CN112858442B

CN112858442B - 敌百虫溶胶-凝胶印迹传感器的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN112858442B
Application number: CN202110023769.5A
Authority: CN
Inventors: 高文惠; 李东东; 秦思楠; 尤晓亭
Original assignee: Hebei University of Science and Technology
Current assignee: Hebei University of Science and Technology
Priority date: 2021-01-08
Filing date: 2021-01-08
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2041-01-08
Also published as: CN112858442A

Abstract

本发明公开了一种敌百虫溶胶‑凝胶印迹传感器的制备方法，包括依次进行的玻碳电极预处理、还原氧化石墨烯修饰电极、溶胶‑凝胶预聚液的制备、电聚合制备溶胶‑凝胶印迹膜、模板分子洗脱等步骤，本发明首次以敌百虫为模板分子，甲基三甲氧基硅烷为功能单体，四甲氧基硅烷为交联剂，应用溶胶‑凝胶方法，制备的印迹聚合物膜刚性强，且具有较大的比表面积，有利于模板分子与功能单体形成稳定的主客体化合物，使模板分子能够在聚合物网状结构中保持良好的刚性结构并且形成具有记忆效应的空腔，制备的传感器选择性强、稳定性好、灵敏度高、成本低、响应快。本发明适用于对植物源性食品中敌百虫残留进行快速检测。

Description

敌百虫溶胶-凝胶印迹传感器的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于分子印迹技术领域，涉及一种分子印迹电化学传感器的制备方法及其应用，具体地说是一种敌百虫溶胶-凝胶印迹传感器的制备方法及其应用。

背景技术

敌百虫因其杀虫范围广，毒性较小，降解速度较快等特点，是目前国内生产和应用较为普遍的一种农药。大量研究表明，敌百虫作为一种中度毒性广谱有机磷类农药，在我国农药中毒事件中急性有机磷中毒事件与致死率都位居首位。敌百虫作为一种神经毒素，其作用原理是通过抑制神经细胞中乙酰胆碱酯酶活性，阻断神经递质传递，引起一系列神经系统中毒症状，来实现杀虫的目的。若长期大量使用敌百虫，在获得经济效益的同时，也往往会造成大量有机磷农药的残留，人误食会出现头晕、恶心、呕吐，重者出现昏迷，呼吸中枢麻痹，抑制胆碱酯酶，造成神经生理功能紊乱。所以建立一种快速、灵敏的敌百虫残留检测方法具有重要意义。

目前，国内外对于农作物中敌百虫的检测方法通常采用色谱法、色谱串联质谱法以及酶联免疫法等。但是色谱法与色谱串联质谱法需要较高的检测成本，耗时长，样品前处理复杂，难以实现快速检测；酶联免疫法需要制备抗体，且制备过程复杂，成本高，不耐酸碱，易失活。然而印迹电化学传感器弥补了以上方法的缺点，其具有操作简单、成本低，选择性强、稳定性好、传质快等优点，有望实现对敌百虫残留的快速、灵敏检测。目前，以敌百虫为模板分子，甲基三甲氧基硅烷为功能单体，四甲氧基硅烷为交联剂制备溶胶-凝胶印迹传感器并将其应用到实际样品检测中未见报道。

分子印迹技术(molecular imprinting technology, MIT)是指模板分子与功能单体在一定的条件下混合，通过聚合的方式形成具有特异性识别的多重结合位点，再通过浸泡、超声、电位诱导等方式将模板分子去除，形成与模板分子大小和形状相匹配的三维空穴，这种印迹空穴对模板分子以及模板分子的结构类似物具有特异选择性。分子印迹聚合物主要具有三大特点：构效预定性，选择识别性，广泛实用性。

（1）构效预定性产生的原因是由于随着模板分子以及功能单体种类的改变，聚合物膜的结构也会随之发生改变，进而满足具体试验的要求；

（2）选择识别性产生的原因是在由于模板分子的不同选择，聚合物膜的表面可以形成与模板分子空间结构相匹配的空穴；

（3）广泛实用性是由于分子印迹聚合物，属于化学合成物质，所以性质稳定，能够在恶劣的条件下发挥其作用，并且保存时间较长，容易获得。将分子印迹聚合物成功地固定在转换器表面是制备分子印迹电化学传感器关键的一步。

发明内容

本发明要解决的技术问题，是提供一种一种敌百虫溶胶-凝胶印迹传感器的制备方法，它包括依次进行的玻碳电极预处理、还原氧化石墨烯修饰电极、溶胶-凝胶预聚液的制备、电聚合制备溶胶-凝胶印迹膜、模板分子洗脱等步骤，该方法首次以敌百虫为模板分子，甲基三甲氧基硅烷为功能单体，四甲氧基硅烷为交联剂，利用溶胶-凝胶技术，使制备的印迹聚合物膜刚性强，且具有较大的比表面积，有利于模板分子与功能单体形成稳定的主客体化合物，使模板分子能够在聚合物网状结构中保持良好的刚性结构并且形成具有记忆效应的空腔，该制备方法简单、易于控制，制备的传感器选择性强、稳定性好、灵敏度高、成本低、响应快。

本发明的另外一个目的是，提供了上述基于溶胶-凝胶印迹膜制备敌百虫溶胶-凝胶印迹传感器的应用，它可用于植物源性食品中敌百虫残留的快速检测。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

一种敌百虫溶胶-凝胶印迹传感器的制备方法，它按照如下的步骤顺序依次进行：

（1）玻碳电极预处理

将玻碳电极抛光并洗涤，然后将电极置于0.5mol/L的H₂SO₄溶液中，-0.4～1.2 V电位范围内进行循环扫描；取出电极冲洗后，氮气吹干，置于电活性探针溶液中循环扫描，直至得到稳定的循环伏安响应且峰电位差小于85mV，得到具有活性的电极，记为A；

（2）还原氧化石墨烯修饰电极

将100 mg壳聚糖置于10mL 1%CH₃COOH溶液中，磁力搅拌30min，并超声赶出气泡，记为B，备用；20mg还原氧化石墨烯溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺中，超声30min，然后取5 mL置于烧杯中并在搅拌状态下逐滴加入等体积的B，搅拌30min，制备还原氧化石墨烯-壳聚糖修饰剂，记为C；使用移液枪分两次滴涂共10μL的C于A表面，红外灯下晾干，制得还原氧化石墨烯-壳聚糖修饰电极，记为D；

（3）溶胶-凝胶预聚液的制备

将四甲氧基硅烷、甲基三甲氧基硅烷、2mL 0.2mol/L氯化钾以及2mL无水乙醇混合后超声10min，得到透明的非印迹溶胶-凝胶预聚液，记为E；

将四甲氧基硅烷、甲基三甲氧基硅烷、0.1mol/L敌百虫、2mL 0.2mol/L氯化钾以及2mL无水乙醇混合后超声10min，得到透明的印迹溶胶-凝胶预聚液，记为F；

（4）电聚合制备溶胶-凝胶印迹膜

将D置于E中，采用循环伏安法进行循环扫描，观察溶解氧被还原成为OH^-所对应的出峰位置；

将D置于F中，通过计时电流法在负电位条件下，进行电聚合，在修饰电极表面形成致密均匀的溶胶-凝胶印迹膜，自然晾干后过夜，记为G；

（5）模板分子的洗脱

将G置于洗脱液中洗脱，使用超纯水冲洗电极表面物理吸附的敌百虫和洗脱液，得敌百虫溶胶-凝胶印迹电极。

在本发明中，采用还原氧化石墨烯修饰电极，该步骤可保证修饰的电极具有优良的导电性，为后期制备稳定性好、灵敏度高、的响应快传感器奠定了基础；本发明所用的石墨烯因其具有较大的比表面积，优异的导电性，高机械强度且具有比碳纳米管更强的电子传递能力，可作为一种理想的新型电极修饰材料，化学修饰石墨烯主要包含氧化石墨烯和还原氧化石墨烯（Reduced graphene oxide, rGO），氧化石墨烯带有大量的含氧官能团，这些含氧官能团亲水性强，因此具有可分散性，但是由于引入大量的含氧基团，则会破坏石墨烯共轭结构，使其导电性降低，为了解决导电性差问题，本发明将氧化石墨烯还原，使其部分共轭结构得到恢复，同时部分含氧官能团得到保留。

作为本发明的限定：

（一）步骤（1）中，所述抛光是玻碳电极依次用0.5～0.05μm的Al₂O₃粉在麂皮表面上进行研磨70～80圈。

（二）步骤（1）中，所述电活性探针为K₃[Fe(CN)₆]，电活性探针溶液是由1mmol/L K₃[Fe(CN)₆]与1mol/L KCL溶液按照体积比1:1配制而得。

（三）步骤（3）中：所述甲基三甲氧基硅烷用量为50～200μL；所述四甲氧基硅烷用量为100～900μL；所述敌百虫用量为100～400μL。

在该步骤中甲基三甲氧基硅烷的质量浓度为98%，四甲氧基硅烷的质量浓度为98%；

本发明以敌百虫为模板分子，甲基三甲氧基硅烷为功能单体，四甲氧基硅烷为交联剂，在该步骤中，各个物质的用量及比例是至关重要的，这主要与制备的传感器的性能相关，主要体现在一方面，功能单体与模板分子用量比例对传感器印迹效果具有较为重要的影响，另一方面，功能单体与交联剂添加量的比例对成膜的绝缘性与稳定性也起到决定性作用。

（四）步骤（4）中，所述循环伏安法的循环扫描电位区间为-1.3～0V、扫描速度为0.05 V/s。

（五）步骤（4）中，所述计时电流法的沉积电位为-0.8～-1.3 V，聚合时间为1000～3000s。

（六）步骤（5）中，所述洗脱剂为无水乙醇，洗脱时间为10～70min。

（七）步骤（1）中，所述电活性探针溶液中循环扫描时的电位区间为-0.2～0.8V、扫描速度为0.05V/s。

本发明的反应机理如下：

（1）水解反应：

Si(OR)_n + xH₂O → HO-Si_x(OR)_n-x + xROH

（2）脱水和脱醇反应：

HO-Si≡ + ≡Si-OH → -Si-O-Si- + H₂O

≡Si-OR + HO-Si≡ → -Si-O-Si- + ROH

（3）聚合反应：

n (Si-O-Si) → (－Si-O-Si－)

本发明还提供了敌百虫溶胶-凝胶印迹传感器的应用，它用于特异性吸附敌百虫，进一步应用于植物源性食品中敌百虫残留的分析检测。

由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：

1. 本发明首次以敌百虫为模板分子，甲基三甲氧基硅烷为功能单体，四甲氧基硅烷为交联剂，并利用溶胶-凝胶技术，使制备的印迹聚合物膜刚性强，且具有较大的比表面积，有利于模板分子与功能单体形成稳定的主客体化合物，使模板分子能够在聚合物网状结构中保持良好的刚性结构并且形成具有记忆效应的空腔。

2. 本发明与其它的敌百虫检测技术相比，制备的传感器选择性强，稳定性好，灵敏度高，成本低，响应快。

本发明适用于制备敌百虫溶胶-凝胶印迹传感器，并进一步应用于对植物源性食品中敌百虫残留分析检测。

本发明下面将结合具体实施例作进一步详细说明。

附图说明

图1为实施例1中敌百虫溶胶-凝胶印迹传感器制备过程示意图；

图2为还原氧化石墨烯（rGO）用量-电流示意图；

图3为修饰剂滴涂量-电流示意图；

图4为印迹溶胶-凝胶预聚液中功能单体用量-电流示意图；

图5为印迹溶胶-凝胶预聚液中交联剂用量-电流示意图；

图6为印迹溶胶-凝胶预聚液中模板分子用量-电流示意图；

图7为修饰电极在溶胶-凝胶溶液中的循环伏安曲线（a-未除氧；b-除氧）；

图8为溶胶-凝胶印迹传感器的聚合电位-电流示意图；

图9为溶胶-凝胶印迹传感器的聚合时间-电流示意图；

图10为溶胶-凝胶印迹传感器的模板洗脱时间-电流示意图；

图11为不同电极在电活性探针溶液中的循环伏安曲线（a-rGO/GCE；b-GCE；c-MTP/rGO/GCE；d- adTF-MTP/rGO/GCE；e-TF- MTP/rGO/GCE）；

图12为敌百虫溶胶-凝胶印迹传感器选择性研究柱状图（a-敌百虫，b-久效磷，c-甲基对硫磷，d-克百威，e-噻菌灵）；

图13为敌百虫胶-凝胶印迹传感器线性关系曲线图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业渠道得到。

实施例1 敌百虫溶胶-凝胶印迹传感器的制备方法

本实施例中敌百虫溶胶-凝胶印迹传感器的制备方法，制备过程如图1所示，按照如下的步骤顺序依次进行：

（1）玻碳电极预处理

将玻碳电极依次用0.5～0.05μm的Al₂O₃粉在麂皮表面上进行研磨77圈，用超纯水清洗电极表面后，依次置于0.5%HNO₃（质量浓度）、无水乙醇、超纯水中分别超声清洗20s；取出并用超纯水冲洗干净，氮气吹干，然后将电极置于0.5mol/L的H₂SO₄溶液中，-0.4～1.2 V电位范围内进行循环扫描；

取出电极冲洗后，置于电活性探针溶液中，其中，电活性探针为铁氰化钾，电活性探针溶液为1mmol/L K₃[Fe(CN)₆]与1mol/L KCl溶液按照体积比1:1配制而得；

在-0.2～0.8V的电位区间、以0.05V/s扫描速度循环扫描，直至得到稳定的循环伏安响应，即对称可逆的循环伏安峰（峰电流比为1:1，峰电位差小于85 mV），得到具有活性的电极，记为A；

（2）还原氧化石墨烯(rGO)修饰电极

将100 mg壳聚糖（CS）置于10mL 1%CH₃COOH（体积浓度）溶液中，磁力搅拌30min，并超声赶出气泡，记为B，备用；20mg rGO溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）分散介质中，超声30min后将其充分溶解，然后取5ml置于烧杯中并在搅拌状态下逐滴加入等体积的B，搅拌30min，成功制备rGO-CS修饰剂，记为C；使用移液枪滴涂10μL的C（均分两次滴涂）于GCE表面，红外灯下晾干，制得rGO-CS修饰电极，记为D；

（3）溶胶-凝胶预聚液的制备

将500μL四甲氧基硅烷、100μL甲基三甲氧基硅烷、2mL 0.2mol/L氯化钾以及2mL无水乙醇混合后超声10 min，得到透明的非印迹溶胶-凝胶预聚液，记为E；

将500μL四甲氧基硅烷、100μL甲基三甲氧基硅烷、 0.1mol/L 300μL敌百虫、2mL0.2 mol/L氯化钾以及2mL无水乙醇混合后超声10 min，得到透明的印迹溶胶-凝胶预聚液，记为F；

（4）电聚合制备溶胶-凝胶印迹膜

将D置于E中，采用循环伏安法（CV），在-1.3～0V电位条件下，进行循环扫描，扫描速度为0.05V/s，观察到溶解氧被还原生为OH^-所对应的出峰位置为-0.7 V左右；

将D置于F中，通过计时电流法（i-t），在-1.0V电位条件下，聚合2000s，在修饰电极表面形成致密均匀的溶胶-凝胶印迹膜，自然晾干后过夜，记为G；

（5）模板分子的洗脱

将G置于无水乙醇中通过浸泡洗脱10min，模板分子敌百虫被成功洗脱，然后使用超纯水冲洗电极表面物理吸附的敌百虫和洗脱液，得敌百虫溶胶-凝胶印迹电极。

本实施例所制备的传感器选择性强，即只能特异性吸附敌百虫，稳定性好、灵敏度高、成本低、响应快，制备步骤简单、易于控制，与其它敌百虫检测技术相比，操作过程简单、成本低、耗时短。

实施例2-6 敌百虫溶胶-凝胶印迹传感器的制备方法

本实施例分别为一种敌百虫溶胶-凝胶印迹传感器的制备方法，制备步骤及技术参数与实施例1相似，不同之处仅在于：制备过程中相应的技术参数不同，具体结果见表1。

表1 制备过程的技术参数表

实施例2-6中所制备的传感器选择性强、稳定性好、灵敏度高、成本低、响应快，制备步骤简单、易于控制，与其它的敌百虫检测技术相比，操作过程简单、成本低、耗时短。

实施例7 还原氧化石墨烯修饰条件选择实验

rGO具有较大的比表面积，优异的导电性等电化学特征，可作为一种理想的新型的修饰材料。首先，试验分别选取DMF和超纯水作为rGO的分散介质，将其固定为10mL，然后准确称取20mg rGO溶于分散介质中，超声30min将其充分溶解后放入4℃环境中静置3d，试验发现以超纯水作为溶剂的rGO修饰剂发生了明显的沉降现象，而以DMF作为溶剂的rGO修饰剂分散效果良好。

将以DMF为溶剂的rGO修饰剂滴涂在清洗后的玻碳电极表面，发现rGO在电极表面分散不均匀且不稳定，为取得最佳的修饰效果，试验向修饰液中加入等体积的CS-1%CH₃COOH溶液作为最佳的分散剂，由于CS具有良好的成膜性，优异的机械性能且含有大量的-OH和-NH₂，同时rGO也带有大量的含氧官能团，两者之间由于静电吸附作用，CS包裹在rGO表面，使其均匀分布在电极表面，且在电极表面可以稳定的粘附。但壳聚糖具有绝缘性，过多的CS会影响rGO修饰层的导电作用，因此试验对壳聚糖的用量进行了优化，结果表明，当CS使用量为25mg和50mg时rGO修饰层容易发生脱落现象，当CS使用量大于100mg时，玻碳电极修饰后的响应电流值明显降低，且不易在红外灯下晾干，因此CS的最佳用量为100 mg。

试验对rGO的使用量进行了优化，试验分别将5～50mg的rGO溶解在10mL的DMF溶液中，然后与CS-1%CH₃COOH等体积混合后对玻碳电极进行修饰，并对修饰电极的响应电流值进行了考察。由图2可以看出，当rGO的使用量为20mg时，修饰电极的响应电流值最大，因此rGO的最佳使用量为20mg。

最后，试验对rGO修饰液的滴涂用量进行了确定，将rGO修饰的电极置于红外灯下晾干后，对该电极的响应电流值进行考察。结果如图3所示，当修饰液的滴涂量为10μL时修饰电极的响应电流值最大，因此最佳的修饰液的滴涂量为10μL。

实施例8 模板分子、功能单体与交联剂用量的确定

一方面，功能单体与模板分子用量比例对传感器印迹效果具有较为重要的影响，另一方面，功能单体与交联剂添加量的比例对成膜的绝缘性与稳定性也起到决定性作用。因此，试验对功能单体的用量进行了确定，首先固定交联剂TMOS的用量500μL，然后分别选取功能单体MTMOS 50μL、100μL、150μL、200μL四种不同用量进行电聚合，试验分别考察了非印迹聚合膜的聚合情况及稳定性，在上述四种条件聚合完成后，在电极表面都形成了几乎不导电的聚合物薄膜，然后考察洗脱后聚合物薄膜的稳定性，结果如图4中a）图所示，当功能单体的用量为100μL和150μL时制备的非印迹电极经过无水乙醇浸泡洗脱后改变的电流值较小，即形成的聚合物膜稳定，然后对印迹聚合物膜的吸附能力进行考察，试验固定模板分子0.1mol/L的TF 200μL与交联剂TMOS 500μL，然后在上述四种条件下分别进行电聚合，形成印迹聚合物薄膜，然后经无水乙醇浸泡洗脱后，对印迹电极的吸附能力进行考察，由图4中b）图可知，当MTMOS的用量为50μL和100μL时，对目标物质的吸附能力较强，综合以上考察结果，最终确定功能单体的最佳用量为100μL。

交联剂的用量在印迹聚合物识别位点的形成中占有重要地位，交联剂用量过少，形成的印迹空穴少，交联剂用量过多，模板分子难洗脱且聚合膜易发生破裂，对印迹效果产生严重的影响。试验固定0.1mol/L的敌百虫200μL，MTMOS 100μL，分别选取100～900μL的TMOS，进行电聚合，结果如图5中a）图所示，当交联剂用量大于500μL时聚合后的响应电流值明显增大，这是由于交联剂用量过多导致印迹膜破裂，试验又对印迹电极洗脱效果进行了考察[如图5中b）图所示]，当交联剂用量为400μL时，洗脱后的响应电流值最大，确定交联剂的最佳用量为400μL。

确定功能单体与交联剂的用量后，试验对模板分子的用量进行了试验，分别选取100μL、150μL、200μL、300μL、400μL 0.1 mol/L的TF标准溶液，进行电聚合，然后用无水乙醇洗脱1h后置于0.5 mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]-0.5 mol/L KCl表征溶液中进行CV扫描，然后将其置于0.1mmol/L敌百虫吸附液中进行吸附，再次进行表征，结果如图6所示，当模板分子使用量为200μL时洗脱后的响应电流值最大[图6中a）图所示],效果最好[图6中b）图所示]，因此模板分子的最佳用量为200μL。

实施例9 聚合电位的选择

将rGO修饰后的电极置于含有TMOS、MTMOS、乙醇、KCl的聚合液中，观察CV曲线[图7中a）图所示]，在-0.7V左右出现还原峰，该峰的出现是由于聚合液中溶解氧在电极表面被还原为OH^-，图7中b）图为修饰电极在去除溶解氧的聚合液中的CV曲线，并未出现还原峰，且将三电极系统置于该聚合液中进行电聚合，即使电位小于-1.0V时也未能形成聚合物膜。因此通过改变电沉积电位，控制OH^-的生成，试验采用计时电流法，分别选取-0.8V、-0.9V、-1.0V、-1.1V、-1.2V、-1.3V为聚合电位，结果如图8，当电位为-1.0V时，聚合后的响应电流值最小，这是由于随着聚合电位的降低，使电极表面附近的pH升高，促进了溶胶-凝胶分子印迹聚合物膜在电极表面的形成。当电流小于-1.0V时，聚合后电流响应值明显增大，这是由于电位过负时，电极表面发生的析氢反应破坏了溶胶-凝胶分子印迹聚合物膜的形成，因此最佳的聚合电位为-1.0V。

实施例10 聚合时间的确定

试验通过调节沉积时间控制聚合膜的厚度，沉积时间短导致形成的聚合膜薄，形成的印迹结合位点少，但沉积时间过长形成的聚合物膜厚度过厚，导致模板分子被包埋，洗脱困难，从而减少印迹空穴的数量，在其他最佳条件下，试验对沉积时间进行了试验，分别选取了沉积时间为1000s、1500s、2000s、2500s、3000s进行电沉积，并将其进行洗脱，结果如图9所示，当沉积时间由1000s增加到2000s时洗脱后的响应电流值不断增加，但随着电沉积时间的继续延长响应电流值逐渐降低，因此最佳的沉积时间为2000s。

实施例11 洗脱剂与洗脱时间的优化

洗脱剂的洗脱效果直接影响传感器的印迹效果，试验不仅要得到更多的印迹有效位点，且要考虑洗脱剂对印迹聚合膜是否存在破坏作用。首先根据敌百虫的物理化学性质，选取了超纯水、无水乙醇、0.04mol/L NaOH水溶液、PBS缓冲溶液（pH=7.2）、乙醇-乙酸（9:1，V/V）作为洗脱剂，当选取乙醇-乙酸（9:1，V/V））和0.04 mol/L NaOH水溶液作为洗脱剂时，对非印迹膜造成了破坏，当选取超纯水和PBS缓冲溶液（pH=7.2）作为洗脱剂时模板分子难以洗脱，当选取无水乙醇作为洗脱剂时模板分子被洗脱且非印迹膜稳定，因此选取无水乙醇作为最佳的洗脱剂。另外本实施例还对洗脱剂的洗脱时间进行了试验，分别考察了洗脱10～70min后峰电流的响应值，如图10所示，当洗脱时间到达40 min后峰电流值趋于稳定，因此最佳的洗脱时间为40 min。

实施例12 吸附液溶剂的选择

试验考察了无水乙醇、超纯水、PBS缓冲液作为吸附溶剂时印迹传感器对目标物质的吸附能力。结果发现，当无水乙醇作为溶剂时目标物质难以吸附到印迹空穴中，当选取超纯水作为溶剂时，印迹空穴对目标物质的吸附效果较差，当PBS缓冲液作为溶剂时吸附效果较好。接下来试验对PBS缓冲液的pH进行了试验，试验分别考察了pH为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的PBS缓冲液作为溶剂时印迹电极对目标物质的吸附能力，结果表明，当选取pH为5.0的PBS缓冲液作为吸附溶剂时印迹传感器对目标分子的吸附能力最佳，因此选取pH为5.0的PBS缓冲液最为最佳的吸附溶剂。

实施例13 分子印迹效应的验证

循环伏安法表征

将实施例1所提供的敌百虫溶胶-凝胶印迹传感器置于电活性探针溶液中（电活性探针溶液以及探针的类型均与实施例1相同）进行循环伏安表征，分别对GCE、rGO/GCE、adTF-MIP/rGO/GCE 、MIP/rGO/GCE、TF-MIP/rGO/GCE五种电极的电化学行为进行表征，结果如图11所示。

由图11中CV曲线可知，rGO修饰电极[图11中a曲线所示]的响应电流值明显大于裸电极（图11中b曲线所示），这是由于rGO具有较大的比表面积，优异的导电性，提高了电极表面的电子交换速率，当修饰电极在聚合液中进行电聚合后（图11中e曲线所示），电极响应电流值几乎无0，表明此时电极表面形成了致密且几乎不导电的溶胶-凝胶印迹聚合膜，抑制了探针离子在电极表面的转移；印迹电极经洗脱后（图11中c曲线所示）与图11中e曲线相比，响应电流值得到显著的提高，表明模板分子经洗脱后，在电极表面形成了具有特异识别性的空穴，探针离子通过空穴与电极表面实现电子转移；当印迹电极重新吸附模板分子后（图11中d曲线所示），模板分子TF重新占据部分印迹空穴，阻碍了电子的转移，峰电流值随之降低，说明传感器具有良好的印迹效应。

实施例14 印迹传感器的性能分析

（1）选择性能的考察

试验选取了与TF结构类似的甲基对硫磷和久效磷作为结构类似物以及与其结构相差较大的克百威、噻菌灵做为干扰物质来考察溶胶-凝胶印迹传感器(实施例1-6所提供)的选择性。将制备成功的印迹电极分别置于0.1mmol/L TF和干扰物质溶液中，然后采用CV测定吸附后的响应电流值，计算相应的峰电流变化情况（ΔI），结果如图12所示，溶胶-凝胶印迹传感器对模板分子敌百虫的选择性最高，对结构类似物甲基对硫磷和久效磷响应较小，对克百威和噻菌灵几乎无响应，因此可以说明本发明所制备的溶胶-凝胶印迹传感器对敌百虫具有良好的识别性。

（2）重复性能的考察

本实施例同时考察了实施例1-6所提供的溶胶-凝胶印迹传感器的重复性，将三支溶胶-凝胶印迹传感器分被置于1.0×10^-5mol/L的TF标准溶液中吸附-洗脱连续检测20次，并记录试验数据，其响应电流值相对标准偏差≤5.13。

稳定性试验是将制备的印迹电极先检测出初始电化学响应值，并保存于4℃条件下，然后依次在放置7d、14d以及21d后进行吸附试验并进行测定，测定值分别为初始值的94.1%、89.3%、83.6%，表明该溶胶-凝胶印迹传感器具有良好的重现性和稳定性。

实施例15 敌百虫溶胶-凝胶印迹传感器在食品样品检测中的应用

（1）样品处理

①样品的提取

将样品（苹果、橙子、黄瓜、白萝卜）用组织捣碎机捣碎后，准确称取样品2 g（精确到0.01g）置于50mL的离心管中，加入10mL PBS，经2 min震荡，10min超声提取，10min离心（速率4000r/min），取出上清液，再向残渣中加入10mL PBS，按照上述的处理方法进行第二次提取，合并两次的上清液于20mL容量瓶中，且将其定容至20mL，待测。

②样品检测

在室温下，采用CV法对处理过的苹果、橙子、黄瓜、白萝卜样品进行检测。测量参数设置如下：起止电位：-0.2～0.8V，扫描速率为50mV/s，每次测定后，将电极置于无水乙醇溶液中洗脱，以去除模板分子，再进行下一次测量。

（2）线性关系与检出限

试验配制了不同浓度的敌百虫标准溶液（1.0×10^-8～1.0×10^-4mol/L），通过CV对吸附不同浓度敌百虫标准溶液后的传感器的响应电流值进行测定。以不同浓度敌百虫标准溶液对应的-lgC为横坐标，以溶胶-凝胶印迹传感器吸附目标物质前后响应峰电流的差值ΔI为纵坐标，绘制标准曲线如图13所示，模板分子TF在5.0×10^-8～1.0×10^-4 mol/L浓度范围内与ΔI呈良好线性关系，其线性方程为ΔI=1.0034lgC+9.925，线性相关系数为R²=0.9989，检出限为2.0×10^-8mol/L（S/N=3）。

（3）苹果、橙子、黄瓜、白萝卜中敌百虫的样品加标回收率和精密度试验

在最佳制备条件下，对①处理过的阴性样品在1.0×10^-7 mol/L、1.0×10^-6 mol/L和1.0×10^-5 mol/L 3个添加水平下进行样品加标回收率试验，通过表2、表3可以看出，样品加标平均回收率为96.87%～99.41%，相对标准偏差（RSD）为2.50%～3.88%（n=5）。结果表明本发明所制备的传感器可用于实际样品中敌百虫的残留检测。

表2 水果样品的回收率和精密度试验结果

表3 蔬菜样品的回收率和精密度试验结果

实施例1-6仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明所作的其它形式的限定，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但凡是未脱离本发明权利要求的技术实质，对以上实施例所作出的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明权利要求保护的范围。

Claims

1.一种敌百虫溶胶-凝胶印迹传感器的制备方法，其特征在于，它按照如下的步骤顺序依次进行：

（1）玻碳电极预处理

将玻碳电极抛光并洗涤，然后将电极置于0.5mol/L的H₂SO₄溶液中，-0.4～1.2V电位范围内进行循环扫描；取出电极冲洗后，氮气吹干，置于电活性探针溶液中循环扫描，直至得到稳定的循环伏安响应且峰电位差小于85mV，得到具有活性的电极，记为A；

（2）还原氧化石墨烯修饰电极

将100mg壳聚糖置于10mL 1%CH₃COOH溶液中，磁力搅拌30min，并超声赶出气泡，记为B，备用；20mg还原氧化石墨烯溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺中，超声30min，然后取5mL置于烧杯中并在搅拌状态下逐滴加入等体积的B，搅拌30min，制备还原氧化石墨烯-壳聚糖修饰剂，记为C；使用移液枪分两次滴涂共10μL的C于A表面，红外灯下晾干，制得还原氧化石墨烯-壳聚糖修饰电极，记为D；

（3）溶胶-凝胶预聚液的制备

所述甲基三甲氧基硅烷的用量为50～200μL；

所述四甲氧基硅烷用量为100～900μL；

所述敌百虫用量为100～400μL；

（4）电聚合制备溶胶-凝胶印迹膜

将D置于E中，采用循环伏安法进行循环扫描，所述循环伏安法的循环扫描电位区间为-1.3～0V、扫描速度为0.05V/s，观察溶解氧被还原成为OH^-所对应的出峰位置；

将D置于F中，通过计时电流法在负电位条件下，进行电聚合，所述计时电流法的沉积电位为-0.8～-1.3 V，聚合时间为1000～3000s，在修饰电极表面形成致密均匀的溶胶-凝胶印迹膜，自然晾干后过夜，记为G；

（5）模板分子的洗脱

将G置于洗脱液中洗脱，所述洗脱液为无水乙醇，洗脱时间为10～70min，使用超纯水冲洗电极表面物理吸附的敌百虫和洗脱液，得敌百虫溶胶-凝胶印迹电极。

2.根据权利要求1所述的敌百虫溶胶-凝胶印迹传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述抛光是玻碳电极依次用0.5～0.05μm的Al₂O₃粉在麂皮表面上进行研磨70～80圈。

3.根据权利要求1所述的敌百虫溶胶-凝胶印迹传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述电活性探针为K₃[Fe(CN)₆]，电活性探针溶液是由1mmol/L K₃[Fe(CN)₆]与1mol/L KCL溶液按照体积比1:1配制而得。

4.根据权利要求1所述的敌百虫溶胶-凝胶印迹传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述电活性探针溶液中循环扫描时的电位区间为-0.2～0.8V、扫描速度为0.05V/s。

5.如权利要求1-4中任意一项所述的敌百虫溶胶-凝胶印迹传感器的应用，其特征在于，它用于特异性吸附敌百虫。

6.根据权利要求5所述的敌百虫溶胶-凝胶印迹传感器的应用，其特征在于，它应用于植物源性食品中敌百虫残留的分析检测。