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CN112779350A - 与小麦小穗粒数QTLQGns．sicau-2D紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

与小麦小穗粒数QTLQGns．sicau-2D紧密连锁的分子标记及其应用 Download PDF

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CN112779350A
CN112779350A CN202110182817.5A CN202110182817A CN112779350A CN 112779350 A CN112779350 A CN 112779350A CN 202110182817 A CN202110182817 A CN 202110182817A CN 112779350 A CN112779350 A CN 112779350A
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wheat
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qgns
sicau
spikelet
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刘亚西
林宇
蒋孝军
周锟瑜
李彩霞
周红
石浩然
王智强
武方琨
侯帅
周婉琳
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Sichuan Agricultural University
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Abstract

本发明涉及分子标记辅助育种技术领域，具体涉及与小麦小穗粒数QTL QGns.sicau‑2D紧密连锁的分子标记及其应用。本发明的分子标记为KASP3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该分子标记与小麦小穗粒数QTL紧密连锁。检测分析表明，该分子标记能准确跟踪小麦小穗粒数QTL，预测小麦的小穗粒数特性，进而方便进行分子设计育种。分子标记KASP3能够提高小麦小穗粒数预测的准确性，以便快速筛选出具有增加小穗粒数的QTL的小麦品种或品系用于育种，可大大加快小麦高产品种的选育进程。

Description

与小麦小穗粒数QTLQGns.sicau-2D紧密连锁的分子标记及其 应用
技术领域
本发明涉及分子标记辅助育种技术领域，具体地说，涉及一种与小麦小穗粒数QTLQGns.sicau-2D紧密连锁的分子标记KASP3及其应用。
背景技术
小麦(Triticum aestivum L.)是世界上重要的粮食作物之一，超过40％的人口以小麦作为主食原料。在中国，小麦不管是在农业生产还是食品加工领域都占有极其重要的地位，是最主要的粮食作物之一。目前全球粮食生产的年增长率为0.9％，远远低于2050年为养活不断增长的世界人口所需的2.4％。因此，提高小麦产量迫在眉睫。由于耕地面积的不断减少和气候变化，培育高产小麦品种已然成为增加粮食总产量的主要战略之一。
小穗粒数是决定作物产量的关键因素。近年来，小穗粒数逐渐成为研究的热点。在水稻、大麦中都有对小穗粒数QTL研究的相关报道，而对于小麦小穗粒数的研究却是很少。Chen等利用Pubing 3504和Jing 4839构建的F2:3的遗传群体发现控制小穗粒数的QTL位于染色体1A， 4A，6D和7A染色体上(Chen D,Wu X,Wu K,et al.Novel and favorablegenomic regions for spike related traits in a wheat germplasm Pubing 3504withhigh grain number per spike under varying environments. Journal ofIntegrative Agriculture 2017,16(11):2386-2401)。Sakuma等在 2A染色体上定位到控制小穗粒数的QTL，可解释61％的表型变异 (Sakuma S,Golan G,Guo Z,et al.Unleashingfloret fertility in wheat through the mutation of a homeobox gene[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2019,116(11):5182–5187)。
小麦材料H461相对于小麦材料中国春具有多小穗粒数、多穗粒数、多小穗数、高千粒重和高穗粒重等特性。同时，小麦材料中国春的小穗粒数显著低于H461。因此，利用H461和中国春构建遗传研究群体，进一步验证小麦H461的小穗粒数特性，定位控制小穗粒数基因，寻找紧密连锁的分子标记，促进小穗粒数基因的图位克隆，同时为小麦特异小穗粒数材料的创制及高产育种提供新基因资源，进一步利用分子标记辅助选择，将增强小穗粒数预测的准确性，提高育种效率，加速实现增加小麦单产的目标。
分子标记辅助选择不依赖于表现型选择，即不受环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。竞争性等位基因特异性PCR (Kompetitive Allele Specific PCR)，可在广泛的基因组DNA样品中，对SNP和特定位点上的Indel进行精准的双等位基因检测。这种检测方法具有操作简便、特异性好、高通量、快速、检测成本低、结果准确等优势，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。因此，筛选出与小穗粒数QTL紧密连锁的，且适用于荧光定量PCR平台KASP技术的分子标记，不仅能对小麦小穗粒数基因进行选择，有效调控小麦的穗粒数，塑造合理的高穗粒数群体，同时提高了选择通量、速度和准确性，解决了大规模推广应用的技术瓶颈，对规模化改良小麦育种群体质量和产量具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种与小麦小穗粒数QTL QGns.sicau-2D紧密连锁的分子标记；本发明的另一目的是提供该分子标记的应用。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供与小麦小穗粒数QTL QGns.sicau-2D紧密连锁的分子标记，其为分子标记KASP3，核苷酸序列SEQ ID NO.1所示(5’-G CAAAGGAATCATTCAACGNTCACTCAAATAGGTGGCGTTCAGAT TT-3’；其中，N为A或G。)。在该序列的第20位碱基多态性为A或G，该多态性与小麦小穗粒数相关，第20位碱基为G对应小麦多小穗粒数。
分子标记KASP3与小麦小穗粒数QTL QGns.sicau-2D紧密连锁，二者共定位于2D染色体上标记AX-109316972～AX-110906716区段内，所述分子标记位于小麦小穗粒数QTLQGns.sicau-2D置信区间内。小麦小穗粒数QTL QGns.sicau-2D能够显著增加小麦小穗粒数，LOD 值大于3，解释26.57％的表型变异。
本发明还提供用于扩增所述分子标记的特异性引物组。
具体地，本发明提供用于荧光定量PCR扩增所述分子标记KASP3 的特异性引物组。
本领域技术人员可以基于KASP检测平台技术设计用于扩增分子标记KASP3的引物。优选地，所述特异性引物组包括序列如SEQ ID NO.2-4所示的引物。其中，SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3所示的引物的5’端分别连有不同的荧光探针。
KASP3-1:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCAAAGGAATC ATTCAACGA-3’；(SEQ IDNO.2)；
KASP3-2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCAAAGGAATC ATTCAACGG-3’；(SEQ IDNO.3)；
KASP3-3:5’-AAATCTGAACGCCACCTATTTG-3’；(SEQ ID NO.4)。
并且，引物KASP3-1和KASP3-2的5’端分别连有不同的荧光探针。
具体地，所述荧光探针的序列如下：
F探针：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(SEQ ID NO.5)，本发明的实施例中该探针结合FAM荧光基团。
H探针：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(SEQ ID NO.6) 本发明的实施例中该探针结合HEX荧光基团。
本发明还提供分子标记KASP3或上述特异性引物组的如下任一种应用：
(1)在鉴定小麦小穗粒数QTL QGns.sicau-2D中的应用；
(2)在筛选或鉴定多小穗粒数的小麦品种中的应用；
(3)在小麦分子标记辅助育种中的应用；
(4)在小麦种质资源改良中的应用。
本发明还提供一种鉴定小麦小穗粒数QTL QGns.sicau-2D的方法，以待测小麦的基因组DNA为模板，采用上述的特异性引物组进行荧光定量PCR扩增，根据PCR扩增结果对待测小麦进行基因分型。
优选地，所述荧光定量PCR扩增的10μL反应体系包括如下组分： 2×KASPMastermix 5μL，KASP Assay Mix 0.14μL，模板DNA 50ng、 Dnase/RNase-free去离子水加至总量为10μL；其中，KASP Assay Mix 含有核苷酸序列如SEQ ID NO.2-4所示的引物，三条引物的摩尔比为 2:2:5。
优选地，所述荧光定量PCR扩增的反应程序包括：95℃活化15min； 95℃变性20s，65℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低 1℃；94℃变性20s，57℃退火延伸60s，循环30次；37℃60s，采集荧光信号。
本发明提供的鉴定小麦小穗粒数QTL QGns.sicau-2D方法的判断标准为：含有小麦多小穗粒数QTL QGns.sicau-2D的小麦品种均出现与SEQ ID NO.3所示引物连接的荧光探针相同的荧光信号，而不含有小麦多小穗粒数QTL QGns.sicau-2D的小麦品种均出现与SEQ ID NO.3所示引物连接的荧光探针明显不同的荧光信号。
本发明中，小麦小穗粒数QTL QGns.sicau-2D及分子标记KASP3 是通过以下方法获得的：
(1)利用多小穗粒数小麦H461作为母本，以小麦中国春为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，采用单粒传法获得的F8代 RIL群体，随机选择300个株系构成遗传作图群体。
(2)用CTAB法提取所述的遗传作图群体的各株系的DNA，用Illumina 55K SNP芯片技术，以亲本H461和中国春的DNA为模板，进行基因分型，获得所述RIL群体的基因型资料。亲本H461的带型记为 A，亲本中国春的带型记为B。F8群体株系带型来源于H461的记为A，来源于中国春的记为B。
用CTAB法提取所述的亲本，F8群体的各单株的DNA，从数据库 http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index下载获得目标区间内scaffold序列信息，根据区间内55K SNP信息，利用DNAMAN 6.0 软件对差异位点进行KASP分子标记开发设计荧光定量引物。获得亲本H461的带型记为A，亲本中国春的带型记为B。
(3)小麦田间鉴定所述F8群体植株的小穗粒数。
(4)利用JoinMap4.0作图软件将获得的所述RIL群体基因型资料构建小麦分子连锁图谱，寻找最优的标记数和标记顺序，确定后续使用的连锁群。利用软件IciMapping 4.2的完备区间作图法(Inclusive Composite Interval Mapping)，并结合F8群体小穗粒数表型数据将小穗粒数QTL QGns.sicau-2D定位于2D染色体上AX-109316972～ AX-110906716的区段内。
(5)将目标区段内SNP位点转换为荧光定量PCR引物，用于后续筛选。利用DNAMAN6.0软件设计荧光定量PCR引物4对(表1)。荧光定量PCR引物设计标准：扩增引物长度18～30bp，扩增产物长度 45-70bp，退火温度57-62℃，GC含量在40％～60％之间。合成引物序列为：
正向引物1：F探针+扩增引物序列；
正向引物2：H探针+扩增引物序列；
反向引物：扩增引物序列；
F探针：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可结合FAM荧光基团)；
H探针：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可结合HEX荧光基团)；
表1 4对KASP引物序列及扩增片段长度
Figure BDA0002941879150000061
(6)竞争性等位基因特异性PCR(KASP)分析
a)亲本之间多态性分子标记的筛选：选取上述设计的4对引物，以亲本H461和中国春的DNA为模板，进行PCR扩增，共获得1对效果良好的分子标记引物，命名为KASP3-1/2/3(核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2-4所示)。扩增产物为具有多态性的分子标记KASP3，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
b)F8群体的KASP分析：用上述步骤获得的具有多态性的分子标记KASP3的PCR引物，扩增亲本H461、中国春和F8群体植株的DNA，进行基因型鉴定，获得分子标记数据。亲本H461的类型记为A，扩增片段大小长47bp，单碱基差异位点为G。亲本中国春的类型记为B，扩增片段长47bp，单碱基差异位点为A。F8群体株系类型来源于H461 的记为A，来源于中国春的记为B。
本发明的有益效果在于：本发明首次公开了来自小麦H461的小穗粒数QTLQGns.sicau-2D，位于小麦2D染色体，显著增加了小麦小穗粒数。该QTL在小麦产量(调控小穗粒数)育种中具有较高的利用价值。本发明首次公开了基于荧光定量PCR平台精确检测小麦H461 新小穗粒数QGns.sicau-2D的分子标记KASP3，且为共显性标记，检测准确高效、扩增方便稳定。本发明公开的分子标记KASP3与小穗粒数QTL QGns.sicau-2D显著相关，呈现共分离标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，提高适应不同环境的小麦特定小穗粒数品种的选择鉴定效率，且成功率高。
附图说明
图1为本发明实施例1中小麦H461小穗粒数QTL QGns.sicau-2D在 2D染色体上的位置及与分子标记KASP3之间的连锁遗传图谱。
图2为本发明实施例2中利用荧光定量PCR引物对H461、中国春、川麦107三叶期的叶片DNA做基因型分型的结果。
图3为本发明实施例2中H461×川麦107的F8 RIL群体后代利用荧光定量PCR引物进行基因型分型的结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1小麦小穗粒数QTL QGns.sicau-2D及分子标记KASP3的获得
在本发明中，小麦小穗粒数QTL QGns.sicau-2D及分子标记 KASP3是通过以下方法获得的：
(1)利用多小穗粒数小麦H461作为母本，以小麦中国春为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，采用单粒传法获得的F8代 RIL群体，随机选择300个株系构成遗传作图群体。
(2)用CTAB法提取所述的遗传作图群体的各株系的DNA，用 55K SNP芯片技术，以亲本H461和中国春的DNA为模板，进行基因分型，获得所述RIL群体的基因型资料。亲本H461的带型记为A，亲本中国春的带型记为B。F8群体株系带型来源于H461的记为A，来源于中国春的记为B。
用CTAB法提取所述的亲本，F8群体的各单株的DNA，从数据库 http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index下载获得目标区间内scaffold序列信息，根据区间内55K SNP信息，利用DNAMAN 6.0 软件对差异位点进行KASP分子标记开发设计荧光定量引物。获得亲本H461的带型记为A，亲本中国春的带型记为B。
(3)小麦田间鉴定所述F8群体植株的小穗粒数。
(4)利用JoinMap4.0作图软件将获得的所述RIL群体基因型资料构建小麦分子连锁图谱，寻找最优的标记数和标记顺序，确定后续使用的连锁群。利用软件IciMapping 4.2的完备区间作图法(Inclusive Composite Interval Mapping)，并结合F8群体小穗粒数表型数据将小穗粒数QTL QGns.sicau-2D定位于2D染色体上一个6.68cM(侧翼标记 AX-109316972和AX-110906716)的区段内。
(5)将SNP标记AX-109316972、AX-110906716转换荧光定量 PCR引物，用于后续筛选。利用DNAMAN 6.0软件设计荧光定量PCR 引物4对(表1)。荧光定量PCR引物设计标准：扩增引物长度18～30bp，扩增产物长度45-70bp，退火温度57-62℃，GC含量在40％～60％之间。合成引物序列为：
正向引物1：F探针+扩增引物序列；
正向引物2：H探针+扩增引物序列；
反向引物：扩增引物序列；
F探针：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可结合FAM荧光基团)；
H探针：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可结合HEX荧光基团)。
(6)竞争性等位基因特异性PCR(KASP)分析
a)亲本之间多态性分子标记的筛选：选取上述设计的4对引物，以亲本H461和中国春的DNA为模板，进行PCR扩增，共获得1对效果良好的分子标记引物，命名为KASP3-1/2/3(核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2-4所示)。扩增产物为具有多态性的分子标记KASP3，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其序列中n为a或g。
b)F8群体的KASP分析：用上述步骤获得的具有多态性的分子标记KASP3的PCR引物，扩增亲本H461、中国春和F8群体植株的DNA，进行基因型鉴定，获得分子标记数据。亲本H461的类型记为A，扩增片段大小长47bp，单碱基差异位点为G。亲本中国春的类型记为B，扩增片段长47bp，单碱基差异位点为A。F8群体株系类型来源于H461 的记为A，来源于中国春的记为B。
c)利用软件IciMapping 4.2的完备区间作图法(Inclusive Composite IntervalMapping)，并结合F8群体小穗粒数表型数据，发现分子标记KASP3与小穗粒数QTLQGns.sicau-2D位点紧密连锁，结果如图1所示。由图1可知，小穗粒数QTL QGns.sicau-2D定位在标记 AX-109316972和AX-110906716之间的6.68cM的区段内，而分子标记 KASP3与AX-109316972共分离，与QTL呈紧密连锁。
小麦多小穗粒数QTL QGns.sicau-2D在2D染色体上的位置及与分子标记KASP3之间的连锁遗传图谱见图1。
实施例2与小麦小穗粒数QTL QGns.sicau-2D紧密连锁的分子标记 KASP3的应用
1、DNA提取
试验材料选取H461、中国春及川麦107，其中中国春、川麦107 为小穗粒数少的小麦材料，H461为小穗粒数多的小麦材料。采用 CTAB法提取小麦样品三叶期的叶片DNA。
2、检测小麦小穗粒数QTL QGns.sicau-2D的引物的筛选
2.1引物设计
将SNP标记AX-109316972和AX-110906716转换设计荧光定量 PCR引物，用于后续筛选。利用DNAMAN 6.0软件设计荧光定量PCR 引物4对(见表1)。荧光定量PCR引物设计标准：扩增引物长度18～30bp，扩增产物长度45-70bp，退火温度57-62℃，GC含量在40％～60％之间。合成引物序列为：
正向引物1：F探针+扩增引物序列；
正向引物2：H探针+扩增引物序列；
反向引物：扩增引物序列；
F探针：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可结合FAM荧光基团)；
H探针：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可结合HEX 荧光基团)。
2.2荧光定量PCR平台测试引物及其亲本间的差异性
(1)提取H461，中国春、川麦107三叶期的叶片DNA。
(2)以待测小麦的基因组DNA为模板，基于KASP检测平台技术设计引物，进行荧光定量PCR扩增；
其中，步骤2的引物序列如下：
KASP3-1:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCAAAGGAATC ATTCAACGA-3’；
KASP3-2:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCAAAGGAATC ATTCAACGG-3’；
KASP3-3:5’-AAATCTGAACGCCACCTATTTG-3’；
并且，引物KASP3-1和KASP3-2的5’端分别连有不同的荧光探针；
所述荧光探针的序列如下：
F探针：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’(可结合FAM荧光基团)；
H探针：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’(可结合HEX荧光基团)。
(3)荧光定量PCR扩增反应体系：2×KASP Mastermix 5μL，KASP Assay Mix 0.14μL，模板DNA 50ng、Dnase/RNase-free去离子水加至总量为10μL；其中，KASP Assay Mix中含有引物KASP3-1、KASP3-2 和KASP3-3，体积比为2:2:5。即，在KASP Assay Mix中，将浓度为100μM的引物KASP3-1、KASP3-2和KASP3-3按2:2:5体积比混合。
(4)荧光定量PCR程序：95℃活化15min；95℃变性20s，65℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低1℃；94℃变性20s， 57℃退火延伸60s，循环30次；37℃60s，采集荧光信号。
(5)分析PCR产物的具体方法如下：含有小麦多小穗粒数QTL QGns.sicau-2D的小麦样本均出现与小麦H461相同的基因型，记为A 型，而不含有小麦多小穗粒数QTLQGns.sicau-2D的小麦品种均出现与小麦H461明显不同的荧光信号，如中国春、川麦107，记为B型。 H461、中国春、川麦107用KASP引物做基因型分型的结果见图2。
3、群体检测过程中引物序列KASP3-1/2/3的适用性
(1)以H461为母本，川麦107为父本杂交得到F1，F1自交获得F2，通过单粒传法加代至F8代RIL验证群体。提取群体中各株系三叶期的叶片DNA。
(2)以步骤(1)所得的DNA作为模板，利用本发明所提供的引物进行荧光定量PCR扩增，荧光染料为SsoFast EvaGreen。
(3)荧光定量PCR扩增反应体系：2×KASP Mastermix 5μL，KASP Assay Mix 0.14μL，模板DNA 50ng、Dnase/RNase-free去离子水加至总量为10μL；其中，KASP Assay Mix中含有引物KASP3-1、KASP3-2 和KASP3-3，体积比为2:2:5。即，在KASP Assay Mix中，将浓度为100μM的引物KASP3-1、KASP3-2和KASP3-3按2:2:5体积比混合后，再吸取混合液0.14μL。
(4)荧光定量PCR程序：95℃活化15min；95℃变性20s，65℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低1℃；94℃变性20s， 57℃退火延伸60s，循环30次；37℃60s，采集荧光信号。
(5)分析PCR产物的具体方法如下：含有小麦多小穗粒数QTL QGns.sicau-2D的小麦样本均出现与小麦H461相同的基因型，记为A 型，而不含有小麦多小穗粒数QTLQGns.sicau-2D的小麦品种均出现与小麦H461明显不同的荧光信号，记为B型，结果如图3所示。随机抽检107株株系，51株能扩增出与H461相同类型的片段，为小麦小穗粒数QTLQGns.sicau-2D的植株，预测株系植株小穗粒数较高。56株能扩增出与中国春、川麦107相同的B型片段，为不含有小麦多小穗粒数QTL QGns.sicau-2D的植株，预测这些植株小穗粒数较低。
(6)小麦田间鉴定该107个F8植株的小穗粒数，结果见表2，小穗粒数长QTLQGns.sicau-2D的分子标记KASP3预测遗传群体小穗粒数的结果。与H461类型相同的植株平均小穗粒数为5.48个，显著高于与中国春、川麦107类型的植株平均小穗粒数为5.10个。实际结果与预期结果一致，说明本发明的小穗粒数QTL QGns.sicau-2D确实具有显著增加小穗粒数的作用，且分子标记KASP3可以用于跟踪鉴定小穗粒数QTL QGns.sicau-2D。
表2 KASP3在遗传群体中分型结果
Figure BDA0002941879150000121
Figure BDA0002941879150000131
Figure BDA0002941879150000141
Figure BDA0002941879150000151
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 与小麦小穗粒数QTL QGns.sicau-2D紧密连锁的分子标记及其应用
<130> KHP211111107.5
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcaaaggaat cattcaacgn tcactcaaat aggtggcgtt cagattt 47
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtgacc aagttcatgc tgcaaaggaa tcattcaacg a 41
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaaggtcgga gtcaacggat tgcaaaggaa tcattcaacg g 41
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaatctgaac gccacctatt tg 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaaggtcgga gtcaacggat t 21
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaaggtgacc aagttcatgc tgaacgccac ctatttgagt gac 43
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaggtcgga gtcaacggat tgaacgccac ctatttgagt gat 43
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caatcgcaaa ggaatcattc 20
<210> 10
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaaggtgacc aagttcatgc tcacgtaagt aaccggaata agataga 47
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaaggtcgga gtcaacggat tcacgtaagt aaccggaata agatagc 47
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
catcgagcag ttccatatca ttatag 26
<210> 13
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaaggtgacc aagttcatgc tcgtaagtaa ccggaataag ataga 45
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaaggtcgga gtcaacggat tcgtaagtaa ccggaataag atagc 45
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcgagcagtt ccatatcatt atag 24

Claims (10)

1.与小麦小穗粒数QTL QGns.sicau-2D紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为KASP3，所述分子标记与小麦小穗粒数QTL QGns.sicau-2D共定位于小麦2D染色体上标记AX-109316972～AX-110906716区段内，所述分子标记位于小麦小穗粒数QTLQGns.sicau-2D置信区间内。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在所述序列的第20位碱基多态性为A或G。
3.根据权利要求1或2所述的分子标记，其特征在于，所述小麦小穗粒数QTLQGns.sicau-2D能够显著增加小麦小穗粒数，LOD值大于3，解释26.57％的表型变异。
4.用于扩增权利要求1～3任一项所述分子标记的特异性引物组。
5.根据权利要求4所述的特异性引物组，其特征在于，所述特异性引物组包括序列如SEQ ID NO.2-4所示的引物。
6.根据权利要求5所述的特异性引物组，其特征在于，SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3所示的引物的5’端分别连有不同的荧光探针。
7.权利要求1～3任一项所述分子标记或权利要求4-6任一所述特异性引物组的如下任一种应用：
(1)在鉴定小麦小穗粒数QTL QGns.sicau-2D中的应用；
(2)在筛选或鉴定多小穗粒数的小麦品种中的应用；
(3)在小麦分子标记辅助育种中的应用；
(4)在小麦种质资源改良中的应用。
8.一种鉴定小麦小穗粒数QTL QGns.sicau-2D的方法，其特征在于，以待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求4-6任一所述的特异性引物组进行荧光定量PCR扩增，根据PCR扩增结果对待测小麦进行基因分型。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的10μL反应体系包括如下组分：2×KASP Mastermix 5μL，KASP Assay Mix 0.14μL，模板DNA 50ng、Dnase/RNase-free去离子水加至总量为10μL；其中，KASP Assay Mix含有核苷酸序列如SEQ IDNO.2-4所示的引物，三条引物的摩尔比为2:2:5；
和/或，所述荧光定量PCR扩增的反应程序包括：95℃活化15min；95℃变性20s，65℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低1℃；94℃变性20s，57℃退火延伸60s，循环30次；37℃60s，采集荧光信号。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，含有小麦多小穗粒数QTLQGns.sicau-2D的小麦品种均出现与SEQ ID NO.3所示引物连接的荧光探针相同的荧光信号，而不含有小麦多小穗粒数QTL QGns.sicau-2D的小麦品种均出现与SEQ ID NO.3所示引物连接的荧光探针明显不同的荧光信号。
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