CN112870429A - 一种壳聚糖基聚电解质复合止血海绵、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种壳聚糖基聚电解质复合止血海绵，所述复合止血海绵包括壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸和京尼平。本发明利用聚电解质形的特性，通过冻干法获得系列壳聚糖基电解质复合海绵，并对海绵的表观结构、吸水性、机械性能、生物相容性和创面愈合效果进行测定和评价，结果显示筛选出的复合止血海绵具有良好的力学性能、吸液性能和生物相容性，并能明显加速创面愈合过程。为止血材料的研制提供了有效的方法。

Description

一种壳聚糖基聚电解质复合止血海绵、制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，尤其是一种壳聚糖基聚电解质复合止血海绵、制备方法和应用。

背景技术

伤口愈合是一个动态的过程，其主要包括四个阶段如血瘀、炎症、增殖和细胞外基质(ECM)重塑。这四个愈合阶段包括不同类型的细胞、生物活性因子和支持平台(通常是细胞分泌的天然ECM)之间的相互作用。伤口的分泌物如血液和体液的积累会促进细菌生长，进而引起感染，并导致伤口愈合过程的延迟。每年有数百万人因过度的物理化学因素或疾病而遭受皮肤损伤。随之而来的是伤口感染和严重的组织坏死，危及人类生命。

目前，临床上的止血敷料种类繁多，包括沸石粉、Arista止血微球、纤维蛋白敷料、氧化纤维素和氧化再生纤维素敷料、医用明胶海绵以及壳聚糖绷带和藻酸盐钙纤维垫等。其中壳聚糖(CS)类止血海绵因其止血效果好、抗菌作用强、组织黏附性好、生物相容性好等优点而显示出巨大的应用潜力。聚电解质复合材料是由聚阳离子和聚阴离子组成的高亲水性合成材料，是一种性能优良的生物医用材料。应用于伤口敷料的壳聚糖聚电解质复合材料是近年来发展迅速的。其中壳聚糖和海藻酸盐由于其离子特性，可形成具有生物活性的聚电解质复合物，已被广泛应用于止血材料中。

壳聚糖的脆性是制备创伤愈合材料时最明显的不足。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种壳聚糖基聚电解质复合止血海绵、制备方法和应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种壳聚糖基聚电解质复合止血海绵，所述复合止血海绵包括壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸和京尼平。

而且，所述壳聚糖分子量为800kDa，脱乙酰度为75％，海藻酸钠的分子量为1200kDa，京尼平的纯度≥98％。

如上所述的壳聚糖基聚电解质复合止血海绵的制备方法，步骤如下：

⑴壳聚糖-海藻酸钠聚电解质复合物的制备；

⑵壳聚糖基聚电解质复合止血海绵的制备。

而且，所述步骤⑴具体包括如下步骤：

取壳聚糖加入到去离子水中，再加入体积百分含量为1％的乙酸溶液，搅拌至壳聚糖全部溶解，配制成2％(w/v)的壳聚糖溶液；同样取海藻酸钠使其溶解于去离子水中，配制成2％(w/v)的海藻酸钠溶液；将配制好的壳聚糖溶液与海藻酸钠溶液按1：10～10：1的体积比混合搅拌均匀，即得不同比例的聚电解质复合物。

而且，所述步骤⑵具体包括如下步骤：

取京尼平使其溶解于去离子水中，配制成0.05％～1.0％(w/v)的京尼平水溶液；同样取透明质酸使其溶解于去离子水中，配制成1％(w/v)的透明质酸溶液；将配制好的京尼平溶液和透明质酸溶液加入步骤⑴所得的聚电解质复合物中，聚电解质复合物：京尼平溶液的质量比为1:5～1：1，聚电解质复合物：透明质酸溶液的质量比为2:1，将得到的凝胶使用机械搅拌充分混合均匀，倒入聚苯乙烯模具中，室温放置2h，使京尼平与壳聚糖交联2h后，将所得凝胶放入-20℃进行预冻，预冻时间为12h；将预冻好的样品进行真空冷冻干燥，得到壳聚糖基聚电解质复合海绵。

如上所述的壳聚糖基聚电解质复合止血海绵在止血敷料方面中的应用。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明复合止血海绵属于一种新型止血材料，其包括壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸和京尼平。壳聚糖具有止血效果好、抗菌作用强、组织黏附性好、生物相容性好等优点。海藻酸钠无毒、生物相容性好，可降解且生物稳定性良好，是一种亲水生物聚合物。利用聚电解质复合物的特性，将带有正电荷的壳聚糖溶液与带有负电荷的海藻酸钠溶液混合制备了壳聚糖基聚电解质复合物溶液。为了改善壳聚糖的力学性能，向复合物中加入天然生物交联剂京尼平，使之与壳聚糖进行化学交联反应。同时也加入透明质酸，其良好的亲水性以及独特的粘弹性可使复合材料为伤口提供一个潮湿的环境，同时能促进成纤维细胞的增殖，促进创面无疤痕愈合。

2、本发明方法通过真空冷冻干燥技术制得多孔结构型海绵，这种海绵具有良好的机械性能和吸液性能，也可促进气体交换，从而有助于预防伤口感染，还有助于伤口分泌物的排出和促进伤口愈合。

3、本发明方法操作简单，全程反应条件温和，并且能够扩大规模量化生产。

4、本发明复合止血海绵可有效应用于生物医用止血材料领域。

5、本发明利用聚电解质形的特性，通过冻干法获得系列壳聚糖基电解质复合海绵，并对海绵的表观结构、吸水性、机械性能、生物相容性和创面愈合效果进行测定和评价，结果显示筛选出的复合止血海绵具有良好的力学性能、吸液性能和生物相容性，并能明显加速创面愈合过程。为止血材料的研制提供了有效的方法。

6、由于壳聚糖的脆性是制备创伤愈合材料时最明显的不足，可以通过利用壳聚糖本身聚阳离子特性与其他材料形成聚电解质复合物改善缺陷。本发明将壳聚糖与海藻酸钠和透明质酸(HA)共混，并使用天然生物交联剂京尼平(Ge)进行交联。京尼平具有较高的生物相容性，并且在京尼平与壳聚糖之间形成的氢键可以使材料具有更好的性能。其中的透明质酸(HA)具有良好的亲水性。它可为伤口提供一个潮湿的环境，保护受伤组织的表面不干燥。同时透明质酸还能促进成纤维细胞的增殖，增加创面胶原分泌，促进创面无疤痕愈合。通过不同配比获得了系列止血海绵，并对其性能进行评价。

附图说明

图1本发明实施例1制备的不同壳聚糖基聚电解质复合止血海绵的表观形态图；其中，A为CAHS1，B为CAHS2，C为CAHS3，其中，左图为海绵侧面形貌图，右图为海绵正面形貌图；

图2本发明实施例1制备的不同壳聚糖基聚电解质复合止血海绵的扫描电镜图；

图3本发明实施例3测试的不同壳聚糖基聚电解质复合止血海绵的孔隙率；

图4本发明实施例4测试的不同壳聚糖基聚电解质复合止血海绵在溶胀平衡时水分分布的情况图；

图5本发明实施例4测试的不同壳聚糖基聚电解质复合止血海绵的溶胀曲线；

图6本发明实施例5测试的不同壳聚糖基聚电解质复合止血海绵在不同浓度下的溶血率图；

图7本发明实施例6中不同组壳聚糖基聚电解质复合止血海绵以及纱布组对伤口愈合影响的评价图；其中，A为三组海绵及纱布组处理的伤口直径变化图，B为三组海绵及纱布组处理的伤口愈合直观图，C为创面再生的组织形态图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。

一种壳聚糖基聚电解质复合止血海绵，所述复合止血海绵包括壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸和京尼平。

较优地，所述壳聚糖分子量为800kDa，脱乙酰度为75％，海藻酸钠的分子量为1200kDa，京尼平的纯度≥98％。

如上所述的壳聚糖基聚电解质复合止血海绵的制备方法，步骤如下：

⑴壳聚糖-海藻酸钠聚电解质复合物的制备；

⑵壳聚糖基聚电解质复合止血海绵的制备。

较优地，所述步骤⑴具体包括如下步骤：

取壳聚糖加入到去离子水中，再加入体积百分含量为1％的乙酸溶液，搅拌至壳聚糖全部溶解，配制成2％(w/v)的壳聚糖溶液；同样取海藻酸钠使其溶解于去离子水中，配制成2％(w/v)的海藻酸钠溶液；将配制好的壳聚糖溶液与海藻酸钠溶液按1：10～10：1的体积比混合搅拌均匀，即得不同比例的聚电解质复合物。

较优地，所述步骤⑵具体包括如下步骤：

取京尼平使其溶解于去离子水中，配制成0.05％～1.0％(w/v)的京尼平水溶液；同样取透明质酸使其溶解于去离子水中，配制成1％(w/v)的透明质酸溶液；将配制好的京尼平溶液和透明质酸溶液加入步骤⑴所得的聚电解质复合物中，聚电解质复合物：京尼平溶液的质量比为1:5～1：1，聚电解质复合物：透明质酸溶液的质量比为2:1，将得到的凝胶使用机械搅拌充分混合均匀，倒入聚苯乙烯模具中，室温放置2h，使京尼平与壳聚糖交联2h后，将所得凝胶放入-20℃进行预冻，预冻时间为12h；将预冻好的样品进行真空冷冻干燥，得到壳聚糖基聚电解质复合海绵。

如上所述的壳聚糖基聚电解质复合止血海绵在止血敷料方面中的应用。

具体地，相关制备及检测如下：

实施例1：壳聚糖基聚电解质复合止血海绵的制备

具体方法：

(1)取所述的壳聚糖加入到去离子水中，再加入体积百分含量为1％的乙酸溶液，搅拌至壳聚糖全部溶解，配制成2％(w/v)的壳聚糖溶液；同样取所述的海藻酸钠使其溶解于去离子水中，配制成2％(w/v)的海藻酸钠溶液；将配制好的壳聚糖溶液与海藻酸钠溶液按1:3、2:3、1:1的体积比混合搅拌均匀，即得不同比例的聚电解质复合物。

(2)取所述京尼平使其溶解于去离子水中，配制成0.05％的京尼平水溶液；同样取所述透明质酸使其溶解于去离子水中，配制成1％的透明质酸溶液；将配制好的京尼平溶液(M_CS:M_Ge＝1:5)和透明质酸溶液(M_CS:M_HA＝2:1)加入步骤(1)所得的聚电解质复合物中，将得到的凝胶使用机械搅拌充分混合均匀，倒入聚苯乙烯模具中，室温放置2h，使京尼平与壳聚糖交联。2h后，将所得凝胶放入-20℃冰箱进行预冻，预冻时间大约为12h；将预冻好的样品进行真空冷冻干燥，得到不同比例的壳聚糖基聚电解质复合海绵(将其按照CS的含量分别命名为CAHS1、CAHS2、CAHS3)。三组样品海绵表观形态如图1所示。

实施例2：对实施例1制备的复合止血海绵的微观形态观察

使用扫描电子显微镜(SEM)对三种不同组分比例的复合海绵进行了微观形态观察。如图2所示，分别为由实施例1制备的CAHS1、CAHS2、CAHS3在400倍下表面和截面微观形态图。从图上可以看出，三种材料均能形成具有一定孔隙的结构，且表面与截面相差无几，这可以证明该材料的表面和内部是较为均一的。相比较而言，CAHS2的表面及截面明显得比CAHS1、CAHS3更均匀，有更细小致密的孔状结构，这对于伤口处体液和血液的吸收有至关重要的作用，同时也会一定程度地影响到材料的机械性能。而CAHS1、CAHS3的结构则更偏向于片状，这样的结构对于孔隙度以及材料硬度都会有较差的影响。因此，根据材料表面和截面的SEM分析，CAHS2更适合制作止血海绵。

实施例3：对实施例1制备的复合止血海绵的孔隙率进行测试

方法：将制备的海绵样品浸入无水乙醇中直至饱和，并对浸泡前后的海绵进行称重。

孔隙率(P)计算公式如下：

其中P代表孔隙率，W₁和W₂分别表示海绵样品在乙醇中浸没前后的重量。V₁是样品浸没前的乙醇体积，V₂是样品浸没后的乙醇体积，ρ是常数(常温下乙醇密度)。所有样品在实验中一式三份。

结果：使用乙醇置换法评估样品的孔隙率，CAHS1，CAHS2和CAHS3复合海绵的孔隙率如图3所示。可以看出CAHS3海绵的孔隙率最小为76％，CAHS1海绵的孔隙率最高为115％。海绵的孔隙率随壳聚糖浓度的增加而略有下降。根据实施例2扫描电子显微镜下的海绵微观形态图像也可看出，CAHS1海绵的孔隙较大但稀疏，而CAHS2海绵的孔隙微小且密集。

实施例4：对实施例1制备的复合止血海绵的溶胀性能进行表征

方法：利用低场核磁共振成像技术(LF-NMR)对海绵的溶胀性能进行了表征。其中利用T₂曲线反演分析了LF-NMR数据。为了测试初始T₂分布和振幅A₀，取各海绵20mg(W₀)置于直径为15mm的NMR试管中。随后向试管内加入100μL pH＝7.0的磷酸盐缓冲液。

溶胀率(SR)的计算公式如下：

其中A₀为溶胀前样品的初始振幅，A_total是这个系统所含全部水的振幅，A_texwater表示在溶胀过程第t min时材料外部水的振幅。W_water是加入水的质量。

结果：本发明用LF-NMR分别测定了CAHS1、CAHS2、CAHS3在溶胀平衡时水分分布的情况，其结果如图4所示。在LF-NMR图像分析中，每个T2组分的振幅对应于水组分的量，受到材料的分子性质和三维结构的影响。并且将100ms以内的组分定义为内部水(约20ms处)，是在溶胀过程中被吸收的。大于100ms的组分被归属于外部水(约140ms和1400ms处)，可用重量法去除。利用上述方法中的公式即可计算出不同时刻不同组分比例海绵的溶胀率(SR)，并绘制成曲线如图5所示。由曲线图中可以清晰地看到，当达到溶胀平衡(120min)时，CAHS3的溶胀率最高，达到了166.67％，其次是CAHS2，溶胀率达到了158.46％，CAHS1的溶胀率最低，为77.37％。但是纵观整个从开始溶胀到溶胀平衡的过程，CAHS1、CAHS3的曲线都是较为平直的，而CAHS2的溶胀率则在30min前有明显的增长。由此可以分析出，尽管溶胀平衡时CAHS2的溶胀率没有CAHS3高，但是整个溶胀过程CAHS2更符合材料的预期要求，因此CAHS2的溶胀效果也更优秀。

实施例5：对实施例1制备的复合止血海绵进行体外溶血性能测试

方法：采用体外溶血法来评价复合海绵的血液相容性。枸橼酸兔全血(2mL)200×g离心15min后收集红细胞。将样品(1mg)和PBS(0.8mL)分别加入红细胞混悬液(0.2mL)中，作为处理组。在红细胞混悬液中分别加入去离子水和不加标本的PBS作为阳性对照组和阴性对照组。37℃孵育1h后，处理组和对照组2000×g离心10min，用紫外-可见分光光度计测定上清液在540nm处的吸光度。

溶血率(Hemolysis ratio)的计算公式如下：

结果：溶血是评价止血海绵血液相容性的一种非常简单和可靠的方法。一般情况下，止血海绵的溶血率越低，血液相容性越好。随着样品浓度的增加，溶血率基本呈上升趋势，如图6所示。在低浓度下，CAHS2的溶血率高于CAHS1和CAHS3。随着浓度的增加，CAHS1和CAHS3的溶血率升高。可以看出所有样品海绵的溶血率都小于7％，这表明止血海绵的血液相容性尚可。

实施例6：评价实施例1制备的复合止血海绵对伤口愈合的影响

方法：对体重180～220g、3～8周龄的Wistra大鼠进行体内创面愈合研究。24只大鼠分成4组，不加限制地给予正常大鼠饲料和水。在脱毛和麻醉后，在每只大鼠的背部建立一个直径2厘米的圆形全层伤口。三组大鼠的伤口分别用CAHS1、CAHS2、CAHS3和纱布包扎。对照组采用纯纱布包扎创面。每周两次拍照并测量伤口面积。切除大鼠皮肤创面组织，用4％多聚甲醛固定，并用苏木精-伊红(H&E)染色，于第7、14、21天进行组织学观察。

结果：在Wistra大鼠体内进行创面愈合研究，以评价皮肤组织重建的效果。从图7(A)中可以看出，在7天、14天、21天时各组伤口面积逐渐减小。7天后，CAHS3组海绵包扎的伤口开始愈合。14天后，CAHS2组创面收缩明显优于纱布组和CAHS1、CAHS3组。图7(B)直观地显示了各组对创面愈合的影响。21天时，CAHS2组处理的伤口完全愈合，而CAHS1和CAHS3组与纱布组相比效果较差。为了进一步探讨海绵对创面愈合的影响，对创面再生的组织形态学评价如图7(C)。从图中可以分析出第7天各组创面处均出现炎性细胞浸润和成纤维细胞迁移，其中CAHS1组和纱布组聚集了大量炎性细胞。第14天，CAHS1组和纱布组仍然聚集了大量的炎症细胞，而CAHS2组和CAHS3组减轻了炎症并逐渐形成上皮细胞和部分结缔组织。21天时，纱布组创面也形成了再生的上皮组织，而真皮仍含有大量的炎性细胞和成纤维细胞。CAHS1组也形成了上皮细胞，但炎症细胞仍然活跃。CAHS2组创面形成稳定复杂的网状纤维，再生毛囊和血管。结缔组织形成后，CAHS3组再次发生炎性细胞浸润，但未形成纤维细胞，这可能是由于海绵中壳聚糖浓度大所致。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (6)

1.一种壳聚糖基聚电解质复合止血海绵，其特征在于：所述复合止血海绵包括壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸和京尼平。

2.根据权利要求1所述的壳聚糖基聚电解质复合止血海绵，其特征在于：所述壳聚糖分子量为800kDa，脱乙酰度为75％，海藻酸钠的分子量为1200kDa，京尼平的纯度≥98％。

3.如权利要求1或2所述的壳聚糖基聚电解质复合止血海绵的制备方法，其特征在于：步骤如下：

⑴壳聚糖-海藻酸钠聚电解质复合物的制备；

⑵壳聚糖基聚电解质复合止血海绵的制备。

4.根据权利要求3所述的壳聚糖基聚电解质复合止血海绵的制备方法，其特征在于：所述步骤⑴具体包括如下步骤：

取壳聚糖加入到去离子水中，再加入体积百分含量为1％的乙酸溶液，搅拌至壳聚糖全部溶解，配制成2％(w/v)的壳聚糖溶液；同样取海藻酸钠使其溶解于去离子水中，配制成2％(w/v)的海藻酸钠溶液；将配制好的壳聚糖溶液与海藻酸钠溶液按1：10～10：1的体积比混合搅拌均匀，即得不同比例的聚电解质复合物。

5.根据权利要求3所述的壳聚糖基聚电解质复合止血海绵的制备方法，其特征在于：所述步骤⑵具体包括如下步骤：

取京尼平使其溶解于去离子水中，配制成0.05％～1.0％(w/v)的京尼平水溶液；同样取透明质酸使其溶解于去离子水中，配制成1％(w/v)的透明质酸溶液；将配制好的京尼平溶液和透明质酸溶液加入步骤⑴所得的聚电解质复合物中，聚电解质复合物：京尼平溶液的质量比为1:5～1：1，聚电解质复合物：透明质酸溶液的质量比为2:1，将得到的凝胶使用机械搅拌充分混合均匀，倒入聚苯乙烯模具中，室温放置2h，使京尼平与壳聚糖交联2h后，将所得凝胶放入-20℃进行预冻，预冻时间为12h；将预冻好的样品进行真空冷冻干燥，得到壳聚糖基聚电解质复合海绵。

6.如权利要求1或2所述的壳聚糖基聚电解质复合止血海绵在止血敷料方面中的应用。

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