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CN112789292A - 对cd137和pd-l1特异性的新型融合蛋白 - Google Patents

对cd137和pd-l1特异性的新型融合蛋白 Download PDF

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CN112789292A CN201980050587.8A CN201980050587A CN112789292A CN 112789292 A CN112789292 A CN 112789292A CN 201980050587 A CN201980050587 A CN 201980050587A CN 112789292 A CN112789292 A CN 112789292A
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M·欣纳
J·佩珀
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Pieris Pharmaceuticals GmbH
Laboratoires Servier SAS
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Abstract

本发明提供对CD137和PD‑L1特异性的融合蛋白，其中融合蛋白能够用于以PD‑L1靶标依赖性方式共刺激淋巴细胞活化。这种融合蛋白可用于许多制药应用中，例如作为用于治疗或预防诸如各种肿瘤的人疾病的抗癌剂和/或免疫调节剂。本发明还涉及制备本文所述的融合蛋白以及包含这种融合蛋白的组合物的方法。本发明进一步涉及编码这种融合蛋白的核酸分子和用于产生这种融合蛋白和核酸分子的方法。此外，本申请公开了这些融合蛋白以及包含一种或多种这种融合蛋白的组合物的治疗性和/或诊断性用途。

Description

对CD137和PD-L1特异性的新型融合蛋白
背景技术
程序性死亡-配体1，或PD-L1(也称为分化簇274或CD274和B7同系物1或B7-H1)，是一种属于抗原呈递的共刺激/共抑制分子B7家族的单程I型膜蛋白。PD-L1的细胞外部分包含两个结构域，即N-端IgV-型结构域和IgC-型结构域。PD-L1具有短的细胞质结构域，该结构域无任何明显的信号转导基序，这致使人们最初认为PD-L1没有作为受体的内在的信号传导。然而，最新的数据表明，PD-L1的细胞质结构域包含非经典的保守信号转导基序，该基序能够抑制干扰素(IFN)转导并保护癌细胞免受IFN细胞毒性(Gato-Canas等，Cell Rep，2017)。
PD-L1在怀孕、慢性感染、组织同种异体移植、自身免疫疾病和癌症期间的免疫系统的抑制中起关键作用。PD-L1在多种细胞类型上表达，所述细胞类型包括B细胞、T细胞、巨噬细胞、髓样树突状细胞、肥大细胞、上皮和血管内皮细胞。PD-L1也在多种癌症类型中表达，所述癌症类型包括但不限于黑素瘤、肺癌、膀胱癌、结肠癌和乳腺癌。通过介导肿瘤浸润T细胞的衰竭和无反应性、免疫抑制性细胞因子的分泌和保护免于被细胞毒性T细胞裂解，高PD-L1表达水平与增加的肿瘤侵袭性相关。
PD-L1是程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的配体，PD-1是主要的免疫检查点抑制受体，其主要在活化的T细胞上表达，但也在免疫系统的其它细胞上表达，包括B细胞和单核细胞。PD-1是免疫球蛋白家族的成员，其含有类IgV细胞外结构域、跨膜结构域和具有ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)和ITSM(基于免疫受体酪氨酸的转换(switch)基序)的细胞质尾端。PD-1被PD-L1接合会导致含有src同系物2结构域的酪氨酸磷酸酶1和2(SHP 1和2)募集至PD-1的细胞内转换基序，并导致CBL家族的E3泛素连接酶的表达。随后这些泛素连接酶泛素化并使关键TCR信号转导介质失活，导致从细胞表面移除TCR(Karwacz等，EMBO MolMed，2011)。SHP 1和SHP 2磷酸酶通过终止ZAP70与PI3K磷酸化而直接抑制TCR信号传导。此外，PD-L1接合的PD-1可通过影响CK2和周期蛋白依赖性激酶(CDK)的表达和活性来引起TCR信号传导通路抑制(Arasanz等，Oncotarget，2017)。还有研究表明，PD-1接合导致了T细胞代谢从增加的糖酵解(这是产生用于效应子功能的能量所需的)到脂肪酸β-氧化(这与长寿细胞相关联)的重编程。这也解释了高PD-1表达细胞在具有慢性感染和癌症的患者中的存活与持久性(Patsoukis等，Nat Commun，2015)。
通过抗-PD-1或抗-PD-L1靶向试剂阻断PD-1/PD-L1相互作用可逆转免疫检查点功能并放开对T细胞应答的制动闸(brake)。目前经批准用于治疗癌症的PD-L1抗体有三种，阿妥珠单抗(atezolizumab)(TECENTRIQ，MPDL3280A，RG7466)、阿维鲁单抗(avelumab)(BAVENCIO，MSB0010718C)及德瓦鲁单抗(durvalumab)(IMFINZI，MEDI4736)。数项采用这些抗体的成功临床试验显示它们在膀胱癌、皮肤癌和肺癌中有高的客观应答率、应答持久性或改进的生存率(Xu-Monette等，Front Immunol，2017)。
分化簇137或CD137(也称为4-1BB或TNFRS9)为一种共刺激性免疫受体及肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员。其主要在活化的CD4+与CD8+T细胞、活化的B细胞和天然杀伤(NK)细胞上表达，但也可在静息的单核细胞和树突状细胞(Li和Liu，Clin Pharmacol，2013)或内皮细胞(Snell等，Immunol Rev，2011)上发现。CD137在调节免疫应答中扮演重要作用，因此是癌症免疫疗法的靶标。CD137配体(CD137L)是已知的CD137的唯一天然配体，并在一些诸如活化的B细胞、单核细胞和脾脏树突状细胞的抗原呈递细胞上组成型表达，也可在T淋巴细胞上诱导CD137配体。
CD137L是一种以膜结合形式和可溶性变体存在的三聚体蛋白。但是，可溶性CD137L活化例如表达CD137的淋巴细胞上的CD137的能力是受限的，需要高浓度才能引发效用(Wyzgol等，J Immunol，2009)。活化CD137的天然方法为通过CD137-阳性细胞与CD137L阳性细胞的接合。认为然后通过在相对细胞上的CD137L的聚集来诱导CD137的活化，导致经由TRAF1、2、和3的信号传导(Yao等，Nat Rev Drug Discov，2013；Snell等，Immunol Rev，2011)和进一步在CD137-阳性T细胞中的伴发下游效应。在通过它们相应的同源靶标的识别来活化T细胞的情况下，由共刺激CD137而引发的作用为进一步增强的活化、增强的存活和增殖、促炎性细胞因子的产生以及改进的杀伤能力。
在许多体内模型中已经证实了CD137共刺激对消除癌细胞的益处。CD137L在肿瘤上的过(forced)表达导致了例如肿瘤排斥(Melero等，Eur J Immunol，1998)。类似地，抗-CD137 scFv在肿瘤上的过表达导致CD4+T细胞和NK-细胞依赖性肿瘤消除(Yang等，CancerRes，2007；Zhang等，Mol Cancer Ther，2006；Ye等，Nat Med，2002)。研究还证实了，系统地施用抗-CD137抗体导致肿瘤生长迟缓(Martinet等，Gene Ther，2002)。
研究还表明，CD137是人肿瘤中天然存在的肿瘤反应性T细胞的极佳标记物(Ye等，Clin Cancer Res，2014)，并且抗-CD137抗体可用于改进CD8+黑色素瘤浸润的淋巴细胞的扩增和活性，以用于过继性T细胞疗法(Chacon等，PLoS One，2013)。
CD137共刺激的潜在治疗益处的临床前论证促进了靶向CD137的治疗性抗体包括BMS-663513(在美国专利No.7,288,638中描述)和PF-05082566(Fisher等，Cancer ImmunolImmunother，2012)的开发。
除其它之外，本发明提供了经由一种或多种融合蛋白同时接合CD137和PD-L1的新手段，该种融合蛋白具有针对CD137的结合特异性和针对PD-L1的结合特异性的性质。
II.定义
以下所列定义了在本说明书中使用的术语、短语和缩写。本文列出和定义的所有术语旨在涵盖所有语法形式。
如本文所使用，除另有规定外，“CD137”意是指人CD137(huCD137)。人CD137意指由UniProt Q07011定义的全长蛋白、其片段或其变体。CD137也称为4-1BB或肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)和淋巴细胞活化诱导的(ILA)。在一些特定的实施方案中，采用非人物种的CD137，如猕猴(cynomolgus)CD137和小鼠CD137。
如本文所使用，除另有规定外，“程序性细胞死亡1配体1”或“PD-L1”意是指人PD-L1(huPD-L1)。人PD-L1意指由UniProt Q9NZQ7定义的全长蛋白、其片段或其变体。人PD-L1由CD274基因编码。PD-L1也称为分化簇274(CD274)或B7同系物1(B7-H1)。在一些特定的实施方案中，采用非人物种的PD-L1，如猕猴PD-L1和小鼠PD-L1。
如本文所使用，“结合亲和力”描述了本发明的生物分子(如多肽或蛋白，比如脂质运载蛋白突变蛋白、抗体、融合蛋白或任何其它肽或蛋白)结合选定靶标并形成复合物的能力。可以通过本领域技术人员已知的多种方法测量结合亲和力，包括但不限于，荧光滴定、基于酶联免疫吸附试验(ELISA)的测定(包括直接和竞争ELISA)、比如等温滴定量热法(ITC)的量热法和表面等离子体共振(SPR)。这些方法在本领域中是熟知的，并且其一些实例也在下文进一步描述。由此，将结合亲和力表示为采用这些方法测量的解离常数(KD)、半数最大有效浓度(EC50)或半数最大抑制浓度(IC50)的值。较低的KD、EC50或IC50值反映更好(更高)的结合能力(亲和力)。由此，可以测量并比较两个生物分子对选定靶标的结合亲和力。当比较两个生物分子对选定靶标的结合亲和力时，术语“大体相同”、“基本上相同”或“基本上类似”意指在所述结合亲和力测量的实验变异(variability)范围内，一种生物分子具有的表示为与另一分子相同或相似的KD、EC50或IC50值的结合亲和力。所述结合亲和力测量的实验变异取决于所采用的具体方法并是本领域技术人员已知的。
如本文所使用，术语“基本上”还可以指表现出目标特征或特性的全部或接近全部的范围或程度的定性条件。生物领域的普通技术人员将理解，生物学及化学现象很少(若有的话)走向完结和/或进行至完成或达到或避免绝对结果。因此，本文所使用的术语“基本上”用于捕捉许多生物学及化学现象中固有的潜在缺乏完整性的情况。
如本文所使用，术语“检测(detect/detection/detecting)”或“可检测的”理解为在定量和定性水平上以及它们的组合。从而其包括在本发明的生物分子上实施的定量、半定量和定性测量。
如本文所使用，“可检测的亲和力”一般意指生物分子及其靶标之间的结合能力为至多约10-5M或更低，其表示为KD、EC50或IC50值。一般不再能通过常规方法例如ELISA和SPR测量高于10-5M的结合亲和力(表示为KD、EC50或IC50值)，且因此其是次要的。
注意到，本发明的生物分子与其靶标之间的复合物的形成受多个不同因素的影响，如相应靶标的浓度、竞争者的存在、所采用的缓冲系统的pH和离子强度、用于测定结合亲和力的实验方法(例如荧光滴定、竞争ELISA和表面等离子体共振)，和甚至用于评估实验数据的数学算法。因此，本领域技术人员也清楚表示为KD、EC50或IC50值的结合亲和力可以在某个实验范围内变化，这取决于方法和实验设置。这意味着，所测得的KD、EC50或IC50值可能会有轻微的偏差或公差范围，例如，取决于该值是通过ELISA(包括直接或竞争ELISA)、通过SPR还是另一方法测定的。
如本文所使用，“特异的(specific for)”、“特异性结合”、“特异地结合”或“结合特异性”涉及生物分子区分所需靶标(例如CD137和PD-L1)与一种或多种参照靶标(例如中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的细胞受体)的能力。应理解，此类特异性不是绝对性质，而是一种相对性质，并且可以例如通过SPR、蛋白质印迹、ELISA、荧光激活细胞分选(FACS)、放射免疫检定法(RIA)、电化学发光(ECL)、免疫放射测定(IRMA)、免疫组化(IHC)和肽扫描来测定。
当在本文的结合CD137和PD-L1的本发明的融合蛋白的上下文中使用时，术语“特异的(specific for)”、“特异性结合”、“特异地结合”或“结合特异性”意指如本文所述的融合蛋白结合CD137和PD-L1、与CD137和PD-L1反应或针对CD137和PD-L1，但基本上不结合另一种蛋白。术语“另一种蛋白”包括不是CD137或PD-L1或者与CD137或PD-L1密切相关或同源的蛋白的任何蛋白。然而，来自除人以外的物种的CD137或PD-L1和CD137或PD-L1的片段和/或变体未被术语“另一种蛋白”排除。术语“基本上不结合”意指本发明的融合蛋白以比CD137和/或PD-L1更低的结合亲和力结合另一种蛋白，即显示出小于30％、优选地20％、更优选地10％、特别优选地小于9％、8％、7％、6％或5％的交叉反应性。如上文定义的所述融合蛋白是否特异性反应可以很容易地进行测试，特别是通过比较本发明的融合蛋白与CD137和/或PD-L1的反应和所述融合蛋白与其它(另一种)蛋白的反应。
如本文所使用，术语“脂质运载蛋白”是指重量为约18-20kDa的单体蛋白，其具有圆柱形β折叠片超二级结构区，所述结构区包含通过在一端的多个(优选为4个)环逐对连接的多个β-链(优选为8个β-链，标记为A至H)以由此包含配体结合口袋和限定配体结合口袋的入口。优选地，本发明中所用的包含配体结合口袋的环是连接β-链A和B、C和D、E和F，和G和H的开口端的环，并被标记为AB、CD、EF和GH环。得到公认的是，在脂质运载蛋白家族成员中，正是所述环在本应刚性的脂质运载蛋白骨架中的这种多样性产生多种不同的结合模式，每一种模式能够容纳不同大小、形状和化学特征的靶标(例如Skerra，Biochim BiophysActa，2000；Flower等，Biochim Biophys Acta，2000；Flower，Biochem J，1996中的综述)。应当理解，蛋白的脂质运载蛋白家族已经天然进化为结合范围广泛的配体，具有非常低水平的整体序列保守性(通常具有小于20％的序列同一性)，但保留高度保守的整体折叠模式。不同脂质运载蛋白中位置之间的对应关系也为本领域技术人员所熟知(参见如美国专利No.7,250,297)。落入本文所使用的“脂质运载蛋白”的定义中的蛋白质包括但不限于包括泪液脂质运载蛋白(Tlc，Lcn1)、脂质运载蛋白-2(Lcn2)或中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的人脂质运载蛋白，载脂蛋白D(ApoD)，载脂蛋白M，α1-酸性糖蛋白1，α1-酸性糖蛋白2，α1-微球蛋白，补体成份8γ，视黄醇结合蛋白(RBP)，附睾视黄酸结合蛋白，glycodelin，气味结合蛋白IIa，气味结合蛋白IIb，脂质运载蛋白-15(Lcn15)和前列腺素D合酶。
如本文所使用，除另有规定外，“泪液脂质运载蛋白”是指人泪液脂质运载蛋白(hTlc)，并进一步是指成熟人泪液脂质运载蛋白。当将术语“成熟”用于表征蛋白时意指蛋白基本上不含信号肽。本发明的“成熟hTlc”是指人泪液脂质运载蛋白的成熟形式，其不具有信号肽。将成熟hTlc描述为具有SWISS-PROT数据库登录号P31025的序列的残基19-176，其氨基酸示于SEQ ID NO：1。
如本文所使用，“脂质运载蛋白-2”或“中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白”是指人脂质运载蛋白-2(hTlc2)或人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(hNGAL)，并进一步是指成熟人脂质运载蛋白-2或成熟人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。当将术语“成熟”用于表征蛋白时意指蛋白基本上不含信号肽。本发明的“成熟hNGAL”是指人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的成熟形式，其不具有信号肽。将成熟hNGAL描述为具有SWISS-PROT数据库登录号P80188的序列的残基21-198，其氨基酸示于SEQ ID NO：2。
如本文所使用，“天然序列”是指具有存在于自然界中的序列或具有野生型序列的蛋白或多肽，而不考虑该种蛋白或多肽的制备方式。此类天然序列蛋白或多肽可以从自然界中分离或者可以通过例如重组或合成方法的其它手段产生。
“天然序列脂质运载蛋白”是指与源自自然界的相应多肽具有相同氨基酸序列的脂质运载蛋白。因此，天然序列脂质运载蛋白可以具有来自任何生物体、特别是哺乳动物的相应天然存在的(野生型)脂质运载蛋白的氨基酸序列。当在脂质运载蛋白的上下文中使用时，术语“天然序列”具体涵盖脂质运载蛋白的天然存在的截短的或分泌的形式、天然存在的变体形式(例如脂质运载蛋白的可变剪接形式和天然存在的等位基因变体)。在本文中术语“天然序列脂质运载蛋白”与“野生型脂质运载蛋白”可互换使用。
如本文所使用，“突变蛋白”、“突变的”实体(蛋白质或核酸)或“突变体”是指与天然存在(野生型)的蛋白或核酸相比，一个或多个氨基酸或核苷酸的交换、缺失或插入。所述术语还包括如本文所述的突变蛋白的片段。本发明明确涵盖如本文所述的这样的脂质运载蛋白突变蛋白，该种突变蛋白具有圆柱形β折叠片超二级结构区，所述结构区包含通过在一端的4个环逐对连接的8个β-链以由此包含配体结合口袋和限定配体结合口袋的入口，其中与天然序列脂质运载蛋白相比，所述4个环中的至少三个中的每一个的至少一个氨基酸已被突变。优选地，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白具有如本文所述的结合CD137的功能。
如本文所使用，与本发明的脂质运载蛋白突变蛋白有关的术语“片段”是指N-末端和/或C-末端截短的(即缺少N-末端和/或C-末端氨基酸中的至少一个)源自全长成熟hTlc或hNGAL或脂质运载蛋白突变蛋白的蛋白质或多肽。这种片段可包括其所源自的成熟hTlc或hNGAL或脂质运载蛋白突变蛋白一级序列的至少10个或更多比如20或30个或者更多个连续氨基酸，并且通常在成熟hTlc或hNGAL的免疫测定中可检测到。这种片段可缺少N-末端和/或C-末端氨基酸中的多达2个、多达3个、多达4个、多达5个、多达10个、多达15个、多达20个、多达25个或多达30个(包括之间的所有数字)。作为示例性实例，这种片段可缺少成熟hTlc的N-末端氨基酸(His-His-Leu-Leu)中的1个、2个、3个或4个和/或C-末端氨基酸(Ser-Asp)中的1个或2个。应理解，所述片段优选为其所源自的成熟hTlc或hNGAL或脂质运载蛋白突变蛋白的功能片段，这意味着该片段优选地保留了其所源自的成熟hTlc/hNGAL或脂质运载蛋白突变蛋白的优选对CD137的结合亲和力。作为示例性实例，这种功能片段可至少包含在对应于成熟hTlc的线性多肽序列的位置5-153、5-150、9-148、12-140、20-135或26-133处的氨基酸。作为另一个示例性实例，这种功能片段可至少包含在对应于成熟hNGAL的线性多肽序列的位置13-157、15-150、18-141、20-134、25-134或28-134处的氨基酸。
关于本发明的融合蛋白的相应靶标CD137或PD-L1的术语“片段”是指N-末端和/或C-末端截短的CD137或PD-L1或者CD137或PD-L1的蛋白结构域。本文所述的CD137的片段或PD-L1的片段保留了全长CD137或PD-L1被本发明的融合蛋白识别和/或结合的能力。作为示例性实例，所述片段可以是CD137或PD-L1的胞外结构域。作为示例性实例，这种胞外结构域可包含CD137的胞外亚结构域的氨基酸，比如结构域1(UniProt Q07011的残基24-45)、结构域2(残基46-86)、结构域3(87-118)和结构域4(残基119-159)的单独或组合的氨基酸序列。作为另一示例性实例，这种胞外结构域可包含UniProt Q9NZQ7的氨基酸残基19-238。
如本文所使用，术语“变体”涉及包含突变的蛋白质或多肽的衍生物，所述突变例如通过氨基酸序列或核苷酸序列的置换、缺失、插入和/或化学修饰进行。在一些实施方案中，这种突变和/或化学修饰不会减少蛋白或肽的功能。这种置换可以是保守的，即氨基酸残基被替代为化学相似的氨基酸残基。保守置换的实例为以下组的成员之间的替代：1)丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸；2)天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和组氨酸；3)精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和组氨酸；4)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸和脯氨酸；和5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这种变体包括蛋白或多肽，其中一个或多个氨基酸被它们各自的D-立体异构体或除天然存在的20个氨基酸外的氨基酸(比如，例如，鸟氨酸、羟脯氨酸、瓜氨酸、高丝氨酸、羟赖氨酸、戊氨酸)置换。这种变体还包括，例如，在N-和/或C-末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基的蛋白或多肽。一般而言，变体与天然序列蛋白或多肽具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％或至少约98％的氨基酸序列同一性。变体优选保留了生物活性，如结合其所源自的蛋白或多肽的相同靶标。
如本文关于本发明的融合蛋白的相应蛋白配体CD137或PD-L1所使用的术语“变体”涉及分别与CD137或PD-L1(野生型CD137或PD-L1，比如如本文所述的以UniProt Q07011保存的CD137或以UniProt Q9NZQ7保存的PD-L1)相比具有一个或多个(比如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、50、60、70、80或更多个)氨基酸置换、缺失和/或插入的CD137或PD-L1或其片段。CD137变体或PD-L1变体与野生型CD137或PD-L1分别具有优选地至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的氨基酸同一性。本文所述的CD137变体或PD-L1变体保留了结合本发明公开的对CD137和PD-L1具有特异性的融合蛋白的能力。
如本文关于脂质运载蛋白突变蛋白所使用的术语“变体”涉及本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或其片段，其中其序列具有包括置换、缺失和插入的突变和/或化学修饰。本文所述的脂质运载蛋白突变蛋白的变体保留了生物活性，如该变体所源自的脂质运载蛋白突变蛋白的结合CD137的生物活性。一般而言，脂质运载蛋白突变蛋白的变体与其所源自的脂质运载蛋白突变蛋白具有至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、98％的氨基酸序列同一性。
如本文所使用，术语“诱变”是指向多核苷酸或氨基酸序列中引入突变。优选地，在实验条件下引入突变，以使得在蛋白或多肽序列的给定位置处的天然存在的氨基酸可被改变，例如被至少一个氨基酸置换。术语“诱变”还包括通过缺失或插入一个或多个氨基酸而(另外的)改变序列区段的长度。因此，以下情况在本发明的范围内：例如，一个在选定序列位置处的氨基酸被三个氨基酸的延伸段(stretch)替代，从而相比于天然蛋白或多肽氨基酸序列的相应区段的长度，导致两个氨基酸残基的添加。这样的插入或缺失可以彼此独立地引入在本发明中可以进行诱变的任何序列区段中。在本发明的一个示例性实施方案中，插入可以引入到对应于天然序列脂质运载蛋白的AB环的氨基酸序列区段中(参见以全文引用并入本文的国际专利公开文本No.WO 2005/019256)。
如本文所使用，术语“随机诱变”意指无预定的突变(氨基酸的改变)存在于某个序列位置处，而是至少两个氨基酸可以在诱变期间以某概率掺入在预限定的序列位置处。
如本文所使用，术语“序列同一性”或“同一性”是衡量序列的相似性或关系的序列特性。如本发明所使用的术语“序列同一性”或“同一性”意指在本发明的蛋白或多肽序列与所讨论的序列(同源性)比对之后，相对于这两个序列中较长一个的残基数量的配对相同残基的百分比。通过将相同氨基酸残基的数量除以残基总数再使结果乘以100来量度序列同一性。
如本文所使用，术语“序列同源性”或“同源性”是其一般含义，并且同源氨基酸包括相同氨基酸以及认为是在本发明的蛋白或多肽(如本发明的任意融合蛋白或脂质运载蛋白突变蛋白)线性氨基酸序列中的等同位置处的保守置换的氨基酸。
技术人员可识别可用的计算机程序，例如BLAST(Altschul等，Nucleic AcidsRes，1997)、BLAST2(Altschul等，J Mol Biol，1990)和Smith-Waterman(Smith和Waterman，J Mol Biol，1981)以便采用标准参数测定序列同源性或序列同一性。在本文中可以采用例如程序BLASTP，2.2.5版(2002年11月16日)(Altschul等，Nucleic Acids Res，1997)测定序列同源性或序列同一性百分比。在本实施方案中，同源性百分比基于包括前肽序列的完整蛋白或多肽序列比对(矩阵：BLOSUM 62；间隙罚分：11.1；截止值设置为10-3)，优选地在配对比较中使用野生型蛋白骨架作为参照。其计算为作为BLASTP程序输出的结果表示的“阳性”(同源氨基酸)数除以程序选定的用于比对的氨基酸总数的百分比。
具体而言，为了确定脂质运载蛋白突变蛋白氨基酸序列的氨基酸残基是否与对应于野生型脂质运载蛋白氨基酸序列中的某一位置的野生型脂质运载蛋白不同，技术人员可利用本领域熟知的手段和方法，如手动地或通过使用计算机程序比如BLAST 2.0(其代表基本局部比对搜索工具)或ClustalW或任意适用于产生序列比对的其它合适程序进行比对。因此，脂质运载蛋白的野生型序列可作为“受试序列”或“参照序列”，而本文所述的与野生型脂质运载蛋白不同的脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列作为“查询序列”。本文中术语“野生型序列”、“参照序列”和“受试序列”可互换使用。优选地，脂质运载蛋白的野生型序列是示于SEQ ID NO：1的hTlc序列或示于SEQ ID NO：2的hNGAL序列。
“间隙”是添加或缺失氨基酸所导致的比对中的空间。因此，两份完全相同的序列具有100％的同一性，但较不高度保守且具有缺失、添加或替换的序列可能具有较低程度的序列同一性。
如本文所使用，术语“位置”意指本文描述的氨基酸序列中的氨基酸的位置或本文描述的核酸序列中的核苷酸的位置。要理解的是，如本文中在一种或多种脂质运载蛋白突变蛋白氨基酸序列位置的上下文中使用的术语“对应”或“相应”，相应位置不仅由前面的核苷酸或氨基酸的数量决定。因此，由于在(突变体或野生型)脂质运载蛋白的其它位置处的氨基酸缺失或添加，根据本发明的给定氨基酸的绝对位置可能与相应位置不同。类似地，由于在突变蛋白或野生型脂质运载蛋白5’-非翻译区(UTR)(包括启动子和/或任何其它调节序列或基因(包括外显子和内含子))的其它位置处的核苷酸缺失或添加，根据本发明的给定核苷酸的绝对位置可能与相应位置不同。
根据本发明的“相应位置”可以是在根据本发明的配对或多序列比对中与其所对应的序列位置相匹配的序列位置。对于根据本发明的“相应位置”，优选地理解，核苷酸或氨基酸的绝对位置可以不同于相邻的核苷酸或氨基酸，但是所述相同的一个或多个“相应位置”仍可包含可已被交换、缺失或添加的所述相邻核苷酸或氨基酸。
此外，对于基于根据本发明的参照序列的脂质运载蛋白突变蛋白中的相应位置，优选地理解，脂质运载蛋白突变蛋白的核苷酸或氨基酸的位置在结构上可对应于参照脂质运载蛋白(野生型脂质运载蛋白)或另一脂质运载蛋白突变蛋白中的其它位置处的位置，尽管这些位置在绝对位置数字方面可能不同，如技术人员鉴于脂质运载蛋白之间高度保守的整体折叠形式所理解地。
如本文可互换使用的，术语“缀合(conjugate/conjugation)”、“融合(fuse/fusion)”或“连接”是指通过包括但不限于基因融合、化学缀合、通过连接子或交联试剂偶联和非共价联合的手段，经由全部形式的共价或非共价键(linkage)将两个或更多个亚基连接在一起。
如本文所使用的“融合多肽”或“融合蛋白”是指包含两个或更多个亚基的多肽或蛋白。在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包含两个或更多个亚基，这些亚基中至少一个能够特异性结合CD137，和另一个亚基能够特异性结合PD-L1。在该融合蛋白中，这些亚基可通过共价或非共价键连接。优选地，所述融合蛋白是两个或更多个亚基之间的翻译融合物。该翻译融合物可以通过使一个亚基的编码序列在与另一个亚基的编码序列的阅读框内基因工程化产生。两个亚基被编码连接子的核苷酸序列散布(interspersed)。然而，本发明的融合蛋白的亚基也可通过化学缀合连接。典型地，形成融合蛋白的亚基彼此之间连接，一个亚基的C-末端与另一个亚基的N-末端，或一个亚基的C-末端与另一个亚基的C-末端，或一个亚基的N-末端与另一个亚基的N-末端，或一个亚基的N-末端与另一个亚基的C-末端连接。融合蛋白的亚基可以以任何顺序连接，并可包括任何组成亚基中的一个以上。如果一个或多个亚基是由一条以上多肽链组成的蛋白(复合物)的一部分，那么术语“融合蛋白”还可指包含融合的序列以及该蛋白(复合物)的全部其它多肽链的蛋白。作为一个示例性实例，在全长免疫球蛋白经由该免疫球蛋白的重链或轻链与脂质运载蛋白突变蛋白融合的情况下，术语“融合蛋白”可以指包含给脂质运载蛋白突变蛋白和该免疫球蛋白的重链或轻链的单一多肽链。术语“融合蛋白”也可以指完整的免疫球蛋白(轻链和重链)和融合至其重链和/或轻链中的一个或两个上的脂质运载蛋白突变蛋白。
如本文所使用，术语本文公开的融合蛋白的“亚基”是指单一蛋白或独立的多肽链，其自身可形成稳定的折叠结构并定义一种向靶标提供结合基序的独特功能。在一些实施方案中，本发明优选的亚基是脂质运载蛋白突变蛋白。在一些其它实施方案中，本发明优选的亚基是全长免疫球蛋白或其抗原结合结构域。
可由本发明的融合蛋白包含的“连接子”连接两个或更多个如本文所述融合蛋白的亚基。所述键(linkage)可以是共价或非共价的。一种优选的共价键(linkage)是通过肽键，比如氨基酸之间的肽键。一种优选的连接子是肽连接子。因此，在优选的实施方案中，所述连接子包含一个或多个氨基酸，比如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸。本文描述了优选的肽连接子，包括甘氨酸-丝氨酸(GS)连接子、糖基化的GS连接子和脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物(PAS)连接子。在一些优选的实施方案中，GS连接子是如SEQ ID NO：13所述的(G4S)3，将其用于将融合蛋白的亚基连接在一起。其它优选的连接子包括化学连接子。
如本文所使用，术语“白蛋白”包括所有的哺乳动物白蛋白，比如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠血清白蛋白。
如本文所使用，术语“有机分子”或“小有机分子”表示这样的有机分子，其包含至少两个碳原子，但是优选地包含不超过7或12个可旋转碳键，具有100到2,000道尔顿、优选地100到1,000道尔顿范围的分子量，且任选地包含一个或两个金属原子。
将“样品”定义为从任何受试者采集的生物样品。生物样品包括但不限于血液、血清、尿液、粪便、精液或组织，包括肿瘤组织。
“受试者”是脊椎动物，优选是哺乳动物，更优选是人。如本文所使用的术语“哺乳动物”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括但不限于人、家畜和农用动物以及动物园、运动或宠物动物，比如绵羊、狗、马、猫、牛、大鼠、猪、如猕猴(cynomolgous monkey)的猿，仅举几个示例性实例。优选地，本文所使用的“哺乳动物”是人。
“有效量”是足够产生有益或者所希望的结果的量。可以在一次或多次施用或给药中施用有效量。
如本文所使用，“抗体”包括整个抗体或其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。整个抗体是指包含通过二硫键互相连接的至少两个重链(HC)和两个轻链(LC)的糖蛋白。每个重链由重链可变结构域(VH或HCVR)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每个轻链由轻链可变结构域(VL或LCVR)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH与VL区可进一步细分成高可变区，称作互补决定区(CDR)，其间散布更保守的区域，称作框架区(FR)。各VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端按下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原(例如，PD-L1)相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可任意地介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(如，效应子细胞)及典型补体系统的第一组分(C1q)。
如本文所使用，抗体的“抗原结合片段”是指保留了抗体的特异性结合抗原(如PD-L1)的能力的一个或多个片段。研究表明抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段进行。涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”中的结合片段的实例包括(i)由VH、VL、CL、及CH1结构域组成的Fab片段；(ii)包含由在铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的F(ab’)2片段，其；(iii)由VH、VL、CL、及CH1结构域和CH1和CH2结构域之间的区域组成的Fab’片段；(iv)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(v)由抗体单臂的VH和VL结构域组成的单链Fv片段；(vi)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，Nature，1989)；和(vii)分离的互补决定区(CDR)或两个或更多个分离的CDR的组合，其可任选地通过合成连接子连接；(viii)包含在同一多肽链中采用短连接子连接的VH和VL的“双抗体”(参见如专利文件EP 404，097；WO 93/11161；和Holliger等，Proc Natl Acad Sci USA，1993)；(ix)仅含有VH或VL的“结构域抗体片段”，其中在一些情况下，两个或更多个VH区为共价连接的。
抗体可以是多克隆的或单克隆的；异种的、同种异体的或同系的；或它们的修饰形式(如，人源化的、嵌合的或多特异性的)。抗体也可能是完全人类的。
如本文所使用，“框架”或“FR”是指可变结构域残基而非高可变区(CDR)残基。
“片段可结晶区”或“Fc区”是指免疫球蛋白重链的C-末端区域，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能改变，但人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226或从Pro230位置的氨基酸残基(根据Kabat的EU索引编号)延伸到其羧基末端(Johnson和Wu，Nucleic Acids Res，2000)。可以，例如，在抗体的生产或纯化过程中或通过重组工程化编码抗体重链的核酸，移除Fc区的C-末端赖氨酸(根据Kabat的EU索引编号，残基447)。因此，完整抗体的组合物可包含移除了所有K447残基的抗体群、无K447残基移除的抗体群及具有有和无K447残基的抗体混合物的抗体群。在本发明抗体中使用的合适的天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
“Fc”受体或“FcR”是指结合抗体Fc区的受体。
如本文所使用，“分离的抗体”是指实质上脱离其自然环境的抗体。举例而言，分离的抗体实质上不含来自其所源自的细胞或组织来源的细胞材料和其它蛋白。“分离的抗体”进一步是指实质上不含其它具有不同抗原特异性的抗体的抗体。在本文中，特异性结合PD-L1的分离的抗体实质上不含特异性结合PD-L1以外的抗原的抗体。然而，特异性结合PD-L1的分离的抗体可具有与其它抗原的交叉反应性，所述其它抗原比如来自其它物种的PD-L1分子。
如本文所使用，“单克隆抗体”是指单一分子组合物的抗体分子制备物。单克隆抗体组合物对特定表位展示出单一的结合特异性和亲和力。
如本文所使用，“人源化抗体”是指由源自除人之外的哺乳动物的抗体CDR以及人抗体或源自人抗体的FR区和恒定区组成的抗体。在一些实施方案中，人源化的抗体包括具有可变区氨基酸序列的可变结构域，采用如Ehrenmann等，(2010)所述的ImmunogeneticsInformation System(IMGT)DomainGapAlign工具评估，从整体上分析，所述可变区氨基酸序列更接近于人而非其它物种。在一些实施方案中，由于降低的抗原性，人源化抗体可作为治疗剂中的有效成分。如本文所使用的术语“治疗剂”或“治疗活性剂”是指治疗有用的试剂。治疗剂可以是任何用于预防、改善或治疗疾病、生理状态、症状或用于疾病、生理状态、症状的评估或诊断的试剂。
如本文所使用，“人抗体”包括这样的抗体，该种抗体具有其中框架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。此外，若抗体包含恒定区，则该恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包括并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变而引入的突变)。然而，如本文所使用，术语“人抗体”不旨在包括这种抗体，该种抗体中源自另一哺乳动物物种种系(比如小鼠)的CDR序列被移植至人的框架序列。
III.附图说明
图1：提供了本申请中描述的代表性融合蛋白的设计概述，所述融合蛋白是对靶标CD137和PD-L1双特异性的。基于对PD-L1特异性的抗体(如一种抗体，其重链由SEQ ID NO：86提供，或包含SEQ ID NO：77的重链可变结构域，或包含GFSLSNYD(HCDR1，SEQ ID NO：60)、IWTGGAT(HCDR2，SEQ ID NO：61)和VRDSNYRYDEPFTY(HCDR3；SEQ ID NO：62)的CDR序列，以及其轻链由SEQ ID NO：87提供，或包含SEQ ID NO：82的重链可变结构域，或包含QSIGTN(LCDR1，SEQ ID NO：63)，YAS(LCDR2)和QQSNSWPYT(LCDR3；SEQ ID NO：64)的CDR序列)和对CD137特异性的一种或多种脂质运载蛋白突变蛋白(如SEQ ID NO：42的脂质运载蛋白突变蛋白)制备代表性融合蛋白。如图1A-1I所示，将一种或多种脂质运载蛋白突变蛋白遗传地融合至PD-L1特异性抗体的重链或轻链的C-和/或N-末端，得到融合蛋白，如SEQ ID NOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQ ID NOs：92和87、SEQ ID NOs：86和93、SEQ ID NOs：94和87及SEQ ID NOs：90和91。可将所得的融合蛋白与CD137二价化(如图1A-1D所示)，或与CD137四价化(如图1E-1H所示)或与CD137具有甚至更高的价(如图1I所示)。通过将一或多个CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白(如图1J-1K所示)经由肽连接子融合至如本文所述提供的抗体的Fc区的C-末端来产生另外的单特异性融合蛋白。如SEQ ID NO：88和SEQ ID NO：89提供了所得到的单特异性融合蛋白。
图2：示出了ELISA试验的结果，其中如实施例4中所述测定了代表性融合蛋白与PD-L1或CD137的结合。将PD-L1或CD137(具有C-末端His或Fc标签)涂覆在微量滴定板上，并用100nM的最高浓度开始滴定测试的试剂。分别通过抗-人IgG Fc-HRP或抗-NGAL-HRP检测研究中的结合的试剂。使用1∶1结合模型拟合数据，其中EC50值和最大信号作为自由参数，斜率固定为1。所得到的EC50值在表4中提供。
图3：示出了ELISA试验的结果，其中如实施例5中所述测定了代表性融合蛋白同时结合靶标PD-L1和CD137的能力。将重组huPD-L1-His或huCD137-His涂覆在微量滴定板上，然后用100nM的最高浓度开始滴定融合蛋白。随后，分别加入恒定浓度的生物素化的huCD137-His或生物素化的huPD-L1-His，其通过碱性磷酸酶-过氧物酶(ExtrAvidin-Peroxidase)检测。
图4：示出了融合蛋白的靶标结合的评估结果，其如实施例6所述采用表达人或猕猴CD137(图4A-4B)以及人或猕猴PD-L1(图4C-4D)的Flp-In-CHO细胞通过流式细胞术进行。当采用模拟(mock)转染的Flp-In-CHO细胞时，未观察到结合(图4E)。以荧光强度的几何平均值使用非线性回归(共享如下，斜率＝1)计算EC50值。表6中提供了EC50值。
图5：示出了融合蛋白与PD-L1-阳性肿瘤细胞的结合，其如实施例7所述，通过温育RKO细胞和融合蛋白采用流式细胞术评估。
图6：提供了基于多重结合SPR的实验的实例，如实施例8所述，设计该实验以研究融合蛋白与CD137的相互作用是否受CD137L与CD137的结合的影响。通过在SPR传感器芯片上产生huCD137(C-末端Fc融合)与huCD137L(具有C-末端His标签)的复合物，并检查该融合蛋白是否仍然结合huCD137和CD137L的复合物，来进行评估。作为参照，还采用测试的融合蛋白在不存在huCD137L的情况下温育huCD137。采用实茎箭头标记相应融合蛋白与单独huCD137结合的SPR踪迹。采用空茎箭头标记相应融合蛋白与已用huCD137L饱和的huCD137的结合的SPR踪迹。作为对照，采用不含融合蛋白的空白注射液。该实验表明，在CD137L存在下，所有测试的融合蛋白均能够结合CD137。
图7：示出了融合蛋白与PD-L1竞争结合PD-1，如实施例9所述的竞争ELISA研究中所描绘的。将恒定浓度的huPD-1-His涂覆在微量滴定板上，然后添加不同浓度的测试分子与固定浓度的示踪剂huPD-L1-Fc的混合物。采用HRP标记的抗-IgG Fc抗体检测结合的示踪剂。观察到了CD137与PD-L1双特异性融合蛋白或PD-L1特异性抗体对huPD-L1-Fc与PD-1的结合的剂量依赖性抑制。
图8：采用CD137生物测定评估代表性融合蛋白以PD-L1靶标依赖性方式共刺激T细胞活化的潜力。在各种浓度的融合蛋白或对照存在下，将NFκB-luc2/CD137 Jurkat细胞与表达PD-L1的肿瘤细胞系RKO共培养。4小时后，加入荧光素酶(Luciferase)测定试剂并测量发光信号。采用GraphPad
Figure BPA0000299772270000181
进行四参数逻辑曲线分析，以计算EC50值(参见表9)。融合蛋白仅在PD-L1(图8A和8C)存在下共刺激T细胞活化，而在不存在PD-L1的情况下不共刺激T细胞活化(图8B与8D)。相对地，在存在和不存在PD-L1阳性RKO细胞的情况下，参照抗-CD137mAb(SEQ ID NOs：28和29)展示出类似的活化。
图9：示出了代表性实验的结果，其中研究了选择的融合蛋白诱导T细胞活化的能力。单独和作为抗PD-L1/抗CD137混合物(cocktail)组合地测试了PD-L1抗体(包括相应的PD-L1抗体构建块(building block))、作为Fc融合蛋白的CD137结合脂质运载蛋白突变蛋白和抗-CD137基准抗体。在该实验中，在1ng/mL葡萄球菌肠毒素B(SEB)存在下，采用融合蛋白、抗体、脂质运载蛋白突变蛋白Fc融合蛋白、混合物(cocktail)或对照温育人外周血液单核细胞(PBMC)。如实施例11所述，通过基于电化学发光的测定来测定分泌的白细胞介素2(IL-2)的水平(代表T细胞活化)作为T细胞活化的读数，并相对于对应的IgG4对照的水平标准化。所有融合蛋白均能诱导T细胞活化，且所述活化比单一构建块或基准抗-PD-L1/抗-CD137抗体的混合物更强或至少相当。
图10：示出了代表性融合蛋白以PD-L1靶标依赖性方式共刺激T细胞活化的能力。可单独和作为抗-PD-L1/抗-CD137混合物(cocktail)组合地测试了PD-L1抗体(包括相应的PD-L1抗体构建块)、作为Fc融合蛋白的CD137结合脂质运载蛋白突变蛋白和抗-CD137基准抗体。将表达不同PD-L1水平的不同肿瘤细胞系(高：RKO；中等：HCC827；阴性：HepG)接种至涂覆了抗-人CD3的板中。加入Pan T细胞和不同浓度的融合蛋白和单一构建块并温育3天。如实施例12所述，通过基于电化学发光的测定来测定分泌的IL-2的水平。所有融合蛋白均能以PD-L1依赖性方式增加IL-2分泌。
图11：示出了融合蛋白在PBS或25mM组氨酸、60mM NaCl、200mM精氨酸pH 6中，在37℃或40℃下以1mg/ml或20mg/mL的浓度温育1、2、3或4周后的储存稳定性。如实施例13所述，通过从分析型尺寸排阻中回收单体或通过从定量ELISA中回收功能蛋白来评估稳定性。
图12：示出了代表性融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87)在采用CD4+T细胞的混合淋巴细胞反应(MLR)中刺激IL-2分泌的能力。如实施例14所述，以等摩尔浓度单独或作为抗-PD-L1/抗-CD137混合物(cocktail)组合地测试了融合蛋白、PD-L1抗体构建块(SEQ ID NOs：86和87)、作为Fc融合蛋白的CD137结合脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO：89)和抗-CD137基准抗体或抗-PD-L1基准抗体。在与源自不同健康供体的总人CD4+T细胞和单核细胞衍生的树突状细胞(moDC)温育6天后，测定上清液中的IL-2分泌。图12A表明，在等摩尔浓度(相当于10或0.1μg/ml的测试的融合蛋白)下，与单独的构建块(PD-L1抗体SEQ ID NOs：86和87或CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白SEQ ID NO：89)和参照抗PD-L1或抗-CD137抗体(分别为SEQ ID NOs：26和27或SEQ ID NOs：28和29)，融合蛋白SEQ ID NOs：90和87显示IL-2分泌显著增加。示出了来自8个独立实验的数据。图12B示出了融合蛋白SEQ ID NOs：90和87在0.001至20μg/mL范围的浓度能诱导剂量依赖性的IL-2分泌。与等摩尔浓度的参照抗-PD-L1抗体(SEQ ID NOs：26和27)和参照抗-CD137抗体(SEQ ID NOs：28与29)的混合物相比，融合蛋白诱导更高水平的IL-2。示出了来自代表性供体的数据。
图13：示出了示例性融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87)诱导CD8+T细胞效应分子分泌的能力。如实施例15所述，将融合蛋白用来自错配的(mismatching)健康供体的moDC和CD8+T细胞培养6天，接着采用Luminex测定定量上清液中IL-2与CD8+T细胞效应分子的分泌。与参照抗-PD-L1抗体(SEQ ID NOs：26与27)和参照抗-CD137抗体(SEQ ID NOs：28和29)(当单独或作为混合物使用时)相比，融合蛋白SEQ ID NOs：90和87在10μg/mL时，显示IL-2和细胞毒性因子(穿孔素、颗粒酶B和颗粒酶A)的分泌增加。
图14：示出了融合蛋白与临床活性的CD137抗体(SEQ ID NOs：28和29)结合重叠的表位，如实施例17所述的竞争ELISA研究所示。将恒定浓度的SEQ ID NOs：28和29涂覆在微量滴定板上，随后加入不同浓度的测试分子和固定浓度的生物素化的huCD137-Fc示踪剂的混合物。经由碱性磷酸酶-过氧物酶(ExtrAvidin-Peroxidase)检测结合的示踪剂。融合蛋白与CD137抗体竞争CD137的结合。
图15：示出了代表性融合蛋白阻断由PD-1/PD-L1相互作用介导的抑制信号的潜力，如实施例18所述采用PD-1/PD-L1阻断生物测定评估该种潜力。在不同浓度的测试分子存在下，将PD-1-NFAT-luc Jurkat T细胞(表达PD-1和在NFAT启动子控制下的NFAT介导的荧光素酶基因的Jurkat细胞系)与PD-Ll aAPC/CHO-K1细胞共培养。6小时后，加入荧光素酶测定试剂并测量发光信号。背景信号为将PD-1-NFAT-luc Jurkat T细胞与仅PD-L1 aAPC/CHO-K1细胞共培养。SEQ ID NOs：90和87的融合蛋白阻断PD-1/PD-L1途径，其与测试的PD-L1抗体相当，所述PD-L1抗体包括示于SEQ ID NOs：86和87的构建块PD-L1抗体和示于SEQID NOs：26和27的参照PD-L1抗体。
图16：示出了代表性融合蛋白诱导T细胞活化的能力。还测试了PD-L1抗体构建块和参照CD137抗体(当单独和与PD-L1抗体组合使用时)。在实验中，在0.1ng/mL SEB存在下用融合蛋白、抗体、混合物(cocktails)或对照温育人PBMC。如实施例19所述和图16A所示，通过基于电化学发光的测定来测定分泌的IL-2水平作为T细胞活化的读数。图16B展示了当与背景IL-2分泌水平(以0.1ng/mL SEB且不含任何测试分子刺激PBMC)相比时，由测试分子诱导的IL-2分泌水平成倍增加。融合蛋白导致IL-2分泌的剂量依赖性增加，其比单独或组合的PD-L1抗体或CD137抗体更强。
图17：证明了在PD-L1存在下代表性融合蛋白共刺激T细胞活化的能力。平行测试了PD-L1抗体构建块、参照CD137抗体、CD137抗体和参照PD-L1抗体的混合物。将用人PD-L1(图17A)转染的CHO细胞或模拟转染的CHO细胞(人PD-L1阴性，图17B)接种至涂覆了人抗-CD3的板中。加入Pan T细胞以及不同浓度的测试分子并温育2天。如实施例20所述，通过基于电化学发光的测定来测定上清液中分泌的IL-2的水平。将IL-2分泌水平相对于背景水平(Pan T细胞+抗-CD3+CHO细胞)标准化，以说明在表达人PD-L1的CHO细胞(图17C)或模拟转染的CHO细胞(图17D)存在下IL-2分泌成倍增加。融合蛋白仅在PD-L1存在下诱导IL-2分泌的强剂量依赖性增加，其比单独的参照CD137抗体或其与参照PD-L1抗体的组合更强。
图18：提供了小鼠中双特异性融合蛋白以及构建块PD-L1抗体(SEQ ID NOs：86和87)的药代动力学分析结果，如实施例21所述。给雄性CD-1小鼠(每个时间点3只小鼠)以10mg/kg的剂量静脉内注射融合蛋白。使用通过靶标PD-L1和CD137检测完整分子的夹心ELISA检测了药物水平。使用采用靶标PD-L1和人Fc的夹心ELISA测定了抗-PD-L1抗体血浆水平。
图19：提供了与两种在先描述的CD137-和PD-L1-结合融合蛋白(SEQ ID NO：147和SEQ ID NO：148)相比，小鼠中代表性融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87)的药代动力学分析结果，如实施例22所述。给雄性CD-1小鼠(每个时间点2只小鼠)以2mg/kg的剂量静脉内注射测试分子。在指定的时间点采用ELISA检测药物水平。将数据以时间vs.浓度绘图。本文所述的SEQ ID NOs：90和87，而非SEQ ID NO：147或SEQ ID NO：148，显示良好的药代动力学特征或类抗体药代动力学。
IV.发明详述
如本文所述，本发明涵盖这样的认知，即双价CD137结合剂(比如抗体)自身可能不足以使CD137在T细胞或NK细胞上聚集并导致有效的活化，这类似于三价可溶性CD137L的活性的缺乏。在采用临床前小鼠模型的最新出版物中，体内证据表明，其它抗-TNFR抗体的作用模式需要抗体经由其Fc部分与表达Fc-γ受体的细胞上的Fc-γ-受体相互作用(Bulliard等，Immunol Cell Biol，2014；Bulliard等，J Exp Med，2013)。取决于表达Fc-γ受体的细胞的存在，这些抗-TNFR抗体的作用模式可以以经由Fc-γ受体的非靶向聚集为主导，相较于正常组织，表达Fc-γ受体的细胞无需在靶向的肿瘤微环境中过表达。
因此，对于产生以特异的、肿瘤靶向的作用模式聚集并活化CD137的疗法的需求还未得到满足。
为了满足该种未得到满足的需求，除了别的之外，本发明提供通过一种或多种具有CD137结合特异性和PD-L1结合特异性的融合蛋白同时接合CD137和PD-L1的新方法。将所提供的融合蛋白设计为通过将CD137-阳性T细胞与肿瘤微环境中表达的PD-L1桥接来促进CD137聚集。此类双特异性分子可以将CD137诱导的T细胞活化和扩增与抗-PD-L1介导的免疫检查点阻断相组合，从而可克服单药疗法的某些局限性，并为例如抗药性或无应答的患者提供益处。还将融合蛋白设计为在一个分子中提供组合疗法的潜力并同时允许在肿瘤微环境中局部诱导抗原特异性T细胞，潜在地降低外周毒性。
在一些方面，本发明提供结合CD137和PD-L1的融合蛋白，及其方法和可用的应用。本发明还提供制备本文所述的结合CD137和PD-L1的融合蛋白的方法以及包含此类蛋白的组合物。可以将本发明的结合CD137和PD-L1的融合蛋白及其组合物用在检测样品中CD137和/或PD-L1的方法中，用在结合受试者中CD137和/或PD-L1的方法中，或用在调控受试者中免疫应答的方法中。先前未曾描述过此类具有与本发明提供的用途相关的这些特征的融合蛋白。与本文提供的融合蛋白相对的是，在先已知的靶向CD137和PD-L1的融合蛋白受累于以下的一种或多种：药代动力学差、脱靶结合的程度无法接受、结合至特定融合蛋白的一个或两个标靶(如，PD-L1和/或CD137)的能力降低或退化和/或如免疫系统的非特异性(如，PD-L1非依赖性)活化的程度无法接受。
A.本发明的对CD137和PD-L1特异性的示例性融合蛋白。
在一些实施方案中，提供的融合蛋白含有至少两个任何顺序的亚基：(1)包含对PD-L1特异性的全长免疫球蛋白或其抗原结合结构域的第一亚基，和(2)包含对CD137特异性的脂质运载蛋白突变蛋白的第二亚基。
在一些实施方案中，提供的融合蛋白还包含至少一个另外的亚基，例如，第三亚基。例如，融合蛋白可含有对CD137特异性的第三亚基。在一些实施方案中，第三亚基可以是或包含对CD137特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。例如，可以将两个脂质运载蛋白突变蛋白融合至第一免疫球蛋白亚基，一个位于免疫球蛋白的C-末端和一个位于免疫球蛋白的N-末端。在一些实施方案中，可将脂质运载蛋白突变蛋白融合至免疫球蛋白的重链或轻链。
在一些实施方案中，提供的融合蛋白可包含一种或多种另外的亚基(如第四、第五或第六亚基)。
在一些实施方案中，至少一个亚基可在其N-末端和/或C-末端融合至另一个亚基。
在一些实施方案中，至少一个亚基可以经由连接子与另一个亚基连接。在一些另外的实施方案中，连接子为肽连接子，例如，非结构性的甘氨酸-丝氨酸(GS)连接子，糖基化的GS连接子或脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物(PAS)连接子。在一些实施方案中，GS连接子为如SEQ ID NO：13所示的(Gly4Ser)3连接子((G4S)3)。其它示例性连接子示于SEQ ID NOs：14-23。在一些实施方案中，肽连接子可具有1至50个氨基酸，比如1、2、3、4、5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。例如，当第一亚基包含全长免疫球蛋白时，第二亚基可经由所述第二亚基的N-末端与所述免疫球蛋白的重链恒定区(CH)的C-末端之间的肽连接子连接。在一些其它实施方案中，第三亚基可经由第三亚基的N-末端与所述免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)的C-末端之间的肽连接子连接。
在一些实施方案中，可基本上如图1所示将一个亚基连接至另一个亚基。一般而言，一个亚基可在其N-末端和/或其C-末端融合至另一个亚基。例如，在一些实施方案中，脂质运载蛋白突变蛋白亚基可在其N-末端和/或其C-末端融合至免疫球蛋白亚基。进一步举例而言，一个脂质运载蛋白突变蛋白可优选经由肽键连接至免疫球蛋白重链结构域(HC)的C-末端、HC的N-末端、免疫球蛋白轻链(LC)的C-末端和/或LC的N-末端(图1A-1D)。
在一些实施方案中，脂质运载蛋白突变蛋白亚基可在其N-末端和/或其C-末端融合至免疫球蛋白片段。例如，在一些实施方案中，脂质运载蛋白突变蛋白可优选经由肽连接子在免疫球蛋白的重链恒定区(CH)的C-末端或轻链恒定区(CL)的C-末端链接。
在一些实施方案中，当一个亚基包含全长免疫球蛋白时，第二亚基可在所述第二亚基的N-末端与所述免疫球蛋白的重链恒定区(CH)的C-末端之间连接。
在一些实施方案中，第三亚基可在所述第三亚基的N-末端与所述免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)的C-末端之间连接。
在一些实施方案中，对于本发明的融合蛋白，其中至少一个亚基可为或包含全长免疫球蛋白，当融合蛋白同时接合CD137和PD-L1时，可同时保留全长免疫球蛋白Fc区对Fc受体阳性细胞的Fc功能。
在一些实施方案中，其中所提供的融合蛋白的至少一个亚基可为或包含全长免疫球蛋白，可通过蛋白工程化降低或完全抑制全长免疫球蛋白Fc区对Fc受体阳性细胞的Fc功能，而融合蛋白同时接合CD137和PD-L1。在一些实施方案中，可以通过例如将IgG1骨架转换为IgG4而实现上述情况，因为已知相比于IgG1，IgG4显示降低的Fc-γ受体相互作用。在一些实施方案中，为了进一步降低与Fc-γ受体的残留结合，可向IgG4骨架中引入诸如F234A和L235A的突变。在一些实施方案中，还可将S228P突变引入IgG4骨架，以减少IgG4半抗体的交换(Silva等，J Biol Chem，2015)。在一些实施方案中，可引入F234A和L235A突变以降低ADCC和ADCP(Glaesner等，Diabetes Metab Res Rev，2010)和/或引入M428L和N434S突变或M252Y、S254T和T256E突变以延长血清半衰期(Dall′Acqua等，J Biol Chem，2006；Zalevsky等，Nat Biotechnol，2010)。在一些实施方案中，融合蛋白的免疫球蛋白重链中可存在另外的N297A突变以便移除天然糖基化基序。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白中包括的免疫球蛋白的Fc部分可有助于维持该融合蛋白的血清水平。例如，当Fc部分结合至内皮细胞和吞噬细胞上的Fc受体时，该融合蛋白可变得内化并循环回到血流中，从而提高其在体内的半衰期。
一方面，本发明的融合蛋白以高亲和力结合CD137。另一方面，所提供的融合蛋白以高亲和力结合PD-L1。在一些优选的实施方案中，所提供融合蛋白同时结合CD137与PD-L1。在一些实施方案中，同时结合至CD137和PD-L1允许所提供的融合蛋白表现出持久的抗肿瘤或抗感染应答。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白能够以至多约2nM或甚至更低，比如约1.5nM或更低、约1nM或更低、约0.6nM或更低或约0.4nM或更低的KD值结合PD-L1。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白能够以与包含在此类融合蛋白中的对PD-L1特异性的免疫球蛋白(比如具有由SEQ ID NOs：86和87提供的重链和轻链的抗体)的KD值相当或更低的KD值结合PD-L1。可以在例如表面等离子体共振(SPR)测定中，比如基本上如实施例3所述的SPR测定中，测量所提供的融合蛋白的KD值。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白能够以至多约10nM或甚至更低，比如约7nM、约6nM、约5nM、约4nM、约3nM、约2nM或甚至更低的KD值结合CD137。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白能够以与包含在特定融合蛋白中的对CD137特异性的脂质运载蛋白突变蛋白(如SEQ ID NO：42)或融合至抗体Fc区的脂质运载蛋白突变蛋白(如SEQ ID NO：89)的KD值相当或更低的KD值结合CD137。可以在例如SPR测定中，比如基本上如实施例3所述的SPR测定中，测量所提供的融合蛋白的KD值。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白能够以至多约0.5nM或甚至更低，比如约0.3nM或更低、约0.2nM或更低、约0.15nM或更低或约0.1nM或更低的EC50值结合PD-L1。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白能够以与包含在特定融合蛋白中的对PD-L1特异性的免疫球蛋白(比如具有由SEQ ID NOs：86和87提供的重链和轻链的抗体)的EC50值相当或更低的EC50值结合PD-L1。可以在例如酶联免疫吸附试验(ELISA)测定中，比如基本上如实施例4所述的ELISA测定中，测量所提供的融合蛋白的EC50值。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白能够以至多约0.6nM或甚至更低，比如约0.5nM或更低、约0.2nM或更低、约0.15nM或更低或约0.1nM或更低的EC50值结合CD137。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白能够以与包含在特定融合蛋白中的对CD137特异性的脂质运载蛋白突变蛋白(如SEQ ID NO：42)或融合至抗体Fc区的脂质运载蛋白突变蛋白(如SEQ ID NO：89)的EC50值相当或更低的EC50值结合CD137。可以在例如ELISA测定中，比如基本上如实施例4所述的ELISA测定中，测量所提供的融合蛋白的EC50值。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白与猕猴PD-L1交叉反应。在一些实施方案中，所提供的融合蛋白能够以至多约0.5nM或甚至更低，比如约0.2nM或更低、约0.1nM或更低或约0.05nM或更低的EC50值结合猕猴PD-L1。可以在例如ELISA测定中，比如基本上如实施例4所述的ELISA测定中，测量所提供的融合蛋白的EC50值。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白与猕猴CD137交叉反应。在一些实施方案中，所提供的融合蛋白能够以至多约15nM或甚至更低，比如约10nM或更低、约8nM或更低、约6nM或更低、约3nM或更低、约1nM或更低、约0.5nM或更低、约3nM或更低或约0.1nM或更低的EC50值结合猕猴CD137。可以在例如ELISA测定中，比如基本上如实施例4所述的ELISA测定中，测量所提供的融合蛋白的EC50值。在一些实施方案中，可以如实施例22所述，通过亲和效应(avidity effect)增强所提供的融合蛋白与猕猴CD137的结合。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白能够同时结合CD137和PD-L1。在一些实施方案中，所提供的融合蛋白能够以至多约1nM或甚至更低，比如0.8nM或更低、0.6nM或更低或0.4nM或更低的EC50值同时结合CD137和PD-L1。在一些其它实施方案中，所提供的融合蛋白能够以至多约10nM或甚至更低，比如8nM或更低、6nM或更低、3nM或更低或2nM或更低的EC50值同时结合CD137和PD-L1。可以在例如ELISA测定中，比如基本上如实施例5所述的ELISA测定中，测定所述同时结合。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白能够以至多约60nM或甚至更低，比如约50nM或甚至更低、约40nM或甚至更低、约30nM或更低、约10nM或更低、约7nM或更低、约5nM或更低、约3nM或更低或约1nM或甚至更低的EC50值结合细胞上表达的CD137。可以在例如基本上如实施例6所述的流式细胞术分析中测量所提供的融合蛋白的EC50值。表达CD137的细胞可以是例如用人CD137或猕猴CD137转染的CHO细胞。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白能够以至多约10nM或甚至更低，比如约8nM或更低、约6nM或更低、约4nM或更低、约2nM或更低或约1或甚至更低的EC50值结合细胞上表达的PD-L1。可以在例如基本上如实施例6所述的流式细胞术分析中测量所提供的融合蛋白的EC50值。表达PD-L1的细胞可以是例如用人PD-L1或猕猴PD-L1转染的CHO细胞。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白能够结合肿瘤细胞上表达的PD-L1。在一些实施方案中，所提供的融合蛋白能够以至多约2nM或甚至更低，比如约1.5nM或更低、约1nM或更低、约0.6nM或更低或约0.3nM或更低的EC50值结合肿瘤细胞上表达的PD-L1。可以在例如，基本上如实施例7所述的流式细胞术分析中测量结合表达PD-L1的肿瘤细胞的融合蛋白的EC50值。表达PD-L1的肿瘤细胞可以是例如RKO细胞。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白基本上不影响CD137与CD137L的结合。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白在与CD137L形成复合物时能够结合CD137。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白能够以与具有由SEQ ID NO：28和29提供的重链和轻链的抗-CD137抗体相似的模式结合CD137。可通过例如SPR测定，比如基本上如实施例8所述的SPR测定来确定融合蛋白与CD137的结合模式。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白能够与PD-1竞争结合PD-L1。在一些实施方案中，所提供的融合蛋白能够以至多约5nM或甚至更低，比如约3nM或更低、约2nM或更低或约1或甚至更低的IC50值与PD-1竞争结合PD-L1。可通过例如ELISA测定，比如基本上如实施例9所述的ELISA测定来确定抑制性作用模式。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白能够与示于SEQ ID NOs：28和29的抗-CD137抗体竞争结合CD137。可以通过基本上如实施例17所述的ELISA测定来评估此类竞争。在一些实施方案中，所提供的融合蛋白可与示于SEQ ID NOs：28和29的抗-CD137抗体具有重叠的表位。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白能够共刺激T细胞应答。在一些实施方案中，与PD-L1抗体(比如构建块PD-L1抗体SEQIDNOs：86和87或参照PD-L1抗体SEQIDNOs：26和27)或CD137抗体(比如参照抗体SEQIDNOs：28和29)相比，所提供的融合蛋白导致相当的或更强的T细胞活化。在一些实施方案中，与抗-PD-L1抗体和靶向CD137的分子(比如抗-CD137抗体或在先已知的CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白)的组合相比，所提供的融合蛋白以相当或更好功效导致T细胞活化。可以在例如基本上如实施例10所述的CD137生物测定中，在基本上如实施例18所述的PD-1/PD-L1阻断生物测定中，或在基本上如实施例11、实施例12、实施例19和实施例20所述的功能T细胞活化测定中，测量刺激的T细胞应答或T细胞活化。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白能够诱导IL-2分泌增加。在一些优选的实施方案中，所提供的融合蛋白能够诱导浓度依赖性IL-2分泌，和/或显示在更高浓度下、优选地涂覆浓度下，诱导增强的IL-2分泌的趋势。在一些实施方案中，与抗-PD-L1抗体和靶向CD137的分子(比如抗-CD137抗体或在先已知的CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白)的组合相比，所提供的融合蛋白以相当或更好功效导致IL-2分泌增加。可以在例如基本上如实施例11和实施例19所述的功能T细胞活化测定中测量IL-2分泌。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白能够以PD-L1依赖性方式共刺激T细胞应答。在一些实施方案中，所提供的融合蛋白可导致在PD-L1阳性细胞(比如PD-L1转染的细胞或PD-L1阳性肿瘤细胞)附近的T细胞局部诱导IL-2产生。当在本文中使用时，“在PD-L1阳性细胞附近”是指T细胞与PD-L1阳性细胞经由同时结合CD137与PD-L1的所提供的融合蛋白而被彼此靠近。可以在例如基本上如实施例10所述的CD137生物测定中，在基本上如实施例18所述的PD-1/PD-L1阻断生物测定中，或在基本上如实施例12和实施例20所述的功能T细胞活化测定中，测定所提供的融合蛋白的PD-L1依赖性T细胞活化。
在一些优选的实施方案中，所提供的融合蛋白能够在表达PD-L1的肿瘤细胞存在下和/或在肿瘤微环境中共刺激T细胞应答。在一些实施方案中，所提供的融合蛋白能够在PD-L1阳性肿瘤存在下以约1nM或更低、约0.5nM或更低、约0.3nM或更低、约0.1nM或更低或约0.05nM或更低的EC50值共刺激T细胞应答。可以在例如基本上如实施例10所述的CD137生物测定中或在基本上如实施例12所述的功能T细胞活化测定中，评估在表达PD-L1的肿瘤细胞存在下和/或在肿瘤微环境中所提供的融合蛋白的T细胞活化。
在一些实施方案中，所提供的融合蛋白在不存在PD-L1的情况下不能共刺激T细胞应答。在一些实施方案中，所提供的融合蛋白在不存在表达PD-L1的细胞的情况下不能共刺激T细胞应答。在一些实施方案中，所提供的融合蛋白能够识别PD-L1的存在并导致比示于SEQ ID NOs：28和29的CD137抗体更好的相应的T细胞活化。可以在例如基本上如实施例10所述的CD137生物测定中，在基本上如实施例18所述的PD-1/PD-L1阻断生物测定中，或在基本上如实施例12和实施例20所述的功能T细胞活化测定中，测定融合蛋白的PD-L1依赖性作用。
在一些实施方案中，所提供的融合蛋白能够阻断由PD-1结合PD-L1介导的抑制信号。在一些实施方案中，所提供的融合蛋白能够通过阻断PD-1/PD-L1相互作用从而放开对T细胞活化的抑制(brake)或导致成功的T细胞活化。可以在例如基本上如实施例18所述的PD-1/PD-L1阻断生物测定中测量PD-1抑制信号的阻断。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白能够刺激T细胞增殖和/或活化。在一些实施方案中，所提供的融合蛋白能够刺激CD4+T细胞增殖和/或活化。在一些实施方案中，所提供的融合蛋白能够诱导IL-2分泌，优选地诱导剂量依赖性IL-2分泌。在一些实施方案中，与抗-PD-L1抗体和靶向CD137的分子(比如抗-CD137抗体或在先已知的CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白)的组合相比，所提供的融合蛋白能够诱导更高的IL-2分泌。本文所使用的IL-2分泌可以是T细胞活化的度量。可以通过例如基本上如实施例14所述的混合淋巴细胞反应(MLR)测定来评估所提供的融合蛋白刺激的CD4+T细胞增殖和/或活化。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白能够刺激CD8+T细胞增殖和/或活化。在一些实施方案中，所提供的融合蛋白能够诱导产生IL-2和效应分子，比如穿孔素、颗粒酶A和颗粒酶B。在一些实施方案中，与抗-PD-L1抗体和靶向CD137的分子(比如抗-CD137抗体或在先已知的CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白)的组合相比，所提供的融合蛋白能够诱导IL-2和细胞毒性因子(穿孔素、颗粒酶B和颗粒酶A)的产生增加。可以通过例如基本上如实施例15所述的MLR测定来评估所提供的融合蛋白刺激的CD8+T细胞增殖和/或活化。
在一些实施方案中，所提供的融合蛋白具有良好的稳定性和药代动力学特征。在一些实施方案中，所提供的融合蛋白具有与构建块抗体SEQ ID NOs：86和87相当的药代动力学特征。在一些实施方案中，所提供的融合蛋白具有抗体样药代动力学。在一些实施方案中，所提供的融合蛋白具有约200小时或更长、约250小时或更长、约300小时或更长、约350小时或更长、约400小时或更长或甚至更长的终末半衰期。在一些实施方案中，所提供的融合蛋白具有比SEQ ID NO：147更好的药代动力学特征。在一些实施方案中，所提供的融合蛋白具有比SEQ ID NO：148更好的药代动力学特征。可如实施例21和实施例22所述分析所提供的融合蛋白的药代动力学特征。在一些实施方案中，若在336h后，Cmax的百分比(％)在10％以上，则可认为实现了良好的药代动力学特征或抗体样药代动力学。
在一些实施方案中，所提供的融合蛋白包含SEQ ID NOs：88-94中任一个所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所提供的融合蛋白包含与SEQ ID NOs：88-94中任一个所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或甚至更高的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所提供的融合蛋白包含SEQ ID NOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQ ID NOs：92和87、SEQ ID NOs：86和93、SEQ ID NOs：94和87或SEQ ID NOs：90和91所示的氨基酸。
在一些实施方案中，所提供的融合蛋白包含与SEQ ID NOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQ ID NOs：92和87、SEQ ID NOs：86和93、SEQ ID NOs：94和87或SEQ ID NOs：90和91所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或甚至更高的序列同一性的氨基酸序列。
B.包含在融合蛋白中的示例性免疫球蛋白
在一些实施方案中，就所提供的融合蛋白而言，第一亚基可以为或包含对PD-L1特异性的全长免疫球蛋白或其抗原结合结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白可以是例如IgG1、IgG2或IgG4。在一些实施方案中，免疫球蛋白是或包含IgG4。在一些实施方案中，免疫球蛋白是针对PD-L1的单克隆抗体。
本发明的结合PD-L1的抗体的示例性实例可包含抗原结合区，其交叉阻断或结合与PD-L1-结合抗体相同的表位，所述PD-L1-结合抗体包含已知抗体的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述已知抗体比如阿妥珠单抗(atezolizumab)(也称作MPDL3280A或RG7446，商品名
Figure BPA0000299772270000321
)、阿维鲁单抗(avelumab)(也称为MSB0010718C，商品名
Figure BPA0000299772270000322
)、德瓦鲁单抗(durvalumab)(先前称为MEDI4736，商品名
Figure BPA0000299772270000323
)和BMS-936559(也称为MDX-1105)、5C10(包括人源化5C10)、5F10(包括人源化5F10)和9F6(包括人源化9F6)。在一些实施方案中，本发明的PD-L1-结合抗体可包含来自选自阿妥珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗、BMS-936559、5C10、5F10和9F6的抗体的抗原结合区，比如三个重链互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)中的任一个。
在一些实施方案中，所提供的PD-L1抗体或其抗原结合结构域可具有选自SEQ IDNOs：75-79的重链可变区(HCVR)和/或选自SEQ ID NOs：80-84的轻链可变区(LCVR)。
在一些实施方案中，所提供的PD-L1抗体或其抗原结合结构域可具有为SEQ IDNOs：85-86中任意之一的重链，和/或为SEQ ID NO：87的轻链。
在一些实施方案中，所提供的PD-L1抗体或其抗原结合结构域的重链和轻链对分别为或包含如下的HCVR和LCVR：SEQ ID NOs：75和80、SEQ ID NOs：76和81、SEQ ID NOs：77和82、SEQ ID NOs：78和83或SEQ ID NOs：79和84。
在一些实施方案中，所提供的PD-L1抗体的重链和轻链对为或包含SEQ ID NOs：85和87或SEQ ID NO：86和87中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所提供的PD-L1抗体或其抗原结合结构域可具有与选自SEQID NOs：75-79的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或甚至更高的序列同一性的HCVR，和/或与选自SEQ IDNOs：80-84的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或甚至更高的序列同一性的LCVR。在其它实施方案中，所提供的PD-L1抗体或其抗原结合结构域可具有与选自SEQ ID NOs：85-86的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或甚至更高的序列同一性的重链，和/或与SEQ ID NO：87的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或甚至更高的序列同一性的轻链。
在一些实施方案中，所提供的PD-L1抗体或其抗原结合结构域的重链可变区可具有三个CDR，所述三个CDR具有如下序列：GFSLSNYD(HCDR1，SEQ ID NO：60)、IWTGGAT(HCDR2，SEQ ID NO：61)、VRDSNYRYDEPFTY(HCDR3；SEQ ID NO：62)。在一些实施方案中，所提供的PD-L1抗体或其抗原结合结构域的重链可变区可具有三个CDR，所述三个CDR具有如下序列：GFDIKDTY(HCDR1，SEQ ID NO：65)、IDPADGNT(HCDR2，SEQ ID NO：66)、ARGLGAWFAS(HCDR3；SEQ ID NO：67)。在一些实施方案中，所提供的PD-L1抗体或其抗原结合结构域的重链可变区可具有三个CDR，所述三个CDR具有如下序列：GFNIKDTY(HCDR1，SEQ ID NO：70)、IDPANGNT(HCDR2，SEQ ID NO：71)、SRGPPGGIGEYIYAMDY(HCDR3；SEQ ID NO：72)。
在一些实施方案中，所提供的PD-L1抗体或其抗原结合结构域的轻链可变区可具有三个CDR，所述三个CDR具有如下序列：QSIGTN(LCDR1，SEQ ID NO：63)、YAS(LCDR2)、QQSNSWPYT(LCDR3；SEQ ID NO：64)。在一些实施方案中，所提供的PD-L1抗体或其抗原结合结构域的轻链可变区可具有三个CDR，所述三个CDR具有如下序列：QDITNS(LCDR1，SEQ IDNO：68)、YTS(LCDR2)、QQGHTLPPT(LCDR3；SEQ ID NO：69)。在一些实施方案中，所提供的PD-L1抗体或其抗原结合结构域的轻链可变区可具有三个CDR，所述三个CDR具有如下序列：SSVSSSY(LCDR1，SEQ ID NO：73)、STS(LCDR2)、HQYHRSPPT(LCDR3；SEQ ID NO：74)。
在一些实施方案中，所提供的PD-L1抗体或其抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有有如下序列的三个CDR：GFSLSNYD(HCDR1，SEQ ID NO：60)、IWTGGAT(HCDR2，SEQ ID NO：61)、VRDSNYRYDEPFTY(HCDR3；SEQ ID NO：62)，所述轻链可变区具有有如下序列的三个CDR：QSIGTN(LCDR1，SEQ ID NO：63)、YAS(LCDR2)、QQSNSWPYT(LCDR3；SEQ ID NO：64)。在一些实施方案中，所提供的PD-L1抗体或其抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有有如下序列的三个CDR：GFDIKDTY(HCDR1，SEQ ID NO：65)、IDPADGNT(HCDR2，SEQ ID NO：66)、ARGLGAWFAS(HCDR3；SEQ ID NO：67)，所述轻链可变区具有有如下序列的三个CDR：QDITNS(LCDR1，SEQ ID NO：68)、YTS(LCDR2)、QQGHTLPPT(LCDR3；SEQ ID NO：69)。在一些实施方案中，所提供的PD-L1抗体或其抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有有如下序列的三个CDR：GFNIKDTY(HCDR1，SEQ ID NO：70)、IDPANGNT(HCDR2，SEQ ID NO：71)、SRGPPGGIGEYIYAMDY(HCDR3；SEQ ID NO：72)，所述轻链可变区具有有如下序列的三个CDR：SSVSSSY(LCDR1，SEQID NO：73)、STS(LCDR2)、HQYHRSPPT(LCDR3；SEQ ID NO：74)。
除非另有说明，本文公开的全部CDR序列均根据Lefranc，M.-P.，TheImmunologist，7，132-136(1999)中所述的IMGT方法定义。CDR1由位置27至38组成，CDR2由位置56至65组成，种系(germline)V-基因的CDR3由位置105至116组成，重排的V-J-基因或V-D-J-基因的CDR3由位置105至117(J-PHE或J-TRP 118之前的位置)组成，其中对于具有小于13个氨基酸的重排的CDR3-IMGT的环顶部具有间隙，或对于具有大于13个氨基酸的重排的CDR3-IMGT具有另外的位置112.1、111.1、112.2、111.2等。本段给出的位置根据Lefranc，M.-P.，The Immunologist，7，132-136(1999)中描述的IMGT编号。
包含在本发明的融合蛋白中的特异性地结合PD-1的抗体可包括Fc部分，所述Fc部分允许延长本发明的双特异性结合分子的体内半衰期。在一些实施方案中，这种Fc部分优选地来自人来源，更优选地为IgG1或IgG4抗体的人Fc部分，甚至更优选地为具有活化的或沉默的效应子功能的IgG1或IgG4的工程化人Fc部分。在一些实施方案中，沉默的效应子功能可优于活化的效应子功能。在一些实施方案中，这种Fc部分被工程化为沉默效应子功能，其在根据Kabat的EU索引(Johnson和Wu，Nucleic Acids Res，2000)编号的位置234和/或235处具有突变。在一些实施方案中，可以在所提供的抗-PD-1抗体的位置F234和L235处引入突变以沉默效应子功能。在其它实施方案中，可以在所提供的抗-PD-1抗体的位置D265和P329处引入突变以沉默效应子功能。两组这些潜在突变的编号均根据Kabat的EU索引(Shields等，J Biol Chem，2001)。
用于产生抗体及其片段的各种技术是本领域熟知的并描述在如Altshuler等(2010)中。因此，例如，在用与添加剂和佐剂混合的抗原免疫后，可以从动物的血液中获得多克隆抗体，并且可以通过提供由连续细胞系培养物产生的抗体的任何技术来生产单克隆抗体。这种技术的实例描述在如Harlow和Lane(1999)，(1988)中，并包括最初由
Figure BPA0000299772270000351
和Milstein，1975描述的杂交瘤技术、trioma技术、人B细胞杂交瘤技术(参见如Li等，ProcNatl Acad Sci USA，2006；Kozbor和Roder，Immunol Today，1983)和EBV-杂交瘤技术以产生人单克隆抗体(Cole等，Cancer Res，1984)。此外，重组抗体可以从单克隆抗体获得或可以通过各种展示方法(比如噬菌体、核糖体、mRNA或细胞展示)从头制备。在一些实施方案中，用于表达重组(人源化)抗体或其片段的合适系统可选自例如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞系或转基因动物或植物(参见如美国专利No.6,080,560；Holliger和Hudson，NatBiotechnol，2005)。另外，所描述的用于产生单链抗体的技术(尤其参见美国专利No.4,946,778)可适于产生对本发明的靶标特异性的单链抗体。可将BIAcore系统中应用的表面等离子体共振用于增加噬菌体抗体的效率。
C.本发明的示例性脂质运载蛋白突变蛋白
脂质运载蛋白是已天然进化成结合配体的蛋白质性结合分子。脂质运载蛋白存在于许多生物体中，包括脊椎动物、昆虫、植物和细菌。脂质运载蛋白家族的成员(Pervaiz和Brew，FASEB J，1987)通常是小的分泌的蛋白并具有单个多肽链。它们的特征在于一系列不同的分子识别特性：它们结合多种主要是疏水性的小分子(例如类视黄醇、脂肪酸、胆固醇、前列腺素、胆绿素、信息素、甜味剂(tastant)和着嗅剂(odorant))；和它们结合特异细胞表面受体及其大分子复合物的形成。尽管过去将它们主要分类为转运蛋白，但现在明确了脂质运载蛋白完成多种生理功能。这些功能包括在视黄醇转运、嗅觉、信息素信号传导和前列腺素合成中的作用。脂质运载蛋白还涉及免疫应答的调节和细胞内环境稳态的介导(例如，Flower等，Biochim Biophys Acta，2000；Flower，Biochem J，1996中的综述)。
脂质运载蛋白之间的全序列保守性水平非常低，通常具有低于20％的序列同一性。形成强烈对比的是，其整体折叠模式高度保守。脂质运载蛋白结构的中心部分由单个八链反平行的β-片组成，所述β-片自身闭合形成连续的氢键合的β桶。该β桶形成中央腔体。桶的一端被穿过其底部的N-末端肽段以及连接β-链的三个肽环立体封闭。β桶的另一端对溶剂开放并包含由四个柔性肽环(AB、CD、EF和GH)形成的靶标结合位点。正是所述环在本应刚性的脂质运载蛋白骨架中的这种多样性产生多种不同的结合模式，每一种模式能够容纳不同大小、形状和化学特征的靶标(例如Skerra，Biochim Biophys Acta，2000；Flower等，Biochim Biophys Acta，2000；Flower，Biochem J，1996中的综述)。
根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可以是任何脂质运载蛋白的突变蛋白。其突变蛋白可以使用的合适的脂质运载蛋白(有时也称为“参照脂质运载蛋白”、“野生型脂质运载蛋白”、“参照蛋白骨架”或简单地称为“骨架”)的实例包括但不限于泪液脂质运载蛋白(脂质运载蛋白-1、Tlc或von Ebner’s腺蛋白)、视黄醇结合蛋白、嗜中性粒细胞脂质运载蛋白型前列腺素D合酶、β乳球蛋白、胆汁结合蛋白(BBP)、载脂蛋白D(APOD)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、α2微球蛋白相关的蛋白(A2m)、24p3/子宫钙蛋白(24p3)、vonEbner’s腺蛋白1(VEGP 1)、von Ebner’s腺蛋白2(VEGP 2)和主要过敏原Can f 1(ALL-1)。在相关的实施方案中，脂质运载蛋白突变蛋白源自由人泪液脂质运载蛋白(hTIc)、人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(hNGAL)、人载脂蛋白D(hAPOD)和欧洲粉蝶(Pierisbrassicae)的胆汁结合蛋白组成的脂质运载蛋白组。
相比于与另一种脂质运载蛋白(还参见上文)的序列同一性，根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列与其所源自的参照(或野生型)脂质运载蛋白(例如hTlc或hNGAL)可具有高序列同一性。在该一般情况下，根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列与相应参照(野生型)脂质运载蛋白的氨基酸序列至少基本上相似，条件是在比对时可能有由于氨基酸的添加或缺失导致的间隙(如本文所定义)。与相应参照(野生型)脂质运载蛋白的序列基本上相似的本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的相应序列，在一些实施方案中，与相应脂质运载蛋白的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％、至少90％的同一性，包括至少95％的同一性。在这一方面，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白当然可包含如本文所述的置换，其使该脂质运载蛋白突变蛋白能够结合CD137。
典型地，脂质运载蛋白突变蛋白相对于野生型或参照脂质运载蛋白(例如hTlc或hNGAL)的氨基酸序列在包含配体结合口袋并限定配体结合口袋入口的开放端的四个环(参见上文)中含有一个或多个突变的氨基酸残基。如上文所述，这些区域在决定脂质运载蛋白突变蛋白对所需靶标的结合特异性中至关重要。在一些实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白还可在四个环之外的区域含有突变的氨基酸残基。在一些实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可在连接脂质运载蛋白封闭端处的β-链的三个肽环(命名为BC、DE和FG)中的一个或多个中含有一个或多个突变的氨基酸残基。在一些实施方案中，源自泪液脂质运载蛋白、NGAL脂质运载蛋白或它们的同源物的突变蛋白在N-末端区域和/或β-桶结构端部处排列的三个肽环BC、DE和FG中的任意序列位置处可具有1、2、3、4或更多个突变的氨基酸残基，所述β-桶结构端部位于天然脂质运载蛋白结合口袋的对面。在一些实施方案中，与泪液脂质运载蛋白的野生型序列相比，源自泪液脂质运载蛋白、NGAL脂质运载蛋白或它们的同源物的突变蛋白可在β-桶结构端部处排列的肽环DE中没有突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，与相应的参照(野生型)脂质运载蛋白相比，根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可包含一个或多个(比如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或甚至更多个)突变的氨基酸残基，条件是这种脂质运载蛋白突变蛋白应该能够结合CD137。在一些实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白包含至少两个(包括2、3、4、5或甚至更多个)突变的氨基酸残基，其中相应的参照(野生型)脂质运载蛋白的天然氨基酸残基被精氨酸残基置换。
设想任意类型和数量的突变(包括置换、缺失和插入)，只要所提供的脂质运载蛋白突变蛋白保留了其结合CD137的能力，和/或其与参照(野生型)脂质运载蛋白(例如成熟hTlc或成熟hNGAL)的氨基酸序列具有至少60％，比如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或更高的序列同一性。
在一些实施方案中，置换是保守置换。在一些实施方案中，置换是非保守置换或来自下文列出的示例性置换的一个或多个。
具体而言，为了确定脂质运载蛋白突变蛋白氨基酸序列的氨基酸残基是否与对应于参照(野生型)脂质运载蛋白氨基酸序列中的某一位置的参照(野生型)脂质运载蛋白不同，技术人员可利用本领域熟知的手段和方法，如手动地或通过使用计算机程序例如BLAST2.0(其代表基本局部比对搜索工具)或ClustalW或任意适用于产生序列比对的其它合适程序进行比对。因此，参照(野生型)脂质运载蛋白的氨基酸序列可作为“受试序列”或“参照序列”，而脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列作为“查询序列”(还参见上文)。
保守置换通常为以下置换，根据待突变的氨基酸列举，每一个待突变的氨基酸后面为一个或多个可作为保守性的替代：Ala→Ser、Thr或Val；Arg→Lys、Gln、Asn或His；Asn→Gln、Glu、Asp或His；Asp→Glu、Gln、Asn或His；Gln→Asn、Asp、Glu或His；Glu→Asp、Asn、Gln或His；His→Arg、Lys、Asn、Gln、Asp或Glu；Ile→Thr、Leu、Met、Phe、Val、Trp、Tyr、Ala或Pro；Leu→Thr、Ile、Val、Met、Ala、Phe、Pro、Tyr或Trp；Lys→Arg、His、Gln或Asn；Met→Thr、Leu、Tyr、Ile、Phe、Val、Ala、Pro或Trp；Phe→Thr、Met、Leu、Tyr、Ile、Pro、Trp、Val或Ala；Ser→Thr、Ala或Val；Thr→Ser、Ala、Val、Ile、Met、Val、Phe、Pro或Leu；Trp→Tyr、Phe、Met、Ile或Leu；Tyr→Trp、Phe、Ile、Leu或Met；Val→Thr、Ile、Leu、Met、Phe、Ala、Ser或Pro。其它置换也是可允许的并可凭经验或根据其它已知的保守或非-保守置换确定。作为另一取向(orientation)，以下组的每一组包含通常可用于定义彼此的保守置换的氨基酸：
(a)丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)
(b)天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、组氨酸(His)
(c)精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、组氨酸(His)
(d)异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、脯氨酸(Pro)
(e)异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)
如果这种保守性置换导致了生物活性的改变，则可引入更多实质性改变(如以下或如下文关于氨基酸分类进一步描述)并就所需特征筛选产物。这种更实质性改变的实例是：Ala→Leu或Phe；Arg→Glu；Asn→Ile、Val或Trp；Asp→Met；Cys→Pro；Gln→Phe；Glu→Arg；His→Gly；Ile→Lys、Glu或Gln；Leu→Lys或Ser；Lys→Tyr；Met→Glu；Phe→Glu、Gln或Asp；Trp→Cys；Tyr→Glu或Asp；Val→Lys、Arg、His。
在一些实施方案中，脂质运载蛋白(突变蛋白)的物理和生物性质中的实质性修饰通过选择它们在维持以下的效果上显著不同的置换来完成：(a)置换区域中多肽骨架的结构，例如片(sheet)或螺旋构象；(b)靶点处分子的电荷或疏水性；或(c)侧链的体积(bulk)。
基于一般侧链性质，将天然存在的残基分为以下的组：(1)疏水性：甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；(2)中性亲水性：半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；(3)酸性：天冬氨酸、谷氨酸；(4)碱性：组氨酸、赖氨酸、精氨酸；(5)影响链取向的残基：甘氨酸、脯氨酸；和(6)芳香族：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。在一些实施方案中，置换可能需要将这些类别中一类的成员换成另一类。
通常还可用丝氨酸置换不参与维持相应脂质运载蛋白正确构象的任何半胱氨酸残基，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可将半胱氨酸键添加至脂质运载蛋白以提高其稳定性。
D.本发明的示例性CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白
如上所述，脂质运载蛋白是由其超二级结构定义的多肽，超二级结构即包含通过在一端的4个环逐对连接的8个β链以由此限定结合口袋的圆柱形β-折叠片超二级结构区。本发明不局限于本文具体公开的脂质运载蛋白突变蛋白。在这一方面，本发明涉及具有圆柱形β-折叠片超二级结构区的脂质运载蛋白突变蛋白，该结构区包含通过在一端的4个环逐对连接的8个β链以由此限定结合口袋，其中所述4个环中的至少3个的每一个的至少一个氨基酸已经突变，并且其中所述脂质运载蛋白以可检测的亲和力有效结合CD137。
在一些实施方案中，本文公开的脂质运载蛋白突变蛋白可以是或包含成熟人泪液脂质运载蛋白(hTlc)的突变蛋白。本文将成熟hTlc的突变蛋白命名为“hTlc突变蛋白”。在一些其它实施方案中，本文公开的脂质运载蛋白突变蛋白为成熟人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(hNGAL)的突变蛋白。本文将成熟hNGAL的突变蛋白命名为“hNGAL突变蛋白”。
一方面，本发明包括任何数量的以可检测亲和力结合CD137的源自参照(野生型)脂质运载蛋白(优选源自成熟hTlc或成熟hNGAL)的脂质运载蛋白突变蛋白。在相关的方面，本发明包含多种能够通过结合CD137来活化CD137下游信号传导通路的脂质运载蛋白突变蛋白。在此意义上，可将CD137看作参照(野生型)脂质运载蛋白(优选hTlc或hNGAL)的非天然靶标，其中“非天然靶标”是指在生理条件下不结合参照(野生型)脂质运载蛋白的物质。通过在某些序列位置处用一个或多个突变工程化参照(野生型)脂质运载蛋白，本发明的发明人已经证明对非天然靶标即CD137的高亲和力和高特异性是可能的。在一些实施方案中，基于产生能够结合CD137的脂质运载蛋白突变蛋白的目标，在编码野生型脂质运载蛋白上某些序列位置处的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或甚至更多个核苷酸三联体处，可以通过用核苷酸三联体的亚集(subset)在这些位置处的置换来实施随机诱变。
在一些实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白在对应于参照脂质运载蛋白(优选hTlc或hNGAL)的线性多肽序列的一个或多个序列位置处可具有突变的(包括置换、缺失或插入)氨基酸残基。在一些实施方案中，相比于参照脂质运载蛋白(优选hTlc或hNGAL)的氨基酸序列，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的突变的氨基酸残基的数目为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多(比如25、30、35、40、45或50)，其中优选地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11，更优选地为9、10或11。然而，优选地本发明的脂质运载蛋白突变蛋白仍然能够结合CD137。
在一些实施方案中，与相应的参照(野生型)脂质运载蛋白相比，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可在其N-末端缺失1、2、3、4或更多个氨基酸和/或在其C-末端缺失1、2或更多个氨基酸；例如SEQ ID NOs：34-40。在一些实施方案中，本发明涵盖如上定义的hTlc突变蛋白，其中成熟hTlc的前4个、1个、2个或3个N-末端氨基酸残基(His-His-Leu-Leu；位置1-4)和/或成熟hTlc的线性多肽序列的最后1个或2个C-末端氨基酸残基(Ser-Asp；位置157-158)缺失(如SEQ ID NOs：34-40)。在一些实施方案中，本发明涵盖如上定义的hNGAL突变蛋白，其中成熟hNGAL的线性多肽序列的氨基酸残基(Lys-Asp-Pro；位置46-48)缺失(SEQ IDNO：45)。此外，在突变的氨基酸序列位置之外，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可包括参照(野生型)脂质运载蛋白(优选hTlc或hNGAL)的野生型(天然)氨基酸序列。
在一些实施方案中，将一个或多个突变的氨基酸残基引入本发明的脂质运载蛋白突变蛋白基本上不会妨碍或不会干扰该突变蛋白与指定靶标的结合活性和折叠。可以采用已建立的标准方法(Sambrook和Russell，2001，Molecular cloning：a laboratorymanual)在DNA水平上完成这种突变(包括置换、缺失和插入)。在一些实施方案中，在对应于参照(野生型)脂质运载蛋白(优选hTlc或hNGAL)的线性多肽序列的一个或多个序列位置处，通过用核苷酸三联体的亚集(subset)置换编码参照脂质运载蛋白相应序列位置的一个或多个核苷酸三联体的随机诱变来引入突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，所提供的以可检测的亲和力结合CD137的脂质运载蛋白突变蛋白可包含至少一个用另一个氨基酸(例如丝氨酸残基)置换天然半胱氨酸残基的氨基酸置换。在一些实施方案中，以可检测的亲和力结合CD137的脂质运载蛋白突变蛋白可包含置换参照(野生型)脂质运载蛋白(优选hTlc或hNGAL)的一个或多个氨基酸的一个或多个非天然半胱氨酸残基。在一些实施方案中，根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白包含至少两个用半胱氨酸残基置换天然氨基酸的氨基酸置换，从而形成一个或多个半胱氨酸桥。在一些实施方案中，所述半胱氨酸桥可以连接至少两个环区。根据(Biochim Biophys Acta，2000)、Flower(1996)和Breustedt等，(2005)在本文中使用这些区的定义。
一般而言，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白与成熟hTlc(SEQ ID NO：1)或成熟hNGAL(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列具有至少约70％，包括至少约80％，比如至少约85％的氨基酸序列同一性。
在一些方面，本发明提供结合CD137的hTlc突变蛋白。在这一方面，本发明提供一种或多种hTlc突变蛋白，其能够以通过约300nM、200nM、150nM、100nM或更低的KD量度的亲和力结合CD137。在一些实施方案中，所提供的hTlc突变蛋白能够以约250nM、150nM、100nM、50nM、20nM或甚至更低的EC50值结合CD137。在一些实施方案中，结合CD137的hTlc突变蛋白可与猕猴CD137(cyCD137)交叉反应。
在一些实施方案中，本发明的hTlc突变蛋白可干扰CD137L与CD137的结合。
在一些实施方案中，所提供的hTlc突变蛋白在对应于成熟hTlc的线性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153的一个或多个位置处可包含突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，所提供的hTlc突变蛋白在对应于成熟hTlc的线性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置26-34、55-58、60-61、65、104-106和108的一个或多个位置处可包含突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，所提供的hTlc突变蛋白在对应于成熟hTlc的线性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置101、111、114和153的一个或多个位置处可进一步包含突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，所提供的hTlc突变蛋白在对应于成熟hTlc的线性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或甚至更多个位置处可包含突变的氨基酸残基。在一些优选的实施方案中，所提供的hTlc突变蛋白能够结合CD137，特别是人CD137。
在一些实施方案中，所提供的hTlc突变蛋白在对应于成熟hTlc的线性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置26-34、55-58、60-61、65、104-106和108的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或甚至更多个位置处包含突变的氨基酸残基。在一些优选的实施方案中，所提供的hTlc突变蛋白能够结合CD137，特别是人CD137。
在一些实施方案中，根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可包含至少一个用如丝氨酸残基置换天然半胱氨酸残基的氨基酸置换。在一些实施方案中，根据本发明的hTlc突变蛋白包含用另一个氨基酸(比如丝氨酸残基)置换天然半胱氨酸残基的氨基酸置换，所述天然半胱氨酸残基在对应于成熟hTlc的线性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置61和/或153的位置处。在本上下文中应注意已经发现(在相应的天然
Figure BPA0000299772270000431
核酸文库的水平上)移除由半胱氨酸残基61和153形成的野生型hTlc的结构二硫键(参见Breustedt等，J Biol Chem，2005)可以提供hTlc突变蛋白，其不仅稳定折叠，还能以高亲和力结合给定非-天然靶标。在一些实施方案中，结构二硫键的消除可提供进一步的优点，即允许将非天然二硫键生成或有意引入到本发明的突变蛋白中，由此增加该突变蛋白的稳定性。然而，结合CD137并具有在Cys 61和Cys 153之间形成的二硫桥的hTlc突变蛋白也是本发明的一部分。
在一些特定实施方案中，本发明的hTlc突变蛋白在对应于成熟hTlc的线性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置61和/或153的位置处可包含以下氨基酸置换中的一个或多个：Cys61→Ala、Phe、Lys、Arg、Thr、Asn、Gly、Gln、Asp、Asn、Leu、Tyr、Met、Ser、Pro或Trp和/或Cys153→Ser或Ala。
在一些实施方案中，在对应于成熟hTlc的线性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置61、101和153的位置处的两个或全部三个半胱氨酸密码子被另一个氨基酸的密码子替换。此外，在一些实施方案中，根据本发明的hTlc突变蛋白在对应于成熟hTlc的线性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置101的位置处包含天然半胱氨酸残基被丝氨酸残基或组氨酸残基置换的氨基酸置换。
在一些实施方案中，根据本发明的突变蛋白包含在对应于成熟hTlc的线性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置28或105的位置处的天然氨基酸被半胱氨酸残基置换的氨基酸置换。此外，在一些实施方案中，根据本发明的突变蛋白包含在对应于成熟hTlc的线性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置111的位置处的天然精氨酸残基被脯氨酸残基置换的氨基酸置换。另外，在一些实施方案中，根据本发明的突变蛋白包含在对应于成熟hTlc的线性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置114的位置处的天然赖氨酸残基被色氨酸残基或谷氨酸置换的氨基酸置换。
在一些实施方案中，所提供的结合CD137的hTlc突变蛋白在对应于成熟hTlc的线性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153的一个或多个位置处可包含一个或多个如下的突变的氨基酸残基：Ala 5→Val或Thr；Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Thr 42→Ser；Gly46→Asp；Lys 52→Glu；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Lys 65→Arg或Asn；Thr 71→Ala；Val 85→Asp；Lys 94→Arg或Glu；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Lys 121→Glu；Ala 133→Thr；Arg 148→Ser；Ser 150→Ile；和Cys 153→Ser。在一些实施方案中，本发明的hTlc突变蛋白在成熟hTlc(SEQ ID NO：1)的这些序列位置处包含两个或更多个，比如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或更多个或甚至全部突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，与成熟hTlc的线性多肽序列(SEQ ID NO：1)相比，所提供的结合CD137的hTlc突变蛋白可包含以下突变的氨基酸残基的组之一：
(a)Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；和Cys 153→Ser；
(b)Ala 5→Thr；Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Lys 65→Arg；Val 85→Asp；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Lys 121→Glu；Ala 133→Thr；和Cys 153→Ser；
(c)Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Lys 65→Asn；Lys 94→Arg；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Lys 121→Glu；Ala 133→Thr；和Cys153→Ser；
(d)Ala 5→Val；Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Lys 65→Arg；Lys 94→Glu；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Lys 121→Glu；Ala 133→Thr；和Cys 153→Ser；
(e)Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Thr 42→Ser；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Ser 150→Ile；和Cys 153→Ser；
(f)Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Lys 52→Glu；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Thr 71→Ala；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Ala 133→Thr；Arg 148→Ser；Ser 150→Ile；和Cys 153→Ser；和
(g)Ala 5→Thr；Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Gly 46→Asp；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Thr 71→Ala；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Ser 150→Ile；和Cys153→Ser。
在一些实施方案中，本发明的hTlc突变蛋白的剩余区域，即与对应于成熟hTlc的线性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153的位置不同的区域，在突变的氨基酸序列位置之外，可包含成熟hTlc的线性多肽序列的野生型(天然)氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的hTlc突变蛋白与成熟hTlc的序列(SEQ ID NO：1)具有至少70％的序列同一性或至少70％的序列同源性。作为示例性实例，SEQ ID NO：34的突变蛋白与成熟hTlc的氨基酸序列具有近84％的氨基酸序列同一性或序列同源性。
在一些实施方案中，本发明的hTlc突变蛋白包含如SEQ ID NOs：34-40中任一个所示的氨基酸序列或其片段或变体。
在一些实施方案中，本发明的hTlc突变蛋白与选自SEQ ID NOs：34-40的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性。
本发明还包含具有选自SEQ ID NOs：34-40的氨基酸序列的hTlc突变蛋白的结构同源物，所述结构同源物与所述的hTlc突变蛋白具有大于约60％，优选地大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于92％和最优选地大于95％的氨基酸序列同源性或序列同一性。
在一些方面，本发明提供结合CD137的hNGAL突变蛋白。在这一方面，本发明提供一种或多种hNGAL突变蛋白，其能够以通过约800nM、700nM、200nM、140nM、100nM或更低，优选约70nM、50nM、30nM、10nM、5nM、2nM或甚至更低的KD量度的亲和力结合CD137。在一些实施方案中，所提供的hNGAL突变蛋白能够以约1000nM、500nM、100nM、80nM、50nM、25nM、18nM、15nM、10nM、5nM或更低的EC50值结合CD137。
在一些实施方案中，所提供的结合CD137的hNGAL突变蛋白可与猕猴CD137交叉反应。在一些实施方案中，所提供的hNGAL突变蛋白能够以通过约50nM、20nM、10nM、5nM、2nM或甚至更低的KD量度的亲和力结合猕猴CD137。在一些实施方案中，所提供的hNGAL突变蛋白能够以约100nM、80nM、50nM、30nM或甚至更低的EC50值结合猕猴CD137。
在一些实施方案中，本发明的hNGAL突变蛋白可干扰或竞争CD137L与CD137的结合。在一些其它实施方案中，本发明的hNGAL突变蛋白在CD137L和/或CD137/CD137L结合复合物存在下能够结合CD137。
在一些实施方案中，所提供的hNGAL突变蛋白在对应于成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO：2)的位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132和134的一个或多个位置处可包含突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，所提供的hNGAL突变蛋白在对应于成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO：2)的位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132和134的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或甚至更多个位置处可包含突变的氨基酸残基。在一些优选的实施方案中，所提供的hNGAL突变蛋白能够结合CD137，特别是人CD137。
在一些实施方案中，所提供的hNGAL突变蛋白在对应于成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO：2)的位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、87、96、100、103、106、125、127、132和134的一个或多个位置处可包含突变的氨基酸残基。在一些优选的实施方案中，所提供的hNGAL突变蛋白能够结合CD137，特别是人CD137。
在一些实施方案中，所提供的hNGAL突变蛋白在对应于成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO：2)的位置36、87和96的一个或多个位置处和在对应于成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO：2)的位置28、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、94、100、103、106、125、127、132和134的一个或多个位置处可包含突变的氨基酸残基。
在一些其它实施方案中，所提供的hNGAL突变蛋白在对应于成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO：2)的位置20、25、28、33、36、40-41、44、49、52、59、68、70-73、77-82、87、92、96、98、100、101、103、122、125、127、132和134的一个或多个位置处可包含突变的氨基酸残基。
在其它实施方案中，所提供的hNGAL突变蛋白在对应于成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO：2)的位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、125、127、132和134的一个或多个位置处和在对应于成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO：2)的位置20、25、33、44、59、71、78、80、82、87、92、98、101和122的一个或多个位置处可包含突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可包含至少一个用如丝氨酸残基置换天然半胱氨酸残基的氨基酸置换。在一些实施方案中，根据本发明的hNGAL突变蛋白可包含用另一个氨基酸(比如丝氨酸残基)置换天然半胱氨酸残基的氨基酸置换，所述天然半胱氨酸残基在对应于成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO：2)的位置76和/或175的位置处。在本上下文中应注意已经发现(在相应的天然
Figure BPA0000299772270000481
核酸文库的水平上)移除由半胱氨酸残基76和175形成的野生型hNGAL的结构二硫键(参见Breustedt等，J BiolChem，2005)可以提供hNGAL突变蛋白，其不仅稳定折叠，还能以高亲和力结合给定非-天然靶标。在一些实施方案中，结构二硫键的消除可提供进一步的优点，即允许将非天然二硫键生成或有意引入到本发明的突变蛋白中，由此增加该突变蛋白的稳定性。然而，结合CD137并具有在Cys 76和Cys 175之间形成的二硫桥的hNGAL突变蛋白也是本发明的一部分。
在一些实施方案中，所提供的结合CD137的hNGAL突变蛋白在对应于成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO：2)的位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132和134的一个或多个位置处可包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg或Lys；Gln49→Val、Ile、His、Ser或Asn；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Met、Ala或Gly；Leu 70→Ala、Lys、Ser或Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Met、Arg、Thr或Asn；Trp 79→Ala或Asp；Arg 81→Met、Trp或Ser；Phe 83→Leu；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu和Lys 134→Tyr。在一些实施方案中，本发明的hNGAL突变蛋白在成熟hNGAL(SEQ IDNO：2)的这些序列位置处包含两个或更多个，比如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、甚至更多个比如13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个或全部突变的氨基酸残基。
在一些实施方案中，所提供的结合CD137的hNGAL突变蛋白在对应于成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO：2)的位置20、25、28、33、36、40-41、44、49、52、59、68、70-73、77-82、87、92、96、98、100、101、103、122、125、127、132和134的一个或多个位置处可包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Gln 20→Arg；Asn 25→Tyr或Asp；Gln 28→His；Val 33→Ile；Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Glu 44→Val或Asp；Gln 49→His；Tyr 52→Ser或Gly；Lys 59→Asn；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Phe 71→Leu；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln或His；Tyr 78→His；Trp 79→Ile；Ile 80→Asn；Arg 81→Trp或Gln；Thr 82→Pro；Cys 87→Ser；Phe 92→Leu或Ser；Asn 96→Phe；Lys 98→Arg；Tyr 100→Asp；Pro 101→Leu；Leu 103→His或Pro；Phe 122→Tyr；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr132→Trp；和Lys 134→Gly。
在一些实施方案中，所提供的结合CD137的hNGAL突变蛋白在对应于成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO：2)的位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、125、127、132和134的一个或多个位置处可包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Ser或Gly；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln或His；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp或Gln；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His或Pro；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly。在一些实施方案中，所提供的结合CD137的hNGAL突变蛋白在对应于成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO：2)的位置20、25、33、44、59、71、78、80、82、87、92、98、101和122的一个或多个位置处可进一步包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Gln 20→Arg；Asn 25→Tyr或Asp；Val 33→Ile；Glu 44→Val或Asp；Lys 59→Asn；Phe 71→Leu；Tyr 78→His；Ile 80→Asn；Thr 82→Pro；Phe 92→Leu或Ser；Lys 98→Arg；Pro 101→Leu；和Phe 122→Tyr。
在一些实施方案中，与成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO：2)相比，所提供的结合CD137的hNGAL突变蛋白可包含以下突变的氨基酸残基的组之一：
(a)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Asn；Tyr 52→Met；Ser 68→Gly；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Ala；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(b)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg；Gln 49→Ile；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Met；Leu 70→Lys；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Met；Trp 79→Asp；Arg 81→Trp；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(c)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg；Gln 49→Asn；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Ala；Leu 70→Ala；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Asp；Arg 81→Trp；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(d)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Asn；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Ala；Leu 70→Ala；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Asp；Arg 81→Trp；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(e)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Ser；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Ser；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Ala；Arg 81→Met；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(f)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Val；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Arg；Trp 79→Asp；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(g)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg；Gln 49→His；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Ala；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(h)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Asn；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Ala；Arg 81→Ser；Phe 83→Leu；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；或
(i)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg；Gln 49→Ser；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Ala；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Asn；Trp 79→Ala；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr。
在一些其它实施方案中，在剩余区域，即与成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ IDNO：2)的位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132和134不同的区域，在突变的氨基酸序列位置之外，本发明的hNGAL突变蛋白可包含成熟hNGAL的野生型(天然)氨基酸序列。
在一些其它实施方案中，与成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO：2)相比，所提供的结合CD137的hNGAL突变蛋白可包含以下突变的氨基酸残基的组之一：
(a)Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Ser；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(b)Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Ser；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Phe 92→Leu；Asn 96→Phe；Lys 98→Arg；Tyr 100→Asp；Pro 101→Leu；Leu 103→His；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(c)Asn 25→Tyr；Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Gly；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Phe 71→Leu；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Arg 81→Gln；Phe 92→Ser；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(d)Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Gly；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Tyr 78→His；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Phe 92→Leu；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(e)Asn 25→Asp；Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Gly；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Phe 92→Leu；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(f)Val 33→Ile；Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Gly；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Phe 92→Leu；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(g)Gln 20→Arg；Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Glu 44→Val；Gln 49→His；Tyr 52→Gly；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Phe 92→Leu；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Phe 122→Tyr；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(h)Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Ser；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Ile 80→Asn；Arg 81→Trp；Thr 82→Pro；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Pro 101→Leu；Leu 103→Pro；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(i)Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Gly；Lys 59→Asn；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Phe 92→Leu；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；和
(j)Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Glu 44→Asp；Gln 49→His；Tyr 52→Ser；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Phe 71→Leu；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→His；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Phe 92→Leu；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly。
在一些实施方案中，在本发明的hNGAL突变蛋白的剩余区域，即与成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO：2)的位置20、25、28、33、36、40-41、44、49、52、59、68、70-73、77-82、87、92、96、98、100、101、103、122、125、127、132和134不同的区域，在突变的氨基酸序列位置之外，可包含成熟hNGAL的野生型(天然)氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的hNGAL突变蛋白与成熟hNGAL的序列(SEQ ID NO：2)具有至少70％的序列同一性或至少70％的序列同源性。作为示例性实例，SEQ ID NO：42的突变蛋白与成熟hNGAL的氨基酸序列具有近87％的氨基酸序列同一性或序列同源性。
在一些实施方案中，本发明的hNGAL突变蛋白包含如SEQ ID NOs：41-59中任一个所示的氨基酸序列或其片段或变体。
在一些实施方案中，本发明的hNGAL突变蛋白与选自SEQ ID NOs：41-59的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性。
本发明还包含具有选自SEQ ID NOs：41-59的氨基酸序列的hNGAL突变蛋白的结构同源物，所述结构同源物与所述hNGAL突变蛋白具有大于约60％，优选地大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于92％和最优选地大于95％的氨基酸序列同源性或序列同一性。
在一些实施方案中，本发明提供一种以约5nM或更低的KD量度的亲和力结合CD137的脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白与SEQ ID NO：42的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或更高的序列同一性。
在一些实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可在其N-或C-末端，优选地C-末端包含异源氨基酸序列，比如Strep II标签(SEQ ID NO：12)或某些限制性酶的切割位点序列，而不影响该脂质运载蛋白突变蛋白的生物活性(结合其靶标，如CD137)。
在一些实施方案中，可以引入脂质运载蛋白突变蛋白的其它修饰来调节突变蛋白的某些特征或者向突变蛋白中引入新的特征，所述调节突变蛋白的某些特征比如提高折叠稳定性、血清稳定性、蛋白抗性或水溶解性，或者降低聚集趋势。在一些实施方案中，修饰可导致所提供的突变蛋白的两个或更多(如2、3、4、5、6、7、8、9或10)个特征被调节。
例如，还可以使脂质运载蛋白突变蛋白的一个或多个氨基酸序列位置突变以引入新的反应基团，例如用于与其它化合物如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、生物素、肽或蛋白质缀合，或用于形成非天然存在的二硫键(linkage)。在一些情况下，缀合的化合物(例如PEG和HES)能够增加相应脂质运载蛋白突变蛋白的血清半衰期。
在一些实施方案中，脂质运载蛋白突变蛋白的反应基团可天然存在于其氨基酸序列中，比如天然存在于所述氨基酸序列中的半胱氨酸残基。在一些其它实施方案中，可通过诱变引入此类反应基团。在通过诱变引入此类反应基团的情况下，一种可能性为在适当位置的氨基酸突变为半胱氨酸残基。将半胱氨酸残基引入hTlc突变蛋白的氨基酸序列中的此类突变的示例性可能性包括hTlc的野生型序列(SEQ ID NO：1)的置换Thr 40→Cys、Glu 73→Cys、Arg 90→Cys、Asp 95→Cys和Glu 131→Cys。将半胱氨酸残基引入hNGAL突变蛋白的氨基酸序列中的此类突变的示例性可能性包括，在对应于hNGAL的野生型序列(SEQ ID NO：2)的序列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146或158的一个或多个序列位置处引入半胱氨酸残基。所产生的硫醇部分可以用于PEG化或HES化突变蛋白，例如，以便增加相应脂质运载蛋白突变蛋白的血清半衰期。
在一些实施方案中，为了给将上述化合物中的一个缀合至脂质运载蛋白突变蛋白提供合适的氨基酸侧链以作为新的反应基团，可以将人工氨基酸引入脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列。一般而言，这些人工氨基酸设计为更具反应性，从而促进与所需化合物缀合。这种可通过诱变(例如采用人工tRNA)引入的人工氨基酸为对乙酰基-苯丙氨酸。
在一些实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白以其N-末端或其C-末端融合至蛋白、蛋白结构域或肽，例如，抗体、信号序列和/或亲和标签。在一些其它实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白以其N-末端或其C-末端缀合至配偶体，所述配偶体为蛋白、蛋白结构域或肽，例如抗体、信号序列和/或亲和标签。
合适的融合配偶体的实例是诸如Strep-标签或Strep-标签II(Schmidt等，J MolBiol，1996)、c-myc-标签、FLAG-标签、His-标签或HA-标签的亲和标签或者诸如谷胱甘肽-S-转移酶的蛋白质，其允许容易检测和/或纯化重组蛋白。具有生色或荧光性质的蛋白(比如绿色荧光蛋白(GFP)或黄色荧光蛋白(YFP))也是本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的合适融合配偶体。一般而言，可以用任何合适的化学物质或酶标记本发明的脂质运载蛋白突变蛋白，所述化学物质或酶在化学、物理、光学或酶反应中直接或间接产生可检测化合物或信号。例如，可将荧光或放射标记缀合至脂质运载蛋白突变蛋白以产生作为可检测信号的荧光或X-射线。碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和β-半乳糖苷酶是催化显色反应产物形成的酶标记(同时是光学标记)的实例。一般而言，通常用于抗体(除了那些专门与免疫球蛋白的Fc部分中的糖部分一起使用的)的所有标记也可用于与本发明的脂质运载蛋白突变蛋白缀合。
在一些实施方案中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可与延长该突变蛋白血清半衰期的部分融合或缀合(这方面还参见国际专利公开文本No.WO 2006/056464，其中参考具有CTLA-4结合亲和力的人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(hNGAL)的突变蛋白描述了这种融合或缀合策略)。所述延长血清半衰期的部分可以是PEG分子、HES分子、诸如棕榈酸(Vajo和Duckworth，Pharmacol Rev，2000)的脂肪酸、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合肽或白蛋白结合蛋白或转铁蛋白，仅举几个例子。
在一些实施方案中，若将PEG用作缀合配偶体，则该PEG分子可以是取代的、未取代的、线性的或支链的。其也可以是活化的聚亚烷基衍生物。合适的化合物的实例是如国际专利公开文本No.WO 1999/64016、美国专利No.6,177,074或美国专利No.6,403,564中关于干扰素所述的PEG分子，或如对于其它蛋白例如PEG修饰的天冬酰胺酶、PEG-腺苷脱氨酶(PEG-ADA)或PEG-超氧化物歧化酶所述的PEG分子(Fuertges和Abuchowski，Journal ofControlled Release，1990)。此类聚合物(比如聚乙二醇)的分子量可以从约300至约70,000道尔顿，包括，例如，具有约10,000、约20,000、约30,000或约40,000道尔顿的分子量的聚乙二醇。此外，如例如美国专利No.6,500,930或6,620,413所述，基于延长血清半衰期的目的，可将例如HES的碳水化合物低聚物和聚合物与本发明的突变蛋白缀合。
在一些实施方案中，若将免疫球蛋白的Fc部分用于延长本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的血清半衰期的目的，则可采用可从Syntonix Pharmaceuticals，Inc.(MA，USA)商购获得的SynFusionTM技术。这种Fc-融合技术的应用允许产生更长效的生物药物，并可以例如由两个拷贝的连接至抗体Fc区的所述突变蛋白组成以改善药物动力学、溶解度和生产效率。
可用于延长脂质运载蛋白突变蛋白的血清半衰期的白蛋白结合肽的实例是例如如美国专利公开文本No.20030069395或Dennis等(2002)所述，具有Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys共有序列的那些，其中Xaa1是Asp、Asn、Ser、Thr或Trp；Xaa2是Asn、Gln、His、Ile、Leu或Lys；Xaa3是Ala、Asp、Phe、Trp或Tyr；和Xaa4是Asp、Gly、Leu、Phe、Ser或Thr。融合或缀合至脂质运载蛋白突变蛋白以延长血清半衰期的白蛋白结合肽可以是细菌白蛋白结合蛋白、抗体、包含结构域抗体的抗体片段(参见例如美国专利6,696,245)或具有白蛋白结合活性的脂质运载蛋白突变蛋白。细菌白蛋白结合蛋白的实例包括链球菌蛋白G((Konig和Skerra，J Immunol Methods，1998)。
在一些实施方案中，若白蛋白结合蛋白为抗体片段，其可以是结构域抗体。将结构域抗体(dAb)工程化以允许精确控制生物物理性质和体内半衰期，从而产生最佳安全性和有效性产品概况(profile)。结构域抗体例如可从Domantis Ltd.(Cambridge，UK，and MA，USA)商购获得。
在一些实施方案中，白蛋白本身(Osborn等，J Pharmacol Exp Ther，2002)或白蛋白的生物活性片段可用作本发明脂质运载蛋白突变蛋白的配偶体以延长血清半衰期。术语“白蛋白”包括所有的哺乳动物白蛋白，例如人血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠白蛋白。可以按照美国专利No.5,728,553或欧洲专利公开文本No.EP0330451和No.EP0361991中的描述重组产生所述白蛋白或其片段。相应地，可将重组的人白蛋白(如，来自NovozymesDelta Ltd.，Nottingham，UK的
Figure BPA0000299772270000581
)缀合或融合至本发明的脂质运载蛋白突变蛋白。
在一些实施方案中，若将转铁蛋白用作延长本发明的脂质运载蛋白突变蛋白血清半衰期的配偶体，可将该突变蛋白遗传地融合至非-糖基化转铁蛋白的N或C末端或者两者。非-糖基化转铁蛋白具有14-17天的半衰期，且转铁蛋白融合蛋白将类似地具有延长的半衰期。所述转铁蛋白载体还提供高生物利用度、生物分布和循环稳定性。这一技术可从BioRexis(BioRexis Pharmaceutical Corporation，PA，USA)商购获得。用于用作蛋白质稳定剂/半衰期延长配偶体的重组人转铁蛋白(DeltaFerrinTM)也可从Novozymes Delta Ltd.(Nottingham，UK)商购获得。
另一个延长本发明的脂质运载蛋白突变蛋白半衰期的选择是将长的、非结构性的、柔性富含甘氨酸的序列(例如具有约20至80个连续甘氨酸残基的聚甘氨酸)与突变蛋白的N-或C-末端融合。国际专利公开文本No.WO2007/038619中公开了这种方法，例如也称为“rPEG”(重组PEG)。
E.对CD137和PD-L1特异性的融合蛋白的示例性用途和应用
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白可通过双重靶向(dual-targeting)CD137和PD-L1产生协同作用。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白可通过CD137共刺激和PD-1/PD-L1通路阻断产生协同作用。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白可通过双重靶向CD137和PD-L1产生局部抗肿瘤作用。因此，本发明的融合蛋白在医学中存在许多可能的应用。
在一些实施方案中，本发明涵盖一种或多种本文公开的融合蛋白或一种或多种包含此类融合蛋白的组合物用于同时结合CD137和PD-L1的用途。
本发明还涉及一种或多种所述融合蛋白用于与CD137和/或PD-L1形成复合物的用途。
因此，在本发明的一方面，所提供的融合蛋白可用于检测CD137和PD-L1。此类用途可包括如下步骤：使一种或多种所述融合蛋白与怀疑含有CD137和/或PD-L1的样品在合适条件下接触，由此允许在融合蛋白与CD137和/或PD-L1之间形成复合物，并通过合适的信号检测该复合物。可检测的信号可以由如上文所述的标记产生，或通过由于结合(即复合物形成)本身而导致的物理特性的变化而产生。一个实例是表面等离子体共振，其数值在结合配偶体的结合期间发生改变，所述配偶体中的一者固定在表面上，例如金箔上。
本发明的融合蛋白还可用于分离CD137和/或PD-L1。这种用途可包括以下步骤：使一种或多种所述融合蛋白与猜测含有CD137和/或PD-L1的样品在合适条件下接触，由此允许在所述融合蛋白与CD137和/或PD-L1之间形成复合物，并从所述样品中分离所述复合物。
在一些方面，本发明提供包含一种或多种根据本发明的融合蛋白的诊断和/或分析试剂盒。
除了其在诊断中的用途，再一方面，本发明考虑包含一种或多种本发明的融合蛋白和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
此外，在一些实施方案中，本发明提供同时结合CD137和/或PD-L1的融合蛋白，用作诸如抗癌剂和/或抗感染剂和免疫调节剂。在一些实施方案中，设想将本发明的融合蛋白用在预防、改善或治疗诸如各种癌症、包括PD-L1阳性癌症的人疾病的方法中。因此，还提供了预防、改善或治疗有此需要的受试者中诸如各种癌症、包括PD-L1阳性癌症的人疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的一种或多种本发明的融合蛋白。
可采用本发明的融合蛋白治疗的癌症的实例包括：肝癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、乳腺癌、肺癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、肾癌、子宫癌、卵巢癌、结肠直肠癌、结肠癌、直肠癌、肛门区癌症、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌(carcinoma)、子宫内膜癌(carcinoma)、宫颈癌(carcinoma)、阴道癌(carcinoma)、外阴癌(carcinoma)、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌(carcinoma)、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体瘤、卡波西(Kaposi)肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌，由环境诱导的包括那些由石棉诱导的癌症，血液恶性肿瘤，包括例如多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤/原发性纵隔B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴样白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特(Burkitt)淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤、外膜(mantle)细胞淋巴瘤、急性淋巴母细胞性白血病、蕈样霉菌病(mycosis fungoides)、间变性大细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、前体T淋巴母细胞性淋巴瘤和所述癌症的任意组合。在一些实施方案中，本发明还用于治疗转移性癌症。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白可同时靶向其中表达PD-L1的肿瘤细胞，并活化此类肿瘤细胞附近的宿主免疫系统的淋巴细胞。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白可增加靶向的抗肿瘤T细胞活性、增强抗肿瘤免疫和/或对肿瘤生长具有直接抑制作用，由此产生协同抗肿瘤结果。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白可活化肿瘤微环境中的免疫应答。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白可例如通过局部抑制致癌基因活性并诱导淋巴细胞活化，来降低效应子淋巴细胞对健康细胞的副作用，即脱靶毒性。
在一些实施方案中，本发明涵盖本发明的融合蛋白或包含所提供的融合蛋白的组合物用于在PD-L1阳性肿瘤细胞附近诱导局部淋巴细胞应答的用途。因此，在一些实施方案中，本发明提供在PD-L1阳性肿瘤细胞附近诱导局部淋巴细胞应答的方法，所述方法包括应用一种或多种本发明的融合蛋白或一种或多种包含此类融合蛋白的组合物。“局部(的)”意指在同时经由CD137结合T细胞并接合PD-L1阳性肿瘤细胞后，T细胞在PD-L1阳性细胞附近产生细胞因子，特别是IL-2和/或IFNγ。此类细胞因子反映了T细胞的活化，并随后能够通过吸引其它杀伤细胞(比如T细胞或NK细胞)来直接或间接杀死PD-L1阳性细胞。
在一些实施方案中，本发明涵盖本发明的融合蛋白或包含此类融合蛋白的组合物用于共刺激T细胞和/或活化CD137下游信号传导通路的用途。优选地，当接合其中表达PD-L1的肿瘤细胞时，所提供的融合蛋白共刺激T细胞和/或活化CD137下游信号传导通路。因此，本发明提供，优选地当接合其中表达PD-L1的肿瘤细胞时，诱导T淋巴细胞增殖和/或活化CD137下游信号传导通路的方法，所述方法包括应用一种或多种本发明的融合蛋白和/或一种或多种包含此类融合蛋白的组合物。
在一些实施方案中，本发明涵盖本发明的融合蛋白或包含此类融合蛋白的组合物用于在T细胞上诱导CD137聚集和活化以及将此类T细胞导向其中表达PD-L1的肿瘤细胞的用途。
对本领域技术人员而言，经审查以下的实施例及其附图(其并非意图是限制性的)，本发明的另外的目的、优点和特征将变得显而易见。因此，应当理解的是，虽然本发明通过示例性实施方案以及任选的特征进行特定的公开，但本领域技术人员可以采取本文所公开于其中的公开内容的修饰及变化，且认为这样的修饰及变化在本发明的范围内。
F.对CD137和PD-L1特异性的示例性融合蛋白的生产
在一些实施方案中，本发明提供包含编码所提供的融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子(DNA和RNA)。在一些实施方案中，本发明涵盖含有所提供的核酸分子的宿主细胞。由于遗传密码的简并性允许某些密码子被指定同一氨基酸的其它密码子取代，因此本发明不限于编码如本文所述融合蛋白的特定核酸分子，而是涵盖包含编码功能融合蛋白的核苷酸序列的所有核酸分子。在这方面，本发明还涉及编码所提供的融合蛋白的核苷酸序列。
核酸分子，例如DNA，如果它包含含有关于转录和/或翻译调节的信息的序列元件，并且这样的序列“可操作地连接”至编码所述蛋白的核苷酸序列，则被称为“能够表达核酸分子”或“能够允许表达核苷酸序列”。可操作的连接是这样的连接：在所述连接中，调节序列元件和待表达的序列以能够进行基因表达的方式连接。基因表达所必需的调节区域的确切性质可能因物种而异，但是通常这些区域包括启动子，所述启动子在原核生物中含有启动子本身(即引导转录起始的DNA元件)以及当转录成RNA时将发出翻译起始信号的DNA元件。这样的启动子区域通常包括涉及转录和翻译起始的5’非编码序列，比如原核生物中的-35/-10盒和Shine-Dalgamo元件或真核生物中的TATA盒、CAAT序列和5′-加帽元件。这些区域还可以包括增强子或阻遏子元件以及用于将天然蛋白靶向到宿主细胞的特定区室的翻译信号和前导序列。
此外，所述3’非编码序列可能含有涉及转录终止、聚腺苷酸化等的调节元件。然而，如果这些终止序列在特定宿主细胞中不是令人满意的功能性的，则它们可能被该细胞中功能性的信号替代。
因此，本发明的核酸分子可以“可操作地连接”至一个或多个调节序列(比如启动子序列)以允许该核酸分子表达。在一些实施方案中，本发明的核酸分子包括启动子序列和转录终止序列。合适的原核启动子例如为tet启动子、lacUV5启动子或T7启动子。可用于在真核细胞中表达的启动子的实例是SV40启动子或CMV启动子。
在一些实施方案中，编码本申请中所公开的脂质运载蛋白突变蛋白的核酸分子可以与编码本发明的免疫球蛋白的另一个核酸分子“可操作地连接”，以允许本文公开的融合蛋白的表达。
在一些实施方案中，所提供的方法可包括使至少一个编码成熟hTlc的核酸分子在核苷酸三联体处经受诱变，以获得包含在所提供的融合蛋白中的脂质运载蛋白突变蛋白，所述核苷酸三联体编码一个或多个对应于hTlc的线性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153的位置。在一些实施方案中，所提供的方法可包括使至少一个编码成熟hNGAL的核酸分子在核苷酸三联体处经受诱变，以获得包含在所提供的融合蛋白中的脂质运载蛋白突变蛋白，所述核苷酸三联体编码一个或多个对应于hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO：2)的位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132和134的位置。在一些实施方案中，所提供的方法可包括使至少一个编码成熟hNGAL的核酸分子在核苷酸三联体处经受诱变，以获得包含在所提供的融合蛋白中的脂质运载蛋白突变蛋白，所述核苷酸三联体编码一个或多个对应于hNGAL的线性多肽序列(SEQID NO：2)的位置20、25、28、33、36、40-41、44、49、52、59、68、70-73、77-82、87、92、96、98、100、101、103、122、125、127、132和134的位置。
此外，对于包含在融合蛋白中的本发明的hTlc突变蛋白或hNGAL突变蛋白，在一些实施方案中，可以分别移除Cys 61和Cys 153或Cys 76和Cys 175之间天然存在的二硫键。因此，此类突变蛋白可在具有减少的氧化还原环境(redox milieu)的细胞区室中，例如在革兰氏阴性细菌的细胞质中产生。
进一步对于包含在融合蛋白中的本发明所提供的hTlc突变蛋白或hNGAL突变蛋白，本发明还包括编码此类突变蛋白的核酸分子，在一些实施方案中，其在实验性诱变的指定序列位置之外可包含一个或多个另外的突变。这样的突变通常是可容忍的或甚至被证明是有利的，例如，如果它们有助于提高脂质运载蛋白突变蛋白和/或融合蛋白的折叠效率、血清稳定性、热稳定性或配体结合亲和力的话。
在一些实施方案中，所提供的核酸分子还可以是载体或任何其它种类的克隆载体(vehicle)的一部分，所述克隆载体例如质粒、噬菌粒、噬菌体、杆状病毒、粘粒或人造染色体。
在一些实施方案中，所提供的核酸分子可包含在噬菌粒中。如本上下文所使用的，噬菌粒载体表示编码温和噬菌体(比如M13或f1)的基因间区域的载体，或其融合至目标cDNA的功能部分。例如，在一些实施方案中，经由此类提供的噬菌粒载体和适当的辅助噬菌体(如M13K07、VCS-M13或R408)超感染细菌宿主细胞后，产生完整的噬菌体颗粒，由此使所编码的异源cDNA能够与其相应的噬菌体表面上展示的多肽物理偶联(Lowman，Annu RevBiophys Biomol Struct，1997；Rodi和Makowski，Curr Opin Biotechnol，1999)。
根据不同的实施方案，除了上述调节序列以及编码如本文所述的融合蛋白的核酸序列之外，克隆载体可以包含来源于与用于表达的宿主细胞相容的物种的复制和控制序列，以及在转化或转染的细胞上赋予可选表型的选择标记物。大量的合适的克隆载体是本领域已知的，并且是可商购获得的。
在一些实施方案中，本发明还涉及采用基因工程的方法从编码融合蛋白或其中任何亚基的核酸开始生产本发明的融合蛋白的方法。在一些实施方案中，该方法可以在体内进行，其中所提供的融合蛋白可以例如在细菌或真核宿主生物体中产生，然后从该宿主生物或其培养物中分离。也可以例如使用体外翻译系统在体外产生本发明的融合蛋白。
当在体内产生融合蛋白时，可采用本领域熟知的重组DNA技术将编码此类蛋白的核酸引入到合适的细菌或真核宿主生物体中。在一些实施方案中，可以将编码如本文所述的融合蛋白的DNA分子(例如SEQ ID NOs：138-144)，特别是含有此类融合蛋白的编码序列的克隆载体转化至能够表达该基因的宿主细胞中。可以采用标准方法进行转化。因此，本发明还涉及含有本文所述的核酸分子的宿主细胞。
在一些实施方案中，所转化的宿主细胞可在适用于编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列表达的条件下培养。在一些实施方案中，宿主细胞可以是原核的诸如大肠杆菌(Escherichia coli)(E.coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，或真核的诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、SF9或High5昆虫细胞、永生化哺乳动物细胞系(如HeLa细胞或CHO细胞)或原代哺乳动物细胞。
在一些实施方案(其中本发明的(包括包含在本文所公开的融合蛋白中的)脂质运载蛋白突变蛋白包括分子内二硫键)中，可以优选使用适当的信号序列将新生蛋白引导至具有氧化还原环境的细胞区室。这样的氧化环境可以由革兰氏阴性细菌(诸如大肠杆菌)的周质提供，在革兰氏阳性细菌的细胞外环境中，或在真核细胞的内质网的内腔中，并通常有利于结构二硫键的形成。
在一些实施方案中，还可以在宿主细胞(优选大肠杆菌)的胞质溶胶中产生本发明的融合蛋白。在这种情况下，所提供的融合蛋白能够以可溶性的和折叠的状态直接获得，或者以包涵体的形式被回收，然后在体外复性。另一个选择是使用特定宿主菌株，所述菌株具有氧化细胞内环境，这由此可允许在胞质溶胶中形成二硫键(Venturi等，J Mol Biol，2002)。
在一些实施方案中，如本文所述的本发明的融合蛋白不一定是通过使用遗传工程全部或部分地生成或产生的。而是，此类蛋白还可通过许多常规和熟知的技术中的任意技术获得，比如普通有机合成策略、固相相关合成技术、可商购获得的自动合成仪或通过体外转录或翻译。例如有可能的是，使用分子建模识别有前途的融合蛋白或包含在此类融合蛋白中的脂质运载蛋白突变蛋白，在体外合成，并且研究对目标靶标的结合活性。用于蛋白质的固相和/或溶液相合成的方法是本领域熟知的(参见例如Bruckdorfer等，Curr PharmBiotechnol，2004)。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白可以通过使用本领域技术人员已知的已充分建立的方法的体外转录/翻译产生。
在一些进一步的实施方案中，本文所述的融合蛋白还可通过单独的常规重组技术或与常规合成技术结合来制备。
此外，在一些实施方案中，根据本发明的融合蛋白可通过将单独的亚基(如免疫球蛋白)与包含在融合蛋白中的突变蛋白缀合在一起来获得。可以例如采用常规方法通过所有形式的共价或非共价连接来实现此类缀合。
本领域技术人员将理解可用于制备本发明所预期的、但其蛋白质或核酸序列未在本文中明确公开的融合蛋白的方法。作为概述，氨基酸序列的这种修饰包括如单个氨基酸位置的定向诱变，以通过引入某些限制性酶的切割位点来简化蛋白基因或其部分的亚克隆。此外，还能够引入这些突变以进一步提高融合蛋白对其靶标(例如CD137和PD-L1)的亲和力。此外，若需要，可以引入突变以调节所述蛋白的一个或多个特征，比如，以改善折叠稳定性、血清稳定性、蛋白抗性或水溶解性或降低聚集倾向。
V.实施例
实施例1：代表性融合蛋白的表达和分析
在该实施例中，将PD-L1特异性抗体与SEQ ID NO：42的CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白经由连接子(比如SEQ ID NO：13的非结构性(G4S)3连接子)融合在一起以同时接合PD-L1和CD137，产生代表性的抗体-脂质运载蛋白突变蛋白融合蛋白，所述PD-L1特异性抗体具有SEQ ID NO：86提供的重链可变结构域，或包含SEQ ID NO：77的重链可变结构域，或包含GFSLSNYD(HCDR1，SEQ ID NO：60)、IWTGGAT(HCDR2，SEQ ID NO：61)、VRDSNYRYDEPFTY(HCDR3；SEQ ID NO：62)的CDR，和由SEQ ID NO：87提供的轻链，或包含SEQ ID NO：82的重链可变结构域，或包含QSIGTN(LCDR1，SEQ ID NO：63)、YAS(LCDR2)、QQSNSWPYT(LCDR3；SEQ IDNO：64)的CDR。所产生的不同形式如图1所示。例如，通过将一个或多个SEQ ID NO：42的脂质运载蛋白突变蛋白与抗体的四个末端中的一个或多个融合产生比如SEQ ID NOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQ ID NOs：92和87、SEQ ID NOs：86和93、SEQ ID NOs：94和87、和SEQID NOs：90和91的此类融合蛋白，所述抗体包含SEQ ID NO：86提供的重链，或包含SEQ IDNO：77的重链可变结构域，或包含GFSLSNYD(HCDR1，SEQ ID NO：60)、IWTGGAT(HCDR2，SEQ IDNO：61)、VRDSNYRYDEPFTY(HCDR3；SEQ ID NO：62)的CDR，和SEQ ID NO：87提供的轻链，或包含SEQ ID NO：82的重链可变结构域，或包含QSIGTN(LCDR1，SEQ ID NO：63)、YAS(LCDR2)、QQSNSWPYT(LCDR3；SEQ ID NO：64)的CDR。产生的融合蛋白可以是CD137二价的(如，如图1A-1D所示)或CD137四价的(如，如图1E-1H所示)，或对CD137具有甚至更高的价(如，如图1I所示)。
在本实施例中所述的PD-L1特异性抗体以及全部抗体脂质运载蛋白突变蛋白融合蛋白具有工程化的IgG4骨架，所述IgG4骨架包含S228P突变以在体外和体内使IgG4半抗体交换最小化(Silva等，J Biol Chem，2015)。在本文所述全部抗体和融合蛋白中还可存在IgG4骨架中的另外突变，包括突变F234A、L235A、M428L、N434S、M252Y、S254T和T256E中的任一个或多个。还可引入F234A和L235A突变以降低ADCC和ADCP(Glaesner等，Diabetes MetabRes Rev，2010)。还可引入M428L和N434S突变，或M252Y、S254T和T256E突变以延长血清半衰期(Dall′Acqua等，J Biol Chem，2006；Zalevsky等，Nat Biotechnol，2010)。所有抗体表达均不含羧基末端赖氨酸，以避免异质性。
此外，如图1J-1K所示，通过将一个或多个SEQ ID NO：42的CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白经由连接子(如SEQ ID NO：13的非结构性(G4S)3连接子)与SEQ ID NO：30提供的抗体的Fc区的C-末端融合得到单特异性脂质运载蛋白突变蛋白Fc融合蛋白。SEQ IDNOs：88-89中提供了得到的构建体。
本发明还包含不对称的抗体-脂质运载蛋白突变蛋白融合形式，其中例如，该抗体的一条轻链可以与脂质运载蛋白突变蛋白融合而另一条轻链未融合。
通过基因合成并克隆至哺乳动物表达载体产生所述融合蛋白的构建体。然后将融合蛋白的构建体在Expi293FTM细胞(Life Technologies)中瞬时表达。通过应用
Figure BPA0000299772270000671
蛋白A亲和色谱柱(Applied Biosystems)的HPLC(Agilent Technologies)测量细胞培养基中融合蛋白的浓度。融合蛋白的效价汇总于表1。
采用蛋白A色谱，然后通过磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的尺寸排阻色谱(SEC)纯化融合蛋白。SEC纯化后，将包含单体蛋白的级分合并采用分析级SEC再次分析。
表1：瞬时表达效价
Figure BPA0000299772270000672
Figure BPA0000299772270000681
实施例2：融合蛋白的表达
通过基因合成(包括密码子优化)并克隆至哺乳动物表达载体产生示例性融合蛋白的构建体。然后将融合蛋白的构建体在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中稳定表达。通过具有蛋白-A传感器的Octet(ForteBio，Pall Corp.)测量并采用人IgG1标准品定量细胞培养基中融合蛋白的浓度。融合蛋白的效价汇总于表2。数据表明，融合蛋白的几何结构(geometry)可对产物收率和细胞生产力有影响。
表2：稳定表达效价
Figure BPA0000299772270000682
实施例3：通过表面等离子体共振(SPR)测定融合蛋白对PD-L1或CD137的结合
采用Biacore 8K或Biacore T200(GE Healthcare)通过表面等离子体共振(SPR)测定示例性融合蛋白与huPD-L1-His或huCD137-His(具有C-末端聚组氨酸标签的人PD-L1或人CD137，R&D Systems)的结合动力学和亲和力。
采用标准胺化学将抗-人IgG Fc抗体(GE Healthcare)固定在CM5传感器芯片上：使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化芯片上的羧基。随后，以5μL/min的流速施加10mM醋酸钠(pH 5.0)中浓度为25μg/mL的抗-人IgG Fc抗体溶液(GE Healthcare)，直至达到6000-10000共振单位(RU)的固定水平。通过使1M乙醇胺溶液通过表面来封闭剩余未反应的NHS-酯。参考通道以类似的方式处理。然后，以10μL/min的流速在芯片表面用抗-人IgG Fc抗体捕获以0.25μg/ml或0.5μg/mL存在于HBS-EP+缓冲液中的测试融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQ ID NOs：92和87、SEQ ID NOs：86和93、SEQ ID NOs：94和87、SEQ ID NOs：90和91、SEQ ID NO：88和SEQ IDNO：89)达180s。每次捕获步骤后，洗涤针(needle)。作为对照，还测试了抗-PD-L1抗体，包括参照抗体(SEQ ID NOs：26和27)和包含在融合蛋白中的抗体(SEQ ID NOs：86和87)，和参照抗-CD137抗体(SEQ ID NOs：28和29)。
对于亲和力测定，在HBS-EP+缓冲液中制备huPD-L1-His(10nM、5nM和2.5nM)或huCD137-His(900nM、300nM和100nM)的稀释液，并将其施加于制备的芯片表面。采用接触时间为180s、解离时间为900s和流速为30μL/min来实施结合测定。所有的测量均在25℃下进行。通过注入3M MgCl2达120s来实现芯片表面的再生。在蛋白质测量之前，为了调节目的实施三次启动循环。用Biacore T200评估软件(V 2.0)或Biacore 8K评估软件(V1.1.1)评估数据。使用双重参照并使用1∶1的结合模型来拟合原始数据。
将测定的代表性融合蛋白的kon、koff和得到的平衡解离常数(KD)汇总于表3。全部双特异性融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQ ID NOs：92和87、SEQ IDNOs：86和93、SEQ ID NOs：94和87、和SEQ ID NOs：90和91)均以亚纳摩尔至低纳摩尔的亲和力结合PD-L1以及CD137。单特异性CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白-Fc融合蛋白(SEQID NO：88和SEQ ID NO：89)仅以低纳摩尔的亲和力结合CD137。
表3：通过SPR测定的融合蛋白的动力学常数和亲和力
Figure BPA0000299772270000701
实施例4：在酶联免疫吸附试验(ELISA)中融合蛋白对PD-L1或CD137的结合
采用酶联免疫吸附试验(ELISA)来测定示例性融合蛋白与人PD-L1和猕猴PD-L1的结合效力。
将PBS中1μg/mL浓度的重组huPD-L1-His或cyPD-L1-His(具有C-末端聚组氨酸标签的人或猕猴PD-L1，R&D Systems or Sino Biologics)在微量滴定板上于4℃下涂覆过夜。用PBS-0.05％T(补充有0.05％(v/v)吐温20的PBS)洗涤后，将板用在PBS-0.1％T(补充有0.1％(v/v)吐温20的PBS)中的2％BSA(w/v)在室温下封闭1小时。用100μL PBS-0.05％T洗涤5次后，将不同浓度的示例性融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQID NOs：92和87、SEQ ID NOs：86和93、SEQ ID NOs：94和87、SEQ ID NOs：90和91)、CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白Fc融合蛋白(SEQ ID NOs：88和SEQ ID NO：89)和抗-PD-L1抗体(SEQ ID NOs：26和27、SEQ ID NOs：86和87)添加至孔并在室温下温育1h，随后是另一洗涤步骤。用在PBS-0.1％T-2％BSA中1∶5000稀释的抗人IgG Fc-HRP(Jackson Laboratory)温育，检测研究中的结合的分子。在另外的洗涤步骤之后，向每个孔中加入荧光HRP底物(QuantaBlu，Thermo)，并使用荧光酶标仪检测荧光强度。
还采用相同的ELISA设置测量了融合蛋白与CD137的结合效力，其中将huCD137-His(具有C-末端聚组氨酸标签的人CD137，R&D Systems)或cyCD137-Fc(C-末端融合至Fc的猕猴CD137)涂覆在微量滴定板上。类似地滴定测试试剂和经由抗-NGAL-HRP检测结合的试剂。
图2A-2D中描绘了示例性实验的结果，及由1∶1结合S形拟合所产生的拟合曲线，其中EC50值和最大信号为自由参数，斜率固定为一(unity)。所得到的EC50值在表4中提供。
对于所提供的的融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQ IDNOs：92和87、SEQ ID NOs：86和93、SEQ ID NOs：94和87、SEQ ID NOs：90和91、SEQ ID NO：88、和SEQ ID NO：89)对两个人靶标所观察到的EC50值都与测试的PD-L1抗体(SEQ ID NOs：26和27的参照PD-L1抗体以及包含在融合蛋白中的SEQ ID NOs：86和87的PD-L1抗体)和/或包含在融合蛋白中的CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO：42)非常相似或相当。
全部测试的融合蛋白均显示出以与参照PD-L1抗体(SEQ ID NOs：26和27)或包含在融合蛋白中的PD-L1抗体(SEQ ID NOs：86和87)相当的EC50值与猕猴PD-L1的交叉反应性。仅对CD137四价的融合蛋白(SEQ ID NOs：94和87、SEQ ID NOs：90和91、和SEQ ID NO：88)显示出以与人CD137相当的水平与猕猴CD137的交叉反应性，即以在与相应的对人CD137的EC50相同范围内的EC50值结合猕猴CD137。
表4：PD-L1或CD137结合的ELISA数据
Figure BPA0000299772270000711
Figure BPA0000299772270000721
实施例5：在ELISA中融合蛋白同时结合PD-L1和CD137
为了证明示例性融合蛋同时结合PD-L1和CD137，使用双重结合的ELISA形式。
将PBS中的重组huPD-L1-His(R&D Systems)(1μg/mL)在4℃下在微量滴定板上涂覆过夜。在每个温育步骤后，用100μL PBS-0.05％T洗涤板5次。将板用在PBS-0.1％T中的2％BSA(w/v)在室温下封闭1小时，然后再次洗涤。将不同浓度的测试融合蛋白加入到孔中并在室温下温育1小时，随后进行洗涤步骤。随后，将生物素化的huCD137-His(huCD137-His-Bio，Sino Biological)以在PBS-0.1％T-2％BSA中1μg/mL的恒定浓度加入达1小时。洗涤后，向孔中加入在PBS-0.1％T-2％BSA中ExtrAvidin-HRP(Sigma-Aldrich)的1∶5000的稀释液并温育1h。在另外的洗涤步骤之后，向每个孔中加入荧光HRP底物(QuantaBlu，Thermo)，并使用荧光酶标仪检测荧光强度。
同样采用反向设置来测试示例性融合蛋白的双重结合，其中将重组1μg/mlhuCD137-His(R&D Systems)涂布在微量滴定板上并通过添加生物素化的huPD-L1-His(R&DSystems)来检测结合的融合蛋白。
图3A和3B中示出了融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQ IDNOs：92和87、SEQ ID NOs：86和93、SEQ ID NOs：94和87、和SEQ ID NOs：90和91)的双重结合数据，及由1∶1结合S形拟合(sigmoidal binding fit)所产生的拟合曲线，其中EC50值和最大信号为自由参数，斜率固定为一(unity)。EC50值汇总于表5。全部双特异性融合蛋白均示出了明确的结合信号，表明该融合蛋白能够同时接合PD-L1和CD137。该数据进一步表明将CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白融合至PD-L1-特异性抗体的C-末端可比融合至N-端更有利。
表5：PD-L1和CD37的同时靶标结合的ELISA数据
Figure BPA0000299772270000731
实施例6：结合表达人和猕猴CD137和PD-L1的细胞的融合蛋白的流式细胞术分析
通过流式细胞术评估融合蛋白对表达人和猕猴PD-L1的细胞和表达人和猕猴CD137的细胞的靶标特异性结合。
采用Flp-In系统(Life technologies)根据制造商的说明用人PD-L1、猕猴PD-L1、人CD137、猕猴CD137或模拟对照稳定转染CHO细胞。
在补充有10％胎牛血清(Biochrom)和500μg/ml潮霉素B(Roth)的Ham′s F12培养基(Life technologies)中维持转染的CHO细胞。根据制造商的说明(37℃，5％CO2气氛)，在细胞培养瓶中培养细胞。
对于流式细胞术分析，用融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQID NOs：92和87、SEQ ID NOs：86和93、SEQ ID NOs：94和87、SEQ ID NOs：90和91、SEQ IDNO：88、和SEQ ID NO：89)温育相应的细胞系，并采用荧光标记的抗-人IgG抗体在如下所述的FACS分析检测：
将每孔5×104个细胞在含有5％胎牛血清的冰冷PBS(PBS-FCS)中温育1h。向细胞中加入融合蛋白和对照抗体的稀释系列，并在冰上温育1h。将细胞用PBS洗涤两次，然后用山羊抗-hIgG Alexa647标记的抗体在冰上温育30min。随后将细胞洗涤并用iQue流式细胞仪(Intellicyte Screener)分析。采用非线性回归(共享如下，斜率＝1)，使用Graphpad软件绘制并拟合平均几何荧光信号。
图4描绘了融合蛋白结合人与猕猴PD-L1与CD137的能力。双特异性融合蛋白(SEQID NOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQ ID NOs：92和87、SEQ ID NOs：86和93、SEQ IDNOs：94和87、和SEQ ID NOs：90和91)与表达人和猕猴PD-L1的细胞的结合亲和力(EC50)在一位数的纳摩尔范围内，证明了完全猕猴(cyno)-交叉反应性(汇总于表6)。融合蛋白与表达人CD137的细胞的结合亲和力在低纳摩尔范围内。测试的融合蛋白与猕猴CD137(SEQ IDNOs：94和87、SEQ ID NOs：90和91、和SEQ ID NO：88)完全交叉反应，以与相应与人CD137(SEQ ID NOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、和SEQ ID NO：89)的结合亲和力相比下降6-13倍的亲和力结合猕猴CD137，或者不结合猕猴CD137(SEQ ID NO：92和87和86和93)。无融合蛋白结合至模拟转染的细胞。
表6：融合蛋白与表达人和猕猴PD-L1或CD137的细胞的结合亲和力
Figure BPA0000299772270000741
实施例7：融合蛋白与PD-L1阳性肿瘤细胞的结合亲和力
通过流式细胞术评估融合蛋白与表达PD-L1的肿瘤细胞的结合。
在37℃于湿润的5％CO2气氛下，在补充有10％FCS的RPMI1640(Lifetechnologies)中维持表达PD-L1的结直肠癌细胞系RKO。
对于流式细胞术分析，用融合蛋白温育RKO细胞，并采用荧光标记的抗-人IgG抗体如实施例6所述检测。
图5描绘了融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQ ID NOs：92和87、SEQ ID NOs：86和93、SEQ ID NOs：94和87、和SEQ ID NOs：90和91)结合PD-L1阳性肿瘤细胞的能力，并将相应的结合亲和力(EC50)汇总于表7。融合蛋白与表达PD-L1的RKO细胞的结合亲和力在低纳摩尔或亚纳摩尔范围内，与包含在融合蛋白中的PD-L1抗体(SEQ IDNOs：86和87)相当。
表7：融合蛋白与PD-L1阳性肿瘤细胞的结合亲和力
Figure BPA0000299772270000751
实施例8：通过SPR测定CD137L与融合蛋白之间在结合CD137中的竞争
采用SPR测定研究人CD137L(huCD137L-His，R&D Systems)与示例性融合蛋白对人CD137的竞争。在25℃下于Biacore T200仪器(GE Healthcare)上进行竞争测定。
将BiotinCAPture试剂(GE Healthcare)以50μg/ml的浓度和2μL/min的流速在CAP传感芯片上固定300s。参照通道以类似的方式处理。在另一通道以1μg/mL的浓度和5μL/min流速在芯片表面捕获生物素化的huCD137-Fc(R&D systems)300s。
为了分析测试融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQ ID NOs：92和87、SEQ ID NOs：86和93、SEQ ID NOs：90和91、SEQ ID NO：88、和SEQ ID NO：89)是否与CD137L竞争结合CD137，将运行缓冲液(HBS-EP+缓冲液)或500nM huCD137L-His以30μL/min的流速施加至芯片表面达180s。随后，将测试融合蛋白以HBS-EP+缓冲液中1μM的固定浓度施加至制备的芯片表面。采用接触时间为180s、解离时间为15s和流速为30μL/min来实施结合测定。作为对照，以相同参数注射缓冲液。通过以10μL/min的流速注入6M Gua-HCl，0，25MNaOH达120s，随后是采用H2O的另外的洗涤步骤(120s，10μl/min)来实现芯片表面的再生。
图6中提供了融合蛋白SEQ ID NOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQ ID NOs：92和87、SEQ ID NOs：86和93、SEQ ID NOs：90和91、SEQ ID NO：88、和SEQ ID NO：89所得传感图的相关片段的代表性实例。采用实茎箭头(arrow with a solid stem)标记了相应融合蛋白与单独huCD137-Fc结合的SPR踪迹。采用虚茎箭头(arrow with a broken stem)标记了融合蛋白与已用huCD137L-His饱和的huCD137-Fc的结合的SPR踪迹。数据表明，在存在huCD137L的情况下，全部融合蛋白均结合huCD137，但是与在不存在CD137L的情况下它们与CD137的结合相比，具有轻微减弱的信号。这表明，所测试的融合蛋白可能在一定程度上受CD137L与CD137的结合空间阻碍。融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQID NOs：92和87、SEQ ID NOs：86和93、SEQ ID NOs：90和91、SEQ ID NO：88和SEQ ID NO：89)的这种结合行为与抗-CD137抗体SEQ ID NOs：28和29的结合行为相似。
实施例9：采用ELISA测定融合蛋白与PD-L1在结合PD-1中的竞争
为了证明融合蛋白抑制PD-1和PD-L1之间相互作用的能力，采用竞争性ELISA形式(format)。
将PBS中的重组huPD-1-His(Acrobiosystems)(1μg/mL)在4℃下在微量滴定板上涂覆过夜。在每个温育步骤后，用100μL PBS-0.05％T(补充有0.05％(v/v)吐温20的PBS)洗涤板5次。将板用在PBS-0.1％T(补充有0.1％(v/v)吐温20的PBS)中的2％BSA(w/v)在室温下封闭1小时，然后再次洗涤。将不同浓度的融合蛋白与15nM的重组huPD-L1-Fc(R&Dsystems)混合作为示踪剂并在室温下温育1小时。将融合蛋白与示踪剂的混合物添加至板中并在室温下温育20min，随后是采用100μL PBS-0.05％T的5次洗涤步骤。随后向孔中加入山羊-抗人IgG-Fc HRP(Jackson)的1∶5000的稀释液并温育1h。在另外的洗涤步骤之后，向每个孔中加入荧光HRP底物(QuantaBlu，Thermo)，并使用荧光酶标仪检测荧光强度。
图7中示出了示例性融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQ IDNOs：92和87、SEQ ID NOs：86和93、和SEQ ID NOs：90和91)的竞争数据，及由1∶1结合S形拟合所产生的拟合曲线，其中IC50值和最大信号为自由参数，斜率固定为一(unity)。IC50值汇总于表9。全部双特异性融合蛋白均以与抗体构建块(SEQ ID NOs：86和87)和参照PD-L1抗体(SEQ ID NOs：26和27)相当的IC50值明确抑制PD-1/PD-L1相互作用。
表8：融合蛋白与PD-L1竞争结合PD-1
SEQ ID NO IC<sub>50</sub>[nM]
90和87 2.3
86和91 3.0
92和87 3.4
86和93 3.2
94和87 2.4
90和91 2.8
86和87 3.5
26和27 3.8
实施例10：采用CD137生物测定的PD-L1依赖性T细胞共刺激
采用商购可得的双重稳定转染的表达CD137和luc2基因(萤火虫荧光素的人源化版本)的Jurkat细胞系评估在PD-L1存在下所选择的融合蛋白诱导CD137信号传导通路活化的潜力，其中NFκB应答元件驱动luc2表达。在该生物测定中，CD137接合引起了CD137细胞内信号传导，从而导致NFκB-介导的发光。
将表达PD-L1的结直肠癌细胞系RKO如实施例7所述培养。测定的前一天，将RKO细胞以每孔1.25x 104个细胞铺板，并在37℃下在湿润的5％CO2氛围中贴壁过夜。
第二天，将3.75x 104个NF-kB-Luc2/CD137 Jurkat细胞加入各孔，随后加入不同浓度(通常范围为0.001nM至5nM)的融合蛋白或参照CD137抗体(SEQ ID NOs：28和29)。将板用透气密封膜覆盖，并在37℃下于湿润的5％CO2氛围中温育。4h后，将30μL Bio-GloTM试剂加入各孔，并采用光度计(PHERAstar)定量生物发光信号。采用GraphPad
Figure BPA0000299772270000782
进行四参数逻辑曲线分析，以计算EC50值(共享如下，固定斜率)，EC50值汇总于表9。为了证明融合蛋白与CD137接合的PD-L1依赖性，在不存在RKO细胞的情况下平行进行相同的实验。测定一式三份地进行。
图8A-8D描绘了代表性实验的结果。数据证明，所有测试的融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQ ID NOs：92和87、和SEQ ID NOs：86和93)均诱导强的CD137介导的T细胞共刺激。图8B和8D表明通过融合蛋白的CD137活化是PD-L1依赖性的，因为在不存在表达PD-L1的肿瘤细胞的情况下，没有检测到NF-kB-Luc2/CD137 Jurkat细胞的活化。相对地，无论靶细胞是否存在，参照抗-CD137mAb(SEQ ID NOs：28和29)显示出CD137介导的T细胞共刺激。
表9：采用CD137生物测定评估T细胞活化
Figure BPA0000299772270000781
Figure BPA0000299772270000791
实施例11：采用人外周血单核细胞(PBMC)评估T细胞活化
采用T细胞测定来评估所选择的融合蛋白共刺激T细胞应答以及阻止由PD-L1结合PD-1介导的共抑制的能力。基于此目的，将不同浓度的融合蛋白添加至经葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激的人外周血单核细胞(PBMC)并在37℃下温育4天。测量上清液中IL-2分泌水平。
根据Biochrom的方案，通过经由聚蔗糖密度梯度(Biocoll 1.077g/mL，Biochrom)的离心自血沉棕黄色层中分离健康志愿者供体的PBMC。将纯化的T细胞重悬浮于由90％FCS和10％DMSO组成的缓冲液中，立即冷冻并储存在液氮中直至进一步使用。对于测定，将PBMC解冻并置于在37℃下于湿润的5％CO2氛围中的补充有10％FCS和1％青霉素-链霉素(LifeTechnologies)的培养基(RPMI 1640，Life Technologies)中达16h。
对于每个实验条件，采用一式三份实施以下程序：将2.5x104个PBMC温育在384孔平底组织培养板各孔的培养基中。融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQID NOs：92和87、SEQ ID NOs：86和93、SEQ ID NOs：94和87、和SEQ ID NOs：90和91)、构建块PD-L1抗体(SEQ ID NOs：86和87)、参照PD-L1抗体(SEQ ID NOs：26和27)、参照CD137抗体(SEQ ID NO：28和29)、参照CD137抗体(SEQ ID NO：28和29)和PD-L1抗体(SEQ ID NOs：86和87或SEQ ID NOs：26和27)的混合物(cocktail)或同型(isotype)对照(SEQ ID NOs：24和25)的稀释系列(通常范围为10至0.002nM)和0.1ng/ml的SEB添加至相应的孔。将板用透气密封膜(4titude)覆盖，并在37℃下在湿润的5％CO2气氛中温育4天。随后，采用如下程序中所述的人IL-2DuoSet试剂盒(R&D Systems)评估上清液中的IL-2水平。
在室温下用PBS中的1μg/mL“人IL-2捕获抗体”涂覆384孔板达2h。随后，用80μL补充有0.05％吐温的PBS(PBS-T)洗涤孔5次。在含有1％酪蛋白(w/w)的PBS-0.05％T中阻断1h后，将测定上清液和在培养基中稀释的浓度系列的IL-2标准品转移至相应的孔中并在4℃下温育过夜。第二天，在含有0.5％酪蛋白的PBS-T中加入100ng/mL山羊抗-hIL-2-Bio检测抗体(R&D Systems)和1μg/mL Sulfotag-标记的链霉亲和素(Mesoscale Discovery)的混合物并在室温下温育1h。洗涤后，向每个孔中加入25μL读数缓冲液(MesoscaleDiscovery)，并通过Mesoscale Discovery读数器检测得到的电化学发光(ECL)信号。使用Mesoscale Discovery软件进行分析和定量。
图9示出了代表性实验的结果。双特异性融合蛋白SEQ ID NOs：90和87、SEQ IDNOs：86和91、SEQ ID NOs：92和87、SEQ ID NOs：86和93、SEQ ID NOs：94和87、和SEQ IDNOs：90和91能够诱导T细胞活化，这通过与同型对照(hIgG4，Sigma)相比IL-2分泌水平增加而得到证明。在对CD137四价的融合蛋白(SEQ ID NOs：94和87及SEQ ID NOs：90和91)中观察到了最强的IL-2分泌增加，其次是其中脂质运载蛋白突变蛋白与PD-L1特异性抗体的C-末端融合的对CD137二价的融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87及SEQ ID NOs：86和91)。在其中脂质运载蛋白突变蛋白与PD-L1特异性抗体的N-末端融合的对CD137二价的融合蛋白(SEQID NOs：92和87及SEQ ID NOs：86和93)中观察到了最低的增加，但是仍然与参照CD137抗体(SEQ ID NOs：28和29)和参照PD-L1抗体(SEQ ID NOs：26和27)的混合物相当。与单一构建块，即CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白-Fc(SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：89)或构建块PD-L1 mAb(SEQ ID NOs：86和87)相比，全部融合蛋白均显示出更高的IL-2分泌水平。
实施例12：在表达不同水平的PD-L1的肿瘤细胞存在下评估T细胞活化
利用另一T细胞测定以评估融合蛋白以PD-L1靶标依赖性方式共刺激T细胞活化的能力。在具有不同PD-L1表达水平的肿瘤细胞系存在下，将不同浓度的融合蛋白施加至抗-CD3刺激的T细胞。测试的肿瘤细胞系包括RKO(PD-L1高)、HCC827(PD-L1中等)及Hep-G2(PD-L1阴性)。测量上清液中的IL-2分泌水平。
如实施例11所述自血沉棕黄色层中分离健康志愿者供体的PBMC。采用Pan T细胞纯化试剂盒(Miltenyi Biotec GmbH)根据制造商的说明通过磁性细胞分选从PBMC中进一步纯化T淋巴细胞。将纯化的Pan T细胞重悬浮于由90％FCS和10％DMSO组成的缓冲液中，立即冷冻并储存在液氮中直至进一步使用。
对于测定，将T细胞解冻并置于在37℃下于湿润的5％CO2氛围中的补充有10％FCS和1％青霉素-链霉素(Life Technologies)的培养基(RPMI 1640，Life Technologies)中达16h。
对于每个实验条件，采用一式三份实施以下程序：将平底组织培养板用0.25μg/mL抗-CD3抗体在37℃下预涂覆1h并用PBS洗涤两次。将肿瘤细胞系RKO、HCC827或Hep-G2用30μg/ml丝裂霉素C(Sigma Aldrich)处理30min以阻断增殖。然后将用丝裂霉素处理的肿瘤细胞用PBS洗涤两次并以每孔2.5x 104个细胞铺板在培养基中从而允许在37℃下在湿润的5％CO2氛围中贴壁过夜。采用Accutase(PAA Laboratories)使先前已在标准条件下生长的靶细胞脱落，然后重悬浮于培养基中。
第二天，用PBS洗涤板两次后，将每孔1.25x104个T细胞加入至肿瘤细胞中。将融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQ ID NOs：92和87、和SEQ ID NOs：86和93)、单独或组合使用的参照PD-L1抗体(SEQ ID NOs：26和27)和参照CD137抗体(SEQ IDNO：28和29)或同型对照(SEQ ID NOs：24和25)的稀释系列(通常范围为0.005至10nM)添加至相应的孔。将板用透气密封膜覆盖，并在37℃下在湿润的5％CO2气氛中温育3天。
共培养3天后，按照实施例11所述评估上清液中的IL-2水平。
图10示出了示例性数据。在其中脂质运载蛋白突变蛋白与PD-L1特异性抗体的C-末端融合的融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87及SEQ ID NOs：86和91)存在下，与hIgG4同型对照相比，Pan T细胞与RKO细胞(PD-L1高)或HCC827(PD-L1中等)的共培养导致了IL-2分泌明显增加。由其中脂质运载蛋白突变蛋白与PD-L1特异性抗体的N-末端融合的融合蛋白(SEQID NOs：92和87及SEQ ID NOs：86和93)诱导的IL-2分泌增加更弱，但是仍然比参照CD137抗体(SEQ ID NOs：28和29)和参照PD-L1抗体(SEQ ID NOs：26和27)的混合物高。在采用构建块、CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白(Fc融合蛋白，SEQ ID NO：89)和PD-L1抗体(SEQ IDNO：86和87)的混合物中未观察到IL-2分泌增加。此外，Hep-G2(PD-L1阴性)与任何融合蛋白的共培养均未使IL-2分泌水平增加，但是与参照CD137抗体(SEQ ID NOs：28和29)和参照PD-L1抗体(SEQ ID NOs：26和27)的混合物的共培养使IL-2分泌水平增加。
数据表明，通过其活化T细胞或使IL-2分泌增加的能力测量的融合蛋白的功能活性是PD-L1依赖性的。相比而言，当与参照PD-L1抗体(SEQ ID NOs：26和27)组合使用时，由参照CD137抗体(SEQ ID NOs：28和29)诱导的T细胞活化或IL-2分泌不一定是PD-L1依赖性的并难以预测。此外，数据表明在表达PD-L1的靶细胞存在下，靶向PD-L1和CD137的双特异性形式优于靶向CD137和PD-L1的两个独立分子的混合物。
实施例13：融合蛋白的储存稳定性评估
为了评估储存稳定性，将在PBS中的浓度为1mg/mL的示例性融合蛋白(SEQ IDNOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQ ID NOs：92和87、SEQ ID NOs：86和93、SEQ ID NOs：94和87、SEQ ID NO：88、和SEQ ID NO：89)于37℃下温育1周。随后采用分析级尺寸排阻，通过将20μg样品施加至Superdex 200，3.2/300 Increase(GE Healthcare)柱，以0.15ml/min的流速和PBS作为运行缓冲液测定单体融合蛋白。在37℃下于PBS中温育1周后，全部测试融合蛋白均稳定。图11A示出了示例性结果。
对所选的融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87)实施进一步的储存稳定性评估。将20mg/ml的融合蛋白在25mM组氨酸、60mM NaCl、200mM精氨酸pH 6中于40℃下温育4周。采用如实施例5所述的同时结合测定在定量ELISA设置中测量功能融合蛋白的含量。图11B中示出了示例性结果。
实施例14：采用CD4+T细胞的混合淋巴细胞反应(MLR)评估
采用混合淋巴细胞反应(MLR)测定来评估在抗原呈递细胞存在下示例性融合蛋白诱导CD4+T细胞活化的能力。在来自错配的健康供体的源自单核细胞的树突状细胞(moDC)和CD4+T细胞存在下测试不同浓度的融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87)。在测试分子存在下培养6天之后，定量上清液中IL-2和IFN-γ的分泌。
采用Lymphoprep溶液，根据制造商的说明(StemCell)，从血小板单采血袋中纯化PBMC。利用Miltenyi试剂盒自PBMC中纯化总CD4+T淋巴细胞，并将其冷冻在90％FBS和10％DMSO的溶液中。采用CD14+珠子试剂盒(Miltenyi)纯化CD14+单核细胞，并新鲜使用。
通过在50ng/mL的IL-4和100ng/mL的GMCSF(Miltenyi)存在下，在加10％FBS和Pen/Strep(LifeTech)的RPMI1640中以2x106个细胞/mL培养CD14+单核细胞6天来获得MoDC。第3天，加入10ml含有细胞因子的新鲜培养基。通过FACS在分化的第7天评估表型(CD14、CD1a、HLADR、PD-L1)。
在测试分子存在下，在存在50000 CD4+T细胞的U底96孔中的完全RPMI培养基中以一式三份孔的RPMI培养10000个moDC达6天。培养结束时，立即将上清液冷冻并储存以进行细胞因子定量。
通过采用Luminex技术测量上清液中的IL-2水平并将示例性数据示于图12中。图12A示出了在几组MLR实验(N＝8)中，与相应的单独构建块(SEQ ID NO：89和SEQ ID NOs：86和87)或参照CD137或PD-L1抗体(SEQ ID NOs：28和29或SEQ ID NOs：26和27)相比，10和0.1μg/mL的融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87)在IL-2诱导方面显著更好。图12B表明与同型抗体对照相比，融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87)诱导剂量依赖性的IL-2分泌。在0.001至20μg/mL浓度范围内，与等摩尔浓度的参照PD-L1抗体(SEQ ID NOs：26和27)和参照CD137抗体(SEQID NOs：28和29)的混合物相比，融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87)诱导的IL-2水平更高。
实施例15：采用CD8+T细胞的混合淋巴细胞反应评估
鉴于在人CD8+T细胞中CD137表达和活性的报道，在MLR测定中评估了在抗原呈递细胞存在下示例性融合蛋白诱导CD8+T细胞活化的能力。在来自错配的健康供体的moDC和总CD8+T细胞存在下测试融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87)。在测试分子存在下培养6天之后，定量上清液中IL-2和CD8效应分子(穿孔素、颗粒酶B和颗粒酶A)的分泌。
采用Lymphoprep溶液，根据制造商的说明(StemCell)，从血小板单采血袋中纯化PBMC。利用Miltenyi试剂盒自PBMC中纯化总CD8+T淋巴细胞，并新鲜使用。采用CD14+珠子试剂盒(Miltenyi)纯化CD14阳性单核细胞，并新鲜使用。
通过在50ng/mL的IL-4和100ng/mL的GMCSF(Miltenyi)存在下，在加10％FBS和Pen/Strep(LifeTech)的RPMI1640中以2x106个细胞/mL培养CD14+单核细胞6天来获得moDC。第3天，加入10ml含有细胞因子的新鲜培养基。通过FACS在分化的第7天评估表型(CD14、CD1a、HLADR、PD-L1)。
在测试分子存在下，在U底96孔中的完全RPMI培养基(一式三份孔)中用50000 CD8+T细胞培养10000个moDC达6天。培养结束时，立即将上清液冷冻并储存以进行分泌的因子定量。
采用Luminex技术定量上清液中的IL-2、穿孔素、颗粒酶A和颗粒酶B。图13示出了示例性数据。
图13表明与等摩尔浓度(10μg/mL(N＝4))的参照PD-L1抗体(SEQ ID NOs：26和27)、参照CD137抗体(SEQ ID NOs：28和29)或二者的混合物相比，融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87)显示使IL-2、穿孔素、颗粒酶B和颗粒酶A的分泌增加。该数据进一步表明，融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87)对细胞毒性CD8+T细胞具有活性。
实施例16：在植入人PBMC的异种移植小鼠模型中功能性体内活性评估
为了研究所提供的融合蛋白的体内活性，采用细胞系衍生的异种移植小鼠模型。由此，将人类癌细胞系皮下植入免疫缺陷的雌性NOG小鼠中，该小鼠在具有至少1周检疫隔离期的4-6周龄移交(deliver)。当肿瘤达到约80-100mm3的体积后，小鼠将成为人PBMC的代用品(substitutes)。将测试化合物注射至少3次，并不断测量肿瘤的生长和活性。研究结束后，处死小鼠。通过免疫组织化学评估CD3-、CD4-和CD8-阳性细胞的肿瘤内浸润。进行IFN-γRNAscope作为进一步的读数。
实施例17：融合蛋白的表位分析
为了评估融合蛋白识别的表位，以及这些表位是否是临床相关的，采用竞争性ELISA形式(format)来测定融合蛋白与参照CD137抗体之间的竞争。
将PBS中的参照CD137抗体(SEQ ID NOs：28和29)(4μg/mL)在4℃下在微量滴定板上涂覆过夜。在每个温育步骤后，用100μL PBS-0.05％T(补充有0.05％(v/v)吐温20的PBS)洗涤板5次。将板用在PBS-0.1％T(补充有0.1％(v/v)吐温20的PBS)中的2％BSA(w/v)在室温下封闭1小时，然后再次洗涤。将不同浓度的融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87及SEQ IDNOs：86和91)、CD137特异性脂质运载蛋白突变蛋白(SEQ ID NO：42)、参照CD137抗体(SEQID NOs：28和29)和对照抗体(SEQ ID NOs：86和87)与1nM的生物素化的人CD137Fc融合蛋白(huCD137-Fc-bio)混合作为示踪剂并在室温下温育1小时。将测试分子与示踪剂的混合物添加至板中并在室温下温育20min，随后是采用100μL PBS-0.05％T的5次洗涤步骤。随后向孔中加入ExtrAvidin-HRP(Sigma-Aldrich)在PBS-0.1％T-2％BSA中的1∶5000的稀释液并温育1h。在另外的洗涤步骤之后，向每个孔中加入荧光HRP底物(QuantaBlu，Thermo)，并使用荧光酶标仪检测荧光强度。
图14中示出了示例性实验的竞争数据，其中x轴代表测试分子的浓度和y轴代表测量的示踪分子的浓度。将数据拟合为1∶1 S形曲线，其中IC50值和最大信号为自由参数，斜率固定为一(unity)。结果证明，示例性融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87及SEQ ID NOs：86和91)与CD137抗体(SEQ ID NOs：28和29)竞争结合CD137，表明融合蛋白与抗体结合重叠表位。
表10：融合蛋白的竞争
SEQ ID NO IC<sub>50</sub>[nM]
90和87 1.10
86和91 0.99
28和29 0.20
42 2.60
实施例18：采用PD-1/PD-L1阻断生物测定评估T细胞活化
采用与PD-L1 aAPC/CHO-K1细胞(表达人PD-L1和一种设计为以抗原无关的方式活化同源TCR的工程化细胞表面蛋白的CHO-K1细胞)共培养的PD-1-NFAT-luc Jurkat T细胞(工程化为表达PD-1和NFAT应答元件(NFAT-RE)驱动的luc基因(萤火虫荧光素酶基因)的Jurkat细胞系)来评估所选的融合蛋白阻断PD-1/PD-L1介导的抑制的潜力。在该生物测定中，当PD-1-NFAT-luc Jurkat T细胞与PD-L1 aAPC/CHO-K1细胞共培养时，PD-1/PD-L1相互作用抑制TCR信号传导和NFAT-RE介导的发光。PD-1/PD-L1阻断剂，比如本文所述的对CD137和PD-L1特异性的融合蛋白的添加释放了抑制信号，并导致TCR活化和NFAT-RE介导的发光。
使PD-L1 aAPC/CHO-K1细胞在补充了10％FCS的Ham′s F12培养基中生长，其中以每孔8.00x 103个细胞铺板并允许在37℃下于湿润5％的CO2气氛中贴壁过夜。第二天，弃去培养基。将1.00x 104PD-1-NFAT-luc Jurkat T细胞添加至每个孔中，然后加入不同浓度(通常范围为0.005nM至50nM)的融合蛋白(SEQ ID NO：90和87)或PD-L1抗体(SEQ ID NOs：86和87或SEQ ID NOs：26和27)。将板用透气密封膜覆盖，并在37℃下于湿润的5％CO2氛围中温育。6h后，将30μL Bio-GloTM试剂加入各孔，并采用光度计定量生物发光信号。采用GraphPad
Figure BPA0000299772270000861
进行四参数逻辑曲线分析，以计算EC50值，EC50值汇总于表11。测定一式三份地进行。
图15中描绘了代表性实验的结果。数据证明，测试的融合蛋白以与PD-L1抗体(SEQID NOs：86和87或SEQ ID NOs：26和27)的EC50值相当的EC50值以剂量依赖性方式抑制PD-1/PD-L1阻断并活化T细胞。作为阴性对照，参照CD137抗体(SEQ ID NOs：28和29)和同型对照抗体(SEQ ID NOs：24和25)均未导致发光信号增加。
表11：采用PD-1/PD-L1阻断生物测定评估T细胞活化
SEQ ID NO EC<sub>50</sub>[nM]
90和87 0.49
86和91 0.58
28和29 0.46
实施例19：采用人PBMC评估T细胞活化
采用另外的T细胞测定来评估所选融合蛋白共刺激T细胞应答的能力，其中将不同浓度的融合蛋白加入SEB刺激的人PBMC中并在37℃下温育3天。测量上清液中IL-2分泌水平。
按照实施例11所述分离并储存来自健康志愿者供体的PBMC。对于测定，将PBMC解冻并置于在37℃下于湿润的5％CO2氛围中的补充有10％FCS和1％青霉素-链霉素(LifeTechnologies)的培养基(RPMI 1640，Life Technologies)中达24h。
对于每个实验条件，采用一式三份实施以下程序：将2.5x104个PBMC温育在384孔平底组织培养板各孔的培养基中。所选的融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87)、构建块PD-L1抗体(SEQ ID NOs：86和87)、单独使用的参照CD137抗体(SEQ ID NO：28和29)或与参照PD-L1抗体(SEQ ID NOs：26和27)组合使用的参照CD137抗体(SEQ ID NO：28和29)或同型对照(SEQ ID NOs：24和25)的稀释系列(通常范围为0.0002至10nM)和0.1ng/ml的SEB添加至相应的孔。将板用透气密封膜(4titude)覆盖，并在37℃下在湿润的5％CO2气氛中温育3天。随后，按照如实施例11所述评估上清液中的IL-2。
图16描绘了代表性实验的结果。表12中汇总了测试分子诱导IL-2分泌的EC50值。与构建块PD-L1抗体、参照CD137抗体及参照PD-L1和CD137抗体的混合物相比，SEQ ID NOs：90和87的双特异性融合蛋白将强的IL-2分泌的剂量依赖性增加诱导至更高水平，并与单独或组合使用的PD-L1和CD137抗体相比使有效EC50值降低。
表12：采用人PBMC评估T细胞活化
Figure BPA0000299772270000881
实施例20：由融合蛋白诱导的PD-L1依赖性T细胞活化的评估
采用T活化细胞测定来进一步分析融合蛋白的PD-L1靶标依赖性T细胞共刺激。将不同浓度的融合蛋白施加至抗-CD3刺激的T细胞，并与人PD-L1转染的或模拟转染的Flp-In-CHO细胞共培养。测量上清液中IL-2分泌水平。
如实施例11所述自血沉棕黄色层中分离健康志愿者供体的PBMC。按照实施例12所述进一步纯化并储存T淋巴细胞。
对于测定，将T细胞解冻并置于在37℃下于湿润的5％CO2氛围中的补充有10％FCS和1％青霉素-链霉素(Life Technologies)的培养基(RPMI 1640，Life Technologies)中过夜。
对于每个实验条件，采用一式三份实施以下程序：将平底组织培养板用0.25μg/mL抗-CD3抗体在37℃下预涂覆2h，然后用PBS洗涤两次。将用人PD-L1转染或模拟转染的CHO细胞用30μg/ml丝裂霉素C(Sigma Aldrich)处理30min以阻断增殖。然后将用丝裂霉素处理的细胞用PBS洗涤两次并以每孔1.0x 107个细胞铺板在培养基中从而允许在37℃下在湿润的5％CO2氛围中贴壁过夜。采用Accutase(PAA Laboratories)使先前已在标准条件下生长的CHO细胞脱落，然后重悬浮于培养基中。
第二天，将每孔8.33x103个T细胞加入至CHO细胞中。将示例性融合蛋白(SEQ IDNOs：90和87)、构建块PD-L1抗体(SEQ ID NOs：86和87)、参照CD137抗体(SEQ ID NO：28和29)、和参照PD-L1抗体(SEQ ID NOs：26和27)与参照CD137抗体(SEQ ID NO：28和29)的混合物、或同型对照(SEQ ID NOs：24和25)的稀释系列(通常范围为0.003nM至50nM)添加至相应的孔。将板用透气密封膜覆盖，并在37℃下在湿润的5％CO2气氛中温育2天。
共培养2天后，按照实施例11所述评估上清液中的IL-2水平。
图17示出了示例性数据。在融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87及SEQ ID NOs：86和91)存在下，与hIgG4同型对照相比，Pan T细胞与CHO细胞的共培养导致了强的剂量依赖性IL-2分泌并比参照抗体强得多，在参照抗体的情况下，对于参照CD137抗体或参照CD137抗体与参照PD-L1抗体的混合物仅观察到了IL-2分泌的微小增加。当与模拟转染的CHO细胞(PD-L1阴性)共培养时，仅参照CD137抗体和参照CD137抗体与参照PD-L1抗体的混合物显示出微小的IL-2分泌的剂量依赖性增加。结果证明，通过融合蛋白的T细胞的活化是PD-L1依赖性的，与之相对的，无论靶细胞存在与否，参照CD137抗体(SEQ ID NOs：28和29)显示出CD137介导的T细胞共刺激。
实施例21：融合蛋白在小鼠中的药代动力学
在小鼠中进行代表性融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQ IDNOs：92和87、SEQ ID NOs：86和93、SEQ ID NOs：94和87、和SEQ ID NOs：90和91)的药代动力学分析。以10mg/kg的剂量向约5周龄的雄性CD-1小鼠(每个时间点3只小鼠；Charles RiverLaboratories，Research Models and Services，Germany GmbH)在尾部静脉注射融合蛋白。测试品以5mL/kg的体积作为大剂量(bolus)施用。在时间点5分钟、1小时、4小时、8小时、24小时、48小时、4天、8天、14天、21天和28天获得来自小鼠的血浆样品。收集足够的全血(在异氟烷麻醉下采集)以获得至少100μL的Li-Heparin血浆/动物和时间。使用通过靶标PD-L1和CD137检测完整的双特异性构建体的夹心ELISA检测了药物水平。使用Prism GraphPad 5软件的二室模型拟合数据。
图18示出了融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQ ID NOs：92和87、SEQ ID NOs：86和93、SEQ ID NOs：94和87、和SEQ ID NOs：90和91)的血浆浓度随时间的曲线图，一起绘制了构建块PD-L1抗体(SEQ ID NOs：86和87)获得的数值作为参照。在所有情况下，药代动力学看起来均相似。从约200μg/mL的血浆浓度开始，血浆水平在约48小时内降至约50μg/mL的水平，随后进一步以更低的速率降低直至28天后实验结束时的约10μg/mL。对这些数据进行非-室(non-compartmental)分析。表13中汇总了终末半衰期。
数据证明，融合蛋白在小鼠中具有长的、抗体样终末半衰期。由于用于确定融合蛋白血浆浓度的测定需要保留对PD-L1和CD137的活性，因此，该结果还证明该双特异性分子在28天的时间内保持完整。
表13：采用非-室分析确定的小鼠中的终末半衰期
SEQ ID NO 终末半衰期[h]
90和87 295
92和87 346
86和93 332
94和87 209
90和91 250
86和87 390
实施例22：融合蛋白在小鼠中的药代动力学
在小鼠中进行代表性融合蛋白(SEQ ID NOs：90和87)的药代动力学分析，并与两个在前描述的结合CD137-和PD-L1的融合蛋白(SEQ ID NO：147和SEQ ID NO：148)进行比较。以2mg/kg的剂量向约5周龄的雄性CD-1小鼠(每个时间点2只小鼠；Charles RiverLaboratories，Research Models and Services，Germany GmbH)在尾部静脉注射相应的分子。在时间点5分钟、24小时、168小时和336小时获得来自小鼠的血浆样品。收集足够的全血(在异氟烷麻醉下采集)以获得至少30-50μL的Li-Heparin血浆/动物和时间。
然后采用ELISA分析血浆药物浓度。将HuCD137-His(具有C-末端聚组氨酸标签的人CD137)溶解在PBS中(1μg/mL)并在4℃下于微量滴定板上涂覆过夜。在每个温育步骤后，用80μL补充了0.05％(v/v)的吐温20的PBS洗涤板5次。将板用PBS/BSA/吐温(含有2％BSA(w/v)和0.1％(v/v)吐温20的PBS)在室温下封闭1小时，然后洗涤。将血浆样品在PBS/BSA/吐温中稀释至20％血浆浓度，加入到孔中并在室温下温育1小时。随后是另一洗涤步骤。在用各自在含有2％BSA(w/v)和0.1％(v/v)吐温20的PBS中稀释的1μg/mL的生物素化人PD-L1和链霉亲和素SULFO-TAG(Mesoscale Discovery)的混合物温育1小时后检测研究中的结合的试剂。在另外的洗涤步骤后，向每个孔中加入35μL读数缓冲液，并通过MesoscaleDiscovery读数器读取每个孔的电化学发光(ECL)信号。将数据转移至Excel用以分析并定量。建立标准蛋白稀释液的校正曲线。
图19示出了SEQ ID NOs：90和87、SEQ ID NO：147和SEQ ID NO：148的血浆浓度随时间的曲线图。SEQ ID NOs：90和87展示了良好的药代动力学特征或抗体样药代动力学，而SEQ ID NO：147和SEQ ID NO：148则未展示。如本文所述，若在336h后，Cmax的百分比(％)在10％以上，则可认为实现了良好的药代动力学特征或抗体样药代动力学。
本文示例性所描述的实施方式可以适当地在本文中未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制不存在的情况下实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被宽泛地解读且无限制。另外，本文所采用的术语和表达被用作描述的术语而非限制的术语，并且无意图在使用这些术语和表达时，排除掉显示和描述的特征的任何等同物或其部分，而是认可各种修饰可以在本发明请求保护的范围内。因此，应当理解的是，虽然本发明实施方式已通过优选的实施方式和任选的特征而被具体公开，本领域技术人员可以寻求其修饰和变化，并且这样的修饰和变化被认为是在本发明的范围内。本文所述的所有专利、专利申请、教科书和同行评审的出版物均通过引用全文并入本文。此外，当在通过引用并入本文的参考文献中的定义或使用的术语与本文所提供该术语的定义不一致或相反时，适用本文所提供的该术语的定义，而不适用该参考文献中该术语的定义。每个较窄种类和亚属分组落入类属的公开范围内，也形成本发明的一部分。这包括本发明的一般描述，且具有从该种类中去除任何主题的条件或负面限制，而不管该去除的材料是否在本文中具体陈述。此外，当特征是以马库什组的形式描述时，本领域技术人员将认识到，本发明还由此以该马库什组中任何单独成员或成员亚组的形式描述。进一步的实施方式将由以下的权利要求书中变得显而易见。
等同物：本领域的技术人员使用不超过常规实验就会认识到或者能够确定许多与此处描述的本发明的具体实施方式的等同物。以下的权利要求意欲涵盖这些等同物。在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请在此引入本说明书中作为参考，就像每个单独的出版物、专利或专利申请具体地且分别指出引入本文作为参考一样。
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Claims (79)

1.一种能够结合CD137和PD-L1的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含至少两个任意顺序的亚基，其中第一亚基包含全长免疫球蛋白或其抗原结合结构域且是对PD-L1特异性的，和其中第二亚基包含脂质运载蛋白突变蛋白且是对CD137特异性的。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其进一步包含第三亚基，所述第三亚基包含对CD137特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够以至多约2nM的KD值结合PD-L1或能够以与包含于所述第一亚基中的免疫球蛋白或其抗原结合结构域单独的KD值相当或更低的KD值结合PD-L1。
4.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够以至多约7nM的KD值结合CD137或能够以与包含于所述第二亚基中的对CD137特异性的脂质运载蛋白突变蛋白单独的KD值相当或更低的KD值结合CD137。
5.根据权利要求3或4所述的融合蛋白，其中所述KD值通过表面等离子体共振(SPR)测定确定。
6.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够以至多约0.5nM的EC50值结合PD-L1或能够以与包含于所述第一亚基中的免疫球蛋白或其抗原结合结构域单独的EC50值相当或更低的EC50值结合PD-L1。
7.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够以至多约0.6nM的EC50值结合CD137或能够以与包含于所述第二亚基中的对CD137特异性的脂质运载蛋白突变蛋白单独的EC50值相当或更低的EC50值结合CD137。
8.根据权利要求6-7中任一项所述的融合蛋白，其中所述EC50值通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定确定。
9.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白与猕猴PD-L1交叉反应。
10.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白与猕猴CD137交叉反应。
11.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中当在ELISA测定中测量所述融合蛋白时，所述融合蛋白能够以至多约10nM的EC50值同时结合CD137和PD-L1。
12.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够以至多约60nM的EC50值结合细胞上表达的CD137。
13.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中当在流式细胞分析中测量所述融合蛋白时，所述融合蛋白能够以至多约10nM的EC50值结合细胞上表达的PD-L1。
14.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够结合表达PD-L1的肿瘤细胞。
15.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够在存在CD137配体的情况下结合CD137。
16.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够与PD-1竞争结合PD-L1。
17.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够与SEQ ID NO.28和29所示的抗体竞争结合CD137。
18.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白与SEQ ID NO.28和29所示的抗体具有重叠的CD137-结合表位。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够刺激T细胞增殖和/或应答。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够刺激CD4+和/或CD8+T细胞增殖。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够诱导IL-2和/或IFN-γ的分泌增加。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够诱导细胞毒性因子的分泌增加。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够以PD-L1依赖性方式共刺激T细胞应答。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够在肿瘤微环境中共刺激T细胞应答。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的融合蛋白，其中在不存在PD-L1的情况下，所述融合蛋白不共刺激T细胞应答。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白能够阻断PD-1的抑制信号。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有抗体样药代动力学特征。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有比SEQ IDNO：147或SEQ ID NO：148更有利的药代动力学特征。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的融合蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白在对应于成熟人泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153的位置处包含一个或多个突变的氨基酸残基。
30.根据权利要求29所述的融合蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列在对应于成熟hTlc的线性多肽序列(SEQ ID NO：1)的位置5、26-31、33-34、42、46、52、56、58、60-61、65、71、85、94、101、104-106、108、111、114、121、133、148、150和153的一个或多个位置处包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Ala 5→Val或Thr；Arg 26→Glu；Glu27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Thr 42→Ser；Gly 46→Asp；Lys 52→Glu；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Lys 65→Arg或Asn；Thr 71→Ala；Val 85→Asp；Lys 94→Arg或Glu；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys114→Trp；Lys 121→Glu；Ala 133→Thr；Arg 148→Ser；Ser 150→Ile和Cys 153→Ser。
31.根据权利要求29或30所述的融合蛋白，其中与成熟人泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列(SEQ ID NO：1)相比，所述脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列包含以下突变的氨基酸残基的组之一：
(a)Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；和Cys 153→Ser；
(b)Ala 5→Thr；Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Lys 65→Arg；Val 85→Asp；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Lys 121→Glu；Ala 133→Thr；和Cys 153→Ser；
(c)Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Lys 65→Asn；Lys 94→Arg；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Lys 121→Glu；Ala 133→Thr；和Cys 153→Ser；
(d)Ala 5→Val；Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Lys 65→Arg；Lys 94→Glu；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Lys 121→Glu；Ala 133→Thr；和Cys 153→Ser；
(e)Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Thr 42→Ser；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Ser 150→Ile；和Cys 153→Ser；
(f)Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Lys 52→Glu；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Thr 71→Ala；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Ala 133→Thr；Arg 148→Ser；Ser 150→Ile；和Cys 153→Ser；和
(g)Ala 5→Thr；Arg 26→Glu；Glu 27→Gly；Phe 28→Cys；Pro 29→Arg；Glu 30→Pro；Met 31→Trp；Leu 33→Ile；Glu 34→Phe；Gly 46→Asp；Leu 56→Ala；Ser 58→Asp；Arg 60→Pro；Cys 61→Ala；Thr 71→Ala；Cys 101→Ser；Glu 104→Val；Leu 105→Cys；His 106→Asp；Lys 108→Ser；Arg 111→Pro；Lys 114→Trp；Ser 150→Ile；和Cys 153→Ser。
32.根据权利要求29-32中任一项所述的融合蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列包含选自SEQ ID NOs：34-40或其片段或变体的氨基酸序列。
33.根据权利要求29-32中任一项所述的融合蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列与选自SEQ ID NOs：34-40的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性。
34.根据权利要求1-28中任一项所述的融合蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白在对应于成熟人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(hNGAL)的线性多肽序列(SEQ ID NO：2)的位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132和134的位置处包含一个或多个突变的氨基酸残基。
35.根据权利要求34所述的融合蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列在对应于成熟人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(hNGAL)的线性多肽序列(SEQ IDNO：2)的位置28、36、40-41、49、52、65、68、70、72-73、77、79、81、83、87、94、96、100、103、106、125、127、132和134的位置处包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg或Lys；Gln 49→Val、Ile、His、Ser或Asn；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Met、Ala或Gly；Leu 70→Ala、Lys、Ser或Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Met、Arg、Thr或Asn；Trp 79→Ala或Asp；Arg 81→Met、Trp或Ser；Phe 83→Leu；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu和Lys 134→Tyr。
36.根据权利要求1-28中任一项所述的融合蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白在对应于成熟人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(hNGAL)的线性多肽序列(SEQ ID NO：2)的位置20、25、28、33、36、40-41、44、49、52、59、68、70-73、77-82、87、92、96、98、100、101、103、122、125、127、132和134的位置处包含一个或多个突变的氨基酸残基。
37.根据权利要求36所述的融合蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列在对应于成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO：2)的位置20、25、28、33、36、40-41、44、49、52、59、68、70-73、77-82、87、92、96、98、100、101、103、122、125、127、132和134的位置处包含以下突变的氨基酸残基中的一个或多个：Gln 20→Arg；Asn 25→Tyr或Asp；Gln 28→His；Val 33→Ile；Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Glu 44→Val或Asp；Gln 49→His；Tyr 52→Ser或Gly；Lys 59→Asn；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Phe 71→Leu；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln或His；Tyr 78→His；Trp 79→Ile；Ile 80→Asn；Arg 81→Trp或Gln；Thr 82→Pro；Cys 87→Ser；Phe 92→Leu或Ser；Asn 96→Phe；Lys 98→Arg；Tyr100→Asp；Pro 101→Leu；Leu 103→His或Pro；Phe 122→Tyr；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly。
38.根据权利要求34-37中任一项所述的融合蛋白，其中与成熟hNGAL的线性多肽序列(SEQ ID NO：2)相比，所述脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列包含以下突变的氨基酸残基的组之一：
(a)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Asn；Tyr 52→Met；Ser 68→Gly；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Ala；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(b)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg；Gln 49→Ile；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Met；Leu 70→Lys；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Met；Trp 79→Asp；Arg 81→Trp；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(c)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg；Gln 49→Asn；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Ala；Leu 70→Ala；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Asp；Arg 81→Trp；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(d)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Asn；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Ala；Leu 70→Ala；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Asp；Arg 81→Trp；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(e)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Ser；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Ser；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Ala；Arg 81→Met；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(f)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Val；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Arg；Trp 79→Asp；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(g)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg；Gln 49→His；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Ala；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(h)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Lys；Gln 49→Asn；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Gly；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Thr；Trp 79→Ala；Arg 81→Ser；Phe 83→Leu；Cys 87→Ser；Leu 94→Phe；Asn 96→Lys；Tyr100→Phe；Leu 103→His；Tyr 106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(i)Gln 28→His；Leu 36→Gln；Ala 40→Ile；Ile 41→Arg；Gln 49→Ser；Tyr 52→Met；Asn 65→Asp；Ser 68→Ala；Leu 70→Thr；Arg 72→Asp；Lys 73→Asp；Asp 77→Asn；Trp 79→Ala；Arg 81→Ser；Cys 87→Ser；Asn 96→Lys；Tyr 100→Phe；Leu 103→His；Tyr106→Ser；Lys 125→Phe；Ser 127→Phe；Tyr 132→Glu；和Lys 134→Tyr；
(j)Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Ser；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(k)Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Ser；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Phe 92→Leu；Asn 96→Phe；Lys 98→Arg；Tyr 100→Asp；Pro 101→Leu；Leu 103→His；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(l)Asn 25→Tyr；Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Gly；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Phe 71→Leu；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Arg 81→Gln；Phe 92→Ser；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Lys125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(m)Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Gly；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Tyr 78→His；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Phe 92→Leu；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(n)Asn 25→Asp；Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Gly；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Phe 92→Leu；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(o)Val 33→Ile；Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Gly；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Phe 92→Leu；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(p)Gln 20→Arg；Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Glu 44→Val；Gln 49→His；Tyr 52→Gly；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Phe 92→Leu；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Phe122→Tyr；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(q)Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Ser；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Ile 80→Asn；Arg 81→Trp；Thr 82→Pro；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Pro 101→Leu；Leu 103→Pro；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；
(r)Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Gln 49→His；Tyr 52→Gly；Lys 59→Asn；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→Gln；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Phe 92→Leu；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Lys 125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly；和
(s)Leu 36→Met；Ala 40→Asn；Ile 41→Leu；Glu 44→Asp；Gln 49→His；Tyr 52→Ser；Ser 68→Asp；Leu 70→Met；Phe 71→Leu；Arg 72→Leu；Lys 73→Asp；Asp 77→His；Trp 79→Ile；Arg 81→Trp；Phe 92→Leu；Asn 96→Phe；Tyr 100→Asp；Leu 103→His；Lys125→Ser；Ser 127→Ile；Tyr 132→Trp；和Lys 134→Gly。
39.根据权利要求34-38中任一项所述的融合蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列包含选自SEQ ID NOs：41-59或其片段或变体的氨基酸序列。
40.根据权利要求34-38中任一项所述的融合蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列与选自SEQ ID NOs：41-59的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的融合蛋白，其中通过连接子将一个亚基与另一个亚基连接。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的融合蛋白，其中通过连接子将所述第二亚基的N-末端与所述第一亚基的每个重链恒定区(CH)的N-或C-末端或与所述第一亚基的每个轻链恒定区(CL)的N-或C-末端连接。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的融合蛋白，其中通过连接子将所述第三亚基的N-末端与所述第一亚基的每个重链恒定区(CH)的N-或C-末端、与所述第一亚基的每个轻链恒定区(CL)的N-或C-末端或与每个第二亚基的C-末端连接。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的融合蛋白，其中所述连接子是非结构性的(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3连接子(SEQ ID NO：13)。
45.根据权利要求41-43中任一项所述的融合蛋白，其中所述连接子是非结构性的甘氨酸-丝氨酸连接子、多脯氨酸连接子、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物或选自SEQ ID NOs：13-23的连接子。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一亚基是抗体。
47.根据权利要求46所述的融合蛋白，其中所述抗体的重链可变区选自SEQ ID NOs：75-79，和其中所述单克隆抗体的轻链可变区选自SEQ ID NOs：80-84。
48.根据权利要求46所述的融合蛋白，其中所述抗体包含为SEQ ID NOs：85-86中的任一个的重链，和SEQ ID NO：87的轻链。
49.根据权利要求46所述的融合蛋白，其中所述抗体分别包含如下的重链可变区和轻链可变区：SEQ ID NOs：75和80，SEQ ID NOs：76和81，SEQ ID NOs：77和82，SEQ ID NOs：78和83，或SEQ ID NOs：79和84。
50.根据权利要求46所述的融合蛋白，其中所述抗体分别包含如下的重链和轻链：SEQID NOs：85和87，和SEQ ID NOs：86和87。
51.根据权利要求46所述的融合蛋白，其中所述抗体的重链包含以下CDR序列的组之一：
(a)GFSLSNYD(HCDR1，SEQ ID NO：59)，IWTGGAT(HCDR2，SEQ ID NO：60)，VRDSNYRYDEPFTY(HCDR3；SEQ ID NO：61)；
(b)GFDIKDTY(HCDR1，SEQ ID NO：65)，IDPADGNT(HCDR2，SEQ ID NO：66)，ARGLGAWFAS(HCDR3；SEQ ID NO：67)；和
(c)GFNIKDTY(HCDR1，SEQ ID NO：70)，IDPANGNT(HCDR2，SEQ ID NO：71)，SRGPPGGIGEYIYAMDY(HCDR3；SEQ ID NO：72)。
52.根据权利要求46所述的融合蛋白，其中所述抗体的轻链包含以下CDR序列的组之一：
(a)QSIGTN(LCDR1，SEQ ID NO：63)，YAS(LCDR2)，QQSNSWPYT(LCDR3；SEQ ID NO：64)；
(b)QDITNS(LCDR1，SEQ ID NO：68)，YTS(LCDR2)，QQGHTLPPT(LCDR3；SEQ ID NO：69)；和
(c)SSVSSSY(LCDR1，SEQ ID NO：73)，STS(LCDR2)，HQYHRSPPT(LCDR3；SEQ ID NO：74)。
53.根据权利要求46所述的融合蛋白，其中所述抗体的重链包含以下CDR序列的组：GFSLSNYD(HCDR1，SEQ ID NO：59)，IWTGGAT(HCDR2，SEQ ID NO：60)和VRDSNYRYDEPFTY(HCDR3；SEQ ID NO：61)，和所述抗体的轻链包含以下CDR序列的组：QSIGTN(LCDR1，SEQ IDNO：62)，YAS(LCDR2)和QQSNSWPYT(LCDR3；SEQ ID NO：63)。
54.根据权利要求46所述的融合蛋白，其中所述单克隆抗体具有IgG4骨架。
55.根据权利要求54所述的融合蛋白，其中所述IgG4骨架具有以下突变中的一个或多个：S228P、N297A、F234A、L235A、M428L、N434S、M252Y、S254T和T256E。
56.根据权利要求1-55中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NOs：86-94中的任一个所示的氨基酸序列，或其中所述融合蛋白包含与SEQ ID NOs：88-94中的任一个所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或更高的序列同一性的氨基酸序列。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NOs：90和87所示的氨基酸，SEQ ID NOs：86和91所示的氨基酸，SEQ ID NOs：92和87所示的氨基酸，SEQ ID NOs：86和93所示的氨基酸，SEQ ID NOs：94和87所示的氨基酸，或SEQ ID NOs：90和91所示的氨基酸。
58.根据权利要求1-56中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含与SEQ IDNOs：90和87、SEQ ID NOs：86和91、SEQ ID NOs：92和87、SEQ ID NOs：86和93、SEQ ID NOs：94和87或SEQ ID NOs：90和91所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或更高的序列同一性的氨基酸序列。
59.一种核酸分子，其包含编码权利要求1-58中任一项所述的融合蛋白的核苷酸序列。
60.根据权利要求59所述的核酸分子，其中所述核酸分子可操作地与允许所述核酸分子表达的调节序列连接。
61.根据权利要求59或60所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含在载体或噬菌粒载体中。
62.一种宿主细胞，其含有权利要求58-60中任一项所述的核酸分子。
63.一种产生根据权利要求1-62中任一项所述的融合蛋白的方法，其中从编码所述融合蛋白的核酸开始产生所述融合蛋白。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述融合蛋白在细菌或真核宿主生物体中产生且自该宿主生物体或其培养物中分离。
65.一种将根据权利要求1-58中任一项所述的融合蛋白或包含这种融合蛋白的组合物用于同时活化CD137的下游信号传导通路和接合PD-L1-阳性肿瘤细胞的用途。
66.一种同时活化CD137的下游信号传导通路和接合PD-L1-阳性肿瘤细胞的方法，所述方法包括向包含肿瘤的组织应用一种或多种权利要求1-58中任一项所述的融合蛋白或者一种或多种包含这种融合蛋白的组合物。
67.一种同时共刺激T细胞和接合PD-L1-阳性肿瘤细胞的方法，所述方法包括向包含肿瘤的组织应用一种或多种权利要求1-58中任一项所述的融合蛋白或者一种或多种包含这种融合蛋白的组合物。
68.一种同时诱导淋巴细胞活性和接合PD-L1-阳性肿瘤细胞的方法，所述方法包括向包含肿瘤的组织应用一种或多种权利要求1-58中任一项所述的融合蛋白或者一种或多种包含这种融合蛋白的组合物。
69.一种在T细胞上诱导CD137聚集和活化并将所述T细胞导向PD-L1-阳性肿瘤细胞的方法，所述方法包括向包含肿瘤的组织应用一种或多种权利要求1-58中任一项所述的融合蛋白或者一种或多种包含这种融合蛋白的组合物。
70.一种在PD-L1-阳性肿瘤细胞附近诱导局部淋巴细胞应答的方法，所述方法包括向包含肿瘤的组织应用一种或多种权利要求1-58中任一项所述的融合蛋白或者一种或多种包含这种融合蛋白的组合物。
71.一种在PD-L1-阳性肿瘤细胞附近诱导T细胞的IL-2和/或细胞毒性因子的分泌增加的方法，所述方法包括向包含肿瘤的组织应用一种或多种权利要求1-58中任一项所述的融合蛋白或者一种或多种包含这种融合蛋白的组合物。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述细胞毒性因子选自穿孔素、颗粒酶B和颗粒酶A。
73.一种在PD-L1-阳性肿瘤细胞附近诱导T细胞的细胞毒性因子的分泌增加的方法，所述方法包括向包含肿瘤的组织应用一种或多种根据权利要求1-58中任一项所述的融合蛋白或者一种或多种包含这种融合蛋白的组合物。
74.一种药物组合物，其包含一种或多种权利要求1-58中任一项所述的融合蛋白。
75.一种预防、改善或治疗PD-L1-阳性癌症的方法，所述方法包括向包含肿瘤的组织应用一种或多种权利要求1-58中任一项所述的融合蛋白或者一种或多种包含这种融合蛋白的组合物。
76.根据权利要求1-58中任一项所述的融合蛋白，其应用于治疗中。
77.根据权利要求70所述应用的融合蛋白，其中所述应用为在癌症治疗中。
78.根据权利要求1-58中任一项所述的融合蛋白在制备药物中的用途。
79.根据权利要求78所述的用途，其中所述药物用于癌症治疗。
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