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CN112852846A - 青虾Cathepsin L基因、其dsRNA及应用 - Google Patents

青虾Cathepsin L基因、其dsRNA及应用 Download PDF

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CN112852846A CN202110161949.XA CN202110161949A CN112852846A CN 112852846 A CN112852846 A CN 112852846A CN 202110161949 A CN202110161949 A CN 202110161949A CN 112852846 A CN112852846 A CN 112852846A
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cathepsin
freshwater shrimp
seq
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乔慧
张文宜
蒋速飞
熊贻伟
金舒博
龚永生
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Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及青虾Cathepsin L基因及其dsRNA的应用，包括青虾CathepsinL基因、基因片段及其dsRNA，以及dsRNA在抑制青虾卵巢发育中的应用。首先获得青虾Cathepsin L基因，其核苷酸全长序列为SEQ ID No.1，氨基酸序列为SEQ ID No.2。而后利用RNA干扰等技术获得序列为SEQ ID No.3、SEQ ID No.8基因片段，由这两个基因片段合成dsRNA1、dsRNA2。将上述合成的dsRNA1、dsRNA2注入雌性青虾围心腔后，得到dsRNA1可以有效减缓雌性青虾卵巢发育速度。

Description

青虾Cathepsin L基因、其dsRNA及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及青虾Cathepsin L基因、其dsRNA及应用。
背景技术
青虾，学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense)隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Macrobrachium)，又俗称为河虾，广泛分布于亚洲各淡水及半咸水水域，是中国重要的淡水养殖虾类之一，据2020年《中国渔业年鉴》统计，2019年全国养殖青虾产量超过22万吨。雌性青虾具有“性快熟”的特点，在进入繁殖季节后，虾苗放养45天左右可以达到性成熟，当年生的雌虾可繁殖多代。特别是在夏季水温较高时期，雌虾一个卵巢成熟周期只需要15天时间。这一特点是多年来一直困扰青虾产业的重要问题。卵巢快速成熟导致青虾繁殖过快，引起多代同堂，继而引发养殖密度过高、缺氧风险显著提高、饲料消耗增大等问题，严重影响了养殖的经济效益，更给家系选育等科研工作造成难题。因此，找到控制青虾卵巢快熟的方法，对于青虾产业健康高效的发展意义重大。
组织蛋白酶是主要存在于溶酶体中的一类蛋白水解酶，其广泛分布于各种生物体内。其中组织蛋白酶L(Cathepsin L)是溶酶体木瓜蛋白酶C1家族半胱氨酸蛋白酶的主要成员，在生理和病理过程中发挥着重要作用，主要负责蛋白的水解，如抗原递呈、蛋白水解、肿瘤转移等。在生理活动中，Cathepsin L通过降解外源性蛋白，产生多肽抗原决定簇与组织相容性复合体Ⅱ类分子(MHCⅡ)结合而参与抗原递呈。在病理活动中，Cathepsin L通过蛋白水解作用降解细胞外基质，这促进了肿瘤细胞穿透细胞外基质进行转移等。
RNAi(RNA interference,RNAi)技术是利用双链RNA在Dicer酶作用下形成众多小的RNA片段，最终引起靶向mRNA发生降解，导致细胞或个体不能合成相应的氨基酸，引起个体功能表现缺失，达到干扰敲除的目的。已有研究证实，对青虾卵黄蛋白原基因(Vitellogenin)进行RNAi，可有效抑制青虾卵巢发育(Bai et al,2015)。证明RNAi技术在解决青虾“性快熟”问题中具有很好的应用前景。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种青虾Cathepsin L基因、基因片段及其dsRNA和dsRNA在抑制青虾卵巢发育中的应用。该基因可用于减缓雌性青虾卵巢发育成熟速度，为解决青虾“性快熟”问题及遗传改良提供新的思路。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了青虾Cathepsin L基因，其具有如下所示的序列：
(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或
(Ⅱ)、与(Ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(Ⅳ)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所述核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
在上述基础上，本发明提供了青虾Cathepsin L基因编码的蛋白，其具有如下所示的序列：
(Ⅰ)、如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或
(Ⅱ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或
(III)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述序列至少有90％同一性的氨基酸序列。
更重要的是，本发明还提供了所述的青虾Cathepsin L基因或所述的蛋白作为靶标在制备青虾卵巢发育的抑制剂中的应用。
基于上述研究，本发明还提供了青虾Cathepsin L基因片段，其具有如下所示的序列：
(Ⅰ)、如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；或
(Ⅱ)、与(Ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(Ⅳ)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所述核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
本发明还提供了所述的青虾Cathepsin L基因片段在制备青虾卵巢发育的抑制剂中的应用。
此外，本发明还提供了扩增所述青虾Cathepsin L基因片段的引物组，其具有如下所示的序列：
(Ⅰ)、上游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ IDNo.5所示的核苷酸序列；
(Ⅱ)、与(Ⅰ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
基于上述提供的引物组，本发明提供的一种青虾Cathepsin L干扰基因片段获取方法如下：对青虾Cathepsin L氨基酸序列分析后，选择Cathepsin L特异性区域，设计干扰引物，上游引物SEQ ID No.4和下游引物SEQ ID No.5。然后以青虾总cDNA为模板进行PCR扩增得到DNA片段SEQ ID No.3。
本发明还提供了dsRNA，以所述的青虾Cathepsin L基因片段为模板转录获得。
本发明还提供了所述的dsRNA抑制青虾Cathepsin L基因mRNA表达的应用。
本发明还提供了所述的dsRNA抑制青虾卵巢发育的应用。
本发明还提供了青虾Cathepsin L基因及其dsRNA的应用，包括青虾Cathepsin L基因、基因片段及其dsRNA，以及dsRNA在抑制青虾卵巢发育中的应用。首先获得青虾Cathepsin L基因，其核苷酸全长序列为SEQ ID No.1，氨基酸序列为SEQ ID No.2。而后利用RNA干扰等技术获得序列为SEQ ID No.3、SEQ ID No.8基因片段，由这两个基因片段合成dsRNA1、dsRNA2。将上述合成的dsRNA1、dsRNA2注入雌性青虾围心腔后，得到dsRNA1可以有效减缓雌性青虾卵巢发育速度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示卵巢发育为I期的雌性青虾在注射dsGFP、dsRNA1、dsRNA2后，卵巢和肝胰腺中Cathepsin L基因在不同采样时间点的mRNA的表达，青虾β-Actin基因作为内参基因；1、4、7分别为注射后第1天、第4天、第7天(n＝9)；不同字母代表p<0.05，对照组用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)基因作为报告基因，对照组注射相同剂量的dsGFP；
图2是卵巢发育为I期的雌性青虾在注射dsGFP、dsRNA1、dsRNA2后，青虾卵巢性腺指数变化图；1、30分别为注射后第1天与第30天(n＝9)；不同字母a、b代表p<0.05。
具体实施方式
本发明公开了青虾Cathepsin L基因、基因片段及其dsRNA和dsRNA在抑制青虾卵巢发育中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种青虾Cathepsin L基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1；氨基酸序列SEQ ID No.2。
本发明提供了一种高效的青虾Cathepsin L干扰基因片段，其核苷酸序列为SEQID No.3。
本发明提供的一种青虾Cathepsin L干扰基因片段获取方法如下：对青虾Cathepsin L氨基酸序列分析后，选择Cathepsin L特异性区域，设计了两对干扰引物，一是上游引物SEQ ID No.4和下游引物SEQ ID No.5，二是上游引物SEQ ID No.6和下游引物SEQID No.7，然后以青虾总cDNA为模板进行PCR扩增得到DNA片段SEQ ID No.3、SEQ ID No.8。
进一步以DNA片段SEQ ID No.3、SEQ ID No.8为模板，利用试剂盒合成dsRNA1、dsRNA2。
以DNA片段SEQ ID No.3、SEQ ID No.8为模板合成的dsRNA1、dsRNA2在抑制雌性青虾卵巢发育中的应用：注射上述dsRNA1、dsRNA2到青虾围心腔，注射浓度为4μg/g。结果表明注射SEQ ID No.3为模板合成的dsRNA1可以有效降低青虾Cathepsin L基因mRNA的表达，抑制了青虾卵巢发育速度。而注射SEQ ID No.8为模板合成的dsRNA2并没有有效降低Cathepsin L基因mRNA的表达，青虾卵巢发育速度并未受到抑制。
其中：
SEQ ID No.1
ttgaaatctcccgttcaataaacattttctccacaactacgattctctaatccgagactttccgcagatgaaattcctgctcttcctctgtggtttggccatcgctgccgccagtcagtcatgggaaagctttaagctgacccatggcaaggcctactccaacgccaaggaggagctctacaggaagaccattttcgagagcaaccttaaattcgtagcagaacacaatgaacgcttccgaaagggcctagtcaccttcaacgtcgccatgaacagatttggtgacttgaccacagaggagtttgtagcccagatgactggtctgcagaaactggagagcaccgagggaatggaattcgctcacttccctgaggcccccagagctgccgatgttgactggagaaacaagggagctgtcactcctgtcaaggaccagggacagtgtggatcctgctggtccttctctactactggagctctagaaggcgcacatttcatcaaaaccggaagtctgccaagcctctccgaacagcagctggttgattgctcaaaggaaaacagcggttgcaacggaggagttgtgcaatgggcctacgattacctcaagtcctgcggaggaagccagactgagtcttcctatccttacgaggctattgacaacatatgccgcttcgattcatctcaggtggctgccactgtgaggggatacacgaacatcccctatggcgatgaggtgactcaggcctctgctgtccacgacgaaggtccagtcagtgtctgcgtcgatgctggacacttgtccttccagttgtacagctcaggtgtctactacgaaccaaactgcaaccctcagggcatcaaccacgccgtgttggctgttggctacggaaccgaaggcggctccgactactggatcatcaagaactcgtggggcagcagctggggtgagtctggatacatgaagctcaccaggaacaagaacaaccactgcggtgttgccacccagtcttgctacccaaccgtctaaggattccaagaaagtctggttgctttattccatgaagagttatgagtatacatcgacaccttaactcataagaccatagcttgataatcatgtctggctttatatcttgtttatgaaaaataaagtggaatcgattaaaaaaaaaa
SEQ ID No.2
MKFLLFLCGLAIAAASQSWESFKLTHGKAYSNAKEELYRKTIFESNLKFVAEHNERFRKGLVTFNVAMNRFGDLTTEEFVAQMTGLQKLESTEGMEFAHFPEAPRAADVDWRNKGAVTPVKDQGQCGSCWSFSTTGALEGAHFIKTGSLPSLSEQQLVDCSKENSGCNGGVVQWAYDYLKSCGGSQTESSYPYEAIDNICRFDSSQVAATVRGYTNIPYGDEVTQASAVHDEGPVSVCVDAGHLSFQLYSSGVYYEPNCNPQGINHAVLAVGYGTEGGSDYWIIKNSWGSSWGESGYMKLTRNKNNHCGVATQSCYPTV
SEQ ID No.3
gctctacaggaagaccattttcgagagcaaccttaaattcgtagcagaacacaatgaacgcttccgaaagggcctagtcaccttcaacgtcgccatgaacagatttggtgacttgaccacagaggagtttgtagcccagatgactggtctgcagaaactggagagcaccgagggaatggaattcgctcacttc
SEQ ID No.4
gctctacaggaagaccattttc
SEQ ID No.5
gaagtgagcgaattccattcc
SEQ ID No.6
gcctacgattacctcaagtcc
SEQ ID No.7
gtggacagcagaggcctgagtc
SEQ ID No.8
gcctacgattacctcaagtcctgcggaggaagccagactgagtcttcctatccttacgaggctattgacaacatatgccgcttcgattcatctcaggtggctgccactgtgaggggatacacgaacatcccctatggcgatgaggtgactcaggcctctgctgtccac
本发明提供的青虾Cathepsin L基因、基因片段及其dsRNA和dsRNA在抑制青虾卵巢发育中的应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1青虾Cathepsin L基因全长序列的获得
通过对雌性青虾巢各个发育时期进行转录组比较分析，获得全长的差异基因Cathepsin L，其核苷酸全长序列为SEQ ID No.1，氨基酸序列为SEQ ID No.2。
实施例2青虾Cathepsin L基因片段及其dsRNA的获取
以青虾Cathepsin L核苷酸序列SEQ ID No.1为依据，在其开放阅读框内采用NCBI在线dsRNA引物设计软件(https://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl)设计RNA干扰的特异性引物(SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6、SEQ ID No.7)，并在上述引物前添加T7启动子序列：TAATACGACTCACTATAGGG。使用含有T7启动子的上游引物SEQID No.4和下游引物SEQ ID No.5与干扰上游引物SEQ ID No.6和下游引物SEQ ID No.7通过PCR扩增得到PCR产物(序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.8所示)，经PCR产物纯化试剂盒纯化之后，按照制造商的说明书，使用Transcript AidTM T7 High Yield Transcriptionkit(Fermentas,Inc.,USA)进行体外转录合成dsRNA1、dsRNA2，然后用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测dsRNA1、dsRNA2的纯度和完整性，并用紫外分光光度计(Eppendorf,Hamburg,Germany)在260nm下测量dsRNA1、dsRNA2的浓度，然后将其保持在-80℃下备用。
实施例3注射Cathepsin L基因片段合成的dsRNA1、dsRNA2抑制雌性青虾卵巢发育实验
(1)Cathepsin L基因片段合成dsRNA1、dsRNA2的注射
根据青虾卵巢发育的外观特征，选择180只卵巢发育处于I期(卵原细胞增殖期，白色透明)的健康青虾0.61±0.14g，用来确保起始卵巢发育时期的一致，设置注射dsGFP的对照组和dsRNA1、dsRNA2的实验组。采用微量注射器将体外合成的dsRNA注射至青虾围心腔内，注射剂量为4μg/g，每组各60只青虾，设置3个平行重复(n＝20)。注射前在玻璃缸内暂养三天，使其适应实验室的养殖环境(水温25±1℃)，每天早晚投喂新鲜的螺蛳一次。
(2)Cathepsin L基因沉默效率的检测
注射后第1、4、7天从每组随机采集3只，解剖出青虾的卵巢与肝胰腺。使用RNAisoPlus(TaKaRa，Japan)试剂提取总RNA，使用Primer ScriptII1st Strand cDNA Synthesis逆转录试剂盒(Bio-Rad)和M-MLV Kit(TaKaRa,，Japan)反转录获得模板cDNA，用此模板进行Real Time PCR检测Cathepsin L的相对表达量，内参基因为(β-Actin)，用来计算目的基因的沉默效率。
表1肝胰腺原始数据
Figure BDA0002937003030000081
表2平均值与标准差
Figure BDA0002937003030000082
表3卵巢原始数据
Figure BDA0002937003030000083
Figure BDA0002937003030000091
表4平均值与标准差
Figure BDA0002937003030000092
如图1以及表1～4所示：卵巢发育为I期的雌性青虾在注射dsGFP、dsRNA1、dsRNA2后，卵巢和肝胰腺中Cathepsin L基因在不同采样时间点的mRNA的表达。1、4、7分别为注射后第1天、第4天、第7天(n＝9)。不同字母代表p<0.05，对照组用绿色荧光蛋白(Greenfluorescent protein，GFP)基因作为报告基因，对照组注射相同剂量的dsGFP。
结果表明，与dsGFP对照组相比，dsRNA1实验组在注射后第4天与第7天肝胰腺沉默效率分别为99.97％、99.55％，卵巢沉默效率分别为95.56％、99.79％，而dsRNA2实验组与对照组相比差异不显著(p＞0.05)。
(3)注射dsGFP、dsRNA1、dsRNA2后青虾性腺发育指数(Gonad Somatic Index，GSI)的变化
表5性腺指数原始数据
Figure BDA0002937003030000093
Figure BDA0002937003030000101
表6平均值与标准差
Figure BDA0002937003030000102
如图2、表5～6所示：卵巢发育为I期的雌性青虾在注射dsGFP、dsRNA1、dsRNA2后，青虾卵巢性腺指数变化图。1、30分别为注射后第1天与第30天(n＝9)。不同字母a、b代表p<0.05。
根据公式性腺发育指数(GSI)＝性腺湿重/体重湿重X100％，计算dsGFP、dsRNA1、dsRNA2三组的青虾性腺发育指数。通过对照组的GSI性腺发育指数与注射dsRNA1实验组的性腺发育指数对比发现，沉默Cathepsin L之后显著抑制了青虾卵巢发育速度，在养殖30天后，对照组已经从卵巢发育I期(卵原细胞增殖期，白色透明)GSI为1.83％发展到III期(次级卵黄发生期，浅绿色)GSI为3.89％，而dsRNA1实验组GSI为1.76％，依旧停留在I期(卵原细胞增殖期，白色透明)；dsRNA2实验组在养殖30天后性腺发育指数为4.00％，发育到III期(次级卵黄发生期，浅绿色)，与对照组相比差异不显著(p＞0.05)。性腺发育指数结果表明，过外源性注射Cathepsin L的dsRNA1可以有效抑制青虾卵巢发育速度，dsRNA2没有抑制卵巢发育速度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
<120> 青虾Cathepsin L基因、其dsRNA及应用
<130> MP2037667
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1173
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgaaatctc ccgttcaata aacattttct ccacaactac gattctctaa tccgagactt 60
tccgcagatg aaattcctgc tcttcctctg tggtttggcc atcgctgccg ccagtcagtc 120
atgggaaagc tttaagctga cccatggcaa ggcctactcc aacgccaagg aggagctcta 180
caggaagacc attttcgaga gcaaccttaa attcgtagca gaacacaatg aacgcttccg 240
aaagggccta gtcaccttca acgtcgccat gaacagattt ggtgacttga ccacagagga 300
gtttgtagcc cagatgactg gtctgcagaa actggagagc accgagggaa tggaattcgc 360
tcacttccct gaggccccca gagctgccga tgttgactgg agaaacaagg gagctgtcac 420
tcctgtcaag gaccagggac agtgtggatc ctgctggtcc ttctctacta ctggagctct 480
agaaggcgca catttcatca aaaccggaag tctgccaagc ctctccgaac agcagctggt 540
tgattgctca aaggaaaaca gcggttgcaa cggaggagtt gtgcaatggg cctacgatta 600
cctcaagtcc tgcggaggaa gccagactga gtcttcctat ccttacgagg ctattgacaa 660
catatgccgc ttcgattcat ctcaggtggc tgccactgtg aggggataca cgaacatccc 720
ctatggcgat gaggtgactc aggcctctgc tgtccacgac gaaggtccag tcagtgtctg 780
cgtcgatgct ggacacttgt ccttccagtt gtacagctca ggtgtctact acgaaccaaa 840
ctgcaaccct cagggcatca accacgccgt gttggctgtt ggctacggaa ccgaaggcgg 900
ctccgactac tggatcatca agaactcgtg gggcagcagc tggggtgagt ctggatacat 960
gaagctcacc aggaacaaga acaaccactg cggtgttgcc acccagtctt gctacccaac 1020
cgtctaagga ttccaagaaa gtctggttgc tttattccat gaagagttat gagtatacat 1080
cgacacctta actcataaga ccatagcttg ataatcatgt ctggctttat atcttgttta 1140
tgaaaaataa agtggaatcg attaaaaaaa aaa 1173
<210> 2
<211> 319
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys Phe Leu Leu Phe Leu Cys Gly Leu Ala Ile Ala Ala Ala Ser
1 5 10 15
Gln Ser Trp Glu Ser Phe Lys Leu Thr His Gly Lys Ala Tyr Ser Asn
20 25 30
Ala Lys Glu Glu Leu Tyr Arg Lys Thr Ile Phe Glu Ser Asn Leu Lys
35 40 45
Phe Val Ala Glu His Asn Glu Arg Phe Arg Lys Gly Leu Val Thr Phe
50 55 60
Asn Val Ala Met Asn Arg Phe Gly Asp Leu Thr Thr Glu Glu Phe Val
65 70 75 80
Ala Gln Met Thr Gly Leu Gln Lys Leu Glu Ser Thr Glu Gly Met Glu
85 90 95
Phe Ala His Phe Pro Glu Ala Pro Arg Ala Ala Asp Val Asp Trp Arg
100 105 110
Asn Lys Gly Ala Val Thr Pro Val Lys Asp Gln Gly Gln Cys Gly Ser
115 120 125
Cys Trp Ser Phe Ser Thr Thr Gly Ala Leu Glu Gly Ala His Phe Ile
130 135 140
Lys Thr Gly Ser Leu Pro Ser Leu Ser Glu Gln Gln Leu Val Asp Cys
145 150 155 160
Ser Lys Glu Asn Ser Gly Cys Asn Gly Gly Val Val Gln Trp Ala Tyr
165 170 175
Asp Tyr Leu Lys Ser Cys Gly Gly Ser Gln Thr Glu Ser Ser Tyr Pro
180 185 190
Tyr Glu Ala Ile Asp Asn Ile Cys Arg Phe Asp Ser Ser Gln Val Ala
195 200 205
Ala Thr Val Arg Gly Tyr Thr Asn Ile Pro Tyr Gly Asp Glu Val Thr
210 215 220
Gln Ala Ser Ala Val His Asp Glu Gly Pro Val Ser Val Cys Val Asp
225 230 235 240
Ala Gly His Leu Ser Phe Gln Leu Tyr Ser Ser Gly Val Tyr Tyr Glu
245 250 255
Pro Asn Cys Asn Pro Gln Gly Ile Asn His Ala Val Leu Ala Val Gly
260 265 270
Tyr Gly Thr Glu Gly Gly Ser Asp Tyr Trp Ile Ile Lys Asn Ser Trp
275 280 285
Gly Ser Ser Trp Gly Glu Ser Gly Tyr Met Lys Leu Thr Arg Asn Lys
290 295 300
Asn Asn His Cys Gly Val Ala Thr Gln Ser Cys Tyr Pro Thr Val
305 310 315
<210> 3
<211> 193
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctctacagg aagaccattt tcgagagcaa ccttaaattc gtagcagaac acaatgaacg 60
cttccgaaag ggcctagtca ccttcaacgt cgccatgaac agatttggtg acttgaccac 120
agaggagttt gtagcccaga tgactggtct gcagaaactg gagagcaccg agggaatgga 180
attcgctcac ttc 193
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctctacagg aagaccattt tc 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaagtgagcg aattccattc c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcctacgatt acctcaagtc c 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtggacagca gaggcctgag tc 22
<210> 8
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcctacgatt acctcaagtc ctgcggagga agccagactg agtcttccta tccttacgag 60
gctattgaca acatatgccg cttcgattca tctcaggtgg ctgccactgt gaggggatac 120
acgaacatcc cctatggcga tgaggtgact caggcctctg ctgtccac 168

Claims (9)

1.青虾Cathepsin L基因，其特征在于，其具有如下所示的序列：
(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或
(Ⅱ)、与(Ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(Ⅳ)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所述核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
2.青虾CathepsinL基因编码的蛋白，其特征在于，其具有如下所示的序列：
(Ⅰ)、如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或
(Ⅱ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或
(III)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述序列至少有90％同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求所述的青虾CathepsinL基因或如权利要求2所述的蛋白作为靶标在制备青虾卵巢发育的抑制剂中的应用。
4.青虾Cathepsin L基因片段，其特征在于，其具有如下所示的序列：
(Ⅰ)、如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；或
(Ⅱ)、与(Ⅰ)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(Ⅳ)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所述核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的青虾Cathepsin L基因片段在制备青虾卵巢发育的抑制剂中的应用。
6.扩增如权利要求4所述青虾Cathepsin L基因片段的引物组，其特征在于，其具有如下所示的序列：
(Ⅰ)、上游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；
(Ⅱ)、与(Ⅰ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
7.dsRNA，其特征在于，以如权利要求4所述的青虾Cathepsin L基因片段为模板转录获得。
8.如权利要求7所述的dsRNA抑制青虾Cathepsin L基因mRNA表达的应用。
9.如权利要求7所述的dsRNA抑制青虾卵巢发育的应用。
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