CN112772797B - 提高蜂王育成量的饲料添加剂及含该饲料添加剂的饲料 - Google Patents
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Abstract
本发明所提供的一种提高蜂王育成量的饲料添加剂，其活性成分为3‑脱氮基腺苷。实验表明对用工蜂饲料喂养的工蜂幼虫施用一定浓度的DAA能够显著降低幼虫总体的m6A甲基化水平，并诱导发育出蜂王的特征。因此，应用DAA可以在人工培养的情况下，仅用成本较低的工蜂饲料，就可以批量培育蜂王，是一种快捷、高效、可控的蜂王培育方法。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种提高蜂王育成量的饲料添加剂及含该饲料添加剂的饲料。
背景技术
在蜜蜂级型分化过程中，遗传物质相同的雌性蜜蜂幼虫，因食物不同而发育为可育蜂王和不育工蜂两个迥异的级型。蜂王的数量很少，自然情况下，一个蜂群只培育一只蜂王。但在实际生产中，需要培育数量较多的蜂王以扩大蜂群数量，生产王浆或培育蜂王品种，达到蜂产品提质增产的目的。当前的普遍方法是通过在蜂房加入人工王台诱导蜜蜂育王，但这样操作繁琐且不能脱离蜂群，由于蜜蜂对人工王台的接受度有限，培育的蜂王数量并不太多。因此，在蜜蜂级型分化的机制入手，通过人工培育手段提高蜂王育种数量成为蜂业的重大需求。
发明内容
针对于背景技术中存在的问题与限制，本发明的目的在于提供一种提高蜂王育成量的饲料添加剂及含该饲料添加剂的饲料。
本发明提供抑制mRNA m6A修饰的物质在培育蜂王中的应用或在制备培育蜂王产品中的应用。所述产品可为饲料添加剂或饲料。
上述应用中，所述抑制mRNA m6A修饰的物质含有3-脱氮基腺苷，或所述抑制mRNAm6A修饰的物质为3-脱氮基腺苷。
本发明所提供的一种提高蜂王育成量的饲料添加剂，其活性成分为3-脱氮基腺苷(3-deazaadenosine，DAA)。
上饲料添加剂中，所述3-脱氮基腺苷在蜜蜂饲料中的终浓度为300μM-400μM。
上饲料添加剂中，所述3-脱氮基腺苷饲喂量为每日每只幼虫饲喂1.2μg-2.6μg。
本发明还提供含有上述饲料添加剂的蜜蜂饲料。
上述蜜蜂饲料中，所述蜜蜂饲料由工蜂基础饲料和所述饲料添加剂混合而成，所述饲料添加剂按照所述3-脱氮基腺苷在工蜂基础饲料中的终浓度为300μM-400μM的量添加。
上述蜜蜂饲料中，所述工蜂基础饲料可由如下重量份数的原料混合而成：3-6份王浆、0.5-0.7份果糖、0.5-0.7份葡萄糖、0.05-0.15份酵母提取物，3.7份水。
上述蜜蜂饲料中，所述工蜂基础饲料优选由如下重量份数的原料混合而成：5份王浆、0.6份果糖、0.6份葡萄糖、0.1份酵母提取物，3.7份水。
上述蜜蜂饲料中，所述蜜蜂饲料饲喂量为每日每只幼虫饲喂15-25μl，优选20μl。
本发明还保护一种提高蜂王育成量的方法，包括以含有上述饲料添加剂的蜜蜂饲料饲喂工蜂幼虫。
上述饲料添加剂、或上述蜜蜂饲料、或上述方法在蜜蜂养殖中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的一种提高蜂王育成量的饲料添加剂，其活性成分为3-脱氮基腺苷。实验表明对用工蜂饲料喂养的工蜂幼虫施用一定浓度的DAA能够显著降低幼虫总体的m6A甲基化水平，并诱导发育出蜂王的特征。因此，应用DAA可以在人工培养的情况下，仅用成本较低的工蜂饲料，就可以批量培育蜂王，是一种快捷、高效、可控的蜂王培育方法。
附图说明
图1为本发明实施例1中比较工蜂幼虫与同日龄蜂王幼虫的m6A甲基化水平的结果图片。图1中的A图为LC-MS/MS定量测量比较工蜂幼虫与同日龄蜂王幼虫中m6A甲基化水平的结果图。图1中的B图为m6A-seq检测出的各日龄工蜂幼虫样本与同日龄蜂王幼虫样本中被m6A修饰的转录本数量和m6A甲基化数量。图1中的C图为m6A-seq比较蜂王幼虫和同日龄工蜂幼虫之间m6A甲基化差异的火山图，右侧点表示高甲基化，而左侧点表示低甲基化，每个面板中显示了不同的m6A甲基化数。
图2为本发明实施例1中DAA对m6A甲基化的抑制诱导工蜂发育出蜂王特征的图片。图2中的A图为LC-MS/MS分析不同浓度DAA处理后蜜蜂幼虫样品中mRNA的m6A/A比值的结果图。图2中的B图为蜂王和工蜂幼虫各生长发育阶段保幼激素滴度的区别，引用自KlausHartfelder和WolfEngels的研究(1998)。图2中的C图为用300μM和400μM DAA处理工蜂幼虫造成保幼激素滴度的变化图。图2中的D图为DAA处理组与未处理组之间的蜂王发育特异标记基因(AmTOR，AmIRS和AmEgfr)的表达差异。表达量为以AmActin(GB44311)为内参基因的相对表达量。数据为三个独立实验的平均值±标准误，*代表显著性分析结果为P＜0.05，**代表显著性分析结果为P<0.01。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1974年首次在mRNA中发现腺嘌呤上的一个甲基，这个被修饰的碱基被称作N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine)，简写为m6A。发明人进行了如下实验：
1.工蜂幼虫中m6A甲基化含量明显高于蜂王幼虫
所用蜜蜂为意大利蜜蜂(Apis mellifera)，购自蜂场，由蜂农饲养。
在蜂王和工蜂的三个幼虫发育阶段收集了五种幼虫样本：1日龄幼虫、3日龄蜂王和工蜂幼虫、5日龄蜂王和工蜂幼虫。从这五种样品中分别分离mRNA，用三重四级杆串联质谱(LC-MS/MS)定量测量了mRNA上m6A甲基化水平。结果见图1的A图，表明不论3日龄还是5日龄，工蜂幼虫的m6A水平高于同日龄蜂王幼虫。
通过m6A-seq技术，用m6A抗体(公司Synaptic Systems，货号202003)免疫共沉淀含有m6A甲基化的转录本并通过高通量测序(测序平台Illumina HiSeq X Ten sequencingplatform)确定被m6A甲基化的基因。m6A-seq结果显示，不论m6A甲基化的数量还是被m6A修饰的基因数量，工蜂幼虫都显著高于同日龄的蜂王幼虫(图1的B图)。火山图分析结果也表明，不论3日龄还是5日龄，工蜂幼虫都具有较多的甲基化上调的基因(图1的C图)。以上结果表明，工蜂幼虫跟蜂王幼虫相比具有更高的m6A甲基化水平。根据以上研究结果，发明人推测，通过降低工蜂幼虫的m6A甲基化水平肯能会诱导工蜂幼虫发育为蜂王。更重要的是，通过饲喂甲基化抑制药物，可以降低幼虫的甲基化水平，而不会对幼虫的生长发育造成破坏性影响。
2.用DAA抑制m6A甲基化可以诱导工蜂发育出蜂王特征
基于以上的研究基础，发明人选择了一种甲基化抑制药物——3-脱氮基腺苷(3-deazaadenosine，DAA)。DAA是一种S-腺苷高半胱氨酸水解酶抑制剂，能够抑制S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲基化，已在细胞实验中证实DAA能够强烈抑制m6A甲基化(Fustin et al.,2013)，因此发明人选用DAA作为甲基化抑制药物。DAA是应用在人体的抗炎、抗增殖、抗HIV药物，在蜜蜂中从未被使用过。
首先通过筛查不同DAA浓度下的m6A甲基化水平来优化使用剂量。具体实验如下：
1日龄工蜂幼虫从蜂巢中移到48孔培养板上，在温度35℃和95％HR湿度条件的培养箱中培养。每日每只幼虫饲喂20μl工蜂基础饲料(每10g饲料的配方为：5g王浆、0.6g果糖、0.6g葡萄糖、0.1g酵母提取物，水3.7g)。
在给2日龄工蜂幼虫的饲料中加入不同浓度的DAA，每个浓度处理100只幼虫。具体每个处理的饲料配方如下：
对照：工蜂基础饲料(每10g饲料的配方为：5g王浆、0.6g果糖、0.6g葡萄糖、0.1g酵母提取物，水3.7g)。
200μM处理饲料配方：将DAA添加到工蜂基础饲料中，使得DAA的终浓度为200μM。
300μM处理饲料配方：将DAA添加到工蜂基础饲料中，使得DAA的终浓度为300μM。
400μM处理饲料配方：将DAA添加到工蜂基础饲料中，使得DAA的终浓度为400μM。
收集4日龄工蜂幼虫并分离mRNA，通过LC-MS/MS定量m6A甲基化水平，结果见图2的A图。与对照样品相比，300μM和400μM的DAA抑制了约50％的工蜂幼虫m6A修饰。此结果一方面验证了DAA对m6A甲基化的抑制效果，另一方面确定了300μM和400μM作为应用DAA诱导蜂王发育的使用剂量。
发明人继续探查是否DAA药物的施用使工蜂幼虫发育出了蜂王特征。保幼激素(Juvenile hormone，JH)滴度是区分蜂王与工蜂的公认标准之一(Hartfelder andEngels,1998(见图2的B图)；Kamakura,2011)。从3日龄到5日龄，蜂王幼虫的保幼激素滴度要显著高于工蜂幼虫(Hartfelder and Engels,1998；Kamakura,2011；Rembold,1987)。已知4日龄是蜂王与工蜂保幼激素滴度差别最大的阶段。因此，发明人分别用300μM处理饲料和400μM处理饲料饲喂2日龄工蜂幼虫，并在4日龄收集样品进行保幼激素的检测。发现与同日龄未处理的工蜂幼虫(即饲喂工蜂基础饲料的工蜂幼虫，CK)相比，用300μM或400μM DAA处理的工蜂幼虫在4日龄时的保幼激素显著提高(图2的C图)，表现出了蜂王的特征。此外，发明人以qPCR分析了在蜂王幼虫中特异高表达的级型分化标记基因(AmTOR，AmIRS和AmEgfr)的表达情况，这些基因在蜂王的发育过程中不可或缺，当在幼虫期敲低这些基因的表达，蜂王发育将被抑制(Kamakura,2011；Mutti et al.,2011)。qPCR所用引物如下：
AmEgfr引物：
正向引物：CAACGACCATGTACCTGAAGGA(如序列表序列1所示)；
反向引物：GCCCCTGCTCTAGAGGACTCA(如序列表序列2所示)。
AmTOR引物：
正向引物：AAGATCTGATGCTCAGGGAATGA(如序列表序列3所示)；
反向引物：ACATGGTACTCCTTTCTTTGGTAATGT(如序列表序列4所示)。
AmIRS引物：
正向引物：GACCGCCAGGTAAAAGATTTGT(如序列表序列5所示)；
反向引物：GCTGTTCTCGTGGCTCCTAA(如序列表序列6所示)。
AmActin引物：
正向引物：AGGAATGGAAGCTTGCGGTA(如序列表序列7所示)；
反向引物：AATTTTCATGGTGGATGGTGC(如序列表序列8所示)。
实验结果见图2的D图，表明，DAA处理后，4日龄工蜂幼虫中AmTOR，AmIRS和AmEgfr的基因表达水平均显著上调(P<0.01)(图2D)。这表明DAA处理诱导工蜂出现了蜂王发育的特征。
以上实验结果表明，对用工蜂饲料喂养的工蜂幼虫施用300μM和400μM的DAA能够显著降低幼虫总体的m6A甲基化水平，并诱导发育出蜂王的特征。因此，应用DAA药剂，可以在人工培养的情况下，仅用成本较低的工蜂饲料，就可以批量培育蜂王，是一种快捷、高效、可控的蜂王培育方法。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
参考文献
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序列表
<110> 中国农业科学院蜜蜂研究所
<120> 提高蜂王育成量的饲料添加剂及含该饲料添加剂的饲料
<130> GNCSY203291
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caacgaccat gtacctgaag ga 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcccctgctc tagaggactc a 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagatctgat gctcagggaa tga 23
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acatggtact cctttctttg gtaatgt 27
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaccgccagg taaaagattt gt 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctgttctcg tggctcctaa 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aggaatggaa gcttgcggta 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aattttcatg gtggatggtg c 21
Claims (7)
1.3-脱氮基腺苷在提高蜂王育成量中的应用，所述3-脱氮基腺苷在蜜蜂饲料中的终浓度为300µM-400µM，所述3-脱氮基腺苷饲喂量为每日每只幼虫饲喂1.2µg-2.6µg。
2.蜜蜂饲料，其特征在于：含有饲料添加剂，所述饲料添加剂的活性成分为3-脱氮基腺苷；所述蜜蜂饲料中3-脱氮基腺苷的终浓度为300µM-400µM，所述3-脱氮基腺苷饲喂量为每日每只幼虫饲喂1.2µg-2.6µg。
3.根据权利要求2所述的蜜蜂饲料，其特征在于：所述蜜蜂饲料还含有工蜂基础饲料，所述工蜂基础饲料由如下重量份数的原料混合而成：3-6 份王浆、0.5-0.7 份果糖、0.5-0.7 份葡萄糖、0.05-0.15 份酵母提取物，3.7 份水。
4.根据权利要求3所述的蜜蜂饲料，其特征在于：所述蜜蜂饲料饲喂量为每日每只幼虫饲喂15-25µl。
5.一种提高蜂王育成量的方法，其特征在于：包括以权利要求2所述的蜜蜂饲料饲喂工蜂幼虫。
6.权利要求2-4任一所述的蜜蜂饲料在提高蜂王育成量中的应用。
7.权利要求5所述的方法在提高蜂王育成量中的应用。
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| 雌性蜜蜂幼虫发育与dynactin p62基因甲基化;石元元等;《中国蜂业》;20110910;4-9 * |
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