CN112930753A

CN112930753A - 一种交链孢菌引起的防风根腐病或叶斑病的防治方法

Info

Publication number: CN112930753A
Application number: CN202110275750.XA
Authority: CN
Inventors: 李永刚; 宁海龙; 朱俊超
Original assignee: Shuangya Shandong Hao Agricultural Science And Technology Co ltd
Current assignee: Shuangya Shandong Hao Agricultural Science And Technology Co ltd
Priority date: 2021-03-15
Filing date: 2021-03-15
Publication date: 2021-06-11
Also published as: ZA202200320B

Abstract

本发明公开了一种交链孢菌引起的防风根腐病或叶斑病的防治方法。属于植物病害防治技术领域。本发明使用咪鲜胺、丙环·嘧菌酯或氟硅唑进行浸种处理3～6h。与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：本发明在对引起防风根腐病或叶斑病的病原菌交链孢菌进行分离鉴定的基础上，发现种子带菌是主要侵染源，通过浸种处理可有效控制该病害的发生。

Description

一种交链孢菌引起的防风根腐病或叶斑病的防治方法

技术领域

本发明涉及植物病害防治技术领域，更具体的说是涉及一种交链孢菌引起的防风根腐病或叶斑病的防治方法。

背景技术

防风根腐病和叶斑病的发生与危害逐年加重，已经成为制约防风产量和品质的一个最重要的因素。生产上，由于缺乏基础研究，通常只通过化学防治途径于发病初期用药控制该病害；但目前国内报道的病原菌种类较少，多没有经过严格的鉴定，人们往往在不确定病原的情况下，盲目用药，导致该病害得不到有效控制，成为防风生产上的难题。

综上，如何针对特定病原菌提供一种防风种传真菌病害的防治方法成为本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种交链孢菌引起的防风根腐病或叶斑病的防治方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种交链孢菌引起的防风根腐病或叶斑病的防治方法，使用咪鲜胺、丙环·嘧菌酯或氟硅唑进行浸种处理3～9h。

优选的，咪鲜胺的浓度为0.9g/L；

丙环·嘧菌酯的质量浓度为0.374‰；

氟硅唑的浓度为0.8g/L。

优选的，浸种处理时间为6h。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：本发明在对引起防风根腐病或叶斑病的病原菌交链孢菌进行分离鉴定的基础上，发现种子带菌是主要侵染源，通过浸种处理可有效控制该病害的发生。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明实施例1中防风种子携带真菌分离物接种防风幼苗根部、成株叶部和茎部发病病症图，其中a为防风幼苗根腐病；b为防风叶部病斑；c为防风茎斑；红色箭头指向是发病部位。

图2附图为本发明实施例1中防风种传真菌交链格孢的形态图，其中a为菌落正面特征图；b为菌落反面特征图；c为分生孢子图。

图3附图为本发明实施例1中凝胶电泳检测图。

图4附图为本发明实施例1中基于内部转录间隔区(ITS)基因构建的防风种传真菌交链格孢的系统发育树。

图5附图为本发明实施例2中防风种传真菌寄主范围的测定结果图，a为大豆结果；b为黄瓜结果；c为水稻结果；d为高粱结果；e为红小豆结果；f为小麦结果；g为黑芸豆结果；h为绿豆结果；i为玉米结果；j为黑豆结果；k为燕麦结果；l为红芸豆结果；红色方框内是接种的植株，外面是对照，红色箭头指向是发病部位。

图6附图为本发明实施例3中种子带菌部位检测结果图，其中a为完整种子结果；b为剪开种子结果。

图7附图为本发明实施例3中20份采集地点防风种子形态图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

高品质的防风种子主要来自内蒙古自治区呼伦贝尔地区的野生种,故本发明实施例中所用防风种子来源于内蒙古自治区呼伦贝尔地区。

本发明实施例所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道，例如：

唑醚·代森联：60％唑醚·代森联水分散粒剂，巴斯夫欧洲公司；

咯菌腈：25克/升咯菌腈悬浮种衣剂，先正达南通作物保护有限公司；

唑醚·氟酰胺：42.4％唑醚·氟酰胺悬浮剂，巴斯夫欧洲公司；

枯草·地衣芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、哈次木霉菌、淡紫紫孢菌≥10.0亿/克，西班牙佳斯迈皇家科学有限公司；

枯草芽孢杆菌：1000亿芽孢/克，可湿性粉剂，武汉科诺生物科技股份有限公司；

吡唑·醚菌酯：250克/升吡唑·醚菌酯乳油，巴斯夫欧洲公司；

烯酰·吡唑酯：18.7％烯酰·吡唑酯水分散粒剂，巴斯夫欧洲公司；

咪鲜胺：450克/升咪鲜胺水乳剂，上海沪联生物药业股份有限公司；

丙环唑：250克/升丙环唑乳油，瑞士先正达作物保护有限公司；

肟菌·戊唑醇：75％肟菌·戊唑醇水分散粒剂，拜耳股份公司；

苯甲·嘧菌酯：325克/升苯甲·嘧菌酯悬浮剂，先正达南通作物保护有限公司。

丙环·嘧菌酯：18.7％丙环·嘧菌酯悬浮剂，瑞士先正达作物保护有限公司；

嘧霉胺：400克/升嘧霉胺悬浮剂，拜耳股份公司；

氟硅唑：400克/升氟硅唑乳油，山东野田生物科技有限公司；

氟菌唑：30％氟菌唑可湿性粉剂，日本曹达株式会社

实施例中未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。

实施例1病原菌分离及致病力测定

采用常规组织分离法对防风种子进行分离纯化。取完整防风种子，于质量浓度70％酒精消毒2s，放入质量浓度1％次氯酸钠溶液中处理5min后，经无菌水换洗3次，将消毒处理后的病组织和完整的种子置于PDA平板上(PDA培养基的配制：马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂15～20g；蒸馏水1000mL；pH7.0～7.2)，25℃培养5d，培养基上组织周围单一菌落上菌丝边缘挑取少许菌丝，纯化后保存于试管中用于致病力测定形态学及分子生物学鉴定。

本试验随机选择了30粒防风种子共获得真菌分离物28株，形态学基本一致，采用灌根法接种出苗后10d幼苗，采用离体法滴接叶片和茎部，接种浓度为10⁶孢子/mL，接种等量无菌水为空白对照，每处理10株(个)，然后置于光照培养箱中(相对湿度>95％；night/day：12h/12h)25℃培养5d后调查发病情况。

本试验随机选择了30粒防风种子共获得真菌分离物28株，形态学基本一致，采用灌根法和离体接种幼苗、茎和叶片，结果如图1所示，该菌株能够引起幼苗根腐(图1a)、叶斑(图1b)和茎枯(图1c)，依照柯赫氏法则，重新分离并鉴定，与种子上分离株形态学一致，确定该菌株为种传真菌病原物，可以引起防风幼苗根腐、茎枯和叶斑病的病原物。

(1)形态学鉴定

将分离得到的菌株接种在事先准备的PDA培养基上，培养过程观察并记录菌落的颜色、形状、表面特征、生长速度和边缘生长状况。在光学显微镜下观察产孢结构和分生孢子形态特征，并对分生孢子形状、大小、横/纵隔膜数、喙的有无及长短进行记录。

结果如图2所示。图2结果表明，种子携带的真菌病原菌从形态上完全一致(图2a)。菌株在PDA培养基上25℃条件下培养的生长性状如图2所示，菌落前面有繁茂、灰色至黑色、绒状或带粉状菌丝，菌落背面有黑色或墨绿色的色素沉积。在显微镜下可看到分生孢子为淡褐色，倒棒状，顶端延长成喙状，有暗褐色、壁砖状分隔。分生孢子梗单生或簇生，一般情况下不分支且较短。

(2)分子鉴定

为了保证菌种鉴定的准确性，将在形态学初步鉴定完成的菌株中挑选一株代表性菌株培养5～6d，刮取菌落上层的菌丝，采用康为世纪DNA试剂盒进行DNA提取。将提取的DNA用真菌通用引物(ITS1/ITS4)进行扩增，引物为：

ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；SEQ.ID.NO.1；

ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；SEQ.ID.NO.2。

扩增体系(50μL)如表1所示。

表1扩增体系

PCR反应程序如表2所示。

表2反应程序

反应程序	反应温度	反应时间
			Step1	94℃	5min
Step2	94℃	1min
			Step3	58℃	1min
Step4	72℃	1.5min
			Gotostep2	36cycles
Step5	72℃	10min
			Step6	4℃	暂停

结果检测：反应完成后取5μL扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳检测条带符合要求，结果清晰(图3)，送上海生工对扩增产物进行测序，收到测序结果后用BLAST软件拼接，在NCBI数据库中进行同源性比较，然后利用MEGA 6.06软件构建病原菌的系统发育树。

代表性菌株与交链格孢(Alternaria alternata)(登录号为MN548784.1)相似性高达100％，这些菌株与交链格孢(A.alternata)亲缘关系最为接近，属于同一进化枝，同为交链格孢(见图4)。

通过形态学鉴定、分子生物学鉴定及系统发育树分析，结果表明，从防风种子上分离到的病原真菌为交链格孢(A.alternata)。

实施例2防风种传真菌致病力及寄主范围的测定

将玉米、红芸豆、黑小豆、红小豆、大豆、高粱、小麦、水稻、黄瓜、绿豆表面用质量浓度3％的次氯酸钠处理5min后，用无菌水换洗3次播种到带有灭菌的蛭石培养钵中，在温室中25±3℃培养至株高10cm左右，将植株带根取出用无菌水清洗干净，摆在无菌的瓷盘中，每处理6株，然后将实施例1分离得到的防风种传真菌在PDA平板扩繁后打成菌蝶(d＝0.5cm)，贴在根茎部，6株用无菌的菌蝶同样处理作对照，根部用饱和无菌脱脂棉保温，瓷盘用保鲜膜密封保湿25℃黑暗培养6d后，调查发病情况。

结果如图5所示，从图5可以看出，该菌株能够侵染黄瓜、高粱、绿豆和玉米幼苗的根部，不能侵染大豆、水稻、红小豆、小麦、黑芸豆、黑豆、燕麦和红芸豆。

实施例3种子带菌率及带菌部位检测

(1)带菌率及带菌部位检测

将种子表面经质量浓度70％酒精处理2s后，放入质量浓度0.1％升汞中处理3min后，无菌水换洗3次，每处理30粒(10粒/皿)，3次重复，90粒用灭菌剪刀从中间剪开后，放在PDA平板上，90粒完整的种子放在PDA平板上，25℃培养5d，观察有无真菌菌落出现，试验重复一次，计算带菌率。

带菌率(％)＝带菌的种子/测定的种子总数×100％。

结果见表3和图6。从表3可以看出，将完整种子和剪开的种子无菌处理后培养，其带菌率均为90％以上，不存在显著差异，说明种子带菌部位为颍壳的浅层，也表明种子带菌率较高，接近100％。

表3种子带菌率及带菌部位检测

(2)不同地点采集种子带菌率检测

对内蒙古呼伦贝尔地区的20个不同地理来源(每份种子采集地相距5km以上)品种进行带菌率检测，每个品种测定90粒种子，每30粒1个重复，将种子表面经质量浓度70％酒精处理2s后，放入质量浓度0.1％升汞中处理3min后，无菌水换洗3次，每处理30粒(10粒/皿)，放在PDA平板上，25℃培养5d，观察有无真菌菌落出现，统计该品种的种子带菌率，试验重复1次。计算带菌率方法同上。

结果见表4。从表4可以看出，不同采集地点种子带菌均可以分离到真菌菌株，但存在显著差异，整体上看，防风种子带菌率较高，70％的地点种子带菌率达到100％；不同采收时期，种子的重量和色泽差异都比较大(图7)。

表4 20份不同采集地的种子特性及带菌率检测

采集地点	种子百粒重(g)	带菌率(％)	采收时期	色泽
					1	0.73±0.01a	100.00±0.00a	中期	青褐色
2	0.60±0.00c	100.00±0.00a	中期	青褐色
					3	0.50±0.00d	100.00±0.00a	超晚期	黑褐色
4	0.67±0.01b	100.00±0.00a	晚期	褐色
					5	0.53±0.00d	100.00±0.00a	晚期	褐色
6	0.60±0.01cd	100.00±0.00a	中期	青褐色
					7	0.57±0.00cd	100.00±0.00a	晚期	褐色
8	0.60±0.00bc	100.00±0.00a	晚期	褐色
					9	0.50±0.00d	100.00±0.00a	晚期	褐色
10	0.57±0.01cd	96.67±3.33a	超晚期	黑褐色
					11	0.57±0.00cd	16.67±3.33d	早期	浅绿(偏白)
12	0.57±0.00cd	23.33±6.67c	早期	浅绿(偏白)
					13	0.57±0.01cd	100.00±0.00a	超晚期	黑褐色
14	0.70±0.01a	96.67±3.33a	晚期	褐色
					15	0.50±0.00d	76.67±3.33b	早期	浅绿
16	0.60±0.00cd	13.33±3.33d	早期	浅绿
					17	0.53±0.01d	100.00±0.00a	超晚	黑褐色
18	0.67±0.00bc	100.00±0.00a	中期	青褐色
					19	0.60±0.00cd	100.00±0.00a	晚期	褐色
20	0.50±0.00d	100.00±0.00a	晚期	褐色

实施例4种子带菌的防治

(1)化学药剂筛选

不同供试药剂分别稀释成药：水＝1：500用于浸种处理，并以无菌水作为对照；将防风种子浸入其中，保持6h，取出后晾开，每处理30粒，3次重复，带菌率检测采用培养法，将浸种处理后的种子表面消毒后，放在PDA平板上培养，每处理10粒种子，3次重复，计算带菌的种子数。

带菌率(％)＝带菌的种子/测定的种子总数×100％；

防效(％)＝(对照样品带菌率─药剂处理样品带菌率)/对照样品带菌率×100％。

结果见表5。从表5可以看出，15种化学药剂浸种后对种子的抑菌率存在较大差异，因此防效也存在显著差别，其中咪鲜胺防效最好达92.6％，其次，氟硅唑和丙环·嘧菌酯防效为70％以上，其于的药剂防效均不理想。

表5 15种杀菌剂对防风种传真菌的防治效果

杀菌剂	有效成分总含量	带菌率(％)	防效(％)
				CK		100.0±0.0a
唑醚·代森联	60％	96.7±3.3a	4.0
				适乐时	25克/升	86.7±6.7ab	16.0
唑醚·氟酰胺	42.4％	96.7±3.3a	4.0
				枯草·地衣芽孢	≥10.0亿/克	96.7±3.3a	3.3
枯草·芽孢	1000亿芽孢/克	96.7±3.3a	4.0
				吡唑·醚菌酯	250克/升	100.0±0.0a	2.6
烯酰·吡唑酯	18.7％	90.0±5.8ab	3.6
				咪鲜胺	450克/升	16.3±4.8de	92.6
丙环唑	250克/升	53.3±7.7c	41.5
				肟菌·戊唑醇	75％	80.0±3.9b	13.5
苯甲·嘧菌酯	325克/升	68.9±5.9b	31.7
				丙环·嘧菌酯	18.7％	26.7±3.8d	70.7
施佳乐	400克/升	73.3±6.7b	19.5
				氟硅唑	400克/升	8.9±4.4e	88.9
氟菌唑	30％	66.7±6.7bc	26.8

(2)化学药剂处理时间对种子带菌率的影响

通过上述筛选试验，选择对种子带菌防效具有70％以上的化学药剂进行不同时间处理对种子带菌的影响，以获得最佳的处理时间，

将防风种子在丙环·嘧菌酯、氟硅唑和咪鲜胺3种化学药剂的500倍液中浸泡不同时间(3、6、9h)后，进行带菌率调查。每处理30粒，3次重复，带菌率检测采用培养法，将处理后的种子表面消毒后，放在PDA培养基上培养，计算带菌的种子数。

结果见表6。从表6可以看出，优选的2种化学药剂氟硅唑和咪鲜胺浸种处理6h与处理9h对种子带菌的防效差异不显著，丙环·嘧菌酯浸种9h显著优于6h，所有处理6h浸种防效均在70％以上。

表63种化学杀菌剂不同处理时间对防风种子带菌的防效

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种交链孢菌引起的防风根腐病或叶斑病的防治方法，其特征在于，使用咪鲜胺、丙环·嘧菌酯或氟硅唑进行浸种处理3～9h。

2.如权利要求1所述的一种交链孢菌引起的防风根腐病或叶斑病的防治方法，其特征在于，咪鲜胺的浓度为0.9g/L；

丙环·嘧菌酯的质量浓度为0.374‰；

氟硅唑的浓度为0.8g/L。

3.如权利要求2所述的一种交链孢菌引起的防风根腐病或叶斑病的防治方法，其特征在于，浸种处理时间为6h。