CN112877435B

CN112877435B - 口腔鳞癌生物标志物及其应用

Info

Publication number: CN112877435B
Application number: CN202110210190.XA
Authority: CN
Inventors: 潘灏; 唐瞻贵; 王月红; 刘斌杰; 白新娜; 刘欧胜; 全宏志; 周玥颖; 方小丹; 王柏胜; 邓智元; 顾立群
Original assignee: XIANGYA STOMATOLOGICAL HOSPITAL CENTRAL SOUTH UNIVERSITY
Current assignee: XIANGYA STOMATOLOGICAL HOSPITAL CENTRAL SOUTH UNIVERSITY
Priority date: 2021-02-24
Filing date: 2021-02-24
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2041-02-24
Also published as: CN112877435A

Abstract

本发明公开了口腔鳞癌生物标志物及其应用，所述生物标志物为RP11‑733O18.1，或RP11‑733O18.1与AC108142.1或RP13‑297E16.4的组合，本发明公开了生物标志物在制备诊断口腔鳞癌的产品中的应用；本发明同时公开了生物标志物在制备治疗口腔鳞癌的药物组合物中的应用。

Description

口腔鳞癌生物标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及口腔鳞癌生物标志物及其应用。

背景技术

根据2018年全球癌症调查显示，口腔癌是世界最常见的恶性肿瘤之一，其死亡人数占所有癌症死亡人数的1.9％，死亡人数位列第14位，男性发病率明显高于女性，约为女性的2.54倍(Bray F,Ferlay J,Soerjomataram I,et al.Global cancer statistics2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36cancers in185countries[J].CA:A Cancer Journal for Clinicians,2018,68(6):394-424.)。口腔鳞癌为其中常见的类型(Jan J,Hsu W,Liu S,et al.Prognostic Factors in PatientsWith Buccal Squamous Cell Carcinoma:10-Year Experience[J].Journal of Oral andMaxillofacial Surgery,2011,69(2):396-404)。口腔鳞状细胞癌临床上可表现为长久不愈的溃疡、反复糜烂的扁平苔癣、白、红色斑块、质硬不可移动的肿块等。其治疗以外科手术为主。近年来随外科技术和诊断技术不断发展精进，目前OSCC患者的生存率有了显著提升。然而，仍然有很多患者治疗效果不佳，表现为治疗后出现局部区域型复发和远处转移，生存率仍不容乐观。随着关于OSCC的研究逐渐增多，越来越多研究者们认为基因在OSCC诊治中起着重要的作用。

随着现代医学技术的进步，组学研究为医学的进步带来了前所未有的帮助，基因组研究揭示了很多复杂人类疾病的分子机制。而第二代测序技术的发展为基因组学的研究提供了高准确性，高通量，高灵敏度，和低运行成本的研究手段，这种技术已经广泛应用于寻找疾病的候选基因当中(Shridhar K,Walia GK,Aggarwal A,et al.DNA methylationmarkers for oral pre-cancer progression:A critical review[J].Oral Oncol,2016,53:1-9.)。寻找与口腔鳞癌相关的基因对于实现口腔鳞癌的诊断和治疗具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与口腔鳞癌相关的生物标志物，该标志物可以用于诊断受试者是否患有口腔鳞癌或者患口腔鳞癌的风险。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了检测样本中生物标志物的试剂在制备诊断口腔鳞癌的产品中的应用，其特征在于，所述生物标志物包括RP11-733O18.1。

进一步，所述生物标志物还包括AC108142.1或RP13-297E16.4的一种或两种。

进一步，所述生物标志物为RP11-733O18.1和AC108142.1的组合。

进一步，所述生物标志物为RP11-733O18.1和RP13-297E16.4的组合。

进一步，所述生物标志物为RP11-733O18.1、AC108142.1和RP13-297E16.4的组合。

进一步，所述试剂包括测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测生物标志物水平的试剂。

进一步，所述试剂选自：

特异性识别所述生物标志物的探针；或

特异性扩增所述生物标志物的引物。

进一步，所述样本选自组织、血液。

本发明的第二方面提供了一种诊断口腔鳞癌的产品，所述产品包含进行DNA微阵列、寡核苷酸微阵列、RNA印迹法、RNase保护试验和反转录聚合酶链反应所必需的DNA芯片、寡核苷酸芯片、探针或引物，以检测样本中生物标志物的表达，所述生物标志物包括RP11-733O18.1。

进一步，所述生物标志物为RP11-733O18.1和AC108142.1的组合。

进一步，所述生物标志物为RP11-733O18.1和RP13-297E16.4的组合。

进一步，所述产品还包括处理样本的试剂。

本发明的第三方面提供了生物标志物在构建预测口腔鳞癌的计算模型或者嵌入了所述计算模型的系统中的应用，所述生物标志物包括RP11-733O18.1。

进一步，所述生物标志物为RP11-733O18.1和AC108142.1的组合。

进一步，所述生物标志物为RP11-733O18.1和RP13-297E16.4的组合。

进一步，所述计算模型以生物标志物的水平作为输入变量，通过生物信息学方法进行运算。

本发明的第四方面提供了RP11-733O18.1在制备治疗口腔鳞癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括RP11-733O18.1的抑制剂。

进一步，所述抑制剂为特异性降低RP11-733O18.1表达的试剂。

进一步，所述抑制剂为干扰RNA。

本发明的第五方面提供了一种治疗口腔鳞癌的药物组合物，所述药物组合物包括RP11-733O18.1的抑制剂。

进一步，所述抑制剂为特异性降低RP11-733O18.1表达的试剂。

进一步，所述抑制剂为干扰RNA。

本发明所述的产品可用于检测包括RP11-733O18.1、AC108142.1和RP13-297E16.4基因在内的多个基因(例如，与口腔鳞癌发展进程相关的多个基因)的表达水平。

本发明的优点和有益效果：

本发明选择RP11-733O18.1作为生物标志物，可以诊断受试者是否患有口腔鳞癌或者判断受试者患有口腔鳞癌的风险，从而指导医生适时的采取治疗策略、手段及措施。

附图说明

图1是生物标志物在口腔鳞癌组织中的表达情况图，其中，图A是RP11-733O18.1在口腔鳞癌组织中的表达情况图；图B是AC108142.1在口腔鳞癌组织中的表达情况图；图C是RP13-297E16.4在口腔鳞癌组织中的表达情况图；

图2是生物标志物作为检测变量的ROC曲线图，其中，图A是RP11-733O18.1作为检测变量的ROC曲线图；图B是RP11-733O18.1、AC108142.1与RP13-297E16.4联合作为检测检测变量的ROC曲线图。

具体的实施方式

在本发明中，术语“生物标志物”意指化合物，优选是基因，与来自具有第二表型(例如没有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品相比，它在来自具有第一表型(例如患有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品中差异地存在(即增加或减少)。术语“生物标志物”通常是指一种基因的存在/浓度/含量或两种或更多种基因的存在/浓度/含量。

生物标志物可以在任何水平上差异地存在，但是一般以如下的水平存在，所述水平增加了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、或更多；或一般以如下的水平存在，所述水平减少了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％(即不存在)。

优选地，生物标志物以具有统计显著性(即p值小于0.05和/或q值小于0.10，如使用韦尔奇氏T检验(Welch's T-test)或Wilcoxon秩和检验(Wilcoxon's rank-sum Test)所确定)的水平差异地存在。

在本发明的具体实施方式，所述生物标志物包括RP11-733O18.1、AC108142.1和RP13-297E16.4。

在本发明中，RP11-733O18.1(ensembl基因ID：ENSG00000236120)包括RP11-733O18.1基因及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的RP11-733O18.1，以及源自细胞中加工的任何形式的RP11-733O18.1。该术语涵盖RP11-733O18.1的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。

AC108142.1(ensembl基因ID：ENSG00000177822)包括AC108142.1基因及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的AC108142.1，以及源自细胞中加工的任何形式的AC108142.1。该术语涵盖AC108142.1的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。

RP13-297E16.4(ensembl基因ID：ENSG00000223511)包括RP13-297E16.4基因及其同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的RP13-297E16.4，以及源自细胞中加工的任何形式的RP13-297E16.4。该术语涵盖RP13-297E16.4的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。

在本发明中，可以使用任何合适的方法来分析生物样品以确定所述样本中所述生物标志物的水平。这些方法包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术。

本发明的核酸测序方法的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

本发明的核酸测序方法的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。

本发明中的核酸杂交方法包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

将Southern和Northern印迹分别用于检测特异性DNA或RNA序列。使从样本中提取的DNA或RNA断裂，在基质凝胶上通过电泳分离，然后转移到膜滤器上。使滤器结合的DNA或RNA与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向Northern印迹，其中固定到膜的底物核酸为分离的DNA片段的集合，而探针是从组织提取并进行了标记的RNA。

本发明所述核酸扩增方法选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。

通常，PCR使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；RT-PCR则将逆转录酶(RT)用于从mRNA制备互补的DNA(cDNA)，然后将cDNA通过PCR扩增以产生DNA的多个拷贝；TMA在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝，TMA任选地包括使用阻断，部分、终止部分和其他修饰部分，以改善TMA过程的灵敏度和准确度；LCR使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复多个循环中通过DNA连接酶共价连接，以产生可检测的双链连接寡核苷酸产物；SDA使用以下步骤的多个循环：引物序列对与靶序列的相反链进行退火，在存在dNTPαS下进行引物延伸以产生双链半硫代磷酸化的(hemiphosphorothioated)引物延伸产物，半修饰的限制性内切酶识别位点进行的核酸内切酶介导的切刻，以及从切口3'端进行的聚合酶介导引的物延伸以置换现有链并产生供下一轮引物退火、切刻和链置换的链，从而引起产物的几何扩增。

术语“样本”与“样品”在本文中可以互换使用，用于本文时指获得自或衍生自受试者(例如感兴趣的个体)的组合物，其包含有待根据例如物理，生化，化学和/或生理特点来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。例如，短语“疾病样本”或其变体指得自感兴趣的受试者的任何样本，预计或已知其包含待表征的细胞和/或分子实体。样本包括但不限于，组织样本(例如肿瘤组织样本)，原代或培养的细胞或细胞系，细胞上清，细胞裂解物，血小板，血清，血浆，玻璃体液，淋巴液，滑液，滤泡液，精液，羊水，乳，全血，血液衍生的细胞，尿液，脑脊髓液，唾液，痰，泪，汗液，粘液，肿瘤裂解物，和组织培养液，组织提取物如匀浆化的组织，肿瘤组织，细胞提取物，及其组合。

作为优选的实施方式，所述样本选自血液、血清、血浆。

作为另外一种优选的实施方式，所述样本选自组织。

本发明提供了一种诊断口腔鳞癌的产品，所述产品包括检测样本中本发明所述的生物标志物的试剂；并且可包括使用所述产品评估受试者是否患有或易患口腔鳞癌的说明书。

当在实验室环境中处理样本时，可能获得最可靠的结果。例如，可在医生办公室中从受试者获取样本，然后将其发送到医院或商业医学实验室进行进一步测试。然而，在许多情况下，可能希望在临床医生的办公室提供即时结果或允许受试者在家中进行测试。在一些情况下，对于便携式、预包装、一次性的、可由受试者在无协助或指导等的情况下即可使用等等的测试的需求比高度准确度更为重要。在许多情况下，尤其是在有医师随访的情况下，进行初步测试，甚至灵敏度和/或特异度降低的测试也可能就足够了。因此，以产品形式提供的测定可涉及检测和测量相对少量的生物标志物，以降低测定的复杂性和成本。

可使用本文所述的能够检测样本生物标志物的任何形式的样本测定。通常，所述测定将定量样本中生物标志物至一定的程度，例如它们的浓度或量是高于还是低于预定阈值。此类试剂盒可采取测试条、浸杆、盒、药筒、基于芯片或基于珠粒的阵列、多孔板或一系列容器等的形式。提供一种或多种试剂以检测所选样本生物标志物的存在和/或浓度和/或量。可将受试者的样本直接分配到测定中，或从存储的或先前获得的样品中间接分配到测定中。

在本发明中，生物标志物可以个别测定，或者在本发明的一个实施方案中，它们可以同时测定，例如使用芯片或基于珠的阵列技术。然后独立解读生物标志物的浓度，例如使用每种标志物的个别截留，或者它们组合进行解读。

正如熟练技术人员会领会的，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。

用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(DA)(即线性、二次、规则DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即SIMCA)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中，用于获得评估口腔鳞癌中使用的数学算法的统计方法选自DA(即线性、二次、规则判别分析)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。

接受者操作曲线下面积(＝AUC)是诊断规程的性能或精确性的一项指标。诊断方法的精确性由它的接受者操作特征(ROC)描述得最好。ROC图是源自在观察的整个数据范围上连续改变决策阈的所有灵敏度/特异性对的线图。

实验室测试的临床性能取决于它的诊断精确性，或将受试者正确分类入临床有关亚组的能力。诊断精确性测量测试正确辨别所调查的受试者的两种不同状况的能力。此类状况是例如健康和疾病或者疾病进展对无疾病进展。

量化实验室测试的诊断精确性的一项便利目标是通过单一数值来表述它的性能。最常见的全局度量是ROC曲线下面积(AUC)。常规地，此面积总是≥0.5(如果不是这样，那么可以颠倒决策规则来使之这样)。数值范围介于1.0(完美分开两个组的测试值)和0.5(两个组的测试值之间没有明显分布差异)之间。面积不仅取决于线图的特定部分诸如最接近对角线的点或90％特异性处的灵敏度，而且还取决于整个线图。这是ROC线图如何接近完美者(面积＝1.0)的一种定量、描述性表述。

整体测定法灵敏度会取决于实施本文公开的方法要求的特异性。在某些优选设置中，特异性75％可能是充分的，而且统计方法和所得算法可以基于此特异性要求。在一个优选实施方案中，用于评估有口腔鳞癌风险的个体的方法基于特异性80％、85％、或还优选90％或95％。

在本发明中，术语“包括”用于指短语“包括但不限于”，并与短语“包括但不限于”可以互换使用。

统计学方法

在本发明中，实验至少采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1QPCR检测生物标志物的表达水平

1、样本收集

收集15例口腔鳞癌组织和15例相应的癌旁组织，患者术前未接受任何治疗，以癌组织作为实验组，癌旁组织作为正常对照组。

2、RNA提取

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取样本中的RNA，详细操作按说明书进行。

3、QPCR检测

1)采用FastQμant cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR106)进行mRNA反转录；

2)根据RP11-733O18.1、AC108142.1或RP13-297E16.4的序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成，以GAPDH作为内参基因。

用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-ΔΔCT法进行相对定量，具体实验操作按产品说明书进行。

4、结果

结果如图1所示，RP11-733O18.1、AC108142.1或RP13-297E16.4在实验组与对照组中呈现显著性差异，相比对照组，RP11-733O18.1、AC108142.1和RP13-297E16.4在实验组中呈现显著性上调，提示RP11-733O18.1、AC108142.1和RP13-297E16.4可作为生物标志物应用于口腔鳞癌的诊断。

实施例2生物标志物的诊断效能验证

从TCGA数据库下载预处理后的口腔鳞癌的测序数据及临床信息，样本量为癌旁:癌＝44:331。

使用R软件DESeq2进行差异lncRNA表达分析，结果显示RP11-733O18.1、AC108142.1或RP13-297E16.4在口腔鳞癌组织中呈现显著性上调。

使用R包“pROC”绘制受试者工作曲线(ROC)，分析AUC值、敏感性和特异性，判断指标单独或者联合的诊断效能。在判断指标联合的诊断效能时，对各基因的表达水平进行logistics回归，通过拟合出的回归曲线计算出每个个体患癌与否的概率，确定不同的概率划分阈值，根据确定的概率划分阈值，计算得出每种联合检测方案的灵敏度、特异性以及准确性等。结果如表1和图2所示，RP11-733O18.1、AC108142.1、RP13-297E16.4的AUC值分别为0.644、0.831、0.818；三者联合的AUC值为0.904，说明使用RP11-733O18.1、AC108142.1和/或RP13-297E16.4进行口腔鳞癌的诊断具有较高的诊断效能。

表1曲线下面积(AUC)

基因	AUC
		RP11-733O18.1	0.644
AC108142.1	0.831
		RP13-297E16.4	0.818
RP11-733O18.1+AC108142.1	0.833
		RP11-733O18.1+RP-13.297E16.4	0.856
RP11-733O18.1+AC108142.1+RP13-297E16.4	0.904

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.检测样本中生物标志物的试剂在制备诊断口腔鳞癌的产品中的应用，其特征在于，所述生物标志物包括RP11-733O18.1、AC108142.1或RP13-297E16.4的一种或两种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测生物标志物水平的试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：

特异性识别所述生物标志物的探针；或

特异性扩增所述生物标志物的引物。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述样本选自组织、血液。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包含进行DNA微阵列、寡核苷酸微阵列、RNA印迹法、RNase保护试验和反转录聚合酶链反应所必需的DNA芯片、寡核苷酸芯片、探针或引物，以检测样本中生物标志物的表达。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品还包括处理样本的试剂。

7.生物标志物在构建预测口腔鳞癌的计算模型或者嵌入了所述计算模型的系统中的应用，其特征在于，所述生物标志物包括RP11-733O18.1。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述生物标志物还包括AC108142.1或RP13-297E16.4的一种或两种。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述计算模型以生物标志物的水平作为输入变量，通过生物信息学方法进行运算。