CN112912101B

CN112912101B - 血小板裂解物组合物及其用途

Info

Publication number: CN112912101B
Application number: CN201980057604.0A
Authority: CN
Inventors: G·萨顿; 游璟璟; H·弗雷泽
Original assignee: Alpha Medical Ltd
Current assignee: Alpha Medical Ltd
Priority date: 2018-08-07
Filing date: 2019-08-07
Publication date: 2025-02-25
Anticipated expiration: 2039-08-07
Also published as: EP3833379A1; EP3833379A4; WO2020028944A1; CN112912101A; JP2021534231A; US20210290683A1; AU2019317630A1; US12171784B2

Abstract

本发明涉及用于向生物靶标提供机械支持和/或药剂的组合物、试剂盒和方法。具体地，所述组合物包括血小板裂解物、纤维蛋白原和凝血酶。所述组合物可以用于治疗伤口/损伤(例如，角膜)并且用于包含组织培养物的其它应用。

Description

血小板裂解物组合物及其用途

通过交叉引用的方式并入

本申请要求于2018年8月7日提交的澳大利亚临时申请第2018902870号的优先权，所述澳大利亚临时申请的全部内容通过交叉引用并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及生物学和医学领域，并且更具体地涉及用于向生物靶标提供机械支持和/或药剂的组合物和方法。仍更具体地，本发明涉及可以用于治疗伤口/损伤以及用于包含组织培养物的其它应用的组合物和方法。

背景技术

角膜是眼前表面的整体组成部分，其将光折射通过瞳孔，并充当感染、UV光和机械创伤的物理屏障。进一步地，角膜损伤是澳大利亚最常见的眼科急诊就诊，并且所有病例中有约75％是由于角膜中存在异物或擦伤。据估计，这些损伤就使澳大利亚人口每年花费超过1.55亿澳元，并且如果没有进行有效治疗，可能会导致感染和瘢痕形成，从而永久性地损害视力。另外，在大多数发展中国家，角膜疾病是失明的第二大最普遍原因，据估计，全世界3900万盲人中有12％患有双侧角膜性失明，并且另外的2300万人患有单侧角膜性失明。

角膜缺陷可能源于创伤和其它疾病过程。在轻度情况下，角膜能够通过正常的伤口愈合途径再生，并且由于角膜的密集神经元神经支配，角膜损伤可能会非常痛苦。然而，在一些情况下，角膜的正常伤口愈合机制可能是不够的。这导致形成无法愈合的缺陷，从而可能导致角膜融化、角膜新生血管形成、透明度丧失、感染、瘢痕形成以及视力下降到失明的程度。

当细胞补充与细胞损失之间的平衡被破坏时，如在磨蚀、感染或屈光手术之后，发生角膜伤口愈合。在轻度情况下，角膜可以上调生理过程以恢复此不平衡，然而，在更严重的情况下，需要另外的治疗。在发生伤口愈合无效的情况下，可能会导致如视力受损并且甚至角膜性失明等有害后果。

当前用于角膜损伤的医学治疗包含抗生素、眼垫、缝合线和外科手术胶水，这可能有助于轻微伤口。然而，其不能充分解决在更重度的伤口中产生的问题，包含疼痛缓解、感染和/或疤痕组织的发展。感染表示严重并发症，并且可能需要住院治疗。这些问题不仅限于角膜损伤，并且在其它身体组织的伤口的情况下也普遍存在。在严重的角膜损伤中常见的瘢痕形成可能导致永久性视力丧失，其中角膜移植是视力康复的唯一选择。

需要用于治疗角膜损伤的改进的组合物和方法。改进的组合物和方法还可以发现在其它组织伤口的治疗中的应用。

发明内容

本发明缓解了与当前的用于治疗伤口(例如，角膜伤口)的组合物和/或方法相关联的问题中的至少一个。

血小板裂解物的机械特性与水类似，因此难以以结构化形式应用于组织。例如，将原始血小板裂解物逐层应用到组织以生成二维或三维结构(例如，如生物打印等技术所必需)是非常具有挑战性的，并且在大多数情况下是不可行的。本发明人已经开发了促进以结构形式应用到组织的具有机械和结构特性的血小板裂解物组合物。具体地，本发明的组合物可以用于使用二维或三维生物打印技术将血小板裂解物应用到组织(例如，眼睛)。所述组合物可以由最初分离的组分制备，所述组分共同地包括至少血小板裂解物、纤维蛋白原和凝血酶。当混合时，分离的组分固化成包括血小板裂解物的凝胶状材料。可以通过改变各种组合物组分的定时和/或量来控制固化速率，从而在应用过程中提供灵活性。在没有限制的情况下，本文所描述的组合物和方法通常可用于将药剂(例如，药物和/或其它物质)递送到生物靶标(例如，组织、膜、细胞)，可应用用于例如治疗伤口，包含角膜组织中的伤口(例如，不愈合的角膜溃疡或擦伤)。

本发明至少部分地涉及以下实施例：

实施例1.一种组合物，其包括0.1-20mg/ml纤维蛋白原、2-20U/mL凝血酶和1-40％(v/v)血小板裂解物。

实施例2.根据实施例1所述的组合物，其进一步包括以下中的任何一种或多种：离子、离子源、氨基酸、纤连蛋白、麻醉剂、抗生素、生长因子、组织因子XIII、基质蛋白(例如，胶原蛋白)。

实施例3.根据实施例1或实施例2所述的组合物，其中所述离子包括钙离子，和/或所述生长因子包括人表皮生长因子(hEGF)。

实施例4.根据实施例1到3中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括包含所述离子和所述氨基酸的培养基。

实施例5.根据实施例1到4中任一项所述的组合物，其中所述离子是包含在所述组合物中的离子盐溶液的组分。

实施例6.根据实施例1到5中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括细胞(例如，哺乳动物细胞、人细胞)。

实施例7.根据实施例1到6中任一项所述的组合物，其中所述血小板裂解物包括人血小板裂解物或由其组成。

实施例8.根据实施例1到7中任一项所述的组合物，其中所述血小板裂解物不含或基本上不含抗凝血剂(例如，肝素)或者包括小于以下的抗凝血剂(例如，肝素)：10％(v/v)、9％(v/v)、8％(v/v)、7％(v/v)、6％(v/v)、5％(v/v)、4％(v/v)、3％(v/v)、2％(v/v)、1％(v/v)、0.5％(v/v)。

实施例9.根据实施例1到8中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括：

(i)0.1-15mg/ml纤维蛋白原；2-15U/ml凝血酶；以及5-40％(v/v)血小板裂解物；或者

(ii)0.1-10mg/ml纤维蛋白原；2-10U/ml凝血酶；以及10-35％(v/v)血小板裂解物；或者

(iii)0.2-5mg/ml纤维蛋白原；2-8U/ml凝血酶；以及15-30％(v/v)血小板裂解物；或者

(iv)0.2-3mg/ml纤维蛋白原；2-4U/ml凝血酶；以及15-25％(v/v)血小板裂解物。

实施例10.根据实施例1到8中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括：

(i)小于1mg/ml(例如，约0.2mg/ml)纤维蛋白原；2-20U/ml(例如，约3U/ml、约5U/ml、约10U/ml)凝血酶；以及5-40％(v/v)(例如，约20-30％(v/v))血小板裂解物；或者

(ii)1-4mg/ml(例如，约2mg/ml)纤维蛋白原；5-15U/ml(例如，约7U/ml、约10U/ml、约12U/ml)凝血酶；以及10-40％(v/v)(例如，约15-30％(v/v))血小板裂解物；或者

(iii)3-8mg/ml(例如，约5mg/ml)纤维蛋白原；2-15U/ml(例如，约4U/ml、约8U/ml、约12U/ml)凝血酶；以及15-30％(v/v)(例如，约20-25％(v/v))血小板裂解物。

实施例11.根据实施例1到8中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括：

(i)约0.4mg/ml、约0.8mg/ml或约1mg/ml纤维蛋白原，以及

约2U/ml、约10U/ml或约20U/ml凝血酶，以及

约20％(v/v)、约25％(v/v)或约30％(v/v)血小板裂解物；或者

(ii)约2mg/ml、约4mg/ml或约8mg/ml纤维蛋白原，以及

约2U/ml、约10U/ml或约20U/ml凝血酶，以及

约10％、约15％(v/v)或约20％(v/v)血小板裂解物；或者

(iii)约5mg/ml、约10mg/ml或约15mg/ml纤维蛋白原，以及

约2U/ml、约10U/ml或约20U/ml凝血酶，以及

约5％(v/v)、约15％(v/v)或约25％(v/v)血小板裂解物。

实施例12.根据实施例1到8中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括：

(i)至少以下：约0.4mg/ml纤维蛋白原、约2单位/mL凝血酶和约20％(v/v)血小板裂解物；或者

(ii)至少以下：约20％(v/v)血小板裂解物、约4mg/mL纤维蛋白原和约10U/mL凝血酶。

实施例13.一种试剂盒、包装或装置，其包括：

-包括纤维蛋白原的第一隔室和包括凝血酶的第二隔室，其中所述试剂盒、所述包装或所述装置被配置成在将所述纤维蛋白原和所述凝血酶装载到所述试剂盒、所述包装或所述装置中期间和之后，使所述第一隔室的所述纤维蛋白原与所述第二隔室的所述凝血酶分离；

-血小板裂解物；

-用于促进所述第一隔室的所述纤维蛋白原与所述第二隔室的所述凝血酶以及所述血小板裂解物混合的装置。

实施例14.根据实施例13所述的试剂盒、包装或装置，其中所述血小板裂解物定位在所述试剂盒、所述包装或所述装置的第三隔室中，所述试剂盒、所述包装或所述装置被配置成在将所述纤维蛋白原、所述凝血酶和所述血小板裂解物装载到所述试剂盒、所述包装或所述装置中期间和之后，使所述第三隔室的所述血小板裂解物与所述第一隔室的所述纤维蛋白原和所述第二隔室的所述凝血酶分离。

实施例15.根据实施例13所述的试剂盒、包装或装置，其中所述第一隔室包括所述纤维蛋白原和所述血小板裂解物，并且所述第二隔室包括所述凝血酶。

实施例16.根据实施例13到15中任一项所述的试剂盒、包装或装置，其中：

-任何所述隔室进一步包括以下中的任何一种或多种：离子、离子源、氨基酸、纤连蛋白、麻醉剂、抗生素、生长因子(例如，hEGF)、组织因子XIII、基质蛋白(例如，胶原蛋白)；或者

-所述试剂盒、所述包装或所述装置包括另外的隔室，所述另外的隔室包括以下中的任何一种或多种：离子、离子源、氨基酸、纤连蛋白、麻醉剂、抗生素、生长因子(例如，hEGF)、组织因子XIII、基质蛋白(例如，胶原蛋白)；其中所述试剂盒、所述包装或所述装置被配置成在所述试剂盒、所述包装或所述装置的装载期间和之后，使所述另外的隔室的内含物与其它隔室的内含物分离。

实施例17.根据实施例16所述的试剂盒、包装或装置，其中：

所述离子是钙离子，或者

所述离子源是离子盐和/或包括钙离子。

实施例18.根据实施例13到17中任一项所述的试剂盒、包装或装置，其中所述装置被配置成促进所述纤维蛋白原、所述凝血酶和所述血小板裂解物在所述试剂盒、所述包装或所述装置外部进行混合。

实施例19.根据实施例13到18中任一项所述的试剂盒、包装或装置，其中：

所述装置被配置成将所述纤维蛋白原的流动流和所述凝血酶的单独流动流引导到汇聚点，并且由此促进所述混合，并且

所述流动流中的至少一个流动流包括所述血小板裂解物。

实施例20.根据实施例13到19中任一项所述的试剂盒、包装或装置，其中所述第一隔室和所述第二隔室中的任一个或两者和/或第三隔室包括细胞(例如，哺乳动物细胞、人细胞)。

实施例21.根据实施例13到20中任一项所述的试剂盒、包装或装置，其中所述血小板裂解物包括人血小板裂解物或由其组成。

实施例22.根据实施例13到21中任一项所述的试剂盒、包装或装置，其中所述血小板裂解物不含或基本上不含抗凝血剂(例如，肝素)或者包括小于以下的抗凝血剂(例如，肝素)：10％(v/v)、9％(v/v)、8％(v/v)、7％(v/v)、6％(v/v)、5％(v/v)、4％(v/v)、3％(v/v)、2％(v/v)、1％(v/v)、0.5％(v/v)。

实施例23.根据实施例13到22中任一项所述的试剂盒、包装或装置，其中：

(i)所述第一隔室包括0.1-20mg/ml纤维蛋白原；所述第二隔室包括1-40U/ml凝血酶；并且所述装置包括总共5-40％(v/v)血小板裂解物；或者

(ii)所述第一隔室包括0.1-15mg/ml纤维蛋白原；所述第二隔室包括1-30U/ml凝血酶；并且所述装置包括总共5-40％(v/v)血小板裂解物；或者

(iii)所述第一隔室包括0.1-12mg/ml纤维蛋白原；所述第二隔室包括1-25U/ml凝血酶；并且所述装置包括总共7-14％(v/v)血小板裂解物；或者

(iv)所述第一隔室包括0.5-10mg/ml纤维蛋白原；所述第二隔室包括1-10U/ml凝血酶；并且所述装置包括总共0.5-20％(v/v)血小板裂解物。

实施例24.根据实施例13到22中任一项所述的试剂盒、包装或装置，其中：

(i)所述第一隔室包括小于2mg/ml(例如，约0.8mg/ml)纤维蛋白原；所述第二隔室包括0.5-20U/ml(例如，约1U/ml、约10U/ml、约20U/ml)凝血酶；并且所述装置包括总共5-40％(v/v)(例如，约20％(v/v))血小板裂解物；或者

(ii)所述第一隔室包括1-16mg/ml(例如，约8mg/ml)纤维蛋白原；所述第二隔室包括0.5-20U/ml(例如，约1U/ml、约10U/ml、约20U/ml)凝血酶；并且所述装置包括总共5-40％(v/v)(例如，约20％(v/v))血小板裂解物；或者

(iii)所述第一隔室包括5-15mg/ml(例如，约10mg/ml)；所述第二隔室包括0.5-20U/ml(例如，约1U/ml、约10U/ml、约20U/ml)凝血酶；并且所述装置包括总共5-40％(v/v)(例如，约20％(v/v))血小板裂解物。

实施例25.根据实施例13到22中任一项所述的试剂盒、包装或装置，其中：

(i)所述第一隔室包括0.8mg/ml纤维蛋白原，并且

所述第二隔室包括约2U/ml、约10U/ml或约20U/ml凝血酶，并且

所述装置包括总共约20％(v/v)血小板裂解物；或者

(ii)所述第一隔室包括约8mg/ml纤维蛋白原，并且

所述第二隔室包括约2U/ml、约10U/ml或约20U/ml凝血酶，并且

所述装置包括总共约20％(v/v)血小板裂解物；或者

(iii)所述第一隔室包括约20mg/ml纤维蛋白原，并且

所述第二隔室包括约2U/ml、约10U/ml或约20U/ml凝血酶，并且

所述装置包括总共约10％(v/v)血小板裂解物。

实施例26.根据实施例13到22中任一项所述的试剂盒、包装或装置，其中由所述凝血酶、所述纤维蛋白原和所述血小板裂解物混合产生的调配物包括：

(i)至少0.2mg/ml纤维蛋白原、至少1单位/mL凝血酶和约10％(v/v)血小板裂解物；或者

(ii)约20％(v/v)血小板裂解物、约2mg/mL纤维蛋白原和约5U/mL凝血酶。

实施例27.根据实施例13到26中任一项所述的试剂盒、包装或装置，其中所述第一隔室和所述第二隔室不包括所述血小板裂解物。

实施例28.根据实施例13到27中任一项所述的试剂盒、包装或装置，其中所述第一隔室和所述第二隔室是等体积或小于以下不同体积的液体调配物：1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％。

实施例29.一种制备组合物的方法，所述方法包括：

(i)提供以下：

包括纤维蛋白原的第一调配物和包括凝血酶的第二调配物，其中所述第一调配物不与所述第二调配物接触；以及

(ii)将所述第一调配物和所述第二调配物与血小板裂解物一起混合以由此提供所述组合物。

实施例30.根据实施例29所述的方法，其中在所述混合之前，所述血小板裂解物与包括纤维蛋白原的所述第一调配物组合，并且不与包括凝血酶的所述第二调配物组合。

实施例31.根据实施例29所述的方法，其中在所述混合之前，所述血小板裂解物不与包括凝血酶的所述第二调配物组合。

实施例32.根据实施例29所述的方法，其中在所述混合之前，所述血小板裂解物不与包括纤维蛋白原的所述第一调配物组合或者不与包括凝血酶的所述第二调配物组合。

实施例33.根据实施例29到32中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将以下中的任何一种或多种与所述第一调配物和所述第二调配物以及血小板裂解物混合：离子、离子源、氨基酸、纤连蛋白、麻醉剂、抗生素、生长因子(例如，hEGF)、组织因子XIII、基质蛋白(例如，胶原蛋白)。

实施例34.根据实施例29到33中任一项所述的方法，其中：

所述离子是钙离子，或者

所述离子源是离子盐和/或包括钙离子。

实施例35.根据实施例29到34中任一项所述的方法，其进一步包括将细胞(例如，哺乳动物细胞、人细胞)与所述第一调配物和所述第二调配物混合。

实施例36.根据实施例29到35中任一项所述的方法，其中所述血小板裂解物包括人血小板裂解物或由其组成。

实施例37.根据实施例29到36中任一项所述的方法，其中所述血小板裂解物不含或基本上不含抗凝血剂(例如，肝素)或者包括小于以下的抗凝血剂(例如，肝素)：10％(v/v)、9％(v/v)、8％(v/v)、7％(v/v)、6％(v/v)、5％(v/v)、4％(v/v)、3％(v/v)、2％(v/v)、1％(v/v)、0.5％(v/v)。

实施例38.根据实施例29到37中任一项所述的方法，其中：

(i)所述第一调配物包括0.1-20mg/ml纤维蛋白原；所述第二调配物包括1-40U/ml凝血酶；并且所述第一调配物和/或所述第二调配物包括总共5-40％(v/v)血小板裂解物；或者

(ii)所述第一调配物包括0.1-15mg/ml纤维蛋白原；所述第二调配物包括1-30U/ml凝血酶；并且所述第一调配物和/或所述第二调配物包括总共5-20％(v/v)血小板裂解物；或者

(iii)所述第一调配物包括0.1-12mg/ml纤维蛋白原；所述第二调配物包括1-25U/ml凝血酶；并且所述第一调配物和/或所述第二调配物包括总共7-14％(v/v)血小板裂解物；或者

(iv)所述第一调配物包括0.2-10mg/ml纤维蛋白原；所述第二调配物包括2-20U/ml凝血酶；并且所述第一调配物和/或所述第二调配物包括总共8-12％(v/v)血小板裂解物。

实施例39.根据实施例29到37中任一项所述的方法，其中：

(i)所述第一调配物包括小于1mg/ml(例如，约0.4mg/ml)纤维蛋白原；所述第二调配物包括0.5-20U/ml(例如，约1U/ml、约10U/ml、约20U/ml)凝血酶；并且所述第一调配物和/或所述第二调配物包括总共5-40％(v/v)(例如，约20％(v/v))血小板裂解物；或者

(ii)所述第一调配物包括1-8mg/ml(例如，约4mg/ml)纤维蛋白原；所述第二调配物包括0.5-20U/ml(例如，约1U/ml、约10U/ml、约20U/ml)凝血酶；并且所述第一调配物和/或所述第二调配物包括总共5-40％(v/v)(例如，约20％(v/v))血小板裂解物；或者

(iii)所述第一调配物包括5-15mg/ml(例如，约10mg/ml)；所述第二调配物包括0.5-20U/ml(例如，约1U/ml、约10U/ml、约20U/ml)凝血酶；并且所述第一调配物和/或所述第二调配物包括总共5-40％(v/v)(例如，约20％(v/v))血小板裂解物。

实施例40.根据实施例29到37中任一项所述的方法，其中：

(i)所述第一调配物包括约0.4mg/ml纤维蛋白原，并且

所述第二调配物包括约2U/ml、约10U/ml或约20U/ml凝血酶，并且

所述第一调配物和/或所述第二调配物包括总共约10％(v/v)血小板裂解物；或者

(ii)所述第一调配物包括约4mg/ml纤维蛋白原，并且

所述第二调配物包括约2U/ml、约10U/ml或约20U/ml凝血酶，并且

所述第一调配物和/或所述第二调配物包括总共约20％(v/v)血小板裂解物；或者

(iii)所述第一调配物包括约10mg/ml纤维蛋白原，并且

所述第二调配物包括约2U/ml、约10U/ml或约20U/ml凝血酶，并且

所述第一调配物和/或所述第二调配物包括总共约10％(v/v)血小板裂解物。

实施例41.根据实施例29到37中任一项所述的方法，其中所述组合物包括：

(i)至少0.2mg/ml纤维蛋白原、至少1单位/mL凝血酶和约20％(v/v)血小板裂解物；或者

实施例42.根据实施例29到41中任一项所述的方法，其中所述第一调配物和所述第二调配物等体积或小于以下不同体积：1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％。

实施例43.根据实施例29到42中任一项所述的方法，其中所述将所述第一调配物和所述第二调配物与所述血小板裂解物混合在一起包括：

产生包括所述纤维蛋白原的第一流动流、包括所述凝血酶的第二流动流和任选地第三流动流，其中所述流动流最初彼此分离，以及

将所述流动流组合在一起；

并且其中所述第一流动流、所述第二流动流和/或所述第三流动流中的任何一个或多个包括所述血小板裂解物。

实施例44.一种组合物，其通过根据实施例29到43中任一项所述的方法获得或可通过其获得。

实施例45.一种根据实施例13到28中任一项所述的试剂盒、包装或装置的用途，其用于将包括纤维蛋白原、凝血酶和血小板裂解物的调配物应用于受试者的组织。

实施例46.一种治疗受试者的组织的方法，所述方法包括将根据实施例1到12中任一项所述的或根据实施例44所述的组合物应用于所述组织。

实施例47.根据实施例1到12中任一项所述的或根据实施例44所述的组合物，其用于治疗受试者的组织。

实施例48.一种包括纤维蛋白原的第一调配物和包括凝血酶的第二调配物的用途，其用于制备用于治疗受试者的组织的药物，其中所述药物进一步包括血小板裂解物。

实施例49.根据实施例48所述的用途，其中所述药物进一步包括以下中的任何一种或多种：离子、离子源、氨基酸、纤连蛋白、麻醉剂、抗生素、生长因子(例如，hEGF)、组织因子XIII、基质蛋白(例如，胶原蛋白)。

实施例50.根据实施例48或实施例49所述的用途，其中所述药物进一步包括细胞(例如，哺乳动物细胞、人细胞)。

实施例51.一种包括纤维蛋白原的第一调配物、包括凝血酶的第二调配物和任选地第三调配物，其用于同时用于治疗受试者的组织，其中所述第一调配物、所述第二调配物和/或所述任选的第三调配物中的任何一种或多种包括血小板裂解物。

实施例52.根据实施例51所述的调配物，其中：

所述第一调配物、所述第二调配物和/或所述任选的第三调配物中的任何一种或多种包括以下中的任何一种或多种：离子、离子源、氨基酸、纤连蛋白、麻醉剂、抗生素、生长因子(例如，hEGF)、组织因子XIII、基质蛋白(例如，胶原蛋白)。

实施例53.根据实施例51或实施例52所述的调配物，其中：

所述第一调配物、所述第二调配物和/或所述任选的第三调配物中的任何一种或多种包括细胞(例如，哺乳动物细胞、人细胞)。

实施例54.根据实施例49或实施例50所述的用途或根据实施例52到53所述的调配物，其中：

所述离子是钙离子，或者

所述离子源是离子盐和/或包括钙离子。

实施例55.根据实施例48到50中任一项所述或根据实施例54所述的用途或根据实施例51到54中任一项所述的调配物，其中：

所述血小板裂解物包括人血小板裂解物或由其组成。

实施例56.根据实施例48到50、54或55中任一项所述的用途或根据实施例51到55中任一项所述的调配物，其中：

所述血小板裂解物不含或基本上不含抗凝血剂(例如，肝素)或者包括小于以下的抗凝血剂(例如，肝素)：10％(v/v)、9％(v/v)、8％(v/v)、7％(v/v)、6％(v/v)、5％(v/v)、4％(v/v)、3％(v/v)、2％(v/v)、1％(v/v)、0.5％(v/v)。

实施例57.根据实施例48到50或54到56中任一项所述的用途或根据实施例51到56中任一项所述的调配物，其中：

(i)所述第一调配物包括0.1-20mg/ml纤维蛋白原；所述第二调配物包括1-40U/ml凝血酶；并且所述药物或所述调配物包括总共5-40％(v/v)血小板裂解物；或者

(ii)所述第一调配物包括0.1-15mg/ml纤维蛋白原；所述第二调配物包括1-30U/ml凝血酶；并且所述药物或所述调配物包括总共5-15％(v/v)血小板裂解物；或者

(iii)所述第一调配物包括0.1-12mg/ml纤维蛋白原；所述第二调配物包括1-25U/ml凝血酶；并且所述药物或所述调配物包括总共7-14％(v/v)血小板裂解物；或者

(iv)所述第一调配物包括0.2-10mg/ml纤维蛋白原；所述第二调配物包括2-20U/ml凝血酶；并且所述药物或所述调配物包括总共8-12％(v/v)血小板裂解物。

实施例58.根据实施例48到50或54到56中任一项所述的用途或根据实施例51到56中任一项所述的调配物，其中：

(i)所述第一调配物包括小于1mg/ml(例如，约0.4mg/ml)纤维蛋白原；所述第二调配物包括0.5-20U/ml(例如，约1U/ml、约10U/ml、约20U/ml)凝血酶；并且所述药物或所述调配物包括总共5-40％(v/v)(例如，约20％(v/v))血小板裂解物；或者

(ii)所述第一调配物包括1-8mg/ml(例如，约4mg/ml)纤维蛋白原；所述第二调配物包括0.5-20U/ml(例如，约1U/ml、约10U/ml、约20U/ml)凝血酶；并且所述药物或所述调配物包括总共5-40％(v/v)(例如，约20％(v/v))血小板裂解物；或者

(iii)所述第一调配物包括5-15mg/ml(例如，约10mg/ml)；所述第二调配物包括0.5-20U/ml(例如，约1U/ml、约10U/ml、约20U/ml)凝血酶；并且所述药物或所述调配物包括总共5-40％(v/v)(例如，约20％(v/v))血小板裂解物。

实施例59.根据实施例48到50或54到56中任一项所述的用途或根据实施例51到56中任一项所述的调配物，其中：

(i)所述第一调配物包括约0.4mg/ml纤维蛋白原，并且

所述第二调配物包括约2U/ml、约10U/ml或约20U/ml凝血酶，并且

并且所述药物或所述调配物包括总共约20％(v/v)血小板裂解物；或者

(ii)所述第一调配物包括约4mg/ml纤维蛋白原，并且

所述第二调配物包括约2U/ml、约10U/ml或约20U/ml凝血酶，并且

(iii)所述第一调配物包括约10mg/ml纤维蛋白原，并且

所述第二调配物包括约2U/ml、约10U/ml或约20U/ml凝血酶，并且

并且所述药物或所述调配物包括总共约20％(v/v)血小板裂解物。

实施例60.根据实施例48到50或54到56中任一项所述的用途或根据实施例51到56中任一项所述的调配物，其中当所述药物或所述调配物包括：

(ii)约10％(v/v)血小板裂解物、约2mg/mL纤维蛋白原和约5U/mL凝血酶。

实施例61.根据实施例48到50或54到56中任一项所述的用途或根据实施例46到51中任一项所述的调配物，其中：

所述第一调配物和所述第二调配物等体积或小于以下不同体积：1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％。

实施例62.根据实施例45、48到50或54到61中任一项所述的用途、根据实施例51到61中任一项所述的调配物、或根据实施例46所述的方法或根据实施例47所述的组合物，其中所述组织是眼组织(例如，角膜组织)。

实施例63.根据实施例45、48到50或54到61中任一项所述的用途、根据实施例51到61中任一项所述的调配物、或根据实施例46所述的方法或根据实施例47所述的组合物，其中所述组织包括伤口或为包括伤口的眼组织(例如，包括伤口的角膜组织)。

实施例64.根据实施例45或54到62中任一项所述的方法，其中所述调配物使用三维(3D)生物打印应用于所述受试者的所述组织。

实施例65.根据实施例48到50或54到62中任一项所述的方法，其中用于治疗所述受试者的所述组织的药物使用三维(3D)生物打印。

实施例66.根据实施例46所述的方法，其中所述组合物使用三维(3D)生物打印应用于所述组织。

实施例67.根据实施例47所述的组合物，其中所述治疗所述组织利用三维(3D)生物打印。

实施例68.根据实施例51到62中任一项所述的调配物，其中所述治疗所述组织利用三维(3D)生物打印。

定义

如本申请中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”以及“所述(the)”包含复数的指代，除非上下文清楚地另外指明。例如，术语“组分”还包含多种组分。

如本文所使用的，术语“包括(comprising)”意指“包含(including)”。词语“包括(comprising)”的变化形式(“包括(comprise)”和“包括(comprises)”)具有相应不同的含义。因此，例如，“包括”组分“A”的组合物可以仅由组分A组成或可以包含一种或多种另外的组分(例如组分“B”和/或组分“C”)。

如本文所使用的，术语“受试者”包含具有经济、社会或研究重要性的任何动物，包含牛、马、绵羊、灵长类、鸟类和啮齿物种。因此，“受试者”可以是哺乳动物，例如人或非人哺乳动物。

如本文所使用的，术语“组织”将被理解为涵盖作为组织的一种或多种组分的细胞和由组织形成的一个或多个器官两者。

如本文所使用的，术语“试剂盒”是指用于递送材料的任何递送系统。此类递送系统包含允许储存、运输或递送反应试剂(例如，适当的容器中的标签、参考样品、支持材料等)和/或从一个位置到另一位置的支持材料(例如，用于执行测定的缓冲液、书面说明等)。例如，试剂盒可以包含一个或多个含有相关反应试剂和/或支持材料的外壳，如盒子。术语“试剂盒”包含片段化试剂盒和组合的试剂盒两者。“片段化试剂盒”是指包括各自含有全部试剂盒组件的子部分的两个或更多个单独容器的递送系统。容器可以一起或单独地递送给预期的接受者。包括各自含有全部试剂盒组件的子部分的两个或更多个单独容器的任何递送系统包含在术语“片段化试剂盒”的含义内。“组合试剂盒”是指在单个容器中(例如，在容纳期望的组件中的每个组件的单个盒子中)含有反应测定的所有组件的递送系统。

如本文所使用的，术语“约”在参考所引用的数值使用时包含所引用的数值和在所引用的数值的正负百分之十之内的数值。

本文中对现有技术文档的任何描述或本文中衍生自或基于这些文档的陈述，均不承认文档或衍生的陈述是相关技术的公知常识的一部分。

出于描述的目的，除非另有说明，本文所引用的所有文档均通过引用以其全文并入本文。

附图说明

现在将参考附图，仅通过举例来描述本发明的优选实施例，其中

图1是示出针对(A)生物油墨1、(B)生物油墨2、(C)生物油墨3、(D)生物油墨4、(E)生物油墨5、(F)生物油墨6、(G)生物油墨7、(H)生物油墨8、(I)生物油墨9(参考表3)，根据本发明的实施例的组合物在34℃下在1Hz的时间扫描振荡下持续10分钟的储能(G')和损失(G”)模量的一系列图。

图1图例：

图2提供了示出针对生物油墨调配物1-9(参考表3)，根据本发明的实施例的组合物的粘度的图，如在34℃的固定温度下在介于0.1s^-1与100s^-1之间的剪切速率斜升下以帕斯卡秒为单位所测量的。

图2图例：

10％hPL+2mg/mLFI+5U/mLT

..........10％hPL+0.2mg/mLFI+1U/mLT 10％hPL+2mg/mLFI+10U/mLT

10％hPL+0.2mg/mLFI+5U/mLT ..........10％hPL+5mg/mLFI+1U/mLT

10％hPL+0.2mg/mLFI+10U/mLT 10％hPL+5mg/mLFI+5U/mLT

10％hPL+2mg/mLFI+1U/mLT--10％hPL+5mg/mLFI+10U/mLT

图3示出了指示针对生物油墨调配物1-9(参见表3)，根据本发明的实施例的组合物在可见光谱(400-700nm)的波长上的平均透射率百分比的图。

图3图例：

10％hPL+2mg/mLFI+5U/mLT

..........10％hPL+0.2mg/mLFI+1U/mLT 10％hPL+2mg/mLFI+10U/mLT

10％hPL+0.2mg/mLFI+5U/mLT ..........10％hPL+5mg/mLFI+1U/mLT

10％hPL+0.2mg/mLFI+10U/mLT 10％hPL+5mg/mLFI+5U/mLT

10％hPL+2mg/mLFI+1U/mLT --10％hPL+5mg/mLFI+10U/mLT

图4是根据本发明的生物油墨5(参见表3)的实施例的组合物的图像，所述生物油墨粘附到载玻片上。

图5提供了示出针对生物油墨1-9(参见表3)，如通过Inuccyte Zoom测量的HCE-T细胞随时间的平均汇合度(每种条件下n＝6)的图。

图5图例：

...0.2_1

0.2_5

...0.2_10

2_1

2_5

2_10

5_1

5_5

...5_10

图6提供了示出原代人角膜细胞在生物油墨5(表3)中培养以及生长的一系列图像。(A)显示出角膜上皮细胞从角膜外植体中增殖出来。(B)显示出角化细胞的生长。(C)显示出角膜神经元生长。(D)显示出角膜内皮细胞生长。

图7提供了显示出SHSY-5Y在根据本发明的生物油墨5(表3)的实施例的生物油墨调配物中的成功生长的图像。(A)显示出油墨中的细胞生长。(B)显示出细胞在油墨中达到完全汇合。

图8示出了在根据本发明的实施例的生物油墨调配物中培养的球状聚集体的图像(A和B)。(C)示出了从球状聚集体生长的角膜角化细胞。

图9提供了根据本发明的生物油墨5(表3)的实施例的组合物通过2到7天的吸收进行吸收和降解的图像。

图10提供了示出HCE-T细胞(每种条件下n＝3)在5％人血小板裂解物(hPL)、5％胎牛血清(FBS)和仅DMEM中的划痕测定结果的图像(A)和曲线图(B)。在仅DMEM条件下未观察到伤口闭合。(A)显示出在0小时、5小时和24小时的伤口闭合的表示(顶行0小时；中间行5小时；底行24小时；左列5％hPL；中间列5％FBS；右列仅DMEM)。(B)显示出在5％hPL条件(0.19±0.01微米/小时)和5％FBS条件(0.18±0.03)下观察到的划痕愈合速率±SEM。5％FBS与5％hPL之间的愈合速率没有显著差异(p>0.05)。

图11提供了示出先前被拒绝用于移植用途的离体溃疡人角膜的再上皮化的图像。在第1天和第4天应用生物油墨，并在第7天固定、冷冻切片并用H&E染色。(A)显示出初始溃疡，其中溃疡区域以红色强调。(B)显示出伤口清创后无上皮的表面的大小。(C)显示出角膜的中心部分的H&E染色，并示出了完全再上皮化，其厚度和形态与健康人角膜相当。(D)显示出去上皮化角膜的中心部分的H&E染色，以进行比较。(i)：上皮；(ii)：基质；(iii)：上皮缺失；(iv)：基质

图12提供了显示出验尸后猪角膜上穿孔(直径1cm)的产生和成功密封的图像。(A)描绘了穿孔的产生。(B)描绘了泄漏的角膜。(C)描绘了用应用器装置应用生物油墨。(D)描绘了生物油墨应用后2分钟的密封穿孔。

图13提供了展示本发明的生物油墨分层打印的图像。

图14示出了本发明的打印的生物油墨的图像，其包括用Hoescht(蓝色)染色或碘化丙锭(红色)染色的P18 HCET细胞。A和B：挤出后2小时；C和D：挤出后72小时。

图15示出了根据本发明的实施例的打印的生物油墨组合物的透明度。

图16示出了根据本发明的生物油墨在浸入测试后在载玻片上的图像。根据表5，A.示出了组合物1，B.示出了组合物2，C.示出了组合物3，D.示出了组合物4，E.示出了组合物5，F.示出了组合物6，E.示出了组合物7。

图17是示出用本发明的生物油墨处理的人角膜伤口(1.5mm)能够防止泄漏的力的水平的图。A：1.63N，即，112mmHg；B.1.33N，即，105mmHG；C：-.71N，即，56mmHG。

图18是示出本发明的生物油墨能够承受以生物油墨密封的1.5mm直径的穿孔的平均破裂压力(mmHg±SEM)的图。

图19是示出本发明的生物油墨的粘度±SEM在固定剪切速率为1s^-1(以帕斯卡秒(Pa.s)为单位测量)下随时间(以秒为单位，n＝3)变化的图。在t＝60秒时添加组分B。凝结时间被定义为粘度达到添加后峰值所需的时间，并用粉红色虚线表示。在1s^-1的固定剪切速率下，凝结时间被确定为25秒。

图20提供了伤口愈合随时间变化的图像：(i)具有用本发明的生物油墨处理的角膜上皮伤口的兔子的眼睛(列B)；以及(ii)具有用氰丙烯酸盐(histoacryl)处理的角膜上皮伤口的对照兔子的眼睛(列A)。在t＝52小时，在对照兔子和治疗兔子两者中均实现了伤口愈合。-(伤口产生之前)；数字(伤口产生之后的小时数)。

图21是描绘如在直到实现伤口愈合的时间(t＝52小时)内所测量的图20的对照兔子的疼痛评分的图。记录施用另外的镇痛的时间点。1：施用氯胺酮(ketamine)(拯救镇痛)；2：施用美沙酮(methadone)(拯救镇痛)；3：施用丁丙诺啡(buprenorphine)(IM)；4.施用美洛昔康(meloxicam)。

图22是描绘在直到实现伤口愈合的时间(t＝52小时)内所测量的图20的生物油墨处理的兔子的疼痛评分的图。记录施用另外的镇痛的时间点。1：施用丁丙诺啡(IM)；2：施用美洛昔康。

图23提供了伤口愈合随时间变化的图像，其中：(i)用本发明的生物油墨处理的各自具有角膜穿孔的两只兔子的眼睛(列A和B)；以及(ii)具有用氰丙烯酸盐处理的角膜穿孔的对照兔子的眼睛(列C)。当实现角膜穿孔伤口愈合时，标记粉红色边界。当继发性溃疡形成愈合时，标记绿色边界。在t＝80小时观察到对照兔子中的角膜穿孔伤口愈合，并且分别在t＝28小时和t＝32小时观察到治疗兔子中的角膜穿孔伤口愈合。A：生物油墨处理的兔子2；B：生物油墨处理的兔子2；C：对照兔子.数字(伤口产生的小时数)。

图24是描绘如在直到实现完全伤口愈合的时间(t＝80小时)内所测量的图23的对照兔子(列C)的疼痛评分的图。记录施用另外的镇痛的时间点。A：施用丁丙诺啡(IM)；B：施用美洛昔康；C：无氰丙烯酸盐；D：继发性溃疡形成。

图25是描绘如在直到实现完全伤口愈合的时间(t＝52小时)内所测量的图23的生物油墨处理的兔子(列A)的疼痛评分的图。记录施用另外的镇痛的时间点。A：继发性溃疡形成；B：施用丁丙诺啡(IM)；施用美洛昔康。

图26是描绘如在直到实现完全伤口愈合的时间(t＝48小时)内所测量的图23的生物油墨处理的兔子(列B)的疼痛评分的图。记录施用另外的镇痛的时间点。A：继发性溃疡形成；B：施用丁丙诺啡(IM)；施用美洛昔康。

图27提供了伤口愈合随时间变化的图像，其中：(i)兔子的具有用本发明的生物油墨处理的经修饰的角膜穿孔的眼睛(列A)；以及(ii)对照兔子的具有用氰丙烯酸盐处理的经修饰的角膜穿孔的眼睛(列C)。当实现经修饰的角膜穿孔伤口愈合，标记粉红色边界。当继发性溃疡形成愈合时，标记绿色边界。在t＝48小时观察到对照兔子中的经修饰的角膜穿孔愈合，并且在t＝8小时观察到治疗兔子中的角膜穿孔愈合。列A：生物油墨处理的兔子2；列B：对照兔子.数字(伤口产生的小时数)。

图28是描绘以下疼痛评分的图：(i)如在实现完全伤口愈合之前所花费的时间(t＝48小时)内测量的图27的对照兔子(黑线)(列B)；以及(ii)在实现完全伤口愈合之前所花费的时间(t＝8小时)内测量的图27的生物油墨治疗的兔子(较浅色的线)(列A)。记录施用另外的镇痛的时间点。没有向生物油墨处理的兔子施用另外的镇痛剂。A：施用丁丙诺啡(IM)；B：施用美沙酮(methadone)(拯救镇痛)；C：施用美洛昔康；D：无氰丙烯酸盐和继发性溃疡形成。图28图例：

对照物

墨水

图29示出了(A)生物油墨样品在-40摄氏度下冷冻干燥的图像；(B)用每管50uL水重构(A)的冷冻干燥样品，以澄清液体；以及(C)在重构之后形成的粘合剂和透明凝胶。

具体实施方式

本发明人已经开发了促进以结构形式应用到组织的具有机械和结构特性的血小板裂解物组合物。具体地，本发明的组合物可以用于使用二维或三维生物打印技术将血小板裂解物应用到组织(例如，眼睛)。所述组合物提供了将药剂递送到生物靶标(例如，器官、组织、细胞)的装置。尽管适于在治疗角膜损伤中应用，本文所描述的组合物通过提供例如结构支持、活细胞和其它促进伤口愈合过程的因子，为伤口愈合领域中的多种治疗提供了平台。在本领域中需要用于伤口如眼表面伤口的有效的血液衍生治疗。本文所描述的组合物基于血小板裂解物，所述血小板裂解物在眼睛治疗的上下文中不仅润滑眼表面以充当泪液替代物，而且提供了促进伤口愈合的多种生长因子和细胞因子的来源。本文所描述的组合物可以利用模仿体内组织并充当细胞填充的支架的生物材料，和/或通过条件的操纵来鼓励细胞自身再生其周围的基质。在其适于应用于眼组织的上下文中，本发明人例如解决了产生基质的困难，所述基质可以体现在治疗下组织(例如，角膜)的结构完整性，同时维持透明度并且仍然是多孔且生物相容的以足以允许角膜细胞的浸润、迁移和/或增殖以及所需促进愈合的生长因子。在提供受损组织的营养需要与同时满足受损组织(例如，眼组织如角膜)的结构、机械和物理要求之间的平衡是本发明出现时存在的问题。本发明提供了用于将药剂递送到各种不同的生物靶标的改进的组合物和方法。在不限于任何特定应用的情况下，组合物可以用于治疗伤口和其它形式的组织损伤。

用于递送生物药剂的组合物

本发明提供了适于将药剂递送到如组织和细胞等生物靶标的组合物。

组合物利用基础支架材料在应用于生物靶标(例如，组织、膜、细胞、器官)时提供结构支持，以促进药剂向生物靶标的递送和/或促进受损组织的再生和/或生物靶标内的细胞。

关于用于生成支架的具体一种或多种材料不存在特别限制。

例如，支架可以是纤维蛋白支架。这些可以例如通过在组合物中使用纤维蛋白原和凝血酶来产生。如本领域技术人员已知的，纤维蛋白原向纤维蛋白的转化通常发生在三个阶段。凝血酶可以催化第一阶段，所述阶段是有限的蛋白水解，以从纤维蛋白原中释放出纤维蛋白肽(FpA和FpB)，并且由此提供纤维蛋白单体。在第二阶段中，纤维蛋白单体可以通过非共价相互作用形成中间体聚合物。在第三阶段中，中间聚合物可以聚集以形成三维纤维蛋白基质。纤维蛋白形成及其在生物支架中的用途描述于例如Ahmed等人(《组织工程部分B综述(Tissue Eng Part B Rev.)》,2008年6月；14(2):199-215)中。

本发明的组合物可以进一步任选地包括离子和/或离子源。合适离子的非限制性实例包含钙离子。合适的离子源的非限制性实例包含包括钙的化合物(例如，氯化钙)。

本发明的组合物可以包含血小板裂解物。血小板裂解物可以例如是哺乳动物血小板裂解物(例如，使用人、犬、猫、牛、猪、马、山羊(caprine)、山羊(hircine)、鼠类、野兔、仓鼠科动物(cricetine)或鼬鼠科动物(musteline)血小板或其任何组合产生的血小板裂解物)。用于生成血小板裂解物的血小板来源通常取决于要使用组合物的具体目的。如本领域普通技术人员已知的，血小板裂解物是通过分离血小板、裂解所述血小板并去除细胞碎片而生成的。血小板裂解物的成分及其应用已得到很好的分析(参见例如，Burnouf等人,《生物材料(Biomaterials.)》2016年1月；76:371-87)。

本发明人已经鉴定了本发明的组合物的纤维蛋白原、凝血酶和血小板裂解物的最佳相对浓度，其中一些在本申请的实施例和权利要求中描述。应当理解，所公开的纤维蛋白、凝血酶和血小板裂解物的相对浓度是仅示例性的。

根据本发明的组合物可以包含细胞。细胞可以例如是哺乳动物细胞(例如，人细胞、犬细胞、猫细胞、牛细胞、猪细胞、马细胞、山羊细胞(caprine cells)、山羊细胞(hircine cells)、鼠类细胞、野兔细胞、仓鼠科动物细胞或鼬鼠科动物细胞或其任何组合)。所利用的细胞的类型通常将取决于要使用组合物的具体目的。例如，细胞可以是与要向其施用组合物的组织相同的类型(例如，眼表面细胞，包含中心和/或外周角膜上皮、延髓和/或睑结膜上皮、睑结膜基质和/或眼睑边缘的细胞；皮肤细胞，包含但不限于角化细胞、黑色素细胞、默克尔细胞和朗格汉斯细胞；以及神经组织细胞，包含但不限于神经元和神经胶质细胞。其它实例包含上皮细胞、角化细胞、神经元细胞和内皮细胞。在一些实施例中，细胞可以是造血干细胞、骨髓干细胞、神经干细胞、上皮干细胞、皮肤干细胞、肌肉干细胞、脂肪干细胞、多能干细胞、诱导的多能干细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞或其任何组合。在一些实施例中，细胞可以是神经元细胞。

组合物的血小板裂解物和/或细胞可以是自体的(即，自衍生于旨在接受组合物的给定受试者或(即，供体衍生的))。

本发明的组合物可以包括必需和/或非必需氨基酸。合适的必需氨基酸的非限制性实例包含异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸和精氨酸。

本发明的组合物可以包括另外的组分(例如，一种或多种药剂)，包含但不限于纤连蛋白、麻醉剂、抗生素、生长因子(例如，人表皮生长因子(hEGF)、血小板衍生的生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、上皮生长因子、转化生长因子[包含β]和结缔组织生长因子)、纤维蛋白稳定因子(例如，组织因子XIII)、一种或多种基质蛋白(例如，胶原蛋白、层粘连蛋白、整联蛋白)及其任意组合。

本发明的组合物可以包含其它合适的成分，包含水和/或培养基(例如，DMEM、DMEM/F-12、MEM、CnT-PR)。培养基可以包括例如甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬酰胺-H₂O、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐-H₂O、L-胱氨酸2HCl、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐-H2O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸，L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐二水合物、L-缬氨酸、维生素、生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺吡哆醇盐酸盐、核黄素、硫胺盐酸盐、维生素B12、i-肌醇、无机盐、氯化钙(CaCl₂)(无水)、硫酸铜(CuSO₄-5H₂O)、硝酸铁(Fe(NO₃)₃"9H₂O)、硫酸铁(FeSO₄-7H₂O)、氯化镁(无水)、硫酸镁(MgSO₄)(无水)、氯化钾(KCl)、碳酸氢钠(NaHCO₃)、氯化钠(NaCl)、无水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)、磷酸二氢钠(NaH2PO₄-，硫酸锌(ZnSO₄-7H₂O)、其它组分、D-葡萄糖(右旋糖)、次黄嘌呤Na、亚油酸、硫辛酸、腐胺2HCl、丙酮酸钠、胸苷或其任何组合中的任何一种或多种。

在一些实施例中，组合物不包括抗凝血剂或为基本上不含可能仅以痕量存在的抗凝血剂。这些抗凝血剂的非限制性实例包含肝素、维生素K拮抗剂(例如，华法林(Warfarin)、香豆素)、利伐沙班(Rivaroxaban)、依度沙班(Edoxaban)、阿哌沙班(Apixaban)、达比加群(Dabigatran)等。

组合物的非限制性特性包含以下中的一种或多种：

-非牛顿剪切致稀流体特性，由此组合物的粘度可以随剪切速率的增加而降低。在一些实施例中，组合物的粘度在室温下可以介于0.01与1000Pa.s的范围内。

-在不妨碍或基本上不妨碍由光的透射产生的视觉的情况下的光学清晰度，例如，在400-700nm的视觉颜色范围内超过90％。

-具有在打印后维持或基本上维持形状/结构的能力的打印(例如，生物打印/挤出打印)的适用性。

-在打印过程期间在维持组合物中的细胞活力的同时用于打印的适用性。

-在包含或不包含活细胞的情况下，以二维或三维结构提供的能力。

-维持和/或促进细胞生长的能力(例如，维持和/或促进原代人细胞如上皮细胞、角化细胞、神经元细胞和内皮细胞的扩增生长)。

-促进球状类器官形成的能力。

-随时间(例如，2-7天)被细胞降解的能力。

-随时间(例如7天)变化的伤口愈合能力(例如，角膜溃疡)。

-随时间(例如，在34℃下7天)维持细胞活力。

-粘附到包含组织、器官、膜(例如，哺乳动物和人组织、器官、膜)的各种表面的能力。

伤口愈合组合物的制备

本发明的组合物包括血小板裂解物(例如，哺乳动物血小板裂解物、人血小板裂解物)。血小板裂解物可以通过任何合适的方法制备(例如，通过冷冻/解冻裂解；参见例如，Chou和Burnouf,《ISBT科学系列(ISBT Science Series)》,第12卷,第1期,2017年2月,第168-175页)。

另外，本发明人已经观察到在血小板裂解物制备期间(例如，当培养时)抗凝血剂的使用可以对血小板裂解物形成根据本发明的组合物的能力产生影响。因此，在本发明的一些实施例中，在制备方法的一些或全部阶段中，在不使用抗凝血剂(例如，肝素)的情况下制备所利用的血小板裂解物。

通常，本发明的组合物可以通过组合多种不同的调配物来制备。在一些实施例中，可以将包括凝血酶的制剂与包含纤维蛋白原的制剂分开维持，并且将两种制剂在应用组合物之前或期间组合。

例如，可以将包括纤维蛋白原和血小板裂解物的第一制剂与包括凝血酶的第二制剂混合以提供本发明的组合物。可替代地，可以将包括纤维蛋白原的第一制剂与包括凝血酶和血小板裂解物的第二制剂混合以提供本发明的组合物。可以在任何合适的时间(例如，在混合阶段之前)以任何合适的方式将另外的组分(例如，离子、离子源、氨基酸、细胞、抗生素、生长因子、纤维蛋白稳定因子、麻醉剂等)掺入到组合物中。在一些实施例中，另外的组分中的一些或所有组分(即，除了纤维蛋白原和凝血酶之外的组分)可以包含在包括凝血酶的制剂和/或包括纤维蛋白原的制剂中。在其它实施例中，另外的组分中的一些或所有组分(即，除了纤维蛋白原和凝血酶之外的组分)可以在与包括凝血酶或纤维蛋白原的那些制剂分开的一种或多种制剂中提供。在仍其它实施例中，另外的组分中的一些组分(即，除了纤维蛋白原和凝血酶之外的组分)可以包含在包括凝血酶的制剂和/或包括纤维蛋白原的制剂中，并且另外的组分中的一些组分(即，除了纤维蛋白原和凝血酶之外的组分)可以包含在与包括凝血酶或纤维蛋白原的那些制剂分开的一种或多种制剂中。

在一些实施例中，可以通过建立分离的组分的单独的流动流来制备组合物。这些流可以在合适的时间段内维持连续流动的状态，并被定向为在给定点彼此混合，以由此提供沉积在生物靶标上的混合组分的另外的流。可替代地，可以使流被定向为在组合物所应用到的生物靶标的表面处或表面上彼此混合。

在一些实施例中，本发明提供促进分离形成本发明组合物所需的不同制剂直至使用的装置和/或试剂盒。通常，装置和试剂盒可以包括至少两个物理上分开的隔室，第一个包括凝血酶制剂，并且第二个包括纤维蛋白原制剂。在一些实施例中，一个或两个隔室可以包括要在生成组合物中使用的另外的组分(例如，血小板裂解物、离子、氨基酸、细胞、抗生素、生长因子、纤维蛋白稳定因子、麻醉剂等)。

装置和试剂盒可以进一步包括提供促进两种分隔的制剂混合的装置的组分，例如，通过去除将第一隔室和第二隔室分开的屏障，和/或通过刺穿一个或两个隔室的密封件或壁。技术人员将容易理解，可以为此目的进行各种布置。

另外地或可替代地，可以以确保在将制剂从装置或试剂盒释放期间或之后将两种分隔的制剂混合的方式配置装置和试剂盒。

在一些实施例中，装置和试剂盒可以包括另外的隔室，所述另外的隔室包括要在生成组合物中使用的另外的组分(例如，血小板裂解物、离子、氨基酸、细胞、抗生素、生长因子、纤维蛋白稳定因子、麻醉剂等)。装置或试剂盒可以以在装置或试剂盒的使用期间促进这些另外的组分彼此混合和/或与纤维蛋白原和/或凝血酶的一种或多种制剂混合的这种方式配置。

装置和试剂盒可以促进在从装置或试剂盒中排出组分之前、期间或之后立即混合分离的组分。

在一些实施例中，装置和试剂盒可以提供建立分离的组分的单独流的装置。这些流可以在使用装置或试剂盒期间维持连续流动的状态，并可以被定向为在给定点彼此混合。混合点可以位于装置或试剂盒内、在流离开装置或试剂盒的位点处或在装置或试剂盒外部(例如，在组合物要应用的生物靶标的表面处或之前)。在一些实施例中，组合物是生物油墨，并且装置是三维(3D)打印机(例如，挤出打印机)。

组合物的应用

本发明人已经开发了一种用于将一种或多种药剂递送到靶组织和细胞的组合物，其特征在于其高度适于生物打印。除了在伤口愈合中的治疗应用中使用所述组合物之外，本发明的组合物还可以在治疗应用和/或组织培养方法中使用，在所述治疗应用中，需要应用递送药剂(例如，天然生长因子、药物、纳米颗粒和/或细胞)和/或需要用于固定单个生物表面。

在一些实施例中，组合物可以充当伤口密封剂和/或生物结构的固定剂。其可以为伤口提供结构和/或营养支持。另外地或可替代地，组合物可以促进一种或多种靶细胞类型的生长，包含可以作为伤口区域中存在的组合物和/或细胞的组分提供的那些。

尽管对于可以应用组合物的组织类型没有限制，但是本发明人已经证明了组合物在治疗眼伤口中高度有效。

例如，本文证明了组合物有效治疗角膜伤口。在这些实施例中，组合物可以用于促进角膜上皮细胞的增殖和/或迁移。组合物可以例如支持角膜上皮细胞的多方向生长和/或分层，一旦形成细胞单层，其可以部分或完全生物降解组合物。

因此，本发明提供了治疗伤口的方法，以及为这种治疗方法制造的药物。伤口可以例如定位于眼组织中或周围，包含中心和/或外周角膜上皮、延髓和/或睑结膜上皮、睑结膜基质和/或眼睑边缘。

本领域普通技术人员将理解的是，在不脱离如广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对如在具体实施例中公开的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本实施例在所有方面都应被认为是说明性的而非限制性的。

实例

现在将参考具体实施例描述本发明，所述实施例不应以任何方式构成限制。

实例一：生物油墨组合物的制备和表征

-材料和方法

(i)血小板裂解物的制备

药物人血小板裂解物是由澳大利亚红十字会血液服务局通过以下两种方法制备：

1.单采血液成分术

a.通过单采血液成分术获得血小板。

b.将血小板在4摄氏度下储存5天。

c.血小板裂解物浓度由于单采血液成分术过程而较高，但含有

d.血小板裂解物是通过多个冻融周期制备的，在每轮中均通过opti-press离心并清除碎片，并且然后在-80℃下储存。

2.池化

a.将血袋悬挂，并通过在线过滤分离出红细胞。

b.在袋子中旋转血浆，并且然后通过opti-press将血浆分离到血浆/血小板浓度达到30％。

c.留在袋子中的血小板产物通过管焊机汇集在封闭系统中。

d.将汇集的血小板在4摄氏度下储存5天。

e.将汇集的血小板单位汇集为2升的批次(捐赠50-70次)。

f.然后将汇集的血小板单位离心并去除上清液，以获得约2×10¹¹血小板浓度。

g.血小板裂解物是通过多个冻融周期制备的，通过opti-press离心并清除碎片，并且然后在-80℃下储存。

注意：

●制备的所有hPL在-80℃下稳定长达12个月。

●由于低于30％的低血浆浓度，汇集的血小板没有发生纤维蛋白原减少。

●其通过最终离心和无菌过滤在封闭系统中制备，以去除病原体。

●所有血小板在储存之前都经过伽马辐照，没有使用病原体灭活技术。

从红十字会血库获得的裂解物在4℃下解冻过夜，然后放置于37℃水浴中持续2小时。此后，如果立即使用，则将其储存在4℃或-80℃下直至需要。

(ii)生物油墨制备

制造了包括血小板裂解物、凝血酶和纤维蛋白原的药物组合物(“生物油墨组合物”)。在一些情况下，生物油墨组合物包含另外的成分，如离子(例如，钙)、药学上可接受的必需氨基酸(例如，异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸和/或精氨酸)、纤连蛋白、人内皮生长因子、组织因子XIII、麻醉剂、抗生素、其它生长因子(包含但不限于血小板衍生的生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、上皮生长因子、转化生长因子(包含β)和/或结缔组织生长因子)和/或其它成分/赋形剂(参见表1)。

表1：生物油墨的组合物

通过首先制备两种单独的溶液A和B(参见表2)来制造组合物，在应用生物油墨之前将其混合在一起。不需要完全混合，并且部分混合足以引起生物油墨的形成。

表2：两种溶液混合以形成生物油墨

-结果和讨论

通过在将溶液A和B混合形成透明且无色凝胶来生产生物油墨。注意到了生物油墨的以下特性。

-生物油墨是非牛顿剪切致稀流体，由此其粘度随剪切速率的增加而降低。生物油墨在室温下的粘度介于0.01与1000Pa.s的范围内。

-由于在400-700nm的视觉颜色范围内透光率超过90％，因此生物油墨是光学透明的，并且不会妨碍视觉。

-如流变学所确定的，生物油墨可以通过挤出打印维持其可打印性，并且一旦挤出就可以保持其形状。

-生物油墨可以粘附到组织上。

-在没有次级支持培养基的情况下，生物油墨可以维持并促进组织培养物中的细胞的生长。

-生物油墨可以维持并促进人原代细胞(如上皮细胞、角膜细胞、神经元细胞和内皮细胞)的扩增生长。

-生物油墨促进球状类器官的形成。

-细胞可以在2到7天的时间段内降解生物油墨，并再吸收生物油墨基质。

-生物油墨可以在7天的过程中愈合伤口，如角膜溃疡。

-当在34℃下储存时，生物油墨可以将生物油墨内的细胞活力维持长达7天。

-生物油墨通过将细胞悬浮在第一组分中来实现3D细胞打印。

-生物油墨同时提供结构支持(支架)和营养支持两者，从而促进细胞生长和愈合。

-生物油墨促进多种细胞类型的生长。

生物油墨能够促进角膜中多种细胞类型的生长，从而使其能够充当延伸穿过角膜的多个层的伤口愈合治疗和/或促进人角膜外植体的神经元生长。SHSY5Y作为非角膜来源的神经元细胞系已在生物油墨中成功培养，从而允许用于跨越角膜的应用。

生物油墨能够在组织培养物种使用，以产生细胞的球状聚集体。与已知方法相比，可以以更简单的方式制造聚集体，并且无需通过酶消化组织或使用微孔即可生成球状体。

生物油墨用途广泛且可定制，并且可以针对个别患者的需求量身定制，涵盖了更广泛的应用范围，可以跨更多的病理学以及更多的组织类型延伸。自体血小板裂解物或来自供体的裂解物可以包含在生物油墨中，这取决于对患者最有利的物质。可以定制抗生素和麻醉剂/镇痛剂的浓度和类型，以靶向特异性感染/疾病，并应对潜在的患者过敏。在生物油墨中使用如胶原蛋白和其它蛋白质等组分以及不同浓度的各种因子的初步数据已经允许对其机械和营养特性进行修改和优化，以用于各种应用。

生物油墨可以用于以高分辨率填充眼部缺陷，其是液体，并且一旦混合就可以在几分钟内凝结在物质中，并且在伤口位点处不受温度的影响。生物油墨能够有效地填充缺陷并保持形状，以潜在地加速伤口愈合和/或减少临床所需的时间量。可以在使其与挤出和基于微滴的生物打印兼容的范围内提供生物油墨的剪切致稀特性。

生物油墨基本上是透明的，特征是除了促进角膜中的伤口愈合和细胞生长之外，对于保持视力是有利的。

因此，生物油墨可以为例如角膜细胞提供结构支持和营养支持两者，具有广泛的潜在应用范围，具有有利的物理特性，并已显示出在原代培养物中会生成神经元生长和球状聚集体。

实例二：生物油墨调配物的优化和示例性特性

-材料和方法

(i)试剂和抗生素

从Gibco公司购买不含酚红(DMEM/F12)、磷酸盐缓冲液(PBS)、TrypLE、青霉素/链霉素的达尔伯克氏改良的伊格尔氏培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium)/F12GlutaMax^TM。从红十字会血库获得人血小板裂解物。从康宁公司(Corning)(美国)购买胎牛血清(FBS)。从生命科技公司(Life Technology)(美国)购买人表皮生长因子(hEGF)、青霉素-链霉素[(P-S)，10,000U/mL]。从默克密理博公司(Merck-Millipore)(美国)购买纤维蛋白原和凝血酶。从西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(美国)购买苏木精和曙红。

(ii)样品募集

利翁NSW眼库(Lions NSW Eye Bank)经当地卫生区人类研究伦理委员会(LocalHealth District Human Research Ethics Committee)(HERC 14/275)的同意和伦理批准，提供了不适于移植的人角膜。所有手术均符合赫尔辛基宣言。

从悉尼眼科医院的视力基础训练实验室获得冷冻的猪眼。

(iii)划痕测定

将SV40永生化的人角膜上皮细胞系(HEC-T，日本里尔卡(Rilka,Japan))解冻并在5％FBS培养基(5％FBS、10ng/mL hEGF、5％P-S，DMEM/F12 glutmax)中培养直到80％汇合为止。然后将细胞传代到两个T-75烧瓶中，其中一个用5％FBS培养基培养，并且另一个在5％hPL培养基(5％hPL、10ng/mL hEGF、5％P-S、DMEM/F12)中生长直到80％汇合为止。然后将来自5％FBS的HCE-T细胞接种到24孔板(20,000个细胞/孔)的六孔中，并且留下直到完全汇合。同样，将来自5％hPL的HCE-T细胞以相同的密度接种在同一24孔板中的三孔中，并且留下直到完全汇合。培养基每2天进行更换。在刮擦前一天，用DMEM替代在5％FBS中培养的6孔中的三孔。在刮擦之后，使用具有4倍物镜的奥林巴斯(Olympus)DP70光学显微镜(奥林巴斯，美国)每2小时监测所有孔并捕获图像。所有图像均由图像J(v1.51)分析。针对前5个小时，将伤口闭合的速率计算为5个小时内伤口大小的减少。这在Excel(Microsoft)中进行计算，并在Prism(GraphPad软件公司(GraphPad)，美国)中进行图形化和统计分析。

(iv)生物油墨调配物测试

生物油墨制备

将接收到的hPL在4℃下解冻过夜，然后在37℃水浴中温育2小时。然后将hPL储存在4℃下储存直至进一步使用。

将纤维蛋白原溶解在37℃无菌水中，并以20mg/mL的浓度分装到1mL埃彭道夫管(Eppendorf tubes)中。使用前，将其储存在-20℃下并在37℃下解冻。

将凝血酶溶解于DMEM/F12中，并以20U/mL的浓度分装到1mL埃彭道夫管中。使用前，将其储存在-20℃下并在37℃下解冻。

生物油墨是通过将两种单独组分均匀混合而制成的：组分一在DMEM/F12中含有hPL和纤维蛋白原；并且组分二在DMEM/F12中含有凝血酶。测试了各种浓度的纤维蛋白原(0.2、2和5mg/mL)和凝血酶(1、5、10单位/mL)。所有生物油墨含有的初始浓度为20％hPL(表1)。

表3.测试了九种生物油墨调配物，其中列出了其单独组分组合物。测试的所有浓度均指预混合浓度。

流变学

通过AR-G2流变仪(热分析仪器公司(TA Instruments)，USA)检查所制备的油墨的流变特性。在所有测试中均使用2°/40mm锥板几何形状。进行时间扫描测试以确定在1HZ的恒定频率下和1％的应变下油墨的稠度。温度也保持恒定在34℃下以模仿角膜表面处的温度。测量了每种生物油墨(每种生物油墨，n＝3)的储能模量(G')和损耗模量(G”)在10分钟内作为时间的函数。使用Prism(GraphPad公司，美国)将数据制成表格，绘制图形并进行分析。

剪切致稀是基于挤出的生物打印的理想特性，因此，还通过流变仪测量了响应于应用的剪切应力的油墨粘度。对于每种生物油墨，在34℃的固定温度下测量了跨介于0.1s^-1与100s^-1之间的剪切速率斜升的粘度(每种生物油墨，n＝3)。使用Prism(GraphPad公司，美国)将数据制成表格，绘制图形并进行分析。

透明度

在可见光谱(400-700nm)范围内测量光的平均透射率。将机器对载玻片置零，并且随后将样品放置在载玻片上(每个样品，n＝3)并测量平均透射率。通过用油墨将“角膜”写在玻璃片上并保持在光线下，可以产生油墨的透明度的视觉表示。

细胞相容性

如上文所描述制备的生物油墨也用于细胞相容性测试。将HCE-T细胞(第23代)接种于96孔板中(6000细胞/孔，每种条件n＝6)，并使用Incucyte^TM(ZOOM，Essen生物科学有限公司(Essen BioScience Inc))在7天内每2小时测量汇合度。

所有后续实验均使用生物油墨5的一种调配物进行(表3，预混合浓度：20％hPL、4mg/mL纤维蛋白原、10U/mL凝血酶，DEME/F12)。

培养角膜外植体

从利翁NSW眼库获得角膜外植体。角膜缘区域和中心区域使用8mm trephine分隔。然后将角膜缘区域切成8个相等大小的尽可能多地去除巩膜的片，并将其放置在6孔板的一个孔中，并将中心区域切成8个相等大小的片，并放置在6孔板的另一个孔中。然后用2mL生物油墨5覆盖外植片(表3)。

(v)离体伤口愈合测试

用外科手术铲去除溃疡角膜的上皮(从利翁NSW眼库接收)，并用PBS冲洗。将生物油墨5(表3)立即应用于伤口表面上。然后将角膜悬浮在一罐器官培养基中。在第4天重新应用油墨。在第7天，用4％多聚甲醛将角膜固定过夜，用PBS冲洗两次，并且将其留在30％蔗糖中过夜。然后将角膜切成两半，浸入OCT化合物(Tissue-Tek公司，美国)中，在液氮中进行速冻，并在-80℃下储存直到切片。使用莱卡CM3050 S低温恒温器(德国莱卡生物系统公司(Leica Biosystems)，德国)在-20℃下将冷冻的角膜切成12μm的厚度，并且转移到聚赖氨酸涂覆的载玻片上，干燥并在-20℃下储存。对于迈尔的苏木精和曙红染色，将载玻片浸入95％乙醇中持续15秒，然后浸入4％多聚甲醛中进行10次浸入。然后将载玻片在蒸馏水中冲洗以进行10次浸入，并在苏木精中悬浮持续30秒。然后将载玻片分别浸入两次更换的蒸馏水中10次，然后再在95％乙醇中浸入另外的10次。然后将载玻片在曙红中复染持续15秒，然后在2次更换的95％乙醇和2次更换的100％乙醇中进行脱水，每次浸入10次。然后将载玻片分别浸入2次更换的二甲苯中10次，并安装在DPX(西格玛奥德里奇公司)中。用奥林巴斯DP70光学显微镜检查切片。使用人供体角膜作为阴性对照物，将其上皮去除并立即固定，切片并使用相同的方案进行染色。

(vi)离体穿孔测试

切除来自冷冻的猪眼(n＝3)的角膜，并且然后将其固定在巴伦人工前房中。通过与人工前房连接的注射器注射水使角膜膨胀。用金属针(直径1cm)在每个角膜上产生穿孔，并且观察到漏水以确认已经产生了全厚度的穿孔。然后将生物油墨5(表3)应用在有穿孔的位点处，并使其凝结持续2分钟。然后使角膜重新膨胀，并观察到任何随后的漏水。

(vii)培养非角膜来源的细胞系

解冻SHSY-5Y细胞，并将其在T-25烧瓶中的生物油墨5(表3)中进行培养。通过奥林巴斯DP70观察到细胞形态和汇合。当细胞达到80％汇合时将所述细胞进行传代，并记录传代次数。

用钙离子溶液和MEM产生生物油墨以替代生物油墨的DMEM/F12组分

使用氯化钙溶液(浓度为200mg/mL)和MEM替代生物油墨的DMEM/F12组分，并观察到最终产物发生胶凝。

(viii)统计分析

所有统计分析均在Prism(GraphPad公司，美国)上进行。使用T测试对两种单独的条件进行比较。在使用了三种或更多种调配物的情况下，则一种-

-结果和讨论

(i)划痕测定

用5％hPL和5％FBS处理的孔在24小时时以什么速率和分别以什么速率完全愈合(图1)。观察到没有显著差异(p>0.05)。24小时后在仅DMEM条件下未观察到伤口闭合。

(ii)流变学

时间扫描实验表明，生物油墨调配物2-9(表3)能够胶凝，因为储能模量大于损耗模量(图2)，并且油墨是一致的，因为两个模量随时间变化都稳定(图2)。随时间变化测量粘度表明，当所有生物油墨的粘度随剪切速率的增加而降低时(图3)，所有生物油墨调配物1-9(表3)表现出非牛顿的流体和剪切致稀行为。

(iii)透明度

油墨的所有变体(表3)对于可见光谱中的波长显示出超过85％的透明度(图4)。对油墨透明度的直接评估增强了油墨的可打印性，因为其可以挤出并保留形状，以及增强了透明度，因为通过油墨轻松看到建筑物(图5)。

(iv)细胞相容性

除了生物油墨调配6和9(表3)之外，细胞汇合度随时间增加，从而表明生物油墨调配物1-5和7-8支持细胞生长(图6)。在油墨中用预混合的浓度为20U/mL的凝血酶以及4和10mg/mL纤维蛋白原一起培养的细胞显示出平均汇合度没有增加。另外，随着纤维蛋白原浓度的增加，平均汇合速率也降低了。观察到角膜上皮细胞、角化细胞、内皮细胞和神经元细胞正在生物油墨中生长(图7)。一旦细胞开始移出外植体，也观察到了生物油墨的降解(图7a)。

(v)离体伤口愈合

与去上皮化的角膜相比，在用生物油墨处理的溃疡的角膜中观察到了多个细胞层(图8)。这证明了生物油墨能够促进离体溃疡的人角膜的完全再上皮化。

(vi)穿孔测试

所有三个穿孔的角膜均显示出在2分钟的凝结时间内具有油墨应用的完全伤口密封(图9)。

(vii)与其它细胞类型的相容性

SH-SY细胞能够达到汇合，并成功地培养了用来自表3的生物油墨进行测试的8代(图10)。

-讨论

开发了一种透明的、可打印的、生物相容的且可生物降解的血小板裂解物基油墨，其用于眼表面上的伤口愈合。5％hPL以与胎牛血清(FBS)相当的速率促进了角膜上皮细胞系的划痕愈合，这是目前在标准组织培养方案中使用的速率。通过向血小板裂解物添加纤维蛋白原和凝血酶，可能诱导3D纤维蛋白基质形成并操纵如生物相容性、强度和可打印性等特性。

据发明人所知，人血小板裂解物尚未用作独立的生物打印材料。这是因为单独的血小板裂解物不是足够强的基质，无法单独打印。血小板裂解物形成凝胶的能力取决于其制备方法。对于组织培养，通常将肝素添加到血小板裂解物中以防止血块形成。跨研究所使用的血液产物的凝结时间、离心作用和稀释程度各不相同，然而，已显示这些参数通常会影响血液产物的功效和特性。

通过开发两个独立的腔室(第一个含有20％hPL、4mg/mL纤维蛋白原、DMEM/F12)，并且混合来自两个腔室中的两种成分能够生成透明的、粘合的且可生物打印的油墨，实现了设置为直接位于伤口部位处的3D矩阵。时间扫描流变学实验(图2)表明，可打印油墨的最低要求由≥0.2mg/ml纤维蛋白原、>1单位/mL凝血酶和10％hPL(所有浓度均指预混合阶段)组成。hPL必须按照方法部分中所描述的进行制备以保持其生物活性，并且在hPL制备中则需要避免肝素，因为其会阻止纤维蛋白网的形成。所有油墨组合物跨可见光谱中的波长显示出高透明度，从而使此产物对于眼科应用是理想的(图4和5)。细胞相容性测试表明，油墨不能具有≥10U/mL凝血酶(图6)，才能产生有效的细胞汇合度。

通过细胞相容性和流变学数据的组合，观察到油墨中纤维蛋白原和凝血酶的有利预混合浓度分别为4mg/mL和10U/mL(表3中的生物油墨5)。在随后的离体研究中使用这些浓度，这表明生物油墨具有促进溃疡的人角膜的完全再上皮化的能力(图8)以及使直径1cm的完整穿孔密封的能力(图12)。另外，所有四种细胞类型均显示能够在生物油墨中生长(图7)，从而使此产物必须充当全厚度眼内应用。所有这些结果表明，生物油墨具有以3D打印方式治疗角膜伤口愈合的特性。

在角膜中使用3D打印的概念主要与从外部对整个或部分结构进行生物打印相关联，然而，体内打印的能力对于治疗各种大小且需要迅速注意的角膜伤口是有利的。商业上用于密封伤口的纤维蛋白胶是不透明的，已显示仅起到密封伤口的作用，并且由于其抑制角膜细胞迁移而不促进角膜细胞生长。这阻碍了自然的伤口愈合反应，并且因此阻碍了整体伤口愈合。生成的生物油墨掺入了结构支持纤维蛋白胶，可以提供允许细胞迁移和增殖的额外益处，并且还可以包含增强角膜再生的补充剂。

除了其可打印性之外，生物油墨提供促进细胞生长和愈合的结构支持和营养支持两者。此外，生物油墨产物的性质是通用的和可定制的，并且可以针对个别患者的需要进行量身定制，具有覆盖更多病理学和更多组织类型的广泛应用的潜力。自体血小板裂解物或来自供体的裂解物可以包含在生物油墨中，这取决于对患者最有利的物质。可以定制抗生素和麻醉剂/镇痛剂的浓度和类型，以靶向特异性感染/疾病，并应对潜在的患者过敏。生物油墨还可以用作药物递送工具，以延长半衰期并准确地将药物直接递送到伤口部位。其也可以用于将其它物质(如纳米颗粒)递送到靶向的部位。

球状细胞的形成是3D培养的指示(图11)。在过去的十年中，对开发用于角膜应用的3维细胞聚集体的兴趣日益浓厚。与2维单层细胞培养物相比，已显示3维细胞聚集体以更高的速率促进组织自组装。与单细胞原代培养物相比，此细胞培养方法特别有利，不仅因为此构型促进了更多的细胞间粘附，而且还因为其可以将细胞逆转为更年轻的后代，由此，这些细胞比其原代培养物等效物具有更强的祖细胞潜力，以更高的速度进行迁移和增殖，并具有增强的端粒酶活性和端粒长度。此细胞培养方法显示出对角膜伤口愈合应用的巨大希望。生物油墨可以用于3D培养中的替代性基质，并表示获得球状细胞的更简单方式。

最后，组织培养结果显示出生物油墨具有支持SHSY-5Y(非角膜衍生的神经元细胞系)的能力(图10)，从而表明此油墨的比角膜延伸得更广泛的潜在未来应用范围。

总之，本发明人开发了可生物打印、可生物降解、透明并且具有促进伤口愈合的特性的生物油墨。还设想了生物油墨具有另外的功能，如用于3D培养以生成球状细胞的工具、愈合其它组织中的伤口并充当疾病治疗的有效药物/物质载体的能力。

实例三：生物油墨调配物在层中进行三维打印

-方法

用胰蛋白酶处理P18 HCET细胞，并将其以1×10⁶细胞/mL的最终浓度悬浮于生物油墨中。然后将生物油墨挤出到培养皿中，并使其凝结持续2分钟。然后将另一层油墨正交挤出到顶部上，并且使其进行凝结。在光学显微镜下观察到两条线，以确定所述两条线是否仍然不同。

-结果

如图13所展示的，生物油墨可在不同的层中打印。

实例四：打印的生物油墨中细胞的存活

-方法

用胰蛋白酶处理P18 HCET细胞，并将其以1×10⁶细胞/mL的最终浓度悬浮于生物油墨中。然后将生物油墨挤出到培养皿中，并使其凝结持续2分钟。在挤压后2小时和72小时进行Hoescht和碘化丙锭(PI)活死染色，并用图像J.Hoechst染色(蓝色)染色所有细胞核，而PI染色(红色)仅染色死细胞来计算细胞活力。

-结果

图14A和14B示出了在挤出后2小时在相同区域中的Hoechst和碘化丙锭染色。图14C和14D示出了在挤出后72小时在相同区域中的Hoechst和碘化丙锭染色。

在两种情况下，图像J分析确定的细胞活力均超过90％，这意味着产物可以用作3D打印细胞的细胞载体。

实例五：钙离子在生物油墨形成中的作用

-方法

如表3所示对条件(每种条件n＝3)进行测试

表4：利用的条件

-结果

在含有不依赖钙离子的hPL的所有溶液中均获得透明凝胶。在不使用hPL但存在钙离子的情况下获得了不透明的凝胶。没有hPL并且没有钙离子导致纤维蛋白片漂浮在透明液体的顶部，并且没有形成凝胶。

hPL对于油墨的胶凝和透明度至关重要(图15)。生物油墨能够独立于钙离子形成。

实例六：向生物油墨添加组分。

-方法

将不同组分以各种浓度(表5)(每种调配物n＝3)添加到生物油墨中，并以3滴的形式挤出到载玻片上。使第一滴放置1分钟，第二滴放置2分钟，并且第三滴放置5分钟。然后在这些时间点对其进行“浸入测试”，由此将其浸入水中，并且然后用0.9％NaCl冲洗。最小放置时间由最短的时间点确定，在所述最短时间点，凝胶滴在“浸入测试”后中保留在载玻片上。

表5.对各种浓度的不同组分进行测试

-结果

所有组合物均能够在混合后5分钟时或以下凝结(表6)。图16示出了生物油墨在浸入测试后在载玻片上的图像。根据表5，A.示出了组合物1，B.示出了组合物2，C.示出了组合物3，D.示出了组合物4，E.示出了组合物5，F.示出了组合物6，E.示出了组合物7。

表6.不同组合物的最短凝结时间

组合物	凝结时间
		1(仅生物油墨)	2分钟
2(10μg/mL FXiii)	1分钟
		3(1μg/mL FXiii)	1分钟
4(CnT-PR)	5分钟
		5(内皮细胞特异性介质)	5分钟
6(3mg/mL胶原蛋白)	5分钟
		7(0.5mg/mL纤连蛋白)	2分钟

实例七：生物油墨作为眼表面密封剂的用途

-方法

此实例中的实验均使用生物油墨5的一种调配物进行(表3，预混合浓度：20％hPL、4mg/mL纤维蛋白原、10U/mL凝血酶，DEME/F12)。在从利翁NSW组织库获得的人角膜中央产生了直径约1.5mm的伤口。然后将角膜放置在汉纳(Hanna)人工前房(AAC)中。将生物油墨(n＝3)施用在伤口上并使其经受压力。测量没有密封剂的穿孔角膜表现出稳定泄漏时的压力，并将其作为系统固有的基线压力。确定密封剂失效的原因是观察到伤口泄漏并且将爆裂压力计算为：

并以mmHg记录。

-结果

结果(参见图17和18)表明，生物油墨可以用作小角膜穿孔的密封剂，并作为可商购获得密封剂如氰基丙烯酸酯胶的生物相容性替代物。在直径大约1.5mm的穿孔中，生物油墨能够承受91±27mmHg的平均压力。这远远超过了平均眼内压(10-22mmHg)。

实例八：凝结时间对固定剪切速率

-方法

此实例中的实验均使用生物油墨5的一种调配物进行(表3，预混合浓度：20％hPL、4mg/mL纤维蛋白原、10U/mL凝血酶，DEME/F12)。以1s^-1的固定剪切速率定量测量了生物油墨的凝结时间。在AR-G2流变仪(热分析仪器公司，美国)中还使用了库埃特杯(couette cup)和鲍勃粘度计(bob viscometer)几何形状来确定在生物油墨(n＝3)的固定剪切速率1s^-1下的粘度。将15mL组分A(20％hPL、4mg/mL hPL、DMEM/F12)倒入几何形状，并单独测量组分A的粘度持续60秒。然后，鲍勃暂停旋转5秒，在此期间添加15mL组分B(10U/mL凝血酶、DMEM/F12)。然后鲍勃重新开始旋转，并且测量粘度持续另外的180秒。使用Prism(GraphPad公司，美国)将数据制成表格，绘制图形并进行分析。建立凝结时间，并将其确定为在添加组分B之后达到稳定粘度所花费的时间。

-结果

当以1s^-1的固定剪切速率混合时，生物油墨在25秒内凝结(图19)。先前已经确定，当组分A和B在台式机上被动混合时，凝结时间为2-5分钟。这些结果表明剪切速率会影响凝结时间，这意味着在3D打印装置中挤出生物油墨的分辨率会影响生物油墨凝结的速度。

实例九：体内动物试验:

-方法

此实例中的实验均使用生物油墨5的一种调配物进行(表3，预混合浓度：20％hPL、4mg/mL纤维蛋白原、10U/mL凝血酶，DEME/F12)。

进行实验以确定生物油墨在体内角膜上皮伤口模型和体内角膜穿孔模型中是否促进/不阻碍伤口愈合，并确定其是否减轻了所经历的与伤口愈合过程相关联的疼痛。

受试者：雌性新西兰白化白兔

上皮伤口(兔子1和2)

1.将为兔子受试者准备使用SOP麻醉和镇痛兔子(混合室)手术(SOP-ANA_04_LAS麻醉和镇痛_兔子_20171130)和LAS SOP#38兔子处理和约束的手术。

2.在手术前，将丁丙诺啡贴片放置在兔子背部上。

3.通过去除眼周区域的皮毛来准备眼睑边缘。这是由兽医助理使用兽医剪(40号刀片)完成的。

4.眼表面和眼周皮肤表面区域准备有10％聚维酮-碘洗液。

5.将无菌外科手术盖布放置在暴露眼周区域的兔子上。

6.在手术期间，将儿科窥镜放置在眼睛中以保持通路。

7.然后用无菌盐水冲洗角膜，以去除10％聚维酮-碘洗液。

8.轻轻将外科手术矛应用于角膜，使表面干燥。

9.用3滴(约150微升)的30％乙醇制备5mm无菌角膜遮光罩(海绵)。然后将海绵放置在中心角膜表面持续20秒，以促进上皮细胞从下面的角膜层上松动。小心观察海绵是否有残留液体从海绵中泄露。这可以通过使用外科手术矛吸收另外的液体(如果需要的话)来改善。

10.然后使用外科手术钳去除角膜遮光罩/海绵，然后将其丢弃。然后使用外科手术矛来吸收角膜上残留的乙醇液体。

11.通过使外科手术矛穿过中心5mm区域来去除松动的上皮。如果上皮不能通过外科手术矛去除，则研究人员将使用无菌曲棍球状刀片轻轻地去除剩余的细胞。

12.如果将兔子视为研究兔子，则将生物油墨放置在中央5mm缺陷上。启动计时器持续120秒以确保充分粘附到暴露的角膜表面。

13.将抗生素滴眼剂放置在进行手术的眼睛中，并去除窥镜。向兔子提供0.5mg/kg美洛昔康。美洛昔康由兽医麻醉师施用。

14.研究者从外部检查伤口和周围区域，以确认不存在术中并发症。

15.一旦手术完成，将兔子移动到恢复处进行监测。在返回个人住房之前，将一滴潇莱威(Celluvisc)人工泪液放置在两只眼睛中。在使用抗生素滴眼剂之前，将潇莱威放置于进行手术的眼睛中，并且长达每2个清醒小时，直到伤口闭合。在一天的最后检查中，将不含新鲜的防腐剂的凝胶润滑剂放置在进行手术的眼睛中，以提供延长的过夜覆盖。这将一直持续直到伤口闭合，或者，如果研究者认为兔子受试者在裂隙灯检查下表现出表面刺激(例如，化学性、干燥或不规则的角膜表面)。

16.根据HT复合疼痛评分兔子文档，在整个工作小时内每2小时对疼痛进行评分。

17.常规检查每天进行4次，直到如通过裂隙灯生物显微镜表明伤口愈合为止(最多7天)，然后在伤口闭合后7天内每天检查一次，然后每星期一次，直到安乐死。

角膜穿孔(兔子3、4和5)

2.在手术前，将丁丙诺啡贴片放置在兔子背部上。

4.眼表面和眼周皮肤表面区域准备有10％聚维酮-碘洗液。

5.将无菌外科手术盖布放置在暴露眼周区域的兔子上。

6.在手术期间，将儿科窥镜放置在眼睛中以保持通路。

7.然后用无菌盐水冲洗角膜，以去除10％聚维酮-碘洗液。

8.轻轻将外科手术矛应用于角膜，使表面干燥。

9.使用刀片在角膜的外周区域中产生长度约2mm的完整穿孔。

10.如果将兔子视为研究兔子，则将生物油墨放置在穿孔上。启动计时器持续120秒以确保充分粘附到暴露的角膜表面。

11.如果将兔子视为对照兔子，则将可商购获得的氰丙烯酸盐放置于穿孔上。

12.将抗生素滴眼剂放置在进行手术的眼睛中，并去除窥镜。向兔子提供0.5mg/kg美洛昔康。美洛昔康由兽医麻醉师施用。

13.研究者从外部检查伤口和周围区域，以确认不存在术中并发症。

14.一旦手术完成，将兔子移动到恢复处进行监测。在返回个人住房之前，将一滴潇莱威人工泪液放置在两只眼睛中。在使用抗生素滴眼剂之前，将潇莱威放置于进行手术的眼睛中，并且长达每2个清醒小时，直到伤口闭合。在一天的最后检查中，将不含新鲜的防腐剂的凝胶润滑剂放置在进行手术的眼睛中，以提供延长的过夜覆盖。这将一直持续直到伤口闭合，或者，如果研究者认为兔子受试者在裂隙灯检查下表现出表面刺激(例如，化学性、干燥或不规则的角膜表面)。

15.根据HT复合疼痛评分兔子文档，在整个工作小时内每2小时对疼痛进行评分。

16.常规检查每天进行4次，直到如通过裂隙灯生物显微镜表明伤口愈合为止(最多7天)，然后在伤口闭合后7天内每天检查一次，然后每星期一次，直到安乐死。

经修饰的角膜穿孔(兔子6和7)

2.在手术前，将丁丙诺啡贴片放置在兔子背部上。

4.眼表面和眼周皮肤表面区域准备有0.2％聚维酮-碘洗液。

5.将无菌外科手术盖布放置在暴露眼周区域的兔子上。

6.在手术期间，将儿科窥镜放置在眼睛中以保持通路。

7.然后用无菌盐水冲洗角膜，以去除0.2％聚维酮-碘洗液。

8.轻轻将外科手术矛应用于角膜，使表面干燥。

9.使用刀片在角膜的外周区域中产生长度约2mm的完整穿孔。

-结果

每只兔子的概述

外科手术第1天，2018年8月20日

兔子1-ID编号：233665，于2018年7月11日到达(第1组-2只中的1只)。

用30％乙醇进行清创术手术

Tx.-生物油墨

结果-中度结膜炎症，伤口仅在48小时后愈合。

兔子2-ID编号：233666，于2018年7月11日到达(第1组-2只中的2只)。

用乙醇进行清创术手术

Tx.-对照物(仅抗生素滴剂)

结果-严重结膜炎症和球结膜水肿，病变扩大一倍，疼痛最初难以控制，但在第二天大为改善。伤口仅在48小时后愈合。

外科手术第2天，2018年9月3日

兔子3-ID编号：239686，于2018年8月1日到达(第2组-5只中的1只)。

穿孔手术

Tx.-生物油墨

结果-中度结膜炎症和继发性溃疡形成，穿孔在32小时愈合，并且继发性溃疡在52小时愈合。

兔子4-ID编号：239685，于2018年8月1日到达(第2组-5只中的2只)。

穿孔手术

Tx.-生物油墨

结果-中度结膜炎症和继发性溃疡形成，穿孔在28小时愈合，并且继发性溃疡在48小时愈合。

兔子5-ID编号：239684，于2018年8月1日到达(第2组-5只中的3只)。

穿孔手术

Tx.-对照物(氰基丙烯酸酯胶)

结果-中度结膜炎症和球结膜水肿。兔子非常不舒服，并且采用适当的疼痛管理策略，现在兔子也不那么不舒服了。在56小时观察到继发性溃疡形成，但是现在已经在72小时愈合。穿孔伤口在80小时愈合。

外科手术第3天，2018年9月4日-实施了将聚维酮碘浓度从5％降低到0.2％并添加了润滑滴眼剂

兔子6-ID编号：239687，于2018年8月1日到达(第2组-5只中的4只)。

穿孔手术

Tx.-生物油墨

结果-8小时愈合，无并发症。无需从第一丁丙诺啡贴片中获得另外的镇痛作用。

兔子7-ID编号：239688，于2018年8月1日到达(第2组-5只中的5只)。

穿孔手术

Tx.-对照物(氰基丙烯酸酯胶)

结果-兔子最初因中度结膜炎和显著的球结膜水肿而明显疼痛，这似乎与氰基丙烯酸酯胶的位置有关。考虑了安乐死，然而，其似乎对施用美沙酮有应答，并于当晚开始进食。在今天早上(第2天)进行检查后，兔子似乎对经成功管理的疼痛感到更舒服-其仍然不舒服但没有痛苦。伤口在48小时已经愈合，并且所述兔子现在很舒服。

在上皮缺陷伤口模型(兔子1和2)中，对照兔子和治疗兔子在同一时间点实现了伤口愈合(图20)。向治疗兔子施用显著减少的术后镇痛，并且总体疼痛评分低于对照兔子所经历的疼痛的评分(图21和22)。疼痛评分是基于对包含过度眨眼、睑痉挛、眼睛摩擦、睑痉挛和流泪和眼睛摩擦的指标的评估。

在角膜穿孔模型(兔子3、4和5)中，与对照兔子(t＝80小时)相比，在治疗兔子中发生伤口愈合的速度显著更快(t＝28和t＝32小时)(图23)。与对照兔子(图24)相比，总体上也向治疗兔子施用更少的术后镇痛(图25和26)。

在经修饰的角膜穿孔模型(兔子6和7)中，与对照组(t＝48小时)相比，在治疗兔子中发生伤口愈合的速度显著更快(t＝8小时)(图27)。未对治疗兔子施用术后镇痛，并且与对照组相比，所记录的疼痛评分显著低于治疗兔子的疼痛评分(图28)。

生物油墨可生物相容，并且不会阻碍角膜伤口愈合。这些结果表明，与常规的治疗选项相比，生物油墨减轻与角膜损伤相关联的疼痛，并且还可以加速角膜穿孔的伤口愈合。

实例十：生物油墨的冻干和重构

-方法

●制备了50uL的生物油墨组分A和B。

组分A在DMEM/F12中包含20％hPL、4mg/mL纤维蛋白原，并且组分B在DMEM/F12中包含10U/mL凝血酶。两种组分的最终体积均为50uL。一旦混合，其提供与生物油墨5(表3，预混合浓度：20％hPL、4mg/mL纤维蛋白原、10U/mL凝血酶，DEME/F12)相同的调配物。

●将样品在-40度下冷冻干燥(图29A)

●在几秒钟内用每管50uL水进行重构(图29B)

●混合并形成粘合剂和透明凝胶(图29C)

-结果

视觉评估表明，生物油墨在重构后2分钟内仍可以固化。观察到其是粘性的(连接到图29C的尖端)并且是透明的。(图29C)。

Claims

1.一种组合物，其包括0.2-5 mg/ml纤维蛋白原、5-10 U/mL凝血酶和5-10 %（v/v）血小板裂解物。

2.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包括以下中的任何一种或多种：离子、氨基酸、纤连蛋白、麻醉剂、抗生素、生长因子、组织因子XIII、基质蛋白。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述离子包括钙离子。

4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述生长因子包括人表皮生长因子（hEGF）。

5.根据权利要求2所述的组合物，其中所述基质蛋白包括胶原蛋白。

6.根据权利要求1到5中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括包含所述离子和所述氨基酸的培养基。

7.根据权利要求1到5中任一项所述的组合物，其中所述离子是包含在所述组合物中的离子盐溶液的组分。

8.根据权利要求1到5中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括细胞。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述细胞是人细胞。

11.根据权利要求1到5中任一项所述的组合物，其中所述血小板裂解物包括人血小板裂解物或由其组成。

12.一种试剂盒、包装或装置，其包括：

-包括纤维蛋白原的第一隔室和包括凝血酶的第二隔室，其中所述试剂盒、所述包装或所述装置被配置成在将所述纤维蛋白原和所述凝血酶装载到所述试剂盒、所述包装或所述装置期间和之后，使所述第一隔室的所述纤维蛋白原与所述第二隔室的所述凝血酶分离；

-血小板裂解物；

-用于促进所述第一隔室的所述纤维蛋白原与所述第二隔室的所述凝血酶以及所述血小板裂解物混合的装置：

其中：

所述第一隔室包括0.2-5 mg/ml纤维蛋白原；所述第二隔室包括5-10 U/mL凝血酶；并且所述装置包括总共5-10%（v/v）血小板裂解物。

13.根据权利要求12所述的试剂盒、包装或装置，其中所述第一隔室包括所述纤维蛋白原和所述血小板裂解物，并且所述第二隔室包括所述凝血酶。

14.根据权利要求12或13所述的试剂盒、包装或装置，其中：

-任何所述隔室进一步包括以下中的任何一种或多种：离子、氨基酸、纤连蛋白、麻醉剂、抗生素、生长因子、组织因子XIII、基质蛋白；或者

-所述试剂盒、所述包装或所述装置包括另外的隔室，所述另外的隔室包括以下中的任何一种或多种：离子、氨基酸、纤连蛋白、麻醉剂、抗生素、生长因子、组织因子XIII、基质蛋白；其中所述试剂盒、所述包装或所述装置被配置成在所述试剂盒、所述包装或所述装置的装载期间和之后，使所述另外的隔室的内含物与其它隔室的内含物分离。

15.根据权利要求14所述的试剂盒、包装或装置，其中所述生长因子包括hEGF。

16.根据权利要求14所述的试剂盒、包装或装置，其中所述基质蛋白包括胶原蛋白。

17.根据权利要求14所述的试剂盒、包装或装置，其中：

所述离子是钙离子。

18.根据权利要求12所述的试剂盒、包装或装置，其中：

（i）所述第一隔室和所述第二隔室中的任一个或两者和/或第三隔室包括细胞；和/或

（ii）其中所述血小板裂解物包括人血小板裂解物或由其组成。

19.根据权利要求18述的试剂盒、包装或装置，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

20.根据权利要求18述的试剂盒、包装或装置，其中所述细胞是人细胞。

21.根据权利要求1到5中任一项所述的组合物在制备用于治疗受试者的伤口的药物中的用途，其中所述伤口位于所述受试者的角膜。

22.根据权利要求21所述的用途，其中使用三维（3D）生物打印将所述药物应用于所述伤口。