CN112813028B

CN112813028B - 一种用于结直肠癌类器官培养的培养液及其制备方法

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Publication number: CN112813028B
Application number: CN202110109040.XA
Authority: CN
Inventors: 游明亮; 王磊; 申重阳
Original assignee: Hangzhou Aiming Medical Technology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Aiming Medical Technology Co ltd
Priority date: 2021-01-27
Filing date: 2021-01-27
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2041-01-27
Also published as: CN112813028A

Abstract

本发明公开了一种用于结直肠癌类器官培养的培养液及其制备方法，属于生物医药技术领域。该培养液由如下原料制成：伊卡倍特钠，维生素P4，人重组蛋白R‑Spond i n 1，头蛋白，人重组蛋白rhEGF，4‑羟乙基哌嗪乙磺酸，L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺，青链双抗，N2添加剂，B27添加剂，N‑乙酰‑L‑半胱氨酸，Al k抑制剂A83‑01，4‑(4‑氟苯基)‑2‑(4‑羟基苯基)‑5‑(4‑吡啶基)‑1H‑咪唑，胃泌素，非必需氨基酸溶液，烟酰胺和Advanced DMEM/F‑12培养基。本发明的培养液能使结直肠癌组织细胞在培养的过程中能够保持非常高的细胞和组织活性，更好地表现其固有的病理特征。

Description

一种用于结直肠癌类器官培养的培养液及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于结直肠癌类器官培养的培养液及其制备方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

结直肠癌是最常见的严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一。在我国结直肠癌的发病率为在所有恶性肿瘤中占第三位。而结直肠癌的死亡率在全部恶性肿瘤中占第五位。随着经济的发展、生活水平的提高和生活方式的改变，结直肠癌的发病率还将呈不断上升的趋势。

结直肠癌是一种复杂疾病，其发生、发展是一个动态的过程，涉及到诸多信号分子相互作用，形成了一个复杂的分子调控网络，同时还受到外界环境因素的影响，结直肠癌的病因和发生发展过程有很强的个体差异性，不能一概而论。

目前人们对结直肠癌病理生物学的基本机制了解甚少，并且治疗效率和患者生存率并未显着著改善，主要是由于缺乏合适的研究模型。类器官技术是一种强大的体外建模和研究人类癌症的研究工具。它利用手术中获取的癌组织在体外培养，通过在体外自组装三维(3D)重建，获得的类器官能够再现原始组织的病理生物学关键特征，并且能够进行结直肠癌的功能性测试以及药物筛选。患者来源的癌组织类器官是研究结直肠癌的病理生物学特性以及用于(个性化)药物筛选的先进的临床前工具。

研究表明，肿瘤类器官本身的生长速度慢于其相应的正常组织类器官生长速度，甚至在许多情况下以较慢的速率生长，这可能与失败的有丝分裂和分裂之后的细胞死亡有关。因此，在肿瘤类器官培养过程中需要避免残存正常组织的上皮类器官在肿瘤类器官中过度生长，并且必须使用纯肿瘤细胞样本或者在选择性培养条件下培养肿瘤类器官。

鉴于此，有必要开发一种用于结直肠癌类器官培养的培养液及其制备方法，以解决现有技术的不足。

发明内容

本发明的目的之一，是提供一种用于结直肠癌类器官培养的培养液。本发明的培养液包含了多种针对人结直肠癌组织细胞培养所需的细胞因子、信号通路调控因子、氨基酸和无血清添加剂等，各种细胞因子及调控因子相互直接密切影响，协调配合，使得结直肠癌组织细胞在培养的过程中能够保持非常高的细胞和组织活性，更好地表现其固有的病理特征，并且与原组织的病理生物学特征和直肠癌肿瘤高频突变基因保持高度一致。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种用于结直肠癌类器官培养的培养液，每50mL培养液由如下原料制成：伊卡倍特钠，终浓度为1μg/mL-100μg/mL；维生素P4，终浓度为1μM-100μM；人重组蛋白R-Spondin 1，终浓度为30ng/mL-50ng/mL；头蛋白，终浓度为80ng/mL-100ng/mL；人重组蛋白rhEGF，终浓度为8ng/mL-10ng/mL；4-羟乙基哌嗪乙磺酸，终浓度为1mM；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，终浓度为1×；青链双抗，终浓度1×；N2添加剂，终浓度为1×；B27添加剂，终浓度为1×；N-乙酰-L-半胱氨酸，终浓度为0.09mM-0.125mM；Alk抑制剂A83-01，终浓度为0.3μM-0.5μM；4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑，终浓度为0.3μM-0.5μM；胃泌素，终浓度为10nM；非必需氨基酸溶液，终浓度为1×；烟酰胺，终浓度为5mM和Advanced DMEM/F-12培养基补足至50mL。

本发明的用于结直肠癌类器官培养的培养液的原理是：

结直肠癌类器官细胞团外侧的氧浓度为6％，而结直肠癌类器官细胞团内部的氧气浓度仅为0.5％，缺氧导致大量的细胞凋亡，影响了类器官的发育形态和组织特异性。本发明在培养液中加入依卡倍特钠(英文名称为Ecabet sodium)，可通过抑制ROS活性氧的产生，减少类器官内部细胞的凋亡，提高内细胞团的活性，防止类器官空心化，进而维持类器官的完整性。

结直肠癌类器官细胞中含有大量的突变基因，会产生大量结构异常的蛋白质，这些异常蛋白质不能够正常折叠和糖基化，大量堆积在内质网中，进而引起激活内质网应激反应，导致细胞大量凋亡，不但影响结直肠癌类器官的生长和存活，而且还会影响结直肠癌肿瘤高频突变基因在类器官中的展现。本发明在培养液中加入了维生素P4(英文名称为Troxerutin)，可以通过抑制内质网应激介导的细胞凋亡通路，进而减少细胞凋亡，从而更加真实地展现直肠癌肿瘤高频突变基因的病理特征。

此外，本发明的培养液中还包括如下原料：

1、人重组蛋白R-Spondin 1，作为LGR5的配体，与LGR5结合后激活经典的Wnt信号通路来促进结直肠癌的侵袭转移能力。上述人重组蛋白R-Spondin1可以市售购买，如可以购自R&D Systems公司，货号为4645-RS-100。

2、头蛋白，英文名称是Noggin,是BMP的抑制剂,能拮抗BMP,促进隐窝增生。BMP(英文全称是Bone Morphogenetic Protein)信号通路作为Wnt信号通路负调节信号。上述头蛋白可以市售购买，如可以购自R&D Systems公司，货号为6057-NG-025。

3、人重组蛋白rhEGF,作为有丝分裂原,在小肠隐窝高表达,对干细胞和TA细胞的增殖有重要作用。上述人重组蛋rhEGF可以市售购买，如可以购自Sigma公司，货号为E9644。

4、4-羟乙基哌嗪乙磺酸，英文名称是HEPES,对细胞无毒性作用，是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。上述4-羟乙基哌嗪乙磺酸可以市售购买，如可以购自Gibco公司，货号为15630080。

5、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，英文名称是Gluta MAX,含有L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺稳定形式的二肽，在水溶液中更稳定，不会自发降解，可以防止在长期培养过程中谷氨酰胺的降解和氨的积累。上述L-丙氨酰-L-谷氨酰胺可以市售购买，如可以购自Gibco公司，货号为35050-061，100×。

6、青链双抗,作用是抑制细菌生长，避免细胞污染。上述青链双抗可以市售购买，如可以购自Gibco公司，货号为15140122。

7、N2添加剂,是一款无血清添加剂，用于细胞的有丝分裂后期，可维持细胞存活与生长，而且不需要在培养基中添加血清。

上述N2添加剂(100×)中含有终浓度为1mM的人全铁转铁蛋白、500mg/mL的重组胰岛素全链、0.63mg/L的孕酮、10mM的腐胺和0.52mg/L的亚硒酸盐。上述N2添加剂可以市售购买，如可以购自Thermo公司，货号为17502001。

8、B27添加剂,是一款无血清添加剂，可维持细胞存活与生长，而且不需要在培养基中添加血清。

上述B27添加剂中含有生物素、DL-ɑ-生育酚乙酸脂、DL-ɑ-生育酚、BSA、过氧化氢酶、人重组胰岛素、人转铁蛋白、超氧化物歧化酶、皮质酮、D-半乳糖、乙醇胺盐酸、还原型谷胱甘肽、左旋肉碱盐酸、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺、亚硒酸钠和三碘甲状腺原氨酸。上述B27添加剂可以市售购买，如可以购自Thermo公司，货号为12587010。

9、N-乙酰-L-半胱氨酸，英文名称是N-acety-l-cysteine,可以防止细胞凋亡的DNA片段化，并在没有其它营养支持的情况下维持长期存活。

上述N-乙酰-L-半胱氨酸可以市售购买，如可以购自Sigma公司，货号为A9165。

10、Alk抑制剂A8301,是TGF-βI型受体ALK5、ALK4和ALK7的抑制剂，能够抑制ALK5、ALK4和ALK7诱导的转录。上述Alk抑制剂A8301可以市售购买，如可以购自Sigma公司，货号为SmL0788。

11、4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑，英文名称为SB202190,是p38 MAP激酶的高选择性、有效的和细胞渗透性抑制剂，可在活性激酶的ATP口袋内结合，并选择性抑制p38α和β亚型。上述4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑可以市售购买，如可以购自Sigma公司，货号为S7067。

12、胃泌素，英文名称是Gastrin I human,是胃中产生的内源性肽，通过CCK2受体增加胃酸的分泌。上述胃泌素可以市售购买，如可以购自Sigma，货号为G9145。

13、非必需氨基酸溶液，英文全称为Non-Essential Amino Acids,英文简称为NEAA，包括L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-天(门)冬酰胺、L-天(门)冬氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸和甘氨酸7种非必须氨基酸，能有效改善细胞培养基配比，降低细胞培养时细胞自身生产非必须氨基酸的副作用，促进细胞增殖代谢，是细胞培养中常用的添加剂之一。上述非必需氨基酸溶液可以市售购买，如可以购自Gibco公司，货号为11140-050。

14、烟酰胺，英文名称为Nicotinamide。在细胞中，烟酸被用于合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)。烟酰胺转变途径与烟酸的途径非常相似。NAD与NADP是多种酶促氧化还原反应的辅酶。

上述烟酰胺可以市售购买，如可以购自Sigma公司，货号为N0636。

15、Advanced DMEM/F-12培养基是DMEM培养基和F-12培养基按体积比为1:1的混合物，含有较高浓度的营养物质，有利于细胞的分裂增殖。

上述Advanced DMEM/F-12培养基可以市售购买，如可以购自Gibco公司，货号为12634010。

综上，本发明的培养液包含了多种针对人结直肠癌组织细胞培养所需的细胞因子、信号通路调控因子、氨基酸和无血清添加剂等，各种细胞因子及调控因子相互直接密切影响，协调配合，使得结直肠癌组织细胞在培养的过程中能够保持非常高的细胞和组织活性，更好地表现其固有的病理特征，并且与原组织的病理生物学特征和直肠癌肿瘤高频突变基因保持高度一致。

本发明的用于结直肠癌类器官培养的培养液的有益效果是：

1、本发明的培养液包含多种针对人结直肠癌组织细胞培养所需的细胞因子、信号通路调控因子、氨基酸和无血清添加剂等，各种细胞因子及调控因子相互直接密切影响，协调配合，使得结直肠癌组织细胞在培养的过程中能够更好地表现其固有的活性特征，并且与原组织的病理生物学特征、直肠癌肿瘤高频突变基因保持高度一致。

2、本发明的原料来源广泛，成本低廉，应用前景广泛。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，每50mL所述培养液由如下原料制成：伊卡倍特钠，终浓度为1μg/mL；维生素P4，终浓度为100μM；人重组蛋白R-Spondin 1，终浓度为30ng/mL；头蛋白，终浓度为100ng/mL；人重组蛋白rhEGF，终浓度为8ng/mL；4-羟乙基哌嗪乙磺酸，终浓度为1mM；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，终浓度为1×；青链双抗，终浓度1×；N2添加剂，终浓度为1×；B27添加剂，终浓度为1×；N-乙酰-L-半胱氨酸，终浓度为0.09mM；Alk抑制剂A83-01，终浓度为0.5μM；4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑，终浓度为0.3μM；胃泌素，终浓度为10nM；非必需氨基酸溶液，终浓度为1×；烟酰胺，终浓度为5mM和Advanced DMEM/F-12培养基补足至50mL。

采用上述进一步的有益效果是：以上为最佳参数，得到的培养液的效果最佳。

进一步，每50mL所述培养液由如下原料制成：伊卡倍特钠，终浓度为50μg/mL；维生素P4，终浓度为50μM；人重组蛋白R-Spondin 1，终浓度为40ng/mL；头蛋白，终浓度为90ng/mL；人重组蛋白rhEGF，终浓度为9ng/mL；4-羟乙基哌嗪乙磺酸，终浓度为1mM；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，终浓度为1×；青链双抗，终浓度1×；N2添加剂，终浓度为1×；B27添加剂，终浓度为1×；N-乙酰-L-半胱氨酸，终浓度为0.11mM；Alk抑制剂A83-01，终浓度为0.4μM；4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑，终浓度为0.4μM；胃泌素，终浓度为10nM；非必需氨基酸溶液，终浓度为1×；烟酰胺，终浓度为5mM和Advanced DMEM/F-12培养基补足至50mL。

进一步，每50mL所述培养液由如下原料制成：伊卡倍特钠，终浓度为100μg/mL；维生素P4，终浓度为1μM；人重组蛋白R-Spondin 1，终浓度为50ng/mL；头蛋白，终浓度为80ng/mL；人重组蛋白rhEGF，终浓度为10ng/mL；4-羟乙基哌嗪乙磺酸，终浓度为1mM；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，终浓度为1×；青链双抗，终浓度1×；N2添加剂，终浓度为1×；B27添加剂，终浓度为1×；N-乙酰-L-半胱氨酸，终浓度为0.125mM；Alk抑制剂A83-01，终浓度为0.3μM；4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑，终浓度为0.5μM；胃泌素，终浓度为10nM；非必需氨基酸溶液，终浓度为1×；烟酰胺，终浓度为5mM和Advanced DMEM/F-12培养基补足至50mL。

进一步，所述青链双抗中，含有10000U/mL青霉素和10mg/mL链霉素。

采用上述更进一步的有益效果是：青霉素和链霉素可分别作用于革兰阳性和革兰阴性细菌，其配合使用可预防细胞培养物的细菌污染。青霉素最初从青霉属真菌中纯化而来，通过直接干扰细菌细胞壁的周转，间接触发酶的释放，从而进一步改变细胞壁。链霉素最初从链霉菌中纯化而来。链霉素通过与细菌核糖体30S亚基结合，从而抑制蛋白质合成并导致细菌死亡。

本发明的目的之二，是提供上述用于结直肠癌类器官培养的培养液的制备方法。本发明的制备方法简单，操作容易，成本低廉，适合规模化推广应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种用于结直肠癌类器官培养的培养液的制备方法，包括如下步骤：

分别称取如下原料：伊卡倍特钠，终浓度为1μg/mL-100μg/mL；维生素P4，终浓度为1μM-100μM；人重组蛋白R-Spondin 1，终浓度为30ng/mL-50ng/mL；头蛋白，终浓度为80ng/mL-100ng/mL；人重组蛋白rhEGF，终浓度为8ng/mL-10ng/mL；4-羟乙基哌嗪乙磺酸，终浓度为1mM；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，终浓度为1×；青链双抗，终浓度1×；N2添加剂，终浓度为1×；B27添加剂，终浓度为1×；N-乙酰-L-半胱氨酸，终浓度为0.09mM-0.125mM；Alk抑制剂A83-01，终浓度为0.3μM-0.5μM；4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑，终浓度为0.3μM-0.5μM；胃泌素，终浓度为10nM；非必需氨基酸溶液，终浓度为1×；烟酰胺，终浓度为5mM和Advanced DMEM/F-12培养基补足至50mL，将上述原料混合均匀后，即得所述用于结直肠癌类器官培养的培养液。

本发明的用于结直肠癌类器官培养的培养液的制备方法的有益效果是：

本发明的制备方法简单，操作容易，成本低廉，适合规模化推广应用。

附图说明

图1为本发明的实验例5中，结直肠癌单细胞，标尺为200μm，放大倍数为100倍。

图2为本发明的实验例5中，结直肠癌组织原代培养后得到的类器官，标尺为200μm，放大倍数为100倍。

图3为本发明的实验例5中，采用实施例2的培养液，培养的原代肿瘤细胞连续培养跟踪第0d的照片，标尺为200μm，放大倍数为100倍。

图4为本发明的实验例5中，采用实施例2的培养液，培养的原代肿瘤细胞连续培养跟踪第3d的照片，标尺为200μm，放大倍数为100倍。

图5为本发明的实验例5中，采用实施例2的培养液，培养的原代肿瘤细胞连续培养跟踪第4d的照片，标尺为200μm，放大倍数为100倍。

图6为本发明的实验例5中，采用实施例2的培养液，培养的原代肿瘤细胞连续培养跟踪第5d的照片，标尺为200μm，放大倍数为100倍。

图7为本发明的实验例5中，采用实施例2的培养液，培养的原代肿瘤细胞连续培养跟踪第7d的照片，标尺为200μm，放大倍数为100倍

图8为本发明的实验例6中，采用对比例1的培养液，培养的原代肿瘤细胞连续培养跟踪第0d的照片，标尺为200μm，放大倍数为100倍。

图9为本发明的实验例6中，采用对比例1的培养液，培养的原代肿瘤细胞连续培养跟踪第3d的照片，标尺为200μm，放大倍数为100倍。

图10为本发明的实验例6中，采用对比例1的培养液，培养的原代肿瘤细胞连续培养跟踪第4d的照片，标尺为200μm，放大倍数为100倍。

图11为本发明的实验例6中，采用对比例1的培养液，培养的原代肿瘤细胞连续培养跟踪第5d的照片，标尺为200μm，放大倍数为100倍。

图12为本发明的实验例6中，采用对比例1的培养液，培养的原代肿瘤细胞连续培养跟踪第7d的照片，标尺为200μm，放大倍数为100倍。

图13为本发明的实验例7中，采用对比例2的培养液，培养的原代肿瘤细胞连续培养跟踪第0d的照片，标尺为200μm，放大倍数为100倍。

图14为本发明的实验例7中，采用对比例2的培养液，培养的原代肿瘤细胞连续培养跟踪第3d的照片，标尺为200μm，放大倍数为100倍。

图15为本发明的实验例7中，采用对比例2的培养液，培养的原代肿瘤细胞连续培养跟踪第4d的照片，标尺为200μm，放大倍数为100倍。

图16为本发明的实验例7中，采用对比例2的培养液，培养的原代肿瘤细胞连续培养跟踪第5d的照片，标尺为200μm，放大倍数为100倍。

图17为本发明的实验例7中，采用对比例2的培养液，培养的原代肿瘤细胞连续培养跟踪第7d的照片，标尺为200μm，放大倍数为100倍。

具体实施方式

以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

本实施例的用于结直肠癌类器官培养的培养液，每50mL培养液由如下原料制成：伊卡倍特钠，终浓度为1μg/mL；维生素P4，终浓度为100μM；人重组蛋白R-Spondin 1，终浓度为30ng/mL；头蛋白，终浓度为100ng/mL；人重组蛋白rhEGF，终浓度为8ng/mL；4-羟乙基哌嗪乙磺酸，终浓度为1mM；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，终浓度为1×；青链双抗，终浓度1×；N2添加剂，终浓度为1×；B27添加剂，终浓度为1×；N-乙酰-L-半胱氨酸，终浓度为0.09mM；Alk抑制剂A83-01，终浓度为0.5μM；4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑，终浓度为0.3μM；胃泌素，终浓度为10nM；非必需氨基酸溶液，终浓度为1×；烟酰胺，终浓度为5mM和Advanced DMEM/F-12培养基补足至50mL。所述青链双抗中，含有10000U/mL青霉素和10mg/mL链霉素。

上述用于结直肠癌类器官培养的培养液的制备方法，包括如下步骤：

分别称取如下原料：伊卡倍特钠，终浓度为1μg/mL；维生素P4，终浓度为100μM；人重组蛋白R-Spondin 1，终浓度为30ng/mL；头蛋白，终浓度为100ng/mL；人重组蛋白rhEGF，终浓度为8ng/mL；4-羟乙基哌嗪乙磺酸，终浓度为1mM；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，终浓度为1×；青链双抗，终浓度1×；N2添加剂，终浓度为1×；B27添加剂，终浓度为1×；N-乙酰-L-半胱氨酸，终浓度为0.09mM；Alk抑制剂A83-01，终浓度为0.5μM；4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑，终浓度为0.3μM；胃泌素，终浓度为10nM；非必需氨基酸溶液，终浓度为1×；烟酰胺，终浓度为5mM和Advanced DMEM/F-12培养基补足至50mL，将上述原料混合均匀后，即得所述用于结直肠癌类器官培养的培养液。培养液配制完成后，用0.22μm过滤器除菌过滤，于4℃保存2周。

实施例2

本实施例的用于结直肠癌类器官培养的培养液，每50mL培养液由如下原料制成：伊卡倍特钠，终浓度为50μg/mL；维生素P4，终浓度为50μM；人重组蛋白R-Spondin 1，终浓度为40ng/mL；头蛋白，终浓度为90ng/mL；人重组蛋白rhEGF，终浓度为9ng/mL；4-羟乙基哌嗪乙磺酸，终浓度为1mM；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，终浓度为1×；青链双抗，终浓度1×；N2添加剂，终浓度为1×；B27添加剂，终浓度为1×；N-乙酰-L-半胱氨酸，终浓度为0.11mM；Alk抑制剂A83-01，终浓度为0.4μM；4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑，终浓度为0.4μM；胃泌素，终浓度为10nM；非必需氨基酸溶液，终浓度为1×；烟酰胺，终浓度为5mM和Advanced DMEM/F-12培养基补足至50mL。所述青链双抗中，含有10000U/mL青霉素和10mg/mL链霉素。

分别称取如下原料：伊卡倍特钠，终浓度为50μg/mL；维生素P4，终浓度为50μM；人重组蛋白R-Spondin 1，终浓度为40ng/mL；头蛋白，终浓度为90ng/mL；人重组蛋白rhEGF，终浓度为9ng/mL；4-羟乙基哌嗪乙磺酸，终浓度为1mM；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，终浓度为1×；青链双抗，终浓度1×；N2添加剂，终浓度为1×；B27添加剂，终浓度为1×；N-乙酰-L-半胱氨酸，终浓度为0.11mM；Alk抑制剂A83-01，终浓度为0.4μM；4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑，终浓度为0.4μM；胃泌素，终浓度为10nM；非必需氨基酸溶液，终浓度为1×；烟酰胺，终浓度为5mM和Advanced DMEM/F-12培养基补足至50mL，将上述原料混合均匀后，即得所述用于结直肠癌类器官培养的培养液。培养液配制完成后，用0.22μm过滤器除菌过滤，于4℃保存2周。

实施例3

本实施例的用于结直肠癌类器官培养的培养液，每50mL培养液由如下原料制成：伊卡倍特钠，终浓度为100μg/mL；维生素P4，终浓度为1μM；人重组蛋白R-Spondin 1，终浓度为50ng/mL；头蛋白，终浓度为80ng/mL；人重组蛋白rhEGF，终浓度为10ng/mL；4-羟乙基哌嗪乙磺酸，终浓度为1mM；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，终浓度为1×；青链双抗，终浓度1×；N2添加剂，终浓度为1×；B27添加剂，终浓度为1×；N-乙酰-L-半胱氨酸，终浓度为0.125mM；Alk抑制剂A83-01，终浓度为0.3μM；4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑，终浓度为0.5μM；胃泌素，终浓度为10nM；非必需氨基酸溶液，终浓度为1×；烟酰胺，终浓度为5mM和AdvancedDMEM/F-12培养基补足至50mL。所述青链双抗中，含有10000U/mL青霉素和10mg/mL链霉素。

对比例1

跟实施例2不同的是，对比例1的培养液中无伊卡倍特钠，其余均相同。具体而言，本对比例每50mL培养液由如下原料制成：维生素P4，终浓度为50μM；人重组蛋白R-Spondin1，终浓度为40ng/mL；头蛋白，终浓度为90ng/mL；人重组蛋白rhEGF，终浓度为9ng/mL；4-羟乙基哌嗪乙磺酸，终浓度为1mM；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，终浓度为1×；青链双抗，终浓度1×；N2添加剂，终浓度为1×；B27添加剂，终浓度为1×；N-乙酰-L-半胱氨酸，终浓度为0.11mM；Alk抑制剂A83-01，终浓度为0.4μM；4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑，终浓度为0.4μM；胃泌素，终浓度为10nM；非必需氨基酸溶液，终浓度为1×；烟酰胺，终浓度为5mM和Advanced DMEM/F-12培养基补足至50mL。所述青链双抗中，含有10000U/mL青霉素和10mg/mL链霉素。

对比例2

跟实施例2不同的是，对比例2的培养液中无维生素P4，其余均相同。具体而言，本对比例每50mL培养液由如下原料制成：伊卡倍特钠，终浓度为50μg/mL；人重组蛋白R-Spondin 1，终浓度为40ng/mL；头蛋白，终浓度为90ng/mL；人重组蛋白rhEGF，终浓度为9ng/mL；4-羟乙基哌嗪乙磺酸，终浓度为1mM；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，终浓度为1×；青链双抗，终浓度1×；N2添加剂，终浓度为1×；B27添加剂，终浓度为1×；N-乙酰-L-半胱氨酸，终浓度为0.11mM；Alk抑制剂A83-01，终浓度为0.4μM；4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑，终浓度为0.4μM；胃泌素，终浓度为10nM；非必需氨基酸溶液，终浓度为1×；烟酰胺，终浓度为5mM和Advanced DMEM/F-12培养基补足至50mL。所述青链双抗中，含有10000U/mL青霉素和10mg/mL链霉素。

实验例1：配制用于培养结直肠癌类器官的试剂

1、样本保存液

500mL样本保存液，由如下原料制成：胎牛血清，10mL，终浓度为2％；双抗，5mL，终浓度为1％；Advanced DMEM/F-12培养基，补足至500mL。其中，胎牛血清购自Gibco公司，货号为10099-141；双抗购自Hyclone公司，货号为SV30010；Advanced DMEM/F-12培养基购自Gibco，货号为12634010。

样本保存液配制完成后，用15mL离心管进行分装，每管10mL，分装后可于4℃保存1个月。

2、样本清洗液

500mL样本清洗液，由如下原料制成：100×GlutaMAX，5mL，终浓度为1×；100×青链双抗，5mL，终浓度为1％；PBS，补足至500mL。其中，100×GlutaMAX购自Gibco公司，货号为35050-061；青链双抗购自Gibco，货号为15140122；PBS购自Gibco，货号为20012027。

样本清洗液配制完成后，样本清洗液配制完成后于4℃保存1周。

3、样本消化液

50mL样本消化液，由如下原料制成：CollagenaseⅡ，终浓度为50CDU；CollagenaseⅣ，终浓度为50CDU；Advanced DMEM/F-12培养基，补足至50mL。其中，CollagenaseⅡ购自Sigma公司，货号为C6885；CollagenaseⅣ购自Sigma公司，货号为C5138；Advanced DMEM/F-12培养基购自Gibco公司，货号为12634010。

样本消化液配制完成后，用0.22μm过滤器除菌过滤，用2mL冻存管进行分装，每管0.5mL，分装后可于-80℃保存6个月。

4、样本终止液

200mL样本终止液，由如下原料制成：胎牛血清，20mL，终浓度为10％；100×青链双抗，2mL，终浓度为1％；Advanced DMEM/F-12培养基，补足至200mL。其中，胎牛血清购自Gibco公司，货号为10099-141；青链双抗购自Gibco，货号为15140122；Advanced DMEM/F-12培养基购自Gibco，货号为12634010。

样本终止液配制完成后，用0.22μm过滤器除菌过滤，于4℃保存2周。

实验例2：结直肠癌组织样本的获取

与三甲医院合作，合作的开展通过了正规的医学伦理审查。主治医生按照国际抗癌联盟(UICC)发布的第八版恶性肿瘤的TNM分期，选择入组患者，并根据术中临床指征选择合适的样本用于体外培养。

主治医生提供患者的性别、年龄、病史、家族史、病理分期分型、临床诊断等基本临床信息。隐去患者的姓名、身份证号等与病人隐私相关的信息，用统一的实验编号代替，实验室的命名原则为地区简写+接受样本日期+流水号。例如北京于2020年4月5号收到的第一例样本，则样本实验编号为B20040501。

术中有医生在手术室无菌环境采集新鲜标本，置于事先准备好的实施例1的样本保存液中，样本离体后，6h内冷藏运输到实验室进行下一步操作。

实验例3：结直肠癌组织样本解离前处理

下述操作中用到的手术器材均需高温高压灭菌，烘干后才可使用。

本实验接收人接收后，进行样本信息登记。样本接收人将样本信息及样本交接给实验员。用实验例1的样本清洗液清洗样本10-20次。用手术器械剔除样本中的结缔组织、脂肪组织和坏死组织等多余组织。样本一分为三，第一份用福尔马林液固定做染色，第二份冻存于-80℃用做测序，第三份用来做类器官，样本称重。

实验例4：结直肠癌组织样本的消化

下述操作中用到的手术器材均需高温高压灭菌，烘干后才可使用，离心管、移液管及其它耗材均经过无菌处理才可使用。

按每克组织样本加2mL实验例1的样本消化液的用量，加到样本上，用眼科剪将组织样本剪切成1mm³左右的小块。

在37℃条件下振荡消化，消化时间为30min-2h。每30min在显微镜下观察样本消化情况，直到观察到大量的单细胞。

终止消化：加入样本消化液10倍体积的实验例1的终止消化液。

过筛：用40μm的无菌过滤网过滤细胞悬液，去除残留组织。

500xg室温离心5min，弃去上清。

用10mL无菌PBS重悬细胞，500xg室温离心5min，弃去上清。

如果有红细胞，可加红细胞裂解液(购自Solarbio，货号为R1010)2mL，室温裂解3min，加无菌PBS缓冲液10mL终止裂解，500xg室温离心5min，弃去上清。

如图1所示，解离得到的单细胞悬液，除了原代肿瘤细胞以外，还混杂着大量的其他类型的细胞，如淋巴细胞、纤维细胞等。

实验例5：结直肠癌类器官的培养

用实施例2的用于结直肠癌类器官培养的培养液重悬细胞，显微镜下观察细胞状态，如图1所示，用细胞计数仪对重悬细胞进行计数，培养液和基质胶按体积比为3:4接种细胞，每个胶滴40-60μL，每个滴5000-25000个细胞，置37℃，5％CO₂条件下培养。

培养箱先正置5min，再倒置30min，加实施例2的用于结直肠癌类器官培养的培养液培养。

每天观察细胞状态，每3d换一次培养液。如果培养液颜色变黄，可提前换液，直到细胞形成大于80μm的细胞团。

跟踪拍一个细胞团的形成过程。

如图2所示，经过13d的培养，癌细胞大量扩增形成直径100μm大小的细胞团，有肠道结构，肿瘤细胞总数量可以超过10⁶/胶滴，其它类型的细胞数量逐渐减少甚至消失。本发明的培养液经过大量样本测试，结直肠癌原代肿瘤细胞体外培养成功率可以达到90％以上。

如图3-图7所示，跟踪拍的一个细胞团慢慢形成长大具有肠道结构，活性和形态更好的类器官，可用于研究结直肠癌的发生、发展机制研究，从结直肠癌患者的肿瘤组织中提取并构建的类器官用于高通量药物筛选，更有助于筛选有效药物。

实验例6

跟实验例5不同的是，实验例6采用对比例1的培养液用于结直肠癌类器官的培养，其余均相同。

如图9-图13所示，跟踪拍的一个细胞团，开始有细胞团形成，但是由于大量细胞凋亡，最后无法形成有结构的、多细胞成份的类器官，说明伊卡倍特钠是维持结直肠癌类器官高活性和完整状态所需的因素。

实验例7

跟实验例5不同的是，实验例7采用对比例2的培养液用于结直肠癌类器官的培养，其余均相同。

如图14-图17所示，跟踪拍的一个细胞团，开始有细胞团形成，最后无法形成有结构的、多细胞成份的类器官，说明维生素P4对维持和培养结直肠癌类器官具有很重要的作用

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于结直肠癌类器官培养的培养液，其特征在于，每50mL培养液由如下原料制成：伊卡倍特钠，终浓度为50μg/mL；维生素P4，终浓度为50μM；人重组蛋白R-Spondin 1，终浓度为40ng/mL；头蛋白，终浓度为90ng/mL；人重组蛋白rhEGF，终浓度为9ng/mL；4-羟乙基哌嗪乙磺酸，终浓度为1mM；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，终浓度为1×；青链双抗，终浓度1×；N2添加剂，终浓度为1×；B27添加剂，终浓度为1×；N-乙酰-L-半胱氨酸，终浓度为0.11mM；Alk抑制剂A83-01，终浓度为0.4μM；4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑，终浓度为0.4μM；胃泌素，终浓度为10nM；非必需氨基酸溶液，终浓度为1×；烟酰胺，终浓度为5mM和Advanced DMEM/F-12培养基补足至50mL。

2.根据权利要求1所述的用于结直肠癌类器官培养的培养液，其特征在于，所述青链双抗中，含有10000U/mL青霉素和10mg/mL链霉素。

3.一种用于结直肠癌类器官培养的培养液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：