CN112858698B - 一种d-二聚体胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法 - Google Patents
一种d-二聚体胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种D‑二聚体胶乳增强免疫比浊试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1以及试剂R2，其中试剂R1包括缓冲液100‑200 mM，表面活性剂0.1‑0.3%，防腐剂0.2‑0.5%，无机盐1‑4%以及促凝剂1‑2%；试剂R2包括缓冲液20‑50 mM，蛋白保护剂0.5‑1%，防腐剂0.1‑0.2%以及包被有D‑二聚体单克隆抗体的胶乳颗粒。本发明通过在胶乳微球的标记过程中添加吗啉以及苯甲酸组合物，增加了胶乳微球与抗体的标记效率，显著提升试剂在检测高值阳性样本时的抗HOOK能力，使试剂的线性范围达到0.15‑40 mg/L FEU。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验领域，具体涉及一种D-二聚体胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法。
背景技术
血液中有纤维蛋白，纤维蛋白经过活化和水解，产生特异的降解产物称为“纤维蛋白降解产物。D-二聚体（D-Dimer）是最简单的纤维蛋白降解产物，在体内起着调节纤溶-凝血间平衡的作用。D-二聚体水平升高说明体内存在高凝状态和继发性的纤维蛋白溶解亢进，因此D-二聚体是反映机体血液高凝状态和纤溶系统激活的首选分子标志物。
在正常生理状态下，人体D-二聚体的水平小于0.55mg/L FEU，机体内维持着凝血与纤溶系统的动态平衡，以保证纤维蛋白的及时形成与清除。一旦这种动态平衡被破坏，血管内凝血倾向增强，纤维蛋白增多，纤维蛋白降解产物增加，D-二聚体含量增加，因此D-二聚体水平升高（＞0.55mg/L FEU）可以用来检测具有凝血和纤溶过程的一类疾病，如肺栓塞(PE)、重症肝炎等疾病的检测。于此同时，强烈的化学或放射治疗，杀灭大量白血病细胞，使含于白血病细胞内的促凝物质释放入血，导致高凝状态及血栓形成。这些患者的血浆D-二聚体水平可以达到30-50mg/L FEU或更高。
目前检测D-二聚体的方法学主要有胶乳凝集法，酶联免疫吸附法（ELISA），免疫比浊法，光电散射比浊法和胶体金免疫层析法。目前临床应用最多的多为胶乳增强免疫比浊法，其以灵敏度高、检测快速、准确而广泛应用于临床中。但是，现有试剂存在的问题是，检测线性范围窄（多数试剂线性范围为10mg/L FEU），试剂的抗HOOK能力弱，不利于严重病人（如弥散性血管内凝血、深静脉血栓、肺栓塞妊高症孕妇、先兆子痫）的诊断以及不同医学水平的判定。
发明内容
本发明提供一种D-二聚体胶乳增强免疫比浊试剂盒，通过在胶乳微球的标记过程中添加苯甲酸、吗啉组合物的方式，增加了D-Dimer抗体与胶乳微球的标记效率，同时通过调整试剂配置，显著提升了试剂的检测线性以及抗HOOK能力。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术手段：一种D-二聚体胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括试剂R1以及试剂R2，其特征在于：
所述试剂R1包括：缓冲液100-200mM，表面活性剂0.1-0.3%，防腐剂0.2-0.5%，无机盐1-4%以及促凝剂1-2%；
所述试剂R2包括：缓冲液20-50mM，蛋白保护剂0.5-1%，防腐剂0.1-0.2%以及包被有D-Dimer单克隆抗体的胶乳颗粒；
所述包被有D-Dimer单克隆抗体胶乳颗粒的制备过程包括：在组分A与组分B的存在下，D-Dimer单克隆抗体与胶乳颗粒偶联，所述组分A选自吗啉或哌啶中的至少一种，所述组分B选自苯甲酸或水杨酸中的至少一种。
优选地，所述组分A为吗啉，所述组分B为苯甲酸。
优选地，在所述试剂R1中：
所述缓冲液选自BICINE、PIPES、MES或MOPSO中的至少一种；所述表面活性剂选自Brj 35、吐温20或A90中的至少一种；所述防腐剂选自Proclin-300、叠氮钠或庆大霉素中的至少一种；所述无机盐选自氯化钠或氯化钾中的至少一种；所述促凝剂选自PEG6000或PEG8000中的至少一种。
优选地，在所述试剂R2中：
所述缓冲液选自TAPS、TES、MES、MOPS或HEPES中的至少一种；所述蛋白保护剂选自BSA、酪蛋白或海藻糖中的至少一种；所述防腐剂选自Proclin-300、叠氮钠或庆大霉素中的至少一种。
优选地，所述试剂R1的pH为6.0-8.0，所述试剂R2的pH为6.0-8.0。
优选地，所述包被有鼠抗人D-Dimer单克隆抗体的胶乳颗粒的粒径范围为150-250nm。
一种如上述任一项所述的一种D-二聚体胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）试剂R1的制备
试剂R1按照下述配方进行配置：
缓冲液100-200mM，表面活性剂0.1-0.3%，防腐剂0.2-0.5%，无机盐1-4%以及促凝剂1-2%；
所述缓冲液选自BICINE、PlPES、MES或MOPSO中的至少一种；所述表面活性剂选自Brj 35、吐温20或A90中的至少一种；所述防腐剂选自Proclin-300、叠氮钠或庆大霉素中的至少一种；所述无机盐选自氯化钠或氯化钾中的至少一种；所述促凝剂选自PEG6000或PEG8000中的至少一种；
（2）试剂R2的制备
将胶乳微球加入20-50mM标记缓冲液中，搅拌均匀；随后向其中加入活化剂活化，搅拌均匀；向活化的胶乳微球溶液中加入D-Dimer单克隆抗体，同时向其中加入组分A以及组分B组合物，所述组分A选自吗啉或哌啶中的至少一种，所述组分B选自苯甲酸或水杨酸中的至少一种，搅拌均匀后孵育5-10h；加入0.5-1%蛋白保护剂和0.1-0.2%防腐剂，30-40℃孵育50-70h。
优选地，在所述步骤（2）中，加入0.1-0.5%苯甲酸以及0.1-0.5%吗啉的组合物。
优选地，在所述步骤（2）中，所述标记缓冲液选自TAPS、Tris或HEPES缓冲液中的至少一种；所述蛋白保护剂选自BSA或酪蛋白中的至少一种；所述防腐剂选自PC-300或叠氮钠中的至少一种；所述活化剂采用EDC/NHS，所述NHS与EDC以及胶乳微球的质量比为：1:（15-19），所述D-Dimer单克隆抗体与活化胶乳微球的质量比为：1:（15-19）。
优选地，在所述步骤（2）中，所述R2试剂中包被有D-Dimer单克隆抗体的胶乳颗粒的含量为0.3-0.5%。
一种提升胶乳微球与抗体标记效率的方法，其特征在于，在胶乳微球与抗体偶联的过程中加入组分A以及组分B，所述组分A选自吗啉或哌啶中的至少一种，所述组分B选自苯甲酸或水杨酸中的至少一种。
本发明的有益效果在于：本发明通过在胶乳微球标记液中添加特殊的组分A（优选为吗啉）以及组分B（优选为苯甲酸）组合物，增加了D-Dimer抗体与胶乳微球的标记效率，显著提升了试剂在检测高值阳性样本时的抗HOOK能力（抗HOOK能力可达96.15 mg/L FEU），使试剂检测的线性范围达到0.15-40 mg/L FEU。
附图说明
图1为根据本发明实施例3所提供的D-Dimer赋值样本理论浓度与A组试剂盒测定值的线性关系图；
图2为根据本发明实施例3所提供的D-Dimer赋值样本理论浓度与B组试剂盒测定值的线性关系图；
图3根据本发明实施例3所提供的D-Dimer赋值样本理论浓度与C组试剂盒测定值的线性关系图；
图4为根据本发明实施例4所提供的D-Dimer超高赋值样本理论浓度与A组试剂盒测定值的线性关系图；
图5为根据本发明实施例4所提供的D-Dimer超高赋值样本理论浓度与B组试剂盒测定值的线性关系图；
图6为根据本发明实施例4所提供的D-Dimer超高赋值样本理论浓度与C组试剂盒测定值的线性关系图；
图7为根据本发明实施例4所提供的D-Dimer超高赋值样本理论浓度与D组试剂盒测定值的线性关系图。
具体实施例
本文包括以下的实施例，用于以例证的方式更清楚、明确地阐述本发明的技术方案。本领域技术人员根据本文的公开应当理解，可以在所公开的特定的实施方式中进行许多改变但是仍然获得相似或类似的结果，而不偏离本发明的思想和范围。本发明的具体实施方式仅用于解释本发明，而非意图通过任何方式限制本发明。
实施例1 D-Dimer检测试剂盒的制备
本发明的D-二聚体（D-Dimer）检测试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分。
1.试剂R1的制备
按照下述配方进行配置，充分搅拌混匀后，放于2-8℃保存。
试剂R1：
BICINE缓冲液 100 mM
吐温20 0.2 %
叠氮钠 0.3 %
NaCl 2 %
聚乙二醇6000 1 %
pH 6.0
其余溶剂为超纯水
2.试剂R2的制备
a.将50μL 180nm(固含量10%)的胶乳微球加入10ml 20mM HEPES的标记缓冲液中，搅拌均匀；
b.向上述溶液中加入0.09ug NHS和0.15ug EDC活化微球，匀速搅拌0.5h；
c.向活化的胶乳微球溶液中加入50μL 6.4g/L的鼠抗人D-Dimer单克隆抗体，同时向其中加入0.3%的吗啉与0.1%的苯甲酸组合物，搅拌均匀后孵育6h；
d．加入1%蛋白保护剂BSA，孵育1h后加入0.1%叠氮钠，最终放入37℃烘箱中老化3天。
实施例2 试剂盒的使用方法
本实施例中，使用希森美康血凝仪（CS2000i）配合本发明试剂盒进行样本检测。
1.仪器参数设置
2.测定方案
3.计算方式
使用多点非线性/半对数校准模式，以样条函数为计算模式，根据校准品的值与吸光度变化值作剂量/响应曲线，样品中D-Dimer的含量可根据其吸光度变化值在剂量/响应曲线上计算出。
其中，本发明的检测原理是采用胶乳免疫比浊法测定人血清中D-Dimer的含量。样本中的D-Dimer与胶乳微球表面交联的D-Dimer抗体结合，使相邻的胶乳微球彼此交联，发生凝集反应产生浊度变化，该浊度的高低与样本中D-Dimer的含量成正比，可通过测定特定波长处吸光度计算出样本中D-Dimer的含量，根据工作曲线可以检测出样本中D-Dimer的含量。
实施例3 试剂盒性能测试
为了验证本发明试剂盒的各项性能，共设置3组试剂盒进行性能验证：
A组：本发明实施例1制备得到的试剂盒；
B组：九强D-Dimer检测试剂盒（货号：05102）；
C组：专利CN101819202B实施例1所述方法制备得到的试剂盒。
其中A组试剂盒按照实施例2所述的使用方法进行测试，B组按照其说明书进行测试；C组按照其实施例1中使用方法进行测试。
（1）准确度验证
使用三组试剂盒分别对希森美康赋值样本进行准确度测试，设2个重复，通过希森美康血凝仪（CS2000i）读取信号，计算测定均值与靶值的相对偏差进行准确度验证。检测结果如下表所示：
表1 准确度验证
由上述实验结果可知，三组试剂盒测试值1与靶值1的相对偏差分别为-1.83%、-5.49%以及3.05%，测试值2与靶值2的相对偏差分别为1.17%、-5.75%以及2.83%。其中本发明实施例1制备得到的试剂盒（A组）检测准确度优于对比试剂盒-1（B组）以及对比试剂盒-2（C组）。
（2）精密度验证
选取临床D-Dimer低值样本、中值样本以及高值样本，使用三组试剂盒分别对样本进行测试，每个样本分别重复测定10次，通过希森美康血凝仪（CS2000i）读取信号，分别计算测定均值和标准差，计算变异系数进行精密度考察。检测结果如下表所示：
表2 精密度验证
由上述实验结果可知，三组试剂盒在低值样本检测时的变异系数分别为2.94%、4.41%以及4.15%，中值样本检测时的变异系数分别为2.75%、4.61%以及4.39%，高值样本检测时的变异系数分别为2.05%、4.17%以及3.87%，实验结果说明，本发明实施例1制备得到的试剂盒（A组）在检测低值样本、中值样本以及高值样本时的精密度优于对照试剂盒-1（B组）以及对照试剂盒-2（C组）。
（3）线性范围验证
选择希森美康的D-Dimer检测试剂盒（散射比浊法）在希森美康血凝仪（CS2000i）对超高值样本以及低值样本赋值，其中高值样本的理论浓度值为41.86mg/L FEU，低值样本的理论浓度值为0.11mg/L FEU，随后利用高值样本以及低值样本按比例配置各浓度梯度样本，使用三组试剂盒分别对样本进行测试，每个样本分别重复测定2次，通过希森美康血凝仪（CS2000i）读取信号，分别计算测定均值进行线性范围考察。检测结果如下表所示：
表3 线性范围验证
由上述实验结果可知，本发明实施例1制备得到的试剂盒（A组）在样本浓度为0.1-41 mg/L FEU范围内，检测值与理论值的相对偏差均较小，特别是在30-41 mg/L FEU范围内时，其检测值与理论值的相对偏差均小于1%。而对照试剂盒-1（B组）以及对照试剂盒-2（C组）在样本浓度大于30 mg/L FEU时，其检测值与理论值的相对偏差均大于20%。同时，将三组试剂盒的检测结果与样本浓度理论值进行相关性分析（如附图1-3所示），A组检测值与理论值的相关性显著优于B组以及C组，其中A组检测值与理论值的相关性R2为0.9994，B组R2为0.6831，C组R2为0.9353。实验结果说明本发明实施例1制备得到的试剂盒较对照试剂盒-1以及对照试剂盒-2的线性范围更宽，尤其是针对浓度高于30 mg/L FEU的高值样本，两组对照试剂盒均不能进行准确检测。根据实验结果，推测两组对照试剂盒在测定过程中出现了HOOK效应，导致其对于高值样本的测定值不准确。
实施例4 抗HOOK能力验证
为了验证在胶乳微球标记过程中添加苯甲酸、吗啉的组合物，能够优化试剂的抗HOOK能力，共设置3组试剂盒进行验证：
A组：本发明实施例1制备得到的试剂盒；
B组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，胶乳微球的标记过程中未加入苯甲酸、吗啉的组合物，其余制备方法均与实施例1相同；
C组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，胶乳微球的标记过程中仅加入吗啉，未加入苯甲酸，其余制备方法均与实施例1相同；
D组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，胶乳微球的标记过程中仅加入苯甲酸，未加入吗啉，其余制备方法均与实施例1相同。
选择希森美康的D-Dimer检测试剂盒（散射比浊法）在希森美康血凝仪（CS2000i）对超高值样本赋值，样本浓度为102.56mg/L FEU，利用超纯水按比例稀释配置各浓度梯度样本，使用三组试剂盒分别对样本进行测试，每个样本分别重复测定3次，通过希森美康血凝仪（CS2000i）读取信号，分别计算测定均值及相对偏差SD进行抗HOOK能力验证。检测结果如下表所示：
表4 A组试剂盒抗HOOK能力验证
由上述实验结果，将A组试剂盒的检测结果与样本浓度理论值进行比对分析（如附图4所示），结果显示，本发明实施例1制备得到的试剂盒（A组）能够达到的抗HOOK能力为96.15mg/L FEU（测定均值-3SD的值＞40.0时对应的最高浓度，为该试剂的抗HOOK能力值）。
表5 B组试剂盒抗HOOK能力验证
由上述实验结果，将B组试剂盒的检测结果与样本浓度理论值进行比对分析（如附图5所示），结果显示，B组试剂盒抵抗HOOK能力较差。
表6 C组试剂盒抗HOOK能力验证
由上述实验结果，将C组试剂盒的检测结果与样本浓度理论值进行比对分析（如附图6所示），结果显示，C组试剂盒抗HOOK能力较差。
表7 D组试剂盒抗HOOK能力验证
由上述实验结果，将D组试剂盒的检测结果与样本浓度理论值进行比对分析（如附图7所示），结果显示，D组试剂盒抗HOOK能力较差。
综上，本发明通过在胶乳微球的标记过程中引入苯甲酸以及吗啉组合物，可以有效提升胶乳微球的标记效率，显著提升了试剂后续的检测线性范围以及抗HOOK能力，推测其原因可能是：只有当抗体上的氨基以正确的方向与微球上的羧基结合时，抗体的标记才是有效的，而苯甲酸是含有羧基的有机物，在标记过程中能够竞争性的与抗体上的氨基反应，而吗啉可以与微球上的羧基反应，在标记过程中加入吗啉可以与抗体竞争交联微球的上的羧基，通过控制体系中苯甲酸以及吗啉的浓度，控制抗体上暴露的氨基以及微球上暴露的羧基数量，有效平衡抗体在胶乳微球上的结合位点，最大程度的保证抗体以正确的方向与微球结合，进而提高抗体在羧基微球上的标记效率，整体上提高试剂的性能。
实施例5
本实施例中共设置四组实验，其中每组实验使用的试剂盒与实施例1的区别仅在于胶乳微球的标记工艺不相同：
A组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，胶乳微球的标记过程中加入0.05%苯甲酸以及0.05%吗啉，其余制备方法均与实施例1相同。
B组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，胶乳微球的标记过程中，加入0.1%苯甲酸以及0.1%吗啉，其余制备方法均与实施例1相同。
C组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，胶乳微球的标记过程中，加入0.5%苯甲酸以及0.5%吗啉，其余制备方法均与实施例1相同。
D组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，胶乳微球的标记过程中加入1%苯甲酸以及1%吗啉，其余制备方法均与实施例1相同。
选择希森美康的D-Dimer检测试剂盒（散射比浊法）在希森美康血凝仪（CS2000i）的赋值样本，其中高值样本的理论浓度值为41.86 mg/L FEU，低值样本的理论浓度值为0.11mg/L FEU，随后利用高值样本以及低值样本按比例配置各浓度梯度样本，使用四组试剂盒分别对样本进行测试，每个样本分别重复测定2次，通过希森美康血凝仪（CS2000i）读取信号，分别计算测定均值进行线性范围考察。检测结果如下表所示：
表8 线性范围验证
由上述实验结果可知，由上述实验结果可知，B组以及C组试剂盒在样本浓度为0.1-41mg/L FEU范围内，检测值与理论值的相对偏差均较小，特别是在31-41mg/L FEU范围内时，其检测值与理论值的相对偏差均小于A组以及D组试剂盒。实验结果说明，在胶乳微球的标记过程中加入0.1-0.5%吗啉以及0.1-0.5%苯甲酸组合物时，更有利于试剂线性范围的提升。
实施例6
本实施例中共设置五组实验，其中每组实验使用的试剂盒与实施例1的区别仅在于胶乳微球的标记工艺不相同：
A组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，胶乳微球的标记过程中加入0.3%吗啉以及0.1 %邻氨基苯甲酸，未加入苯甲酸，其余制备方法均与实施例1相同；
B组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，胶乳微球的标记过程中加入0.3%的吗啉，0.1%水杨酸，未加入苯甲酸，其余制备方法均与实施例1相同；
C组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，胶乳微球的标记过程中加入0.3% 哌啶以及0.1 %苯甲酸，未加入吗啉，其余制备方法均与实施例1相同；
D组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，胶乳微球的标记过程中加入0.3% 哌啶以及0.1 %水杨酸，未加入吗啉以及苯甲酸，其余制备方法均与实施例1相同；
E组：所述试剂盒与实施例1试剂盒的区别仅在于，胶乳微球的标记过程中加入0.3%哌啶以及0.1 %邻氨基苯甲酸，未加入吗啉以及苯甲酸，其余制备方法均与实施例1相同；
选择希森美康的D-Dimer检测试剂盒（散射比浊法）在希森美康血凝仪（CS2000i）的赋值样本，其中高值样本的理论浓度值为41.86mg/L FEU，低值样本的理论浓度值为0.11mg/L FEU，随后利用高值样本以及低值样本按比例配置各浓度梯度样本，使用四组试剂盒分别对样本进行测试，每个样本分别重复测定2次，通过希森美康血凝仪（CS2000i）读取信号，分别计算测定均值进行线性范围考察。检测结果如下表所示：
表9 线性范围验证
由上述实验结果可知，B组、C组以及D组试剂盒在样本浓度为0.1-41mg/L FEU范围内，检测值与理论值的相对偏差均小于10%，实验结果说明，在胶乳微球的标记过程中加入苯甲酸与吗啉、吗啉与水杨酸、哌啶与苯甲酸或哌啶与水杨酸组合物时，有利于试剂线性范围的提升。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变形。
Claims (10)
1.一种D-二聚体胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括试剂R1以及试剂R2，其特征在于：
所述试剂R1包括：缓冲液100-200mM，表面活性剂0.1-0.3％，防腐剂0.2-0.5％，无机盐1-4％以及促凝剂1-2％，所述缓冲液为BICINE；
所述试剂R2包括：缓冲液20-50mM，蛋白保护剂0.5-1％，防腐剂0.1-0.2％以及包被有D-Dimer单克隆抗体的胶乳颗粒，所述缓冲液为HEPES；
所述试剂R2的制备过程为：将胶乳微球加入20-50mM标记缓冲液中，搅拌均匀；随后向其中加入活化剂活化，搅拌均匀；向活化的胶乳微球溶液中加入D-Dimer单克隆抗体，同时向其中加入组分A以及组分B组合物，搅拌均匀后孵育5-10h；加入0.5-1％蛋白保护剂和0.1-0.2％防腐剂，30-40℃孵育50-70h;
所述组分A选自吗啉或哌啶中的至少一种，组分A的加入量为0.3％，所述组分B选自苯甲酸或水杨酸中的至少一种，组分B的加入量为0.1％；
所述活化剂采用EDC/NHS，所述NHS、EDC与胶乳微球的质量比为：9:15:500000，所述D-Dimer单克隆抗体与活化胶乳微球的质量比为：1:15.625。
2.根据权利要求1所述的一种D-二聚体胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述组分A为吗啉，所述组分B为苯甲酸。
3.根据权利要求1所述的一种D-二聚体胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，在所述试剂R1中：
所述表面活性剂选自Brj 35、吐温20或A90中的至少一种；所述防腐剂选自Proclin-300、叠氮钠或庆大霉素中的至少一种；所述无机盐选自氯化钠或氯化钾中的至少一种；所述促凝剂选自PEG6000或PEG8000中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的一种D-二聚体胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，在所述试剂R2中：
所述蛋白保护剂选自BSA、酪蛋白或海藻糖中的至少一种；所述防腐剂选自Proclin-300、叠氮钠或庆大霉素中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的一种D-二聚体胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述试剂R1的pH为6.0-8.0，所述试剂R2的pH为6.0-8.0。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种D-二聚体胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述包被有鼠抗人D-Dimer单克隆抗体的胶乳颗粒的粒径范围为150-250nm。
7.一种如权利要求1-5任一项所述的一种D-二聚体胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)试剂R1的制备
试剂R1按照下述配方进行配置：
缓冲液100-200mM，表面活性剂0.1-0.3％，防腐剂0.2-0.5％，无机盐1-4％以及促凝剂1-2％；
所述缓冲液为BICINE；所述表面活性剂选自Brj 35、吐温20或A90中的至少一种；所述防腐剂选自Proclin-300、叠氮钠或庆大霉素中的至少一种；所述无机盐选自氯化钠或氯化钾中的至少一种；所述促凝剂选自PEG6000或PEG8000中的至少一种；
(2)试剂R2的制备
将胶乳微球加入20-50mM标记缓冲液中，搅拌均匀；随后向其中加入活化剂活化，搅拌均匀；向活化的胶乳微球溶液中加入D-Dimer单克隆抗体，同时向其中加入组分A以及组分B组合物，所述组分A选自吗啉或哌啶中的至少一种，所述组分B选自苯甲酸或水杨酸中的至少一种，搅拌均匀后孵育5-10h；加入0.5-1％蛋白保护剂和0.1-0.2％防腐剂，30-40℃孵育50-70h。
8.根据权利要求7所述的一种D-二聚体胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，加入0.1苯甲酸以及0.3％吗啉的组合物。
9.根据权利要求7所述的一种D-二聚体胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述标记缓冲液为HEPES缓冲液；所述蛋白保护剂选自BSA或酪蛋白中的至少一种；所述防腐剂选自PC-300或叠氮钠中的至少一种；所述活化剂采用EDC/NHS，所述NHS、EDC与胶乳微球的质量比为9:15:500000，所述D-Dimer单克隆抗体与活化胶乳微球的质量比为：1:15.625。
10.根据权利要求8-9任一项所述的一种D-二聚体胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述R2试剂中包被有D-Dimer单克隆抗体的胶乳颗粒的含量为0.3-0.5％。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110445631.4A CN112858698B (zh) | 2021-04-25 | 2021-04-25 | 一种d-二聚体胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法 |
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