CN112930171A - 治疗肾脏障碍的方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了一种治疗或预防患有阿尔波特综合征的受试者的肾病的方法，以及治疗或预防慢性肾脏疾病的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的人载脂蛋白M。

Description

治疗肾脏障碍的方法

技术领域

本公开涉及治疗患有阿尔波特综合征(Alport Syndrome)的受试者的慢性肾脏疾病和肾病的材料和方法。

相关申请的交叉引用以及电子提交的材料以引用方式并入

本申请要求2018年7月13日提交的美国临时专利申请号62/697,556的权益，其全部内容以引用方式完全并入本文。

作为本公开的一部分的序列表与说明书作为文本文件同时提交。含有序列表的文本文件的名称为“53188_Seqlisting.txt”。所述序列表于2019年7月2日创建，并且大小为4,142字节。序列表的主题以引用方式并入本文。

背景技术

阿尔波特综合征是由三种IV型胶原基因COL4A3、COL4A4和COL4A5的突变引起的遗传性疾病。所述疾病的特征在于进行性肾衰竭、高血压、蛋白尿、心血管疾病的风险大大增加、以及听力和视力丧失。当前的阿尔波特综合征疗法旨在缓解症状，并且包括血管收缩素转换酶(ACE)抑制剂或血管收缩素受体阻滞剂(ARB)。此类治疗仅仅减慢肾脏功能的丧失或管理血压，而不会治疗或预防疾病的其他影响。

仍然需要与阿尔波特综合征和其他Col4相关疾病有关的肾功能不全的治疗选择、以及对一般慢性肾脏疾病的治疗选择。

发明内容

在一方面，本文描述了治疗或预防受试者的慢性肾脏疾病的方法。所述方法包括以有效治疗受试者的慢性肾脏疾病的量向受试者施用人载脂蛋白M(rhAPOM)。

在另一方面，本文描述了治疗或预防患有阿尔波特综合征的受试者的肾病的方法。所述方法包括以有效治疗受试者的肾病的量向受试者施用重组人载脂蛋白M。

在又另一方面，本文描述了用于在治疗或预防与阿尔波特综合征相关的慢性肾脏疾病或肾病的人载脂蛋白M，其中以有效治疗或预防慢性肾脏疾病或肾病的量和剂量方案施用所述人载脂蛋白M。

除非本文另有定义，否则与本申请结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语。如果本发明的各方面被描述为“包括”特征，则也设想了实施方案“由”所述特征“组成”或“基本上由”所述特征“组成”。除非另有声明，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本公开，而不形成对本公开范围的限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未声明的要素对于本公开的实践是必不可少的。除了在操作实施例中或在另外指明的地方，在本文使用的表示成分或反应条件的数量的所有数字应被理解为在所有情况下均被术语“约”修饰，同样地该术语将由相关领域的技术人员所解释。

附图说明

图1A-图1C：来自Col4a3敲除小鼠的肾小球中ABCA1、ABCG1和APOM的表达降低。通过实时定量PCR对mRNA表达进行条形图分析，表明当与野生型对照(WT)相比时，从Col4a3敲除小鼠(KO)分离的肾小球中的ABCA1(A)、ABCG1(B)和APOM(C)的表达降低。**p<0.01，***p<0.001。

图2A-图2H：用重组人APOM(rh-APOM)治疗Col4a3敲除小鼠恢复了APOM、S1P和甘油三酸酯的正常血清水平、以及在肾皮质和血清中的S1P含量。(A)肾皮质中APOM表达水平的条形图分析，表明APOM表达显著降低。T检验，*p<0.05。(B,C)Col4a3敲除小鼠显示APOM的血清水平(B)和尿液水平(C)显著增加，但是用rh-APOM治疗Col4a3敲除小鼠恢复了APOM的正常血清和尿液水平。T检验(血清)：*p<0.05，F检验(尿液)：***p<0.0001。(D)用rh-APOM治疗Col4a3敲除小鼠恢复了血清甘油三酸酯含量的生理血清水平。T检验，*p<0.05。(E,F)在肾皮质中的S1P表达(E)和S1P血清含量(F)的条形图分析，表明用rh-APOM治疗Col4a3敲除小鼠恢复了S1P的生理水平。*p<0.05。(G)相关分析表明尿液APOM水平与白蛋白/肌酐比率呈正相关，R2＝0.8，p<0.01。(H)相关分析表明肾脏APOM水平与血清肌酐水平呈负相关。R²＝0.8，p<0.05。

图3A-图3F.用重组人APOM(rh-APOM)治疗Col4a3敲除小鼠预防了肾衰竭。(A)与未经治疗的Col4a3敲除小鼠相比，对Col4a3敲除小鼠进行rh-APOM治疗导致白蛋白/肌酐比率显著降低。**p<0.01，***p<0.001。(B)与对照相比，在Col4a3敲除小鼠中血清肌酐水平显著增加。rh-APOM治疗显著降低了Col4a3敲除小鼠的血清肌酐水平。*p<0.01。(C)与对照相比，Col4a3敲除小鼠的血清(血尿素氮)BUN水平显著增加，然而rh-APOM治疗防止了Col4a3敲除小鼠的血清BUN水平增加。*p<0.01。(D)与对照相比，Col4a3敲除小鼠的体重显著降低。rh-APOM治疗防止了Col4a3敲除小鼠体重减轻。**p<0.01。(E)如在WT、WT+rhAPOM和未经治疗的Col4a3敲除小鼠中所观察到，用rh-APOM治疗Col4a3敲除小鼠预防了肾小球硬化症、肾小管萎缩和扩张的发生。显示了过碘酸-希夫染料(PAS)染色的冷冻肾脏切片的代表性图像。(F)肾小球系膜扩张得分的条形图分析表明，与WT小鼠相比，Col4a3 KO小鼠显示出显著增加的肾小球系膜扩张得分，并且用rhAPOM治疗Col4a3 KO小鼠显著降低了肾小球系膜扩张得分。T检验，***p<0.0001。

图4是人APOM氨基酸序列。

图5是人APOM核酸序列。

图6A-图6N。APOM在人足细胞和人肾脏活检组织中表达，并且Col4a3 KO小鼠中APOM缺乏与S1P积累和C信号传导的激活相关。(A)APOM表达的PCR分析表明，APOM在人足细胞和人肾脏活检组织中表达。P1、P2–人足细胞细胞系；H–HepG2细胞(阳性对照)；K1、K2–人肾脏活检组织样品。(B)蛋白质印迹分析表明，与WT小鼠相比在Col4a3 KO小鼠中的APOM蛋白表达降低。(C)实时定量PCR分析表明，与WT小鼠相比在Col4a3 KO小鼠中的SPHK1表达显著增加。***p<0.001，t检验。(D)ELISA表明，与WT小鼠相比在Col4a3 KO小鼠的肾皮质中的S1P水平显著增加。p<0.05，t检验。(E-I)从肾皮质中分离的mRNA的实时定量PCR分析表明，当与WT小鼠相比时在Col4a3 KO小鼠的肾皮质中的S1PR1(E)、S1PR2(F)、S1PR3(G)、S1PR4(H)和S1PR5(I)的表达显著增加。*p<0.05，**p<0.01，t-检验。(J-N)从肾小球中分离的mRNA的实时定量PCR分析表明，当与WT小鼠相比时在Col4a3 KO小鼠的肾小球中的S1PR4(M)表达显著增加，而S1PR1(J)、S1PR2(K)、S1PR3(L)和S1PR5(N)的表达保持不变。*p<0.05，t检验。

图7A-图7F.(A,B)通过慢病毒感染建立了具有稳定的APOM敲低的人足细胞细胞系。进行的实时定量PCR(A)和蛋白质印迹分析(B)表明，与混杂感染的(SC)足细胞相比在siAPOM中的APOM mRNA和蛋白质表达被敲低了75％。n＝1。(C)蛋白质印迹分析表明，当与SC足细胞相比时在siAPOM足细胞中的RhoA表达降低。(D)条形图分析表明，与通过实时定量PCR建立的SC足细胞相比，在siAPOM中的ABCC1表达显著降低。一式三份，n＝1。(E)使用实时定量PCR确定了不同整联蛋白亚基的表达。条形图分析表明，与SC足细胞相比在siAPOM中的ITGB3的表达增加。一式三份，n＝1。(F)条形图分析表明当与经S1P+APOM治疗的足细胞相比在经S1P+白蛋白治疗的足细胞中的细胞凋亡以S1P依赖性方式增加。一式三份，n＝1。

图8A-图8B.用重组人APOM(rh-APOM)治疗Col4a3敲除(KO)小鼠改善了已确认的肾衰竭。(A)与未经治疗的Col4a3敲除小鼠相比，对Col4a3敲除小鼠进行rh-APOM治疗导致白蛋白/肌酐比率以及(B)血浆肌酐水平显著降低。*p<0.05，***p<0.001。

具体实施方式

本公开提供了治疗或预防患有阿尔波特综合征的有需要的受试者的肾病的方法以及治疗有需要的受试者的慢性肾脏疾病的方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的人载脂蛋白M(APOM)。本公开还提供了人载脂蛋白M，其用于在治疗或预防与阿尔波特综合征相关的肾病以及慢性肾脏疾病中使用。

术语“治疗”(treating和treatment)是指疾病或所治疗疾病的症状的任何改善。因此，“治疗”(treating和treatment)包括完全消除疾病的一种或多种症状，但这不是必需的。本领域普通技术人员将理解，肾脏障碍或与之相关的症状的任何程度的改善对诸如人类患者之类受试者都是有益的。通过在任何程度上降低受试者的症状的严重性来改善患者的生活质量。术语“预防”(preventing或prevention)是指抑制障碍、延迟疾病发作、或延迟疾病的一种或多种症状的出现。“预防”并不需要100％抑制疾病发作，但是这是可以预期的。

载脂蛋白M

载脂蛋白M(APOM)是一种载脂蛋白，并且是脂质运载蛋白家族的成员。脂质运载蛋白共有有限的序列同源性区域和共同的三级结构体系。它们具有八链反向平行的对称桶状折叠，其本质上是已经被卷成容纳配体结合位点的圆柱形的β折叠。脂质运载蛋白已经与许多生物学过程相关，所述许多生物学过程包括免疫应答、信息素转运、生物前列腺素合成、类维生素A结合和癌细胞相互作用。APOM与高密度脂蛋白相关，并且在较小程度上与低密度脂蛋白和富含甘油三酸酯的脂蛋白相关。APOM参与脂质运输，并且可以结合鞘氨醇-1-磷酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸、视黄醇、全反式视黄酸和9-顺式视黄酸。APOM进一步描述于例如Zhang等人,Acta Histochemica,2003；105(1):67-72；Axler等人,FEBS Lett.2008年3月5日；582(5):826-8。

以SEQ ID NO:1提供人APOM的氨基酸序列。在各个方面，人APOM包含与SEQ ID NO:1至少90％相同(例如，至少95％、至少99％或100％相同)的氨基酸序列。另选地，APOM由SEQID NO:2的核酸序列编码。在各个方面，不需要全长APOM蛋白。任选地，将APOM融合至改善蛋白质的半衰期或另一种药代动力学特性的部分。例如，在一个实施方案中，APOM与抗体诸如IgG1抗体的Fc区融合。实际上，在优选的实施方案中，人APOM包含与IgG1的Fc区融合的SEQID NO:1的氨基酸序列的Met-1至Asn-188。

可以使用本领域已知的方法生产重组APOM。

肾病

在一方面，本公开提供了一种治疗患有阿尔波特综合征的有需要的受试者的肾病的方法。因此，在某些实施方案中，在施用人重组载脂蛋白M之前受试者已被诊断为患有阿尔波特综合征。可以通过参数评估来实现对阿尔波特综合征的诊断，所述参数包括但不限于受试者的家族病史、临床特征(包括但不限于蛋白尿、白蛋白尿、血尿、受损GFR，耳聋和/或眼部改变)和组织活检结果。可以测试肾脏活检组织中是否存在IV型胶原蛋白α3、α4和α5链。另外地，可以通过肾脏活检材料的电子显微镜检查来检测肾小球中的结构变化。可以测试皮肤活检组织中是否存在IV型胶原蛋白α5链，其通常存在于皮肤中并且在具有X连锁形式的阿尔波特综合征的男性受试者中几乎总是不存在。阿尔波特综合征的诊断还可能包括筛选Col4a3、Col4a4或Col4a5基因中的一个或多个基因的突变。

如本文所用的术语“肾病”(renal disease)或“肾脏疾病”(kidney disease)意指肾脏的正常生理和功能的任何改变。此术语包括但不限于病症诸如肾病(nephropathy)；原发性肾小球病(局灶性节段性肾小球硬化症)、轻微改变型肾病(Minimal Changedisease)、膜性GN、IgA肾病；肾小球肾炎；多囊性肾脏疾病；急性和慢性间质性肾炎、中美洲肾病、肾肥大(一个或两个肾脏的极端肥大)；肾病综合征；肾病综合征、终末期肾病(ESRD)；急慢性肾衰竭；间质性疾病；肾炎；硬化症、由包括例如由于疾病或损伤导致的炎症等原因引起的组织和/或血管的硬结或硬化；肾纤维化和瘢痕形成；肾相关增生性障碍；以及其他原发性或继发性肾发生病症。

如本文所用，术语“慢性肾脏疾病(CKD)”被定义为存在超过三个月的累及健康的肾脏结构或功能异常。根据国家肾脏基金会(National Kidney Foundation)已经将CKD分类为5个阶段：第1阶段是正常eGFR(mL/min/1.73m²)为90或以上的肾脏损害；第2阶段是GFR轻度降低(GFR 60-89mL/min/1.73m²)的肾脏损害；第3阶段是GFR中度降低(GFR 30-59mL/min/1.73m²)；第4阶段是GFR重度降低(GFR 15-29mL/min/1.73m²)；并且第5阶段是肾衰竭(GFR<15mL/min/1.73m²或透析)。已经将第3阶段细分为阶段3A和阶段3B，阶段3A是GFR的轻度至中度降低(GFR 45-59)，阶段3B是GFR的中度至重度降低(GFR 30-44)。

肾病(renal disease)或肾脏疾病(kidney disease)通常也可以被定义为“肾病”(nephropathy或nephropathies)。术语“肾病”(nephropathy或nephropathies)涵盖肾脏中的所有可能导致肾脏纤维化和/或肾小球疾病(例如肾小球硬化症或肾小球肾炎)和/或慢性肾功能不全的临床生理变化，并且可能导致终末期肾病和/或肾衰竭。本公开的一些方面涉及预防和/或治疗高血压性肾病、糖尿病性肾病和其他类型的肾病，诸如镇痛药性肾病、免疫介导的肾小球病(例如，IgA肾病或伯杰氏病(Berger's disease)、狼疮性肾炎)、缺血性肾病、HIV相关肾病、膜性肾病、肾小球肾炎、肾小球硬化症、放射性造影剂诱导的肾病、中毒性肾病、镇痛药诱导的肾毒性、顺铂肾病、移植肾病、以及其他形式的肾小球异常或损伤、或肾小球毛细血管损伤(管状纤维化)。在一些实施方案中，术语“肾病”(nephropathy或nephropathies)具体地是指受试者尿液中存在蛋白质(即蛋白尿)和/或存在肾功能不全的障碍或疾病。

在一些实施方案中，受试者患有白蛋白尿或蛋白尿。与白蛋白尿相关的示例性障碍包括但不限于慢性肾脏疾病、增生性肾小球肾炎(例如，免疫球蛋白A肾病、膜性增生性肾小球肾炎、肾小球系膜增生性肾小球肾炎、抗GBM疾病、肾血管炎、狼疮肾炎、冷球蛋白血症相关的肾小球肾炎、细菌性心内膜炎、过敏性紫癜、感染后肾小球肾炎或丙型肝炎)以及非增生性肾小球性肾炎(例如，膜性肾小球肾炎、轻微改变型肾病、原发性局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、原纤维性肾小球肾炎、免疫触须样肾小球肾炎(immunotactoidglomerulonephritis)、淀粉样变性、高血压肾硬化症、多发性骨髓瘤引起的轻链疾病和继发性局灶性肾小球硬化症)。

在本文提供的任何实施方案中，可以对受试者进行某些测试以评估肾功能。此类测试包括但不限于测量受试者的血液尿素氮；测量受试者血液中的肌酐；测量受试者血液中的肌酐清除率；测量受试者的蛋白尿；测量受试者的白蛋白:肌酐比率；测量受试者的肾小球滤过率；以及测量受试者的尿排出量。在各个方面，本公开的方法在患有本文所述的肾脏障碍的受试者中改善了这些测试中的一项或多项测试的结果。

在本文提供的任何实施方案中，可以将尿液或血液中存在的蛋白质用于评估肾功能。肾脏功能的此类测试包括但不限于测量白蛋白/肌酐尿比率、总蛋白/肌酐尿比率、在定时收集的尿液中的白蛋白或总蛋白、受试者尿液中的N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)蛋白；测量受试者尿液中的嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)蛋白；测量受试者尿液中的肾脏损伤分子1(KIM-1)蛋白；测量受试者尿液中的白介素-18(IL-18)蛋白；测量受试者尿液中的结缔组织生长因子(CTGF)水平；测量受试者尿液中的单核细胞趋化蛋白1(MCP1)水平；测量受试者尿液中的胶原蛋白IV(Col IV)片段；测量受试者尿液中的胶原蛋白III(Col III)片段水平；测量受试者血液中的胱抑素C蛋白；测量受试者血液中的β-痕量蛋白(BTP)；以及测量受试者血液中的2-微球蛋白(B2M)。在本文提供的任何实施方案中，可以在尿液中测量足细胞损伤的标记物。此类蛋白质包括肾病蛋白(nephrin)和足突蛋白(podocin)。可以例如使用可商购的试剂盒通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射性免疫测定(RIA)对蛋白质进行定量。

施用时间和剂量

在一些实施方案中，在例如约1周至约18个月(例如，约1个月至约12个月、约1个月至约9个月、或约1个月至约6个月、或约1个月至约3个月)的治疗时期内进行人载脂蛋白M的一次或多次施用。在一些实施方案中，在以下治疗时间段内向受试者施用本文所述的人载脂蛋白M的一个或多个剂量：例如，约1个月到约12个月(52周)(例如，约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月或约11个月)。

另外，取决于为特定人受试者选择的治疗方案，施用多个剂量的人载脂蛋白M或将多个剂量的施用按时间分开可能是有利的。在一些实施方案中，在一年(12个月，52周)或更短(例如，9个月或更短、6个月或更短或3个月或更短)的时间段内周期性地施用人载脂蛋白M。在这个方面，任选地每隔约3天、或约7天、或约2周、或约3周、或约4周、或约5周、或约6周、或约7周、或约8周、或约9周、或约10周、或约11周、或约12周、或约13周、或约14周、或约15周、或约16周、或约17周、或约18周、或约19周、或约20周、或约21周、或约22周、或约23周、或约6个月、或约12个月向人施用一次人载脂蛋白M。

在一些实施方案中，人载脂蛋白M的剂量包含在约1至约500毫克(例如，在约1至约400毫克之间或在约3至约300毫克之间)的人载脂蛋白M/千克体重(mg/kg)。例如，人载脂蛋白M的剂量可以包含至少约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约26mg/kg、约27mg/kg、约28mg/kg、约29mg/kg、约30mg/kg、约31mg/kg、约32mg/kg、约33mg/kg、约34mg/kg、约35mg/kg、约36mg/kg、约37mg/kg、约38mg/kg、约39mg/kg、约40mg/kg、约41mg/kg、约42mg/kg、约43mg/kg、约44mg/kg、约45mg/kg、约46mg/kg、约47mg/kg、约48mg/kg、或约49mg/kg、或约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg、约100mg/kg、约125mg/kg、约150mg/kg、约175mg/kg、约200mg/kg、约225mg/kg、约250mg/kg、约275mg/kg、约300mg/kg、约325mg/kg、约350mg/kg、约375mg/kg、约400mg/kg、约450mg/kg、或约500mg/kg的人载脂蛋白M。介于任何和所有这些终点之间的范围也可以考虑在内，例如，约1mg/kg至约100mg/kg、约3mg/kg至约300mg/kg、约3mg/kg至约100mg/kg、约5mg/kg至约50mg/kg、约3mg/kg至约75mg/kg、约1mg/kg至约50mg/kg、约100mg/kg至约300mg/kg、约50mg/kg至约200mg/kg、或约200mg/kg至约300mg/kg。

药物组合物

在一些实施方案中，将人载脂蛋白M与药学上有效的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂一起调配成组合物。药物组合物包括但不限于液体组合物、冷冻组合物、和冻干组合物。

优选地，调配物材料在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的。在具体的实施方案中，提供了包含治疗有效量的人载脂蛋白M的药物组合物。

在一些实施方案中，药物组合物可能含有用于修改、维持或保持例如组合物的pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附性或渗透性的调配物材料。在此类实施方案中，合适的调配物材料包括但不限于氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、脯氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(诸如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(诸如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；膨胀剂(诸如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(诸如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；二糖；和其他碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(诸如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐反离子(诸如钠)；防腐剂(诸如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(诸如甘露醇或山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(诸如普朗尼克(pluronic)、PEG、脱水山梨醇酯、聚山梨醇酯，诸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯、曲拉通(triton)、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙帕(tyloxapal))；稳定性增强剂(诸如蔗糖或山梨醇)；张力增强剂(诸如碱金属卤化物，优选地氯化钠或氯化钾，甘露醇山梨醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。参见REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第18版,(A.R.Genrmo编辑),1990,Mack Publishing Company。

组合疗法

在一些实施方案中，本文所述的方法包括施用用于预防或治疗肾脏障碍诸如肾病或相关障碍或并发症的另一种药剂。此类已知化合物的实例包括但不限于：ACE抑制剂药物(例如，卡托普利

依那普利

福辛普利

赖诺普利

培哚普利

喹那普利

川那普利

洛汀新、莫昔普利、雷米普利)；RAS阻滞剂；血管收缩素受体阻滞剂(ARB)(例如，奥美沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦、缬沙坦、坎地沙坦、依普罗沙坦、替米沙坦等)；蛋白激酶C(PKC)抑制剂(例如，芦布妥林)；AGE依赖性途径抑制剂(例如，氨基胍、ALT-946、吡哆胺(pyrododorin)、OPB-9295、阿拉氯胺(alagebrium))；抗炎药剂(例如，环加氧酶(clyclooxigenase)-2抑制剂、霉酚酸酯(mycophenolate mophetil)、咪唑立宾、己酮可可碱)、GAG(例如，舒洛地特(美国专利号5,496,807))；吡哆胺(美国专利号7,030,146)；内皮素拮抗剂(例如，SPP 301)、COX-2抑制剂、PPAR-γ拮抗剂、以及其他化合物(如氨磷汀(用于顺铂肾病)、卡托普利(用于糖尿病性肾病)、环磷酰胺(用于特发性膜性肾病)、硫代硫酸钠(用于顺铂肾病)、曲尼司特等)。(Williams和Tuttle(2005),Advances in Chronic Kidney Disease,12(2):212-222；Giunti等人(2006),Minerva Medica,97:241-62)。

另外地，本文所述的方法还可以包括共同施用用于治疗与肾脏障碍并发症直接或间接相关的另一种疾病的至少一种其他治疗剂，所述另一种疾病包括但不限于：血脂异常、高血压、肥胖症、神经病、炎症、和/或视网膜病变。此类另外的治疗剂包括但不限于皮质类固醇；免疫抑制药物；抗生素；抗高血压和利尿药物(诸如噻嗪利尿药和ACE抑制剂或β-肾上腺素拮抗剂)；降脂药剂，诸如胆汁多价螯合树脂、考来烯胺、考来替泊、烟酸、以及更具体地用于降低胆固醇和甘油三酸酯的药剂和药物(例如，贝特类(例如，

)和HMG-CoA抑制剂，诸如

等)；烟酸；和维生素D。

可以与人载脂蛋白M共同施用的药剂的另外的实例包括免疫调节剂或免疫抑制剂(诸如被已经接受肾脏移植(例如，当他们已经发生肾病时)的受试者使用的那些)、抗肥胖药剂、和食欲降低剂(包括但不限于Xenical^TM(Roche)、Meridia^TM(Abbott)、Acomplia^TM(Sanofi-Aventis)和拟交感神经的芬特明)、用于治疗高钾血症和/或降低由高钾血症引起的心室纤颤的风险的药剂(例如，葡萄糖酸钙、胰岛素、碳酸氢钠、β₂选择性儿茶酚胺诸如沙丁胺醇(albuterol、

)和聚苯乙烯磺酸酯(盖利生(Calcium Resonium)、Kayexalate))和patiromer

如本文所用，如在短语“伴随治疗性治疗”或“与……伴随地”中的术语“伴随”或“伴随地”包括在第二药剂的存在下施用第一药剂。伴随治疗性治疗方法包括其中共同施用第一、第二、第三或另外的药剂的方法。伴随治疗性治疗方法还包括这样的方法，其中在第二药剂或另外的药剂的存在下施用第一药剂或另外的药剂，其中所述第二药剂或另外的药剂例如可能已经预先施用。伴随治疗性治疗方法可以由不同的操作者逐步执行。例如，一名操作者可以向受试者施用第一药剂，并且作为第二名操作者可以向受试者施用第二药剂，并且施用步骤可以同时或几乎同时或在遥远的时间执行，只要第一药剂(和/或另外的药剂)是在第二药剂(和/或另外的药剂)的存在下的施用之后即可。操作者和受试者可以是相同的实体(例如，人)。优选地，第一药剂是人重组载脂蛋白M或含有人重组载脂蛋白M的组合物。第二药剂可以选自本文所述的其他治疗剂。

实施例

本实施例证明了向临床相关的阿尔波特综合征体内模型施用APOM预防了肾衰竭、以及肾脏皮质中异常的脂质含量。

材料和方法：

人重组APOM蛋白的构建和使用：所述蛋白质购自Sino Biological(13495-H02H)。将编码人APOM蛋白(O95445)(Met 1-Asn 188)的DNA序列在C末端与人IgG1的Fc区融合。如通过SDS-PAGE确定，发现所得的人重组APOM蛋白为>85％纯的，并且如通过LAL方法确定每μg蛋白质的内毒素浓度<1.0EU。

调配：将蛋白质从无菌PBS(pH 7.4)中冻干，并且在冻干之前添加通常5％-8％海藻糖、甘露醇和0.01％Tween 80作为保护剂。具体浓度包括在每个COA的硬拷贝中。为了注射，将无菌水添加到小瓶中以制备0.25mg/ml的储备溶液。

人APOM蛋白序列：095445(1-188)：MFHQIWAALL YFYGIILNSI YQCPEHSQLTTLGVDGKEFP EVHLGQWYFI AGAAPTKEEL ATFDPVDNIV FNMAAGSAPM QLHLRATIRM KDGLCVPRKWIYHLTEGSTD LRTEGRPDMK TELFSSSCPG GIMLNETGQG YQRFLLYNRS PHPPEKCVEE FKSLTSCLDSKAFLLTPRNQ EACELSNN(SEQ ID NO:1)。

APOM的酶联免疫吸附测定(ELISA)：小鼠APOM ELISA购自LSBio(#LS-F21415)，并且按照制造商的方案确定血清、尿液和裂解物中的APOM蛋白浓度。

S1P测定试剂盒：S1P测定试剂盒购自Echelon(#K-1900)，并且根据制造商的方案确定血清中的S1P浓度。

实时定量PCR：根据现有技术已知的标准方案，使用Abca1、Abcg1和APOM的引物对来自分离的小鼠肾小球的cDNA进行qPCR。所使用的引物：Abca1-F：CGTTTCCGGGAAGTGTCCTA/Abca1-R：GCTAGAGATGACAAGGAGGATGGA；Abcg1-F：AGGTCTCAGCCTTCTAAAGTTCCTC/Abcg1-R：TCTCTCGAAGTGAATGAAATTTATCG；Apom-F：CCTGGGCCTGTG GTACTTTA；Apom-R：CCATGTTTCCTTTCCCTTCA(SEQ ID NO：4-9)。

用于预防肾病的小鼠模型(例如，图3)：其中缺失IV型胶原α3链的外显子5的小鼠(Col4a3 KO)从Jackson Laboratory获得(#002908，129-Col4a3tm1Dec/J)。饲养Col4a3杂合同窝幼仔以产生Col4a3 KO小鼠。研究了三组小鼠，每组n＝3-4。这三组包括：1)野生型对照+媒介物，2)Col4a3 KO+媒介物，和4)Col4a3 KO+APOM。从4周龄开始以100μg APOM、在第5周龄以100μg APOM、在第6周以75μg APOM、以及在第7周以67μg APOM通过每周一次腹膜内注射施用APOM。从4周龄开始至16周龄每周监测体重和白蛋白尿。当出现了进展至终末期肾衰竭时，在8周龄处死小鼠。

用于治疗肾病的小鼠模型(图8)：研究了三组Col4a3 KO小鼠，每组n＝3-4。这三组包括：1)野生型对照(WT)+媒介物，2)Col4a3 KO+媒介物，4)Col4a3 KO+rh-APOM。从6¹/₂周龄开始以每周100mg APOM通过每周一次腹膜内注射施用rhAPOM。从4周龄开始至8周龄每周监测体重和白蛋白尿。当出现了进展至终末期肾衰竭时，在8周龄处死小鼠。

白蛋白/肌酐比率：所有白蛋白尿值均表示为μg白蛋白/mg肌酐。如先前所述，通过ELISA(Bethyl Laboratories)确定白蛋白/肌酐以进行白蛋白检测，并且基于Jaffe方法进行生物化学测定以进行肌酐检测(Stanbio)。

血清学：在处死前立即在University of Miami的比较实验室核心设施中收集血液样品用于确定BUN和脂质板分析。通过串联质谱法(University of Alabama的UAB-UCSDO'Brien核心中心)确定血清肌酐。

小鼠处死手术：在8周龄时用磷酸盐缓冲盐水通过左心室灌注小鼠。取出右肾，切除一个极并将其埋在OCT中，并且将肾的剩余部分用于胆固醇含量确定和从皮层中提取mRNA。将左肾的两个极切除并固定在4％PFA中，一个极用于石蜡包埋，随后进行组织学分析，另一个极在PBS中的4％戊二醛溶液中后固定12h以进行电子显微镜检查。

肾小球系膜扩张的评估：使用标准方案对4μm厚的组织切片进行过碘酸希夫(PAS)染色。由两名不知情的独立研究者进行的半定量分析(0-4级)对每个切片的二十个肾小球中的肾小球系膜扩张进行了分析。

统计分析：所有体外实验均一式三份进行并且进行3次生物学重复，在所有体内实验中每组分析3-10只小鼠。使用Graph Pad Prism软件实施统计分析。使用方差分析(ANOVA)、随后用Bonferroni事后检验或学生t检验来分析结果。

结果与讨论

出乎意料的是，在阿尔波特综合征中观察到脂质诱导的肾脏损伤。脂质诱导的肾脏损伤在阿尔波特综合征(AS)中的作用是出乎意料的，并且以前尚未被认识到。当检查从Col4a3敲除小鼠(阿尔波特综合征的动物模型)中分离的肾小球中的mRNA(信使核糖核酸)水平时，发现与对照相比，在AS小鼠中除了ABCA1以外，ABCG1(ATP结合盒亚家族G成员1)和载脂蛋白M(APOM)的表达也降低，表明所有三种蛋白质可能在AS的进展中发挥作用。与ABCA1和ABCG1这两种具有协同功能的ATP结合盒转运蛋白不同，APOM是一种主要位于HDL颗粒中的蛋白质，认为其在高密度脂蛋白(HDL)代谢中起着重要作用。

图1中所示的数据证明在Col4a3敲除小鼠中ABCA1、ABCG1和APOM的表达水平降低。在动物模型中异常表达水平与肾脏损伤之间的这种相关性暗示了ABCA1、ABCG1和APOM在阿尔波特综合征进展中的作用。图2的数据进一步支持了在临床相关的体内模型Col4a3敲除小鼠中观察到的降低的APOM表达在肾病进展中的作用。Col4a3敲除小鼠表现出以下综合表型：降低的APOM表达水平(A)、在血清(B)和尿液(C)中降低的APOM蛋白水平、和血清中升高的甘油三酸酯水平(D)、以及在肾脏皮质和血清中增加的鞘氨醇-1-磷酸酯(S1P)水平。此外，发现在Col4a3 KO(KO)小鼠中尿液和肾脏APOM表达与肾功能参数相关(图2G和图2H)。这些数据表明，APOM是调节血清中的甘油三酸酯水平以及肾脏皮质和血清中的S1P水平所必需的。在用人APOM治疗Col4a3敲除小鼠之后，血清中的S1P和甘油三酸酯以及肾脏皮质中的S1P的正常水平随后恢复，这表明APOM也足以治疗在这种临床相关的阿尔波特综合征动物模型中出现的一种或多种症状。

图3中所示的数据表明，通过用重组人APOM治疗恢复正常APOM水平对Col4a3敲除小鼠的肾脏组织的功能和结构产生了积极影响。图(A)至(C)显示，在用人APOM治疗的Col4a3敲除小鼠中依据白蛋白与肌酐比率和血尿素氮(BUN)水平的肾脏功能大大提高。在用人APOM治疗的Col4a3敲除小鼠中也可以防止体重减轻，这表明通常更健康的代谢状态(参见图(D))。如图(E)中染色的组织切片的比较所展示，用人APOM治疗还预防了Col4a3敲除小鼠中阿尔波特综合征中与肾脏损伤相关的几种组织学异常。特别地，与未经治疗的同窝幼仔相比，用人APOM治疗的Col4a3敲除小鼠显示出的肾小球硬化症、肾小管萎缩、以及扩张和肾小管系膜扩张水平降低。这些数据表明，用人APOM治疗可以预防Col4a3敲除小鼠肾脏的功能和结构异常的发作，从而保护经治疗的动物免于肾衰竭。

图6A-图6N中所示的数据显示，APOM在人足细胞和人肾脏活检组织中表达，并且Col4a3 KO小鼠中APOM缺乏与S1P积累和C信号传导的激活相关。

图7中所示的数据显示了通过慢病毒感染建立的人足细胞细胞系具有稳定的APOM敲低(siAPOM)(图7A-图7B)，并证明了相对于混杂的对照，siAPOM足细胞中RhoA蛋白表达(图7C)和ABCC1 mRNA表达(图7D)降低。另外，相对于混杂的对照，在siAPOM中检测到ITGB3的表达增加(图7E)。在用尼罗红(Nile Red)以及细胞隐蔽物和鬼笔环肽标记细胞内脂质可视化细胞之后，使用OPERA高容量筛选系统获得了代表性图像。在经S1P+白蛋白治疗的足细胞中以剂量依赖性方式检测到增加的脂滴，然而在用S1P+APOM治疗的足细胞中未检测到类似的增加(数据未显示)。与经S1P+APOM治疗的足细胞相比，在经S1P+白蛋白治疗的足细胞中以S1P依赖性方式检测到细胞凋亡增加(图7F)。

图8中显示的数据证明用重组人APOM(rh-APOM)治疗6¹/₂周龄的Col4a3敲除(KO)小鼠改善了既定的肾衰竭。在这种情况下，小鼠已发展出肾病的临床体征(蛋白尿)，并且用rh-APOM进行治疗。与未经治疗的Col4a3敲除小鼠(图8B)相比，rh-APOM治疗Col4a3敲除小鼠(KO)导致白蛋白/肌酐比率(图8A)和血浆肌酐水平显著降低。

本文所述的数据表明，向阿尔波特综合征的体内模型(Col4a3小鼠)施用APOM防止了肾衰竭和肾脏皮质中的脂质含量异常。经治疗的动物还具有更健康的体重和更好的肾脏功能。本实施例证明了APOM在阿尔波特综合征的潜在机制中的作用，并且为APOM在治疗或预防肾脏疾病中的治疗用途提供了证据。

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<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 188

<212> PRT

<213> 智人（Homo Sapiens）

<400> 1

Met Phe His Gln Ile Trp Ala Ala Leu Leu Tyr Phe Tyr Gly Ile Ile

1 5 10 15

Leu Asn Ser Ile Tyr Gln Cys Pro Glu His Ser Gln Leu Thr Thr Leu

20 25 30

Gly Val Asp Gly Lys Glu Phe Pro Glu Val His Leu Gly Gln Trp Tyr

35 40 45

Phe Ile Ala Gly Ala Ala Pro Thr Lys Glu Glu Leu Ala Thr Phe Asp

50 55 60

Pro Val Asp Asn Ile Val Phe Asn Met Ala Ala Gly Ser Ala Pro Met

65 70 75 80

Gln Leu His Leu Arg Ala Thr Ile Arg Met Lys Asp Gly Leu Cys Val

85 90 95

Pro Arg Lys Trp Ile Tyr His Leu Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Arg

100 105 110

Thr Glu Gly Arg Pro Asp Met Lys Thr Glu Leu Phe Ser Ser Ser Cys

115 120 125

Pro Gly Gly Ile Met Leu Asn Glu Thr Gly Gln Gly Tyr Gln Arg Phe

130 135 140

Leu Leu Tyr Asn Arg Ser Pro His Pro Pro Glu Lys Cys Val Glu Glu

145 150 155 160

Phe Lys Ser Leu Thr Ser Cys Leu Asp Ser Lys Ala Phe Leu Leu Thr

165 170 175

Pro Arg Asn Gln Glu Ala Cys Glu Leu Ser Asn Asn

180 185

<210> 2

<211> 734

<212> DNA

<213> 智人（Homo Sapiens）

<400> 2

caacagagca ccagcttccc tcctgccctg aagatgttcc accaaatttg ggcagctctg 60

ctctacttct atggtattat ccttaactcc atctaccagt gccctgagca cagtcaactg 120

acaactctgg gcgtggatgg gaaggagttc ccagaggtcc acttgggcca gtggtacttt 180

atcgcagggg cagctcccac caaggaggag ttggcaactt ttgaccctgt ggacaacatt 240

gtcttcaata tggctgctgg ctctgccccg atgcagctcc accttcgtgc taccatccgc 300

atgaaagatg ggctctgtgt gccccggaaa tggatctacc acctgactga agggagcaca 360

gatctcagaa ctgaaggccg ccctgacatg aagactgagc tcttttccag ctcatgccca 420

ggtggaatca tgctgaatga gacaggccag ggttaccagc gctttctcct ctacaatcgc 480

tcaccacatc ctcccgaaaa gtgtgtggag gaattcaagt ccctgacttc ctgcctggac 540

tccaaagcct tcttattgac tcctaggaat caagaggcct gtgagctgtc caataactga 600

cctgtaactt catctaagtc cccagatggg tacaatggga gctgagttgt tggagggaga 660

agctggagac ttccagctcc agctcccact caagataata aagataattc ttcaatcctc 720

aaaaaaaaaa aaaa 734

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

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ccatgtttcc tttcccttca 20

Claims (4)

1.一种治疗或预防受试者的慢性肾脏疾病的方法，所述方法包括以有效治疗所述受试者的慢性肾脏疾病的量施用人载脂蛋白M。

2.一种治疗或预防患有阿尔波特综合征的受试者的肾病的方法，所述方法包括以有效治疗所述受试者的肾病的量向所述受试者施用人载脂蛋白M。

3.一种用于在治疗或预防慢性肾脏疾病中使用的人载脂蛋白M，其中所述人载脂蛋白M以有效治疗所述慢性肾脏疾病的量和剂量方案施用。

4.一种用于在治疗或预防患有阿尔波特综合征的受试者的肾病中使用人载脂蛋白M，其中所述人载脂蛋白M以有效治疗所述肾病的量和剂量方案施用。

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