骤S21、骨髓瘤细胞的准备：
于融合前两周复苏骨髓瘤细胞：将冻存管自液氮中取出，立即放到37℃温水中，用DMEM培养液轻轻混悬，混匀后加入细胞培养瓶中，置37℃、含5％CO2培养箱中进行传代培养；培养过程中在培养液中加入8-氮鸟嘌呤，每日处理1次，连续处理3次，传至8瓶，并使融合当日的骨髓瘤细胞处于对数生长期，备用；
步骤S22、饲养细胞的准备：
细胞融合当日准备饲养细胞：取一只16周龄健康Balb/c小鼠，摘眼球取血，制备阴性血清；断颈处死，用体积分数75％的酒精消毒处理；将小鼠置于超净工作台中，腹面向上，用镊子提起小鼠腹部皮肤，在下腹部剪一小口，纵向剥离，充分暴露腹膜，并用酒精消毒；用一次性灭菌注射器抽取5mL的HAT培养液注入小鼠腹腔内，右手注射器保持不动，轻摇小鼠，随后抽取细胞悬液；将细胞悬液加入60mL的HAT培养基中，混匀后计数，调整细胞浓度至5×105个/mL；按100μL/孔转入到96孔细胞培养板中，置37℃、含5％CO2培养箱中培养备用；
步骤S23、脾细胞的准备：
选取ELISA检测效价最高的免疫小鼠，腹腔注射追加免疫一次，三日后对该鼠摘眼球取血，制备阳性血清；断颈处死，体积分数75％的酒精腹部消毒，在超净工作台内，无菌摘取脾脏，去除脂肪和结缔组织，置于200目灭菌金属网上，用灭菌玻璃注射器芯轻轻研磨脾脏，同时缓慢滴加无血清DMEM培养液；收集脾细胞悬液，并转移到50mL离心管中，以1000r/min离心5min，弃去上清，重悬于5mL无血清DMEM培养液中，脾细胞计数后备用；
步骤S24、细胞融合：
利用聚乙二醇对免疫小鼠脾细胞和Sp2/0进行融合，选择状态良好且呈对数生长的Sp2/0细胞8瓶，将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来并转移到50mL离心管中，以1000r/min离心10min，弃去上清，用5mL无血清DMEM培养液悬浮，普通光学显微镜下用细胞计数板计数；将Sp2/0细胞和免疫脾细胞悬液混匀，脾细胞数与骨髓瘤细胞数的比例应维持在5：1到10：1之间；以1000r/min离心10min，弃去上清；轻轻弹击融合管底，使细胞块松散；用滴管往管中缓慢加入1mL37℃预热的50％聚乙二醇，60S内加完，静置90S；在5min内先慢后快逐滴加入37℃预热的无血清DMEM培养液，共加10mL，轻摇混匀后，以1000r/min离心10min，弃去上清；用HAT培养液重悬细胞，随即移入60mL的HAT培养液中，轻轻混匀，然后按100μL/孔转入96孔细胞培养板中，置37℃、含5％CO2培养箱中培养；
步骤S25、杂交瘤细胞的筛选：
融合后注意观察杂交瘤细胞生长状况，第六日用HAT培养液进行第1次半量换液，第10日左右，待细胞长到孔底的1/3时吸出上清进行间接ELISA检测；以S/N≥2.1作为阳性判断标准，用Sp2/0细胞培养上清及正常小鼠血清作阴性对照，免疫阳性血清作阳性对照；用包被缓冲液将p-tau-181多肽和tau重组蛋白稀释至1μg/mL分别包被酶标板中，每孔100μL，37℃温育2h，洗板3次，加入封闭液37℃温育2h，洗板待用；加入杂交瘤细胞培养上清100μL，用三次免疫后的小鼠血清1：1000稀释做阳性对照，用无血清的DMEM及正常小鼠血清作阴性对照，37℃反应30min洗板3次，加入100μL羊抗鼠酶标二抗，反应30min后洗板3次，加入100μLTMB显色液37℃温育10min，加入50μL终止液，450nm测定吸光度，cutoff值等于2.1×阴性值；
步骤S26、杂交瘤细胞的克隆化培养：
制备饲养细胞；HT培养液中制备饲养细胞层100μL/孔；用移液器将ELISA检测具有特异性反应的阳性杂交瘤细胞轻轻吹打混匀，取样，细胞计数，然后用HT培养液调整细胞数；首次亚克隆时调整细胞数至15-20个/mL，第二、第三次亚克隆时调整细胞数至10个/mL；将杂交瘤细胞悬液接种于含饲养细胞层的96孔细胞培养板中，100μL/孔、置37℃、含5％CO2培养箱中进行培养；每日观察并记录每孔细胞克隆数，待细胞长到孔底的1/3时半量换液，并对细胞上清进行间接ELISA检测；选择克隆数少、吸光度450nm值高的阳性孔，将其再次克隆；经4次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率达100％时，即可确定获得分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株。
杂交瘤细胞的扩大培养及冻存，包括如下步骤：
步骤S31、杂交瘤细胞的扩大培养：
单克隆细胞株经过几次克隆后，阳性率达到100％时，将细胞从96孔培养板转入24孔培养板中，再由24孔板转入细胞培养瓶进行扩大培养；
步骤S32、杂交瘤细胞的冻存：
杂交瘤细胞扩大培养后，一部分进行小鼠的腹腔注射，生产腹水；另一部分可进行冻存，即选择状态良好且呈对数生长的细胞，将其从瓶壁上轻轻吹打下来并转移到50mL离心管中，以1000r/min离心10min，弃去上清，用冻存液将细胞悬浮，按1.5mL/管分装于冻存管中，注明细胞名称及冻存日期，液氮中冻存。
单克隆抗体的批量制备，包括如下步骤：
采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体，16周龄健康Balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5mL，10日后每只小鼠腹腔接种1×106-5×106个杂交瘤细胞，经10日后可见小鼠腹部明显膨大，无菌操作采集腹水，腹水经以8000r/min，离心10min，弃去上层脂肪层，收集中层腹水，-70℃冻存备用。
单克隆抗体的纯化包括如下步骤：
步骤S41、腹水的预处理：将采集的腹水在8℃条件下，以8000r/min离心30min，除去细胞残渣以及小颗粒物质；
步骤S42、向1份预处理过的腹水中加入2份0.06mol/L，pH值为5的乙酸缓冲液，用0.1mol/L的HCl溶液调pH值至4.5；
步骤S43、于室温搅拌下在30min内逐滴加入辛酸，按每毫升稀释前的腹水加33μL，在8℃静置2h，以8000r/min离心30min，弃沉淀；
步骤S44、上清经砂芯漏斗过滤，加入1/10腹水体积的0.1mol/L，pH值7.4的PBS，用1mol/L的NaOH溶液调pH值至7.4；
步骤S45、在8℃冰浴下静置30min，加入0.277g/mL的硫酸铵，硫酸铵的用量为腹水体积的1/5，静置1h以上，以8000r/min离心30min，弃去上清；
步骤S46、沉淀溶于1/3腹水体积的PBS中，8℃条件下置于100倍体积的上述PBS液中透析12h，在8℃条件下，以8000r/min离心30min，除去不溶性沉淀。
实施例3
单克隆抗体的鉴定包括如下步骤：
步骤S51、腹水及抗体效价测定：
对筛选腹水及纯化后抗体用间接ELISA进行测定效价，腹水从1：1×103开始做梯度稀释，以Sp2/0细胞培养上清和阴性小鼠血清作为阴性对照，抗体效价不低于1：1×105；
步骤S52、抗体亚类鉴定：
亚类鉴定采用Sigma公司的免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒进行鉴定，具体步骤按试剂盒的说明书操作；将分泌特异性单克隆抗体的细胞培养上清加入已包被抗原的酶标板中，100μL/孔，37℃作用2h，洗板3次；同型特异试剂IgM、IgA、lgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3，分别用0.01mol/L的PBS，1000倍稀释后，按100μL/孔加样，37℃作用30min，洗板3次；辣根过氧化物酶标记的鼠抗猪IgG，用0.01mol/LPBS2500倍稀释后，按100μL/孔加样，室温下作用15min，洗板3次；加入底物溶液，100μL/孔，37℃作用10-15min；终止液100μL/孔终止反应，观察结果；
步骤S53、抗体配对实验：
对筛选的抗体偶联HRP，利用双抗体夹心ELISA法，将针对磷酸化位点的抗体与针对非磷酸化位点的抗体进行两两配对，选择灵敏度最高抗体对。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.检测磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
第一步、动物免疫及筛选方法的建立，包括动物免疫、细胞筛选条件的优化和效价检验；
第二步、杂交瘤细胞株的制备，包括骨髓瘤细胞的准备、饲养细胞的准备、脾细胞的准备、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选和杂交瘤细胞的克隆化培养；
第三步、杂交瘤细胞的扩大培养及冻存；
第四步、单克隆抗体的批量制备；
第五步、单克隆抗体的纯化；
第六步、单克隆抗体的鉴定，包括腹水及抗体效价测定、抗体亚类鉴定、抗体配对实验。
2.根据权利要求1所述的检测磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体制备方法，其特征在于，动物免疫及筛选方法的建立包括如下步骤：
步骤S11、动物免疫：取人工合成偶联载体蛋白的p-tau-181多肽和未磷酸化tau重组蛋白加入等量弗氏完全佐剂混匀，充分乳化，50μg/只的剂量分别免疫Balb/c小鼠，背部皮下多点注射；第3周进行第二次免疫，取人工合成偶联载体蛋白的p-tau-181多肽和未磷酸化tau重组蛋白加入等量弗氏不完全佐剂混匀，充分乳化，25μg/只免疫Balb/c小鼠，背部皮下多点注射；每次免疫间隔2周，最后一次无佐剂完全抗原腹腔注射加强免疫一次；
步骤S12、细胞筛选条件的优化：采用间接ELISA检测法，以p-tau-181多肽和tau重组蛋白过量包被1.0μg/mL聚苯乙烯反应板，辣根过氧化酶标记的羊抗小鼠IgG作为二抗，梯度稀释酶标二抗，确定酶最佳工作浓度，然后以最佳酶稀释度进行测定；
步骤S13、效价检验：用建立的间接ELISA方法测定免疫小鼠的血清抗体效价；选取效价最高的免疫小鼠，腹腔注射加强免疫一次，三日后摘取小鼠脾脏进行细胞融合。
3.根据权利要求1所述的检测磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体制备方法，其特征在于，杂交瘤细胞株的制备，包括如下步骤：
步骤S21、骨髓瘤细胞的准备：
于融合前两周复苏骨髓瘤细胞：将冻存管自液氮中取出，立即放到37℃温水中，用DMEM培养液轻轻混悬，混匀后加入细胞培养瓶中，置37℃、含5％CO2培养箱中进行传代培养；培养过程中在培养液中加入8-氮鸟嘌呤，每日处理1次，连续处理3次，传至8瓶，并使融合当日的骨髓瘤细胞处于对数生长期，备用；
步骤S22、饲养细胞的准备：
细胞融合当日准备饲养细胞：取一只12-16周龄健康Balb/c小鼠，摘眼球取血，制备阴性血清；断颈处死，用体积分数75％的酒精消毒处理；将小鼠置于超净工作台中，腹面向上，用镊子提起小鼠腹部皮肤，在下腹部剪一小口，纵向剥离，充分暴露腹膜，并用酒精消毒；用一次性灭菌注射器抽取5mL的HAT培养液注入小鼠腹腔内，右手注射器保持不动，轻摇小鼠，随后抽取细胞悬液；将细胞悬液加入60mL的HAT培养基中，混匀后计数，调整细胞浓度至1×105-5×105个/mL；按100μL/孔转入到96孔细胞培养板中，置37℃、含5％CO2培养箱中培养备用；
步骤S23、脾细胞的准备：
选取ELISA检测效价最高的免疫小鼠，腹腔注射追加免疫一次，三日后对该鼠摘眼球取血，制备阳性血清；断颈处死，体积分数75％的酒精腹部消毒，在超净工作台内，无菌摘取脾脏，去除脂肪和结缔组织，置于200目灭菌金属网上，用灭菌玻璃注射器芯轻轻研磨脾脏，同时缓慢滴加无血清DMEM培养液；收集脾细胞悬液，并转移到50mL离心管中，以1000r/min离心5min，弃去上清，重悬于5mL无血清DMEM培养液中，脾细胞计数后备用；
步骤S24、细胞融合：
利用聚乙二醇对免疫小鼠脾细胞和Sp2/0进行融合，选择状态良好且呈对数生长的Sp2/0细胞6-8瓶，将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来并转移到50mL离心管中，以1000r/min离心10min，弃去上清，用5mL无血清DMEM培养液悬浮，普通光学显微镜下用细胞计数板计数；将Sp2/0细胞和免疫脾细胞悬液混匀，脾细胞数与骨髓瘤细胞数的比例应维持在5：1到10：1之间；以1000r/min离心10min，弃去上清；轻轻弹击融合管底，使细胞块松散；用滴管往管中缓慢加入1mL37℃预热的50％聚乙二醇，60S内加完，静置90S；在5min内先慢后快逐滴加入37℃预热的无血清DMEM培养液，共加10mL，轻摇混匀后，以1000r/min离心10min，弃去上清；用HAT培养液重悬细胞，随即移入60mL的HAT培养液中，轻轻混匀，然后按100μL/孔转入96孔细胞培养板中，置37℃、含5％CO2培养箱中培养；
步骤S25、杂交瘤细胞的筛选：
融合后注意观察杂交瘤细胞生长状况，第六日用HAT培养液进行第1次半量换液，第8-10日左右，待细胞长到孔底的1/4-1/3时吸出上清进行间接ELISA检测；以S/N≥2.1作为阳性判断标准，用Sp2/0细胞培养上清及正常小鼠血清作阴性对照，免疫阳性血清作阳性对照；用包被缓冲液将p-tau-181多肽和tau重组蛋白稀释至1μg/mL分别包被酶标板中，每孔100μL，37℃温育2h，洗板3次，加入封闭液37℃温育2h，洗板待用；加入杂交瘤细胞培养上清100μL，用三次免疫后的小鼠血清1：1000稀释做阳性对照，用无血清的DMEM及正常小鼠血清作阴性对照，37℃反应30min洗板3次，加入100μL羊抗鼠酶标二抗，反应30min后洗板3次，加入100μLTMB显色液37℃温育10min，加入50μL终止液，450nm测定吸光度，cutoff值等于2.1×阴性值；
步骤S26、杂交瘤细胞的克隆化培养：
制备饲养细胞；HT培养液中制备饲养细胞层100μL/孔；用移液器将ELISA检测具有特异性反应的阳性杂交瘤细胞轻轻吹打混匀，取样，细胞计数，然后用HT培养液调整细胞数；首次亚克隆时调整细胞数至15-20个/mL，第二、第三次亚克隆时调整细胞数至10个/mL；将杂交瘤细胞悬液接种于含饲养细胞层的96孔细胞培养板中，100μL/孔、置37℃、含5％CO2培养箱中进行培养；每日观察并记录每孔细胞克隆数，待细胞长到孔底的1/4-1/3时半量换液，并对细胞上清进行间接ELISA检测；选择克隆数少、吸光度450nm值高的阳性孔，将其再次克隆；经3-4次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率达100％时，即可确定获得分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株。
4.根据权利要求1所述的检测磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体制备方法，其特征在于，杂交瘤细胞的扩大培养及冻存，包括如下步骤：
步骤S31、杂交瘤细胞的扩大培养：
单克隆细胞株经过几次克隆后，阳性率达到100％时，将细胞从96孔培养板转入24孔培养板中，再由24孔板转入细胞培养瓶进行扩大培养；
步骤S32、杂交瘤细胞的冻存：
杂交瘤细胞扩大培养后，一部分进行小鼠的腹腔注射，生产腹水；另一部分可进行冻存，即选择状态良好且呈对数生长的细胞，将其从瓶壁上轻轻吹打下来并转移到50mL离心管中，以1000r/min离心10min，弃去上清，用冻存液将细胞悬浮，按1.5mL/管分装于冻存管中，注明细胞名称及冻存日期，液氮中冻存。
5.根据权利要求1所述的检测磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体制备方法，其特征在于，单克隆抗体的批量制备，包括如下步骤：
采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体，12-16周龄健康Balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5mL，7-10日后每只小鼠腹腔接种1×106-5×106个杂交瘤细胞，经7-10日后可见小鼠腹部明显膨大，无菌操作采集腹水，腹水经以8000r/min，离心10min，弃去上层脂肪层，收集中层腹水，-70℃冻存备用。
6.根据权利要求1所述的检测磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体制备方法，其特征在于，单克隆抗体的纯化包括如下步骤：
步骤S41、腹水的预处理：将采集的腹水在2-8℃条件下，以8000r/min离心30min，除去细胞残渣以及小颗粒物质；
步骤S42、向1份预处理过的腹水中加入2份0.06mol/L，pH值为5的乙酸缓冲液，用0.1mol/L的HCl溶液调pH值至4.5；
步骤S43、于室温搅拌下在30min内逐滴加入辛酸，按每毫升稀释前的腹水加33μL，在2-8℃静置2h，以8000r/min离心30min，弃沉淀；
步骤S44、上清经砂芯漏斗过滤，加入1/10腹水体积的0.1mol/L，pH值7.4的PBS，用1mol/L的NaOH溶液调pH值至7.4；
步骤S45、在2-8℃冰浴下静置30min，加入0.277g/mL的硫酸铵，硫酸铵的用量为腹水体积的1/5，静置1h以上，以8000r/min离心30min，弃去上清；
步骤S46、沉淀溶于1/3腹水体积的PBS中，2-8℃条件下置于50-100倍体积的上述PBS液中透析12h，在2-8℃条件下，以8000r/min离心30min，除去不溶性沉淀。
7.根据权利要求1所述的检测磷酸化tau蛋白配对单克隆抗体制备方法，其特征在于，单克隆抗体的鉴定包括如下步骤：
步骤S51、腹水及抗体效价测定：
对筛选腹水及纯化后抗体用间接ELISA进行测定效价，腹水从1：1×103开始做梯度稀释，以Sp2/0细胞培养上清和阴性小鼠血清作为阴性对照，抗体效价不低于1：1×105；
步骤S52、抗体亚类鉴定：
将分泌特异性单克隆抗体的细胞培养上清加入已包被抗原的酶标板中，100μL/孔，37℃作用2h，洗板3次；同型特异试剂IgM、IgA、lgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3，分别用0.01mol/L的PBS，1000倍稀释后，按100μL/孔加样，37℃作用30min，洗板3次；辣根过氧化物酶标记的鼠抗猪IgG，用0.01mol/LPBS2500倍稀释后，按100μL/孔加样，室温下作用15min，洗板3次；加入底物溶液，100μL/孔，37℃作用10-15min；终止液100μL/孔终止反应，观察结果；
步骤S53、抗体配对实验：
对筛选的抗体偶联HRP，利用双抗体夹心ELISA法，将针对磷酸化位点的抗体与针对非磷酸化位点的抗体进行两两配对，选择灵敏度最高抗体对。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114002435A (zh) * 2021-10-13 2022-02-01 华中科技大学 三种用于检测人磷酸化Tau蛋白的试剂盒及其制备方法
CN117866087A (zh) * 2024-03-11 2024-04-12 江西赛基生物技术有限公司 一种抗pTau181单克隆抗体及其应用
CN117946264A (zh) * 2024-03-21 2024-04-30 江西赛基生物技术有限公司 一种抗Tau蛋白单克隆抗体及其应用

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