CN112752579A - 用于促进健康的Anaerostipes hadrus - Google Patents

Abstract

本公开涉及活的生物治疗产品、益生菌、包含所述益生菌的药物组合物、以及使用它们治疗胃肠疾病或病症的方法。在一些方面，本公开提供了包含Anaerostipes hadrus细菌菌株的此类组合物及其在治疗肠道疾病或病症中的用途。

Description

用于促进健康的Anaerostipes hadrus

对相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年6月25日提交的美国临时申请序列号62/689,278的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

对序列表的交叉引用

通过电子方式提交的文本文件的内容通过引用完整并入本文：序列表文件名SG301Dseqlist.txt(光盘上的13684字节)的计算机可读格式副本，于2018年6月25日创建。

发明领域

本公开涉及新的且治疗有效的组合物，其包含微生物，特别是Anaerostipeshadrus。该微生物组合物尤其可应用于治疗、改善和/或预防胃肠炎性疾病和/或上皮屏障功能病症。

发明背景

炎性肠病(IBD)是病因学未知的异质性疾病，其导致频繁且带血的肠运动，伴有对胃肠粘膜的组织病理学损害(Zhang et al.,2017,Front Immunol,8:942)。虽然疾病的特定触发物仍然较差限定，但疾病进展的一项提议提示，肠道屏障功能的破坏使细菌或细菌成分移位入粘膜组织中(Coskun,2014,Front Med(Lausanne),1:24；Martini et al.,2017,Cell Mol Gastroenterol Hepatol,4:33-46)。细菌移位导致炎症信号传导的激活，这触发额外的屏障破坏，从而导致屏障破坏、细菌移位和炎症的循环放大环。尽管许多当前的疗法靶向炎症，然而促进粘膜愈合的疗法的缺乏为促进上皮修复和肠屏障完整性的新疗法提供了机会。

胃肠道的微生物组(microbiome)包括多种多样的一批微生物，主要是原核生物，其在宿主生物体的健康中起重要作用。微生物组的复杂性就其群体构成和复合功能而言最近已成为研究的重点领域，因为研究越来越显示对微生物组的操作可以提供健康益处，并可以有效治疗多种疾病和病症。当前，出售许多益生菌，它们含有活细菌和酵母，并被认为可以提升人体中天然存在的这些微生物的益处。越来越多地开发活生物治疗产品(LBP)，用于控制的临床研究和疾病治疗方面的监管批准。

发明概述

如本文所述进行的研究设计为分析健康受试者的肠和诊断为炎性肠病的患者中存在的细菌。重要的是，这项研究能够表征细菌丰度和代谢活性两者。此外，该数据与通过RNAseq分析进行的宿主基因表达分析相关。这项研究和分析的结果鉴定Anaerostipeshadrus在诊断为溃疡性结肠炎或克罗恩氏病的受试者中被消减，从而显示肠道中升高的A.hadrus水平能够有益于受试者的肠道健康。

一方面，提供了用于在有此需要的受试者中治疗炎性肠疾病的方法，其包括对所述受试者施用包含治疗有效量的细菌的组合物，所述细菌具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7至少75％、80％或85％相同的16S rRNA基因。如本文提供的组合物通常包含细菌群体，其中群体的每个成员具有基本上相同的16S rRNA基因序列。

在一些实施方案中，细菌具有16S rRNA基因，其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。

在一些实施方案中，该细菌是Anaerostipes hadrus(A.hadrus)的菌株。

在一些实施方案中，受试者已经被诊断为患有肠炎症。在其他实施方案中，肠炎症在小肠和/或大肠中。在其他实施方案中，肠炎症在直肠中。在其他实施方案中，患者具有与炎性肠病有关的至少一种症状。

在一些实施方案中，受试者已经被诊断为和/或患有炎性肠病(IBD)。在其他实施方案中，IBD选自下组：克罗恩氏病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、隐窝炎、肠易激综合征、肠感染、GI粘膜炎及其组合。在一些实施方案中，受试者已经被诊断患有CD。在其他实施方案中，受试者已经被诊断患有UC。

在一些实施方案中，受试者已经被诊断患有肠溃疡。在其他实施方案中，患者已经被诊断患有引流肠皮肤(enterocutaneous)和/或直肠阴道瘘。

在一些实施方案中，受试者已经被诊断患有CD。在其他实施方案中，CD是轻度活性CD。在其他实施方案中，CD是中等至严重活性的CD。在其他实施方案中，受试者已经被诊断为小儿CD。

在一些实施方案中，受试者已经被诊断患有UC。在其他实施方案中，UC是轻度活性UC。在其他实施方案中，UC是中等至严重活性的UC。在其他实施方案中，受试者已经被诊断为小儿UC。

在一些实施方案中，受试者已经被诊断为粘膜炎。在其他实施方案中，粘膜炎是口腔粘膜炎。在其他实施方案中，粘膜炎是化学疗法诱导的粘膜炎、放射疗法诱导的粘膜炎、化学疗法诱导的口腔粘膜炎或放射疗法诱导的口腔粘膜炎。在其他实施方案中，粘膜炎是胃肠粘膜炎。在其他实施方案中，胃肠粘膜炎是小肠、大肠或直肠的粘膜炎。

在一些实施方案中，受试者处于从IBD的临床缓解中。在其他实施方案中，受试者处于从UC、小儿UC、CD或小儿CD的临床缓解中。

在一些实施方案中，受试者患有CD或UC以外的炎性肠疾病或病症。

在一些实施方案中，施用减轻受试者中胃肠炎症和/或减轻与炎性肠病有关的肠粘膜炎症。在其他实施方案中，施用改善受试者中的肠上皮细胞屏障功能或完整性。

在一些实施方案中，在施用后，受试者经历与炎性肠疾病或病症有关的至少一种症状的减轻。在其他实施方案中，至少一种症状选自下组：腹部疼痛、便血、便脓、发烧、体重减轻、频繁腹泻、疲劳、食欲不振、恶心、抽筋、贫血、里急后重和直肠流血。在其他实施方案中，在施用后，受试者经历腹泻的频率降低、便血减少和/或直肠出血减少。

在一些实施方案中，受试者已经经历对常规疗法的不充分响应。在其他实施方案中，常规疗法是用氨基水杨酸盐/酯、皮质类固醇、硫嘌呤、甲氨蝶呤、JAK抑制剂、鞘氨醇1-磷酸(S1P)受体抑制剂、抗整合蛋白生物制剂、抗ILI2/23R或抗IL23/pI0生物制剂和/或抗肿瘤坏死因子剂或生物制剂的治疗。

在一些实施方案中，施用增加受试者的肠腔中粘蛋白的量。

在一些实施方案中，施用包括对受试者口服施用药物组合物。在其他实施方案中，对胃肠腔施用。

在一些实施方案中，还对受试者施用至少一种第二治疗剂。在其他实施方案中，至少一种第二治疗剂选自下组：益生元(prebiotic)、抗腹泻剂、抗炎剂、抗体、抗生素或免疫抑制剂。在其他实施方案中，至少一种第二治疗剂是氨基水杨酸盐/酯、类固醇或皮质类固醇。在其他实施方案中，至少一种第二治疗剂选自下组：阿达木单抗(adalimumab)、pegol、戈利木单抗(golimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、维多珠单抗(vedolizumab)、乌斯他单抗(ustekinumab)、托法替尼(tofacitinib)和塞妥珠单抗(certolizumab)或certolizumab pegol。

在一方面，提供了包含治疗有效量的细菌的组合物，其中所述细菌包含16S rRNA基因，其与SEQ ID NO:8至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。在一些实施方案中，组合物还包含治疗上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，如本文提供的组合物包含细菌群体，其中群体的每个成员具有基本上相同的16S rRNA基因序列。

在一些实施方案中，细菌是从细菌培养物中基本上纯化的。在其他实施方案中，细菌是活的。

在一些实施方案中，该细菌是A.hadrus菌株。

在另一方面，提供了用于诊断受试者中IBD的方法，其中该方法包括测量来自受试者的样品中的A.hadrus。

在一些实施方案中，样品是粪便样品。

在一些实施方案中，测量来自受试者的样品中的A.hadrus包括检测和定量对A.hadrus特异性的基因组DNA和/或RNA。在其他实施方案中，基因组DNA是16S DNA。在其他实施方案中，RNA是16S RNA。在其他实施方案中，测量包括检测和定量包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或其片段的序列。

在一些方面，提供了将受试者诊断为患有IBD的方法，其中该方法包括检测和/或定量来自受试者的样品中的A.hadrus。

在一些实施方案中，样品是粪便样品。在其他实施方案中，样品是肠活组织检查。

在一些实施方案中，方法包括在样品中检测和/或定量核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7或其片段至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同

附图简述

图1A和1B。如实施例1所述，在测序数据处理的每个步骤时的序列计数分布。显示了DNA-16S(图1A)和RNA-16S(图1B)两者的读段计数(y轴)，归类为原始计数、质量过滤、合并和嵌合体除去。

图2A和2B。示意图显示了通过Kruskal-Wallis检验得到的CD、UC和对照组之间的alpha多样性，以评估观察到的丰富度(richness)(左图)和Shannon多样性(右图)。对DNA-16S(图2A)和RNA-16S(图2B)两者显示了分析。

图3。使用Bray-Curtis相异矩阵(dissimilarity matrix)的主坐标分析(PCoA)的示意图。圆圈表示DNA-16S并且三角形表示RNA-16S样品。相同的样品通过圆圈和三角形之间的线连接。椭圆形代表80％的样品属于该组，并在示意图上对于CD、UC和对照用箭头标识。椭圆实边界指示DNA-16S分析；椭圆虚边界指示RNA-16S分析。

图4。示意图提供了火山图以显示病例(UC或CD)与对照之间的动态微生物群(microbiota)RSV迁移。A，火山图。如图例中所示，将动态RSV(校正的p值<0.05，绝对log2倍数变化>1，以及至少一组中的超过75％的受试者中的非零序列计数)加阴影。

图5。示意图显示了UC、CD和对照中A.hadrus的比例丰度。方框分别描绘均值、第一和第三四分位数。校正的p*<0.05；**<0.01；***<0.001。

发明详述

定义

除非本文另外定义，否则本申请中使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，本文描述的与化学、分子生物学、细胞和癌症生物学、免疫学、微生物学、药理学以及蛋白质和核酸化学结合使用的命名法和技术是本领域公知且通常使用的。因此，虽然认为以下术语是本领域普通技术人员充分理解的，然而阐述以下定义以便于对当前公开的主题的解释。

在整个说明书中，词语“包含”以及变型应当理解为暗示包括陈述的组分或组分组，但不排除任何其他组分或组分组。

术语“一个”或“一种”指该实体中的一个/种或多个/种，即可以指复数个指示物。因此，术语“一个”或“一种”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”在本文可互换使用。此外，通过不定冠词“一个”或“一种”提及“要素”并不排除存在超过一个要素的可能性，除非上下文明确要求存在且仅存在要素之一。

术语“包括”用于表示“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。

如本文所用，术语“微生物体”或“微生物”应广义地理解。这些术语可以互换使用，包括但不限于两个原核域，细菌和古细菌，以及真核真菌和原生生物。在一些实施方案中，本公开涉及“细菌”或“微生物”。该表征不仅可以指所鉴定的微生物分类细菌属，而且还可以指所鉴定的分类学物种，以及各种新的和新鉴定的细菌菌株。

如本文所用，“分离”、“分离的”、“分离的微生物”等术语意图表示一种或多种微生物已经从特定环境(例如胃肠液、胃肠组织、人体消化液、人体消化组织等)与之相关的至少一种物质中分离出来。因此，“分离的微生物”在其自然存在的环境中不存在；而是，通过本文所述的各种技术，微生物已从其自然环境中取出并置于非自然存在的存在状态。因此，分离的菌株可以以例如生物学纯的培养物或以与适于人施用的药学上可接受的载体结合的孢子(或菌株的其他形式)存在。

在本公开的某些方面，分离的微生物以分离的和生物学纯的培养物存在。如本文所用，术语“生物学纯的”是指基本上不含其他生物体物种的实验室培养物。优选地，细菌物种为单一生物体物种的培养物的形式。本领域技术人员将认识到，特定微生物的分离的和生物学上纯的培养物表示所述培养物基本上(在科学原因内)没有其他活生物体，并且仅含有所讨论的单独微生物。培养物可以含有不同浓度的所述微生物。本公开指出，分离的和生物学上纯的微生物通常“必需与纯度较低或不纯的物质不同”。此外，在一些方面，本公开提供了必须在分离的和生物学上纯的微生物培养物中发现的浓度或纯度限制的某些定量测量。在某些实施方案中，这些纯度值的存在是将当前公开的微生物与以自然状态存在的那些微生物区分开的另外的属性。

在本公开的某些方面，分离的微生物还包括本文所述细菌物种或菌株的变体或突变体的用途。如本文所用，术语“变体”和“突变体”包括与参考菌株的基因组序列具有至少93％同一性、至少96％同一性、至少98％或至少99％同一性的衍生细菌菌株。变体和突变体可通过自然过程、诱变运动、随机培养和基因工程技术等获得。术语“变体”在本文中可以与术语“突变体”互换。

如本文所用，术语“突变”包括天然或诱导的突变，其包含至少单一碱基改变，包括缺失、插入、颠换和本领域技术人员已知的其他修饰，包括引入亲本核苷酸或氨基酸序列的遗传修饰。

如本文所用，“单独的隔离群”指在与一种或多种其他微生物分离后，包含微生物的单个属、种或株的优势的组合物或培养物。该短语不应用来指示分离或纯化微生物的程度。然而，“单独的隔离群”可以基本上仅包含微生物的一个属、种或株。

如本文所用，“益生菌(probiotic)”是指基本上纯的微生物(即，单个隔离群)或期望微生物的混合物，并且还可以包括可以施用于受试者(例如，人)用于恢复或改变微生物群的任何其他组分。本发明的益生菌或微生物接种剂组合物可以与试剂一起施用，所述试剂允许微生物在胃肠道的环境中生存，即抵抗低pH并且在胃肠环境中生长。在一些实施方案中，本发明的组合物(例如微生物组合物)是益生菌。

如本文所用，“益生元(prebiotic)_”是指增加一种或多种期望微生物的数量和/或活性的试剂。可用于本公开的方法的益生元的非限制性实例包括低聚果糖(例如，寡果糖、菊粉、菊粉型果聚糖)、半乳寡聚糖、氨基酸、醇及其混合物。参见Ramirez-Farias etal.(2008.Br.J Nutr.4:1-10)和Pool-Zobel and Sauer(2007.J Nutr.137:2580-2584以及增补)。

如本文所用，“活生物治疗产品”或“LBP”是指以下生物产品，其1)包含活生物体，例如细菌，和2)适用于预防、治疗或治愈有此需要的受试者的疾病或状况。在一些实施方案中，LBP是将经历或已经经历临床监管批准的治疗组合物。

两种或更多种细菌的“组合”包括细菌在相同材料或产品中或在物理上相连的产品中的物理共存，以及不同细菌在时间上共施用或共定位。

在两种或更多种核酸或多肽的上下文中，术语“同一性百分比”或“同一性”是指两种或更多种相同或具有指定百分比的核苷酸或氨基酸残基相同的序列。同一性百分比可以使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量。

通常，如下计算序列同一性百分比：测定比对的核酸或多肽序列中的匹配位置数目，将比对的位置数目除以比对的核苷酸或氨基酸的总数，并乘以100。匹配位置指在比对序列中相同核苷酸或氨基酸出现在相同位置的位置。比对核苷酸的总数是指比对第二序列所必需的16S rRNA基因核苷酸的最小数目，并且不包括与非16S rRNA基因序列的比对(例如，强制比对)。比对核苷酸的总数可以对应于整个16S rRNA基因序列，或者可以对应于全长16S rRNA基因序列的片段。

序列可以使用Altschul et al.(Nucleic Acids Res,25:3389-3402,1997)描述的算法比对，该算法并入BLAST(基本局部比对搜索工具)程序，可从万维网上的ncbi.nlm.nih.gov获得。可以使用Altschul等人算法进行BLAST搜索或比对以确定16SrRNA基因核酸与其任何其他序列或部分之间的序列同一性百分比。BLASTN是用于比对和比较核酸序列之间的同一性的程序，而BLASTP是用于比对和比较氨基酸序列之间的同一性的程序。当使用BLAST程序计算16S rRNA基因序列和另一个序列之间的同一性百分比时，使用相应程序的默认参数。

在至少两个核酸的上下文中，短语“基本上相似”和“基本上相同”通常是指多核苷酸包含与参考多核苷酸相比具有至少约75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。在一些实施方案中，基本相同的核酸分子在严格条件下(例如，在中等至高严格性范围内)彼此杂交。

主要rRNA亚基16S的一级结构包括保守区、可变区和高变区的特定组合，其以不同的速率进化，并能够解析非常古老的谱系(例如域)和更现代的谱系(例如属)。16S亚基的二级结构包括约50个螺旋，其导致约67％的残基的碱基配对。这些高度保守的二级结构特征在功能上具有重要意义，并且可用于确保多个序列比对和系统发育分析中的位置同源性。在过去的几十年中，16S rRNA基因已成为测序最多的生物分类标志物，并且是当前细菌和古细菌系统分类的基石(Yarza et al.2014.Nature Rev.Micro.12:635-45)。

两个16S rRNA基因的94.5％或更低的序列同一性是不同属的有力证据，86.5％或更低是不同科的有力证据，82％或更低是不同目的有力证据，78.5％是不同纲的有力证据，并且75％或更低是不同门的有力证据。对16S rRNA基因序列的比较分析能够建立分类阈值，该阈值不仅可用于培养微生物的分类，而且可用于许多环境序列的分类。Yarza etal.2014.Nature Rev.Micro.12:635-45)。

如本文所用，术语“相对丰度”是胃肠道或其他器官系统中存在的微生物的数量或百分比，相对于所述道或器官系统中存在的总微生物的数量或百分比。相对于存在的细菌、真菌、病毒和/或原生动物的总数或百分比，还可以针对诸如细菌、真菌、病毒和/或原生动物的特定类型的微生物确定相对丰度。相对丰度可以通过本领域技术人员容易知道的许多方法来确定，包括但不限于对来自胃肠道或其他目标器官系统的样品进行的阵列或微阵列杂交、定量PCR、和菌落形成单位测定法(cfu，CFU)或噬斑形成单位测定法(pfu，PFU)的培养和性能。

术语“患者”、“受试者”和“个体”可以互换使用，并且是指人类或非人类动物。这些术语包括哺乳动物，例如人类、非人类灵长类、家畜(例如牛、猪、绵羊、山羊或家禽)、伴侣动物(例如犬、猫、马或穴兔属(oryctolagus))和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，该术语是指人类患者。

如本文中所使用的，“抑制和阻抑”和类似术语不应被解释为要求完全抑制或阻抑，尽管这在一些实施方案中可能是期望的。因此，“抑制的免疫应答”或“炎性细胞因子的抑制”不要求绝对抑制。

“生态失调”是指肠或其他身体区域，包括粘膜或皮肤表面(或任何其他微生物群小生境)的微生物群或微生物组的状态，其中生态网络的正常多样性和/或功能被破坏。从微生物群的优选(例如，理想)状态的任何破坏都可以被认为是生态失调，即使此类生态失调不导致健康的可检测的降低。这种生态失调可以是不健康(例如，导致疾病况态)，它可以仅在某些条件下不健康，或者它可以阻止受试者变得更健康。生态失调可以是由于微生物群群体组成的多样性降低、一种或多种病原体(例如，致病细菌群体)或致病有机体(pathobionts)群体的过度生长，仅当患者中存在某些遗传和/或环境条件时能够引起疾病的共生生物的存在和/或过度生长、或者转向不再向宿主提供有益功能并因此不再促进健康的生态网络所致。生态失调状态可以导致疾病或病症(例如胃肠疾病、病症或病况)，或者生态失调状态仅可以在某些条件下导致疾病或病症(例如胃肠疾病、病症或病况)，或生态失调状态可以阻止受试者响应治疗或者从疾病或病症(例如胃肠疾病、病症或病况)恢复。

如本文所用，术语“肠”是指整个胃肠或消化道(也称为消化道)，并且是指多细胞动物内的器官系统，其摄取食物，将其消化以提取能量和营养物，并排出剩余的废物。如本文所用，术语“胃肠道”是指从口腔到直肠的整个消化道。术语“胃肠道”包括但不限于口，并进入食道、胃、小肠、大肠、直肠以及最后是肛门。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指以适用于任何药物治疗的合理益处/风险比对治疗的受试者赋予治疗效果的治疗剂(例如，本发明的微生物、活的生物治疗产品(LBP)和/或益生菌)的量。此类治疗效果可以是客观的(即，可通过某种测试或标志物测量)或主观的(即，受试者给出效果的指示或感觉到效果)。在一些实施方案中，“治疗有效量”是指有效治疗、改善或预防相关疾病或病况(例如延迟相关疾病或病况的发作)和/或表现出可检测的治疗或治疗效果(例如通过改善与疾病有关的症状，预防疾病或延迟疾病的发作和/或减轻疾病症状的严重性或频率)的治疗剂或组合物的量。

如本文所用，术语“治疗”(也称为“处理”)指根据治疗方案的治疗剂(例如，本发明的微生物、LBP和/或益生菌)的任何施用，所述治疗方案实现期望的效果，在于其部分或完全缓解、改善、减轻、抑制特定疾病、病症和/或状况(例如，慢性或复发性免疫应答和GI道炎症)、延迟所述特定疾病、病症和/或状况的发作、降低所述特定疾病、病症和/或状况的严重性和/或减少所述特定疾病、病症和/或状况的一种或多种症状或特征的发生；在一些实施方案中，根据治疗方案的治疗剂的施用与期望效果的实现相关。此类治疗可以针对没有表现出相关疾病、病症和/或病况的体征的受试者和/或针对仅表现出疾病、病症和/或病况的早期体征的受试者。或者/另外，此类治疗可以针对表现出有关疾病、病症和/或病况的一种或多种建立的体征的受试者。在一些实施方案中，可以对已经被诊断患有相关疾病、病症和/或病况的受试者进行治疗。在一些实施方案中，可以对已知具有一种或多种易感性因素的受试者进行治疗，所述易感性因素在统计学上与相关疾病、病症和/或病况发展的风险增加相关。

如本文所用，术语“药物”涵盖在人和兽医学中用于人和动物使用两者的药物。另外，如本文所用，术语“药物”是指提供治疗和/或有益效果的任何物质。如本文所用，术语“药物”不一定限于需要获得上市批准的物质，而是可以包括可用于化妆品、营养食品、食品(例如包括饲料和饮料)、益生菌培养物、LBP、营养补品和自然疗法的物质。另外，如本文所用，术语“药物”涵盖设计用于掺入动物饲料，例如家畜饲料和/或宠物食品中的产品。

“药学”暗示组合物、微生物、试剂、方法等能够具有药学效果，并且该组合物还能够安全地施用于受试者。“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于动物的安全使用，尤其是用于人类的安全使用。“药学上可接受的媒介物”或“药学上可接受的赋形剂”是指与本文所述的微生物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。根据本公开，药物组合物或另外的活性成分的制备将是本领域技术人员已知的，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版,Mack PrintingCompany，1990，通过引用并入本文。此外，对于动物(例如人)施用，应当理解，制剂应满足FDA生物标准局要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。

本文教导的治疗药物组合物可以包含一种或多种天然产物，然而，在某些实施方案中，治疗药物组合物本身不是天然存在的。此外，在某些实施方案中，与自然界中可能存在的任何单独的天然存在的对应物或组合物成分相比，治疗药物组合物拥有明显不同的特性。即，在某些实施方案中，包含治疗有效量的分离的微生物的本文教导的药物组合物拥有至少一种结构和/或功能性质，其与组合物的任何单一单独成分在其可以天然存在时相比对作为整体的组合物赋予明显不同的特征。法院已确定，包含天然产物的组合物是法定主题，它们与任何单独成分在其可以天然存在时相比拥有明显不同的特性。因此，所教导的治疗药物组合物作为整体拥有明显不同的特征。这些特征在本文教导的数据和实施例中说明。

本文阐述了本公开的细节。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本公开的实践或测试中，然而现在描述说明性的方法和材料。根据说明书和权利要求书，本公开的其他特征、目的和优点将是显而易见的。

炎性肠病中的生态失调

近年来，发达国家的炎性肠病(IBD)的发病率急剧增加。克罗恩氏病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)是IBD的两种主要形式，它们具有独特以及重叠的病理和临床特征。已知包括对肠道微生物群的宿主免疫应答受损的遗传和环境因素两者促成IBD。在过去的IBD研究中，粪便样本最常用于鉴定与IBD相关的微生物群(Jacobs et al.,2016,Cell MolGastroenterol Hepatol,2:750-766,Doherty et al.,2018,MBio,9:e02120-17,Kennedyet al.,2018,Inflamm Bowel Dis,24:583–592)，然而它们并不总是直接反映发炎部位的环境，包括肠道粘膜的组织病理学、氧可用度和pH。因此，在本文件中，从CD或UC患者的发炎的肠组织以及非IBD对照中收集粘膜活组织检查，以表征来自同一环境的微生物群和宿主应答。

迄今为止，已经发表了许多专注于粘膜微生物组的IBD研究，然而，其样品量是有限的，并且那些中仅少数具有匹配的宿主应答数据。Kiely et al.(2018,Gut Microbes,9:477–485)和Morgan et al.(2015,Genome Biol,16:67)检查了少于100个样品中并且缺乏宿主应答的IBD微生物组。Mottawea et al.(2016,Nature Communications,7:13419)、Lepage et al.(2011,Gastroenterology,141:227–236)和Hasler et al.(2017,Gut,66:2087–2097)检查了微生物组和宿主两者，然而，分组大小限于至多124。如实施例1中所述，迄今为止，最大的成人IBD研究之一是对185名爱尔兰受试者进行的，整合微生物群和宿主应答数据(RNAseq)。

尽管已经进行了广泛的努力来使用来自DNA样品的16S rRNA基因(DNA-16S)对微生物群进行概况分析，然而该方法仅证实了细菌的丰度，并不一定证实它们是活的还是代谢活性的。实际上，几项研究已经显示了，通过分析RNA样品中16S rRNA基因表达水平(RNA-16S)获得的活性微生物群不同于传统的DNA-16S概况分析(Perez-Cobas et al.,2013,Gut,62:1591–1601；Bajaj et al.,2018,JCI Insight,3:e98019；Ji et al.,2018,FrontMicrobiol,9:710)。Hasler et al.(2016)检查了RNA-16S和宿主RNAseq之间的相关性，然而是在类别水平上，并且没有比较DNA-16S。因此，本文描述了研究，其中检查了来自IBD患者的粘膜样品的RNA-16S和DNA-16S两者，并与来自健康对应物的RNA-16S和DNA-16S进行比较，以更好地理解粘膜微生物群和肠道病症之间的关联。

分析IBD相对于健康受试者中的细菌数量和代谢活性

下文实施例1中所述的研究包括对迄今为止发表的最大的成人IBD粘膜微生物群分组之一的分析，并且使用在可能的情况下具有菌株特异性分类学分类的16S rRNA基因的DNA和RNA两者的高分辨率去噪测序数据与宿主转录物组数据集结合检查细菌与IBD的关联。

过去的许多研究提出了细菌与IBD的关联，然而，分组大小是相当小的和/或结果仅基于DNA-16S。尽管DNA-16S测序已被广泛使用，但没有许多将它应用于RNA的研究，而且似乎没有研究通过结合两种方法研究IBD微生物群的研究。

下文实施例1中详述的研究结果证明了alpha多样性度量的通常观察到的趋势，其中IBD患者的微生物群拥有较低的丰富度和多样性(图2A和2B)。在理论上，由于并非所有细菌都是代谢活性的，独特的RNA-16S分类单元应少于DNA-16S分类单元。然而，在本研究中，与DNA-16S相比在RNA-16S中观察到更多独特的RSV，这可能是由于与DNA-16S相比，RNA-16S测序深度更深(与60,765相比的中值79,451)。PERMANOVA分析通过在PCoA图中描绘的Bray-Curtis和Sorensen距离两者证明DNA-16S和RNA-16S之间的显著差异(图3)。由于Sorensen指数是根据RSV的存在/不存在而非丰度计算的，因此结果指示PCoA的迁移可能是由于RNA-16S样品中鉴定的另外的RSV所致。

传统上，经常在研究内使用OTU聚簇分析16S rRNA测序结果(例如Mottawea etal.,2016,Nature Communications,7:13419；Jacobs et al.,2016,Cell MolGastroenterol Hepatol,2:750-766)，这限制了在不同研究间进行比较的能力。为了对测序错误去噪音并促进研究之间的可比性，采用了DADA2方法(Callahan et al.,2016,Natures Methods,13:581-583)，该方法在每个样品中产生错误校正序列的计数。差异丰度/表达测试揭示了所有四个比较中的10个动态RSV(图4)。通过ANOVA将年龄鉴定为可能的混杂因素(p<0.001；表1)。PERMANOVA指示与微生物群变化的显著相关(在DNA-16S中p＝0.021)，然而，特定的RSV无一表明显著的相关性。因此，所鉴定的与疾病况态相关的RSV不受年龄的影响。对于DNA-16S在CD和UC两者中并且对于RNA-16S在UC中，粪球菌属(Coprococcus)物种(图4)是消减的。另一方面，与RNA-16S中的对照相比，另一粪球菌属物种(图4中的RSV1)在CD中富集，这提示该属在种或菌株水平上对微环境的贡献不同，这进一步突出显示了亚属分类的重要性。Chen et al.(2014,Medicine(Baltimore),93:e51)和Gevers et al.(2014,Cell Host Microbe,15:382-392)在IBD样品中也报告了粪球菌属水平降低。对于DNA-16S在UC中并且对于RNA-16S在CD和UC两者中，A.hadrus是消减的。值得注意的是，A.hadrus和粪球菌属隶属于毛螺菌科。在DNA-16S和RNA-16S中，粪球菌GD/7和G.formicilis X2-56在UC中是消减的。Bajer及同事还报告了IBD患者中的灵巧粪球菌(C.catus)的低丰度(Bajer et al.,2017,World J Gastroenterol,23:4548-4558)，而已经在CD损伤复发的患者中报告了G.formicilis的高丰度(Mondot et al.,2015,Gut,65:954-962)，然而本研究中未检查UC患者。Sutterella wadsworthensis 2_1_59BFAA在RNA-16S中在CD中富集。在许多研究中已研究萨特氏菌属(Sutterella)物种与IBD的相关性(Hiippala et al.,2016,Front Microbial,7:1706；Mangin et al.,2004,；Mukhopadhyaet al.,2011)，但尚无显示在IBD患者和对照之间的明显差异。在UC与对照比较中，在DNA-16S数据集中鉴定为差异丰度的四个RSV是RNA-16S数据集中的那些的子集。另一方面，在CD与对照的比较中，富集或消减的RSV无一在DNA和RNA数据集之间重叠。

作为对这些发现的后续，进一步研究了A.hadrus，因为它在四个比较中的三个中是消减的：DNA-16S中的UC相对于对照，RNA-16S中的UC和CD两者相对于对照。已知此种革兰氏阳性细菌(人类结肠中最主要的细菌之一)具有产生丁酸的能力(Allen-Vercoe et al.,1976,Anaerobe,18:523–529)，许多研究报告了所述能力是有益的(Canani et al.2011,World J Gastroenterol,17:1519-1528；Geirnaert et al.,2017,Sci Rep,7:11450)。尽管通过将UC和CD与对照进行比较鉴定A.hadrus RSV，但是与A.hadrus RSV相关的大多数差异表达的宿主基因在UC或CD中均未显著上调/下调。在途径水平上观察到了相同的趋势，其中当将A.hadrus RSV与宿主RNAseq对比时，当非在将CD或UC与对照对比(数据未显示)时，O-聚糖生物合成途径的终止最显著富集。这可以是由于IBD的异质性所致；特定细菌与宿主基因表达之间的相互作用可以更直接地解决肠道微生物群与疾病的关联。

O-聚糖，特别是粘蛋白，对于肠微生物区系的生理环境的发展是重要的。MUC6、MUC12和MUC13编码粘蛋白糖蛋白，其通过形成不溶性粘液屏障来保护肠腔。可以通过唾液酸终止O-聚糖的生物合成(Varki et al.,2009,Essentials of Glycobiology,2^ndedition,Cold Spring Harbor Laboratory Press)，所述唾液酸附着于O-聚糖并调节电压门控的钾通道门控(Schwetz et al.,2011,J Biol Chem,286:4123-4132)。已知聚糖的末端修饰影响细菌粘附(Baos et al.,2012,Biophys J,102:176-184)，并可充当为特定微生物提供营养优势的底物(Pacheco et al.,2012,Nature,491:113-117)。如已经对Akkermansia muciniphila和其它丁酸生产者，包括粪厌氧棒杆菌(Anaerostipes caccae)报告(Ouwerkerk et al.,2013,Best Pract Res Clin Gastroenterol,27:25-38；Belzeret al.,2017,MBio,8:e00770-l 7)，A.hadrus可以是具有聚糖降解的交叉-进料网络中的聚糖降解者和/或丁酸生产者，以维持粘膜稳态。在本研究中，尽管低于显著性阈值，但在DNA-16S和RNA-16S数据集两者中都检测到A.muciniphila。

生物信息学工具基准测试不是本文描述的研究的意图，但是除了metagenomeSeq之外，还探索了用DESeq2进行的差异测试(Love et al.,2014,Genome Biology,15:550)。DESeq2主要设计用于RNAseq数据的差异基因表达分析，其稀疏度小于标志物基因丰度(Paulson et al.,2013,metagenomeSeq:Statistical analysis for sparse high-throughput sequencing.Bioconductor package:1.11.10ed.2013)。流行性过滤(prevalence filtering)后数据集的稀疏性对于DNA-16S为79.5％并且对于RNA-16S为81.0％。尽管稀疏度与RNAseq数据相当，但与metagenomeSeq相比，DESeq2导致更少的显著性发现。特别地，在RNA-16S中UC或CD与对照比较的任一者中，DESeq2对A.hadrus RSV的差异表达不灵敏(与对照相比，对于CD，校正的p＝0.13或对于UC为0.37)。由于相对丰度箱线图确认了病例(CD或UC)和对照中A.hadrus的不同表达水平(图5)，因此在此特定数据集中，决定使用metageneomeSeq而非DESeq2来鉴定显著改变的RSV。

总之，通过采用RNA-16S方法，可以确定相对于健康对照，A.hadrus RSV在CD和UC两者中是消减的。此外，A.hadrus与宿主基因表达之间的直接比较鉴定O-聚糖生物合成途径终止的显著富集，这可以使优势导向此微生物在此种环境下生存和茁壮，产生抗炎性短链脂肪酸(SCFA)。因此，本文提供了使用A.hadrus菌株或其变体治疗肠疾病的组合物和方法。

Anaerostipes hadrus(A.hadrus)

Anaerostipes hadrus是一种已从人粪便中分离的革兰氏阳性细菌(Allen-Vercoe et all,2012,Anaerobe,18:523-9)。可在GenBank数据库(万维网在ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)上获得A.hadrus的完整基因组序列，例如以登录号NZ_CP012098(菌株BPB5)。GenBank数据库中还可获得A.hadrus 16S rRNA序列，已发布为GenBank登录号JF412658(菌株5/l/63FAA；SEQ ID NO:1)、NR_117139(菌株DSM 3319；SEQID NO:2)、NR_117138(菌株DSM 3319；SEQ ID NO:3)、NR_104799(菌株DSM 3319；SEQ IDNO:4)、MG680450(菌株ASD1240；SEQ ID NO:5)、AY305320(菌株SSC/2；SEQ ID NO:6)和AY305319(SEQ ID NO:7)。因此，本公开涉及与A.hadrus或其变体有关的组合物和方法，其中A.hadrus菌株具有与以NZ_CP012098发表的基因组序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的基因组序列。通常，细菌菌株基因组序列将包含16S rRNA序列的多个拷贝。16S rRNA序列通常用于区分种和株，因为如果一个或多个上述序列与参考序列共享低于规定的百分比序列同一性，则称获得该序列的两种生物体属于不同的种或株。因此，本文考虑的是细菌及其在治疗被诊断患有或有风险形成肠疾病或病症(包括但不限于UC和CD)的受试者中的用途，所述细菌包含一个或多个16S rRNA基因，每个基因与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7至少约95％、96％、97％、98％、99％，99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。还考虑了包含具有工程化基因组的合成细菌的组合物，该工程化基因组具有与本文所述的A.hadrus相同的治疗功效。在一些实施方案中，此类微生物具有与GenBankAcc.No.NZ_CP012098的基因组至少约95％、96％、97％、98％、99％，99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同的基因组。在一些实施方案中，如本文提供的组合物包含细菌群体(即，A.hadrus菌株或其变体的群体)，其中该群体的每个成员具有基本相同的16S rRNA基因序列。

A.hadrus的治疗用途

本文提供了用于治疗有此需要的受试者的方法，所述方法包括对所述受试者施用包含如本公开中所述的A.hadrus菌株或其变体的组合物。在一些实施方案中，如本文提供的组合物包含细菌群体(即，A.hadrus菌株或其变体的群体)，其中该群体的每个成员具有基本相同的16S rRNA基因序列。受试者可以是被诊断出患有炎性肠病、溃疡性结肠炎、小儿UC、克罗恩氏病、小儿克罗恩氏病、短肠综合征、粘膜炎GI粘膜炎、口腔粘膜炎、食道、胃、小肠(十二指肠、空肠、回肠)、大肠(结肠)和/或直肠粘膜炎、化学疗法诱导的粘膜炎、放射诱导的粘膜炎、坏死性小肠结肠炎、隐窝炎、代谢性疾病、乳糜泻、肠易激综合征或化学疗法相关的脂肪性肝炎(CASH)。

炎性肠病

炎性肠病(IBD)经典地包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩氏病(CD)。炎性肠病的发病机理是未知的。已经提出了遗传素因，并且许多环境因素，包括细菌、病毒和可能地饮食抗原可以触发正在进行的肠炎性级联。IBD可引起严重腹泻、疼痛、疲劳和体重减轻。IBD可以使人衰弱，有时导致危及生命的并发症。因此，在一些实施方案中，如本文所述的治疗方法有效减轻、预防或消除上述任何一种或多种症状，其中方法包括对有此需要的患者施用治疗有效量的包含A.hadrus菌株的组合物。在一些实施方案中，治疗方法导致缓解。

溃疡性结肠炎

溃疡性结肠炎是一种在大肠(结肠)和直肠的最内层引起长期的炎症和疮(溃疡)的炎性肠病。溃疡性结肠炎通常表现为从直肠向近端延伸到包括整个结肠(在许多患者中)的浅层连续炎症。缺乏瘘管、裂纹、脓肿和小肠受累。具有有限疾病(例如直肠炎)的患者通常有轻度但经常复发的症状，而具有胰腺炎的患者更普遍地具有严重症状，通常需要住院。Botoman et al.,“Management of Inflammatory Bowel Disease,”Am.Fam.Physician,Vol.57(1):57-68(Jan 01,1998)(省略内部引用)。因此，溃疡性结肠炎是一种在大肠(结肠)和直肠的最内层中引起持久的炎症和疮(溃疡)的IBD。

克罗恩氏病

与溃疡性结肠炎不同，克罗恩氏病可累及从口腔到肛门的整个肠道，具有不连续的局灶性溃疡、瘘管形成和肛周受累。回肠末端最通常受累，通常有不同程度的结肠受累。患者的亚组患有肛周疾病，伴有裂纹和瘘管形成。在克罗恩氏病患者的仅2％至3％具有上消化道的临床显著累及。Botoman et al.,“Management of Inflammatory BowelDisease,”Am.Fam.Physician,Vol.57(1):57-68(1998年1月1日)(省略内部引用)。因此，克罗恩氏病是一种引起消化道内膜炎症的IBD。在克罗恩氏病中，炎症通常扩散到受累组织深处。炎症可涉及消化道的不同区域，即大肠、小肠或两者。胶原性结肠炎和淋巴细胞性结肠炎也被认为是炎性肠病，但通常与经典的炎性肠病分开考虑。

炎性肠病的临床参数

如上所讨论，炎性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。本领域技术人员已知许多得分和临床标志物，它们可用于获得本文描述的施用的A.hadrus组合物治疗这些病况的功效。

有两种评估IBD患者的一般方法。鉴于IBD表现为GI道中的炎症和溃疡的表现的事实，第一种涉及粘膜的视觉检查并依赖于对粘膜的损害体征的观察。可以使用任何允许评估粘膜的程序。示例包括钡灌肠、X射线和内窥镜检查。内窥镜检查可以是食道、胃和十二指肠检查(食管胃十二指肠镜检查)、小肠检查(肠镜检查)或大肠/结肠检查(结肠镜检查、乙状结肠镜检查)。这些技术用于鉴定炎症、溃疡和异常生长如息肉的区域。

存在基于GI道的此视觉检查的评分系统以确定IBD的状态和严重性，并且尽管事实上患者可以通过不同医学人员评估，这些评分系统意图确保在这些疾病的诊断和监测以及临床研究评估中对不同患者进行统一评估。在Daperno Met al(J Crohns Colitis.20115:484-98)中讨论并比较了基于UC视觉检查的评估示例。

也存在具有相同目的的临床评分系统。可以将内窥镜检查或其他粘膜检查上的发现纳入这些临床评分系统中，但这些评分系统还并入基于症状的数据，例如粪便频率、直肠出血和内科医生的整体评估。IBD具有影响生活质量的多种症状，因此这些中的某些评分系统还考虑了对生活质量的影响的定量评估以及症状的量化。

UC的评分系统的一个例子是Mayo评分系统(Schroeder et al.,N Eng J Med,1987,317:1625-1629)，然而存在较不常用的其它系统，并且包括溃疡性结肠炎内窥镜严重性指数(Ulcerative Colitis Endoscopic Index of Severity,UCEIS)得分(Travis etal,2012,Gut,61:535-542)，Baron得分(Baron et al.,1964,BMJ,1:89)，溃疡性结肠炎结肠镜严重性指数(Ulcerative Colitis Colonoscopic Index of Severity,UCCIS)(Thiaet al.,2011,Inflamm Bowel Dis,17:1757-1764)，Rachmilewitz内窥镜检查指数(Rachmilewitz,1989,BMJ,298:82-86)，Sutherland指数(也称为UC疾病活动指数(UCDAI))评分系统；Sutherland et al.,1987,Gastroenterology,92:1994-1998)，Matts得分(Matts,1961,QJM,30:393-407)和Blackstone指数(Blackstone,1984,Inflammatorybowel disease.In:Blackstone MO(ed.)Endoscopic interpretation:normal andpathologic appearances of the gastrointestinal tract,1984,pp.464-494)。对于综述，参阅Paine,2014,Gastroenterol Rep 2:161-168。因此，本文还考虑了用于治疗诊断为UC和患有UC的受试者的方法，其中所述治疗包括施用如本文所述的A.hadrus，并且其中所述治疗导致UC病理学的降低，如通过测量UCEIS得分、Baron得分、UCCIS得分、Rachmilewitz内窥镜检查指数、Sutherland指数和/或Blackstone指数确定。

CD评分系统的一个例子是克罗恩氏病活动指数(CDAI)(Sands Bet al2004,NEngl J Med 350(9):876-85)；大多数主要研究使用CDAI以定义疾病的响应或缓解。CDAI得分的计算包括评分7天内液体粪便数目、7天内腹部疼痛的情况和严重性、7天内的总体健康状况、肠外并发症(例如关节炎/关节痛、虹膜炎/葡萄膜炎、结节性红斑、坏疽性脓皮病、口疮性口炎(aphtous stomatitis)、肛门裂/瘘/脓肿和/或发烧>37.8℃)、7天内使用止泻药、出现腹部块、血细胞比容和体重，作为理想/观察的比率或与标准重量的百分比偏差。根据CDAI得分，将CD分类为无症状缓解(0至149分)、轻度至中度活动CD(150至220分)、中度至重度活动CD(221至450分)或重度活动暴发性疾病(451至1000分)。在一些实施方案中，包括对诊断为CD的患者施用包含治疗有效量的A.hadrus的组合物的治疗方法导致CD的诊断评分降低。例如，得分可以将诊断从严重活动变为轻度或中度活动或无症状缓解。

Harvey-Bradshaw指数是CDAI的更简单版本，其仅由临床参数组成(Harvey etal.,1980,Lancet 1(8178):1134-1135)。炎性肠病问卷(IBDQ)也解决了对生活质量的影响(Irvine et al.,1994,Gastroenterology 106:287-296)。替代方法还包括CDEIS和SES CD(参见例如Levesque,et al.(2015)Gastroentrol.148:37 57)。

在一些实施方案中，提供了治疗IBD，例如UC的方法，其中治疗有效降低Mayo得分。Mayo得分是用于评估UC严重性的组合的内窥镜检查和临床量表，并且具有1-12的量表。Mayo得分是粪便频率、直肠出血、可弯曲直肠乙状结肠镜检查或结肠镜检查的发现以及内科医生的整体评分的综合(Paine,2014,Gastroenterol Rep 2:161-168)。对于直肠出血，小于一半时间在粪便中看到血丝分配1分，大多数粪便中的血液分配2分，并且通过的纯血分配3分。关于粪便频率，每日粪便的正常数目分配0分，比正常多1或2次粪便分配1分，比正常多3或4次粪便分配2分，并且比通常多5次或更多次粪便分配3分。对于内窥镜检查组分，得分0指示正常的粘膜或无活动性UC，对于具有轻度脆弱、降低的血管模式和粘膜红斑的证据的轻度疾病给予得分1，对于具有脆弱、糜烂、血管模式的完全丧失和重大红斑的中度疾病给予得分2，并且对于溃疡和自发性出血给予得分3(Schroeder et al.,1987,N Engl JMed,317:1625-1629)。由内科医生进行的总体评估对正常发现分配0分，对轻度结肠炎分配1分，对中度结肠炎分配2分，并且对严重结肠炎分配3分。因此，在一些实施方案中，当患者在以下至少一项中经历Mayo得分降低至少1、2或3分时，成功地治疗用A.hadrus治疗的患者：直肠出血、在粪便中看到的血丝、内窥镜检查子评分(subscore)和内科医生的整体评估。在一些实施方案中，包括向诊断为UC的患者施用治疗有效量的A.hadrus的治疗方法导致UC的诊断得分降低。例如，得分可以将诊断得分，例如Mayo得分改变至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11分。

隐窝炎

另外/或者，如本文所述的包含A.hadrus菌株的组合物和施用方法可用于治疗隐窝炎。隐窝炎是在UC治疗中通过手术产生的袋内衬的炎症。具体而言，患有严重UC的受试者可以通过称为回肠肛管吻合术(IPAA)或J袋手术的程序将患病的结肠切除并重新连接肠。隐窝炎病例可在许多患者中复发，表现为急性复发性隐窝炎或慢性不间断性隐窝炎。因此，本文提供了用于治疗隐窝炎、急性隐窝炎或复发性隐窝炎的方法。

隐窝炎活动性可以分类为缓解(无活动性隐窝炎)、轻度至中度活动性(增加的粪便频率、尿急和/或不频繁的失禁)或重度活动性(频繁失禁和/或患者因脱水住院)。隐窝炎的持续时间可定义为急性(少于或等于四周)或慢性(四周或更长)，并且模式分类为不频繁(1-2次急性发作)、复发(三次或更少发作)或连续。可以将对药物治疗的响应标记为药物响应或治疗难治性，其中规定任一病例的药物。因此，在一些实施方案中，提供了用于治疗被诊断为患有隐窝炎的受试者的方法，其中用包含A.hadrus的组合物进行的治疗导致隐窝炎的严重性降低和/或导致缓解。

粘膜炎和粘膜屏障

GI道的粘膜是复杂的微环境，涉及上皮屏障、免疫细胞和微生物。在健康的结肠中维持微妙的平衡。内腔微生物通过由上皮和粘液组成的屏障与宿主免疫系统物理分开。虽然尚未完全阐明IBD的发病机制，但它可能涉及宿主对改变的共生菌群的不适当的响应与粘膜屏障功能异常。参见Boltin et al.,“Mucin Function in Inflammatory BowelDisease an Update,”J.Clin.Gastroenterol.,Vol.47(2):106-111(2013年2月)。

当癌症治疗(特别是化学疗法和放射疗法)分解肠道(其从口腔到肛门)内衬的快速分裂的上皮细胞，使粘膜组织对溃疡和感染开放时发生粘膜炎。粘膜组织，也称为粘膜或粘性膜作为与空气连通的所有身体通道，例如呼吸道和消化道的内衬，并且具有分泌粘液的细胞和相关腺体。此种覆盖口腔的内衬部分称为口腔粘膜，是人体最敏感的部分之一，特别容易受到化学疗法和放射线的伤害。口腔是粘膜炎最常见的位置。虽然口腔粘膜是粘膜毒性和由此产生的粘膜炎的最常见部位，但应理解，粘膜炎也可沿着整个消化道，包括食道、胃、小肠(十二指肠、空肠、回肠)、大肠(结肠)和直肠发生。在一些实施方案中，包含A.hadrus的组合物在治疗口、食道、胃、小肠(十二指肠、空肠、回肠)、大肠(结肠)和/或直肠的粘膜炎中是治疗有效的。

口腔粘膜炎可导致若干问题，包括疼痛、由于无法进食而引起的营养问题以及由于粘膜中的开放性疮而增加的感染风险。它对患者的生活质量具有重大影响，并且可以是剂量限制的(即，要求随后的化学疗法剂量减少)。世界卫生组织具有用于诊断口腔粘膜炎的口腔毒性量表：1级：酸痛±红斑，2级：红斑、溃疡；患者可以吞咽固体食物；3级：溃疡伴有广泛性红斑；患者不能吞咽固体食物；4级：粘膜炎至不可能进行营养法的程度。3级和4级口腔粘膜炎被认为是严重的粘膜炎。因此，本文提供了用于治疗诊断为口腔粘膜炎的受试者的方法，其中施用包含A.hadrus的组合物使口腔毒性的等级降低1-4等级量表的至少1分。

在以上任何实施方案中，施用如本文提供的组合物的受试者可经历与炎性肠病、溃疡性结肠炎、小儿UC、克罗恩氏病、小儿克罗恩氏病、短肠综合征，粘膜炎、胃肠粘膜炎、口腔粘膜炎、食道、胃、小肠(十二指肠、空肠、回肠)、大肠(结肠)和/或直肠粘膜炎、化学疗法诱导的粘膜炎、放射诱导的粘膜炎、坏死性小肠结肠炎、隐窝炎、代谢性疾病、乳糜泻、肠易激综合征或化学疗法相关的脂肪性肝炎(CASH)有关的体重减轻。在一些实施方案中，在施用组合物后受试者的体重减轻小于未接受组合物施用的可比患者的体重减轻。例如，在施用组合物后受试者的体重减轻比没有接受组合物施用的可比患者的体重减轻小约5lbs、10lbs、15lbs、20lbs、25lbs或30lbs。在一些实施方案中，在首次施用组合物后的3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月时测量受试者的体重减轻。。包含A.hadrus的组合物

本公开的微生物组合物可以施用于有此需要的受试者以增强总体健康和康乐和/或治疗或预防疾病或病症，诸如如本文所述的代谢病症。在一些实施方案中，微生物组合物是活细菌产品(LBP)，而在其他实施方案中，微生物组合物是益生菌。在一些实施方案中，细菌(A.hadrus)是分离的并已在动物外部培养以增加微生物的数量或浓度，从而增强包含微生物群体的组合物的治疗功效。在一些实施方案中，如本文提供的组合物包含细菌群体(即，A.hadrus菌株或其变体的群体)，其中群体的每个成员具有基本相同的16S rRNA基因序列。

在一些实施方案中，微生物组合物为活细菌群体的形式。活的群体可以是例如冷冻的、冷冻保护的或冻干的。在其他实施方案中，微生物组合物包含非活细菌制剂或其细胞组分。在一些实施方案中，当微生物组合物为非活细菌制剂的形式时，其选自例如热杀伤的细菌、经照射的细菌和裂解细菌。

在一些实施方案中，细菌物种为生物学上纯的形式，基本上没有其他生物体物种。在一些实施方案中，细菌物种为单一生物体种的培养物的形式。

根据本公开内容的包含A.hadrus的组合物可以是适合于施用于受试者的接受的益生菌或LBP递送系统中的任一种。重要的是，必须配制用于递送活的A.hadrus群体的组合物以维持微生物的存活力。在一些实施方案中，组合物包含保护细菌免受胃的酸性环境的要素。在一些实施方案中，该组合物包括肠溶衣。

在一些实施方案中，组合物是基于食物的产品。基于食物的产品可以是例如酸奶、奶酪、乳、肉、奶油或巧克力。此类基于食物的产品可被视为可食用，这意味着它已被批准用于人类或动物食用。

本公开的一个方面涉及食品，其包含上文定义的细菌物种。术语“食品”意图涵盖所有可食用产品，其可以是固体、胶质或液体。合适的食品可以包括例如功能性食品、食物组合物、宠物食物、牲畜饲料、保健食物、饲料等。在一些实施方案中，食品是处方的保健食物。

如本文所用，术语“功能性食品”是指不仅能够提供营养作用而且还能够向消费者传递进一步有益作用的食物。因此，功能性食品是具有掺入其中的组分或成分(例如本文所述的那些)的普通食品，所述组分或成分赋予食品以除纯营养效果外的特定的功能性成分，例如医学或生理益处。

适用于本公开的特定食品的实例包括基于乳的产品、即食甜品、用例如乳或水重构的粉末、巧克力乳饮料、麦芽饮料、即食盘(ready-to-eat dishes)、速食盘(instantdish)或人饮料或食物组合物，其代表意图用于人类、宠物或牲畜的完全或部分饮食。

在一个实施方案中，根据本公开的组合物是意图用于人、宠物或家畜的食品。组合物可以意图用于选自下组的动物：非人灵长类、狗、猫、猪、牛、马、山羊、绵羊或家禽。在另一个实施方案中，组合物是意图用于成年物种，特别是成年人的食品。

本公开的另一个方面涉及包含如上文定义的含有细菌种类的食品、膳食补充剂、营养食品、营养配方食品、饮料和药物及其用途。

在本公开中，“基于乳的产品”指具有变化的脂肪含量的任何液体或半固体的基于乳或乳清的产品。基于乳的产品可以是例如牛乳、山羊乳、绵羊乳、脱脂乳、全脂乳、在没有任何加工的情况下从乳粉和乳清重组的乳、或经加工的产品，例如酸奶、凝固乳(curdledmilk)、凝乳(curd)、酸乳、酸全脂乳、黄油乳和其他酸乳产品。另一个重要组包括乳饮料，例如乳清饮料、发酵乳、炼乳、婴儿或婴孩乳；调味乳、冰淇淋；含乳的食物，例如糖果。

微生物组合物可以是片剂、可咀嚼片剂、胶囊剂、棒状包装、粉末或泡腾粉。组合物可以包含含有细菌的包被珠。可以将粉末悬浮或溶解在诸如水的可饮用液体中以进行施用。

在一些实施方案中，微生物组合物包含分离的微生物。分离的微生物可以与一种或多种其他物质一起包含在组合物中。例如，分离的微生物可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起包含在药物组合物中。在配制包含分离的微生物的药物组合物之前，可以在体外培养分离的微生物以增加微生物的群体。

在一些实施方案中，微生物组合物可以用于促进或改善人类健康。在一些方面，微生物组合物可以用于改善肠健康。在一些方面，微生物组合物可用于调节食欲。在一些方面，微生物组合物可以用于调节血糖水平。在一些方面，微生物组合物可用于调节胰岛素敏感性。

在一些实施方案中，所公开的微生物组合物用于调节受试者的食欲。

本文所述的微生物也可以用于预防应用中。在预防性应用中，以足以至少部分降低形成疾病的风险的量将根据本发明的细菌类或组合物施用于易患特定疾病或以其他方式处于特定疾病的风险的患者。精确量取决于许多患者特异性因素，例如患者的健康状况和体重。

本文还提供了用于维持或改善受试者的总体健康或状况的方法，所述方法包括向受试者施用治疗组合物，所述治疗组合物包含具有16S rRNA基因的细菌(例如，A.Hadrus)，所述16S rRNA基因与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7至少75％、80％或85％相同。如本文提供的组合物通常包含细菌群体，其中群体的每个成员具有基本上相同的16S rRNA基因序列。在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，施用组合物后患者的总体健康或状况大于未接受组合物施用的可比患者的总体健康或状况。可以使用本领域公认的方法和技术来评估总体健康或状况。例如，施用如本文提供的并与总体适合度和健康有关的组合物的益处可包括减少病原体负荷、改善的微生物发酵模式、改善的营养物吸收、改善的免疫功能、改善的肠激素信号传导和代谢调节、辅助消化、增加训练耐力或表现耐力(performance endurance)、在产生增加的乳酸水平的身体活动期间或之后降低人的乳酸水平、减少因身体活动引起的人体内的炎症、在身体活动期间增加人体内的能量代谢、在身体活动期间改善人的运动训练、表现或恢复、从导致炎症和乳酸水平升高的身体活动恢复、或促进体重减轻。

在一些方面，本公开提供了各种速释和控释制剂，其包含本文所述的微生物及其组合。控释制剂有时涉及置于细菌上的控释包衣。在特定的实施方案中，控释包衣可以是肠溶衣、半肠溶衣、延迟释放包衣或脉冲释放包衣，它们可以是期望的。特别地，如果包衣在活性释放(即治疗性微生物及其组合的释放)中提供适当的滞后，则它将是合适的。可以理解的是，在一些实施方案中，人们不希望将治疗性微生物及其组合释放到胃的酸性环境中，其可以在其到达肠中的期望靶标之前降解和/或破坏所教导的微生物。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物涵盖如上所述的A.hadrus及其任何变体。

在一些实施方案中，本公开的药物微生物组合物还包含相对于总重量组合物为约1至约30重量％的量的益生元。例如，益生元可以占组合物总重量的5至20重量％。示例性的碳水化合物选自：果糖寡糖(或FOS)、短链果糖寡糖、菊粉、异麦芽糖寡糖、果胶、木糖寡糖(或XOS)、壳聚糖-寡糖(或COS)、beta-葡聚糖、阿拉伯胶(arable gum)改性和抗性淀粉、聚右旋糖、D-塔格糖、金合欢纤维(acacia fiber)、长豆角(carob)、燕麦和柑桔纤维。例如，在一个实施方案中，益生元可以是短链果糖寡糖(为简单起见，在下文中显示为FOSs-c.c)；所述FOSs-c.c.不是可消化的碳水化合物，通常通过甜菜糖的转化而获得，并且包括与三个葡萄糖分子键合的蔗糖分子。

在一个实施方案中，组合物还包含至少一种其他种类的其他食品级细菌，其中所述食品级细菌优选选自下组：乳酸菌、双歧杆菌(bifidobacteria)、丙酸杆菌(propionibacteria)或其混合物。

在一些实施方案中，微生物组合物包含10⁶-10¹²CFU(菌落形成单位)、10⁸-10¹²CFU、10¹⁰-10¹²CFU、10⁸-10¹⁰CFU或10⁸-10¹¹CFU A.hadrus。在其他实施方案中，微生物组合包含约10⁶、约10⁷、约10⁸、约10⁹、约10¹⁰、约10¹¹、或约10¹²CFU A.hadrus。

施用

可以配制根据本发明的包含A.hadrus的组合物，以递送至接受其施用的个体内的期望的作用部位。例如，可以将组合物配制成用于对胃肠内腔施用，或在肠、末端回肠或结肠中延迟释放。

当用作药物时，即，用于治疗或预防疾病或病症时，本文所述的组合物通常以药物组合物的形式施用。此类组合物可以以药学领域公知的方式制备，并且包含至少一种活性剂，即如本文所述的活细菌。通常，以药学有效量，即治疗或预防有效量施用组合物。活性剂，即如本文所述的微生物的施用量通常将由内科医生根据相关情况，包括要治疗的病况、选择的施用途径、施用的一种或多种微生物的活性、个体患者的年龄、体重和响应、患者症状的严重性等决定。

用于口服施用的组合物可以采取散装液体溶液或悬浮液或散装粉末的形式。然而，更通常地，组合物以单位剂型存在以促进精确给药。典型的单位剂型包括液体组合物的预填充的、预先测量的安瓿或注射器，或者在固体组合物的情况下为丸剂、片剂、胶囊剂等。

用于可口服施用或可注射施用组合物的上述组分仅是代表性的。在Remington'sThe Science and Practice of Pharmacy,21^st edition,2005,Publisher:LippincottWilliams&Wilkins的第8部分(其通过引用并入本文)中阐述了其他材料以及加工技术等。

对于口服施用，特别使用压缩片剂、丸剂、片剂、胶囊(gellules)、滴剂和胶囊剂。

在另一个实施方案中，本公开的组合物与一种或多种其他活性剂组合施用。在此类情况下，本公开的组合物可以与一种或多种其他活性剂连续、同时或序贯施用。

剂量和给药时间表

本文公开的剂量是平均情况的示例。当然，可以存在个别情况，其中较高或较低的剂量范围是值得的，并且这在本发明的范围内。

在一些实施方案中，受试者中的有效每日剂量可以为约1×10⁶至约1×10¹²个菌落形成单位(CFUs)、1×10⁷至1×10¹²CFU、1×10⁸至1×10¹²CFU、1×10⁸至1×10¹¹CFU、1×10⁸至1×10¹⁰CFU、1×10⁸至1×10⁹CFU、1×10⁹至1×10¹²CFU、1×10¹⁰至1×10¹²CFU或1×10¹⁰至1×10¹¹CFU。受试者可以是人或非人灵长类。或者，受试者可以是另一种哺乳动物，例如大鼠、小鼠、兔等。

在一些实施方案中，每日剂量可以每天向受试者施用约1-2周、1-4周、1-2个月、1-6个月或1-12个月。

或者，隔天一次、每周3次、每周5次、每月一次、每月两次、每月3次、每2个月一次、或每年3次、4次或每年6次对受试者施用剂量，所述剂量的范围可以是约1×10⁶至约1×10¹²CFU、1×10⁷至1×10¹²CFU、1×10⁸至1×10¹²CFU、1×10⁸至1×10¹¹CFU、1×10⁸至1×10¹⁰CFU、1×10⁸至1×10⁹CFU、1×10⁹至1×10¹²CFU、1×10¹⁰至1×10¹²CFU、或1×10¹⁰至1×10¹¹CFU。在这些实施方案中，可以将剂量施用于受试者达约1至2周、1至4周、1至2个月、1至6个月或1至12个月的时间段。

对受试者施用的剂量应足以治疗疾病和/或病况，部分逆转疾病和/或病况，完全逆转疾病和/或病况或建立健康状态的微生物组。在某些方面，对受试者施用的剂量应足以治疗或减轻炎性病况的症状。在一些实施方案中，炎性为炎性肠病，例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。

合适的剂量和剂量方案可以通过本领域普通技术人员已知的常规范围寻找技术确定。通常，以较小剂量开始治疗，该剂量小于活性成分的最佳剂量。此后，以小增量增加剂量，直到达到该情况下的最佳效果。有效的剂量和治疗方案可以通过惯用和常规方法确定，开始于例如在实验动物中的低剂量，然后在监测效果的情况下增加剂量，并系统性改变剂量方案。动物研究通常用于确定每千克的生物活性剂的最大耐受剂量(“MTD”)。本领域技术人员在包括人在内的其他物种中在避免毒性的情况下定期外推剂量以达到功效。

剂量可以是一次施用或两次或更多次施用的组合，例如每天、每两次、每周、每月、或者根据临床医生或从业人员的判断，考虑到诸如年龄、体重、疾病严重性以及每次施用中施用的剂量等因素以其它方式。

在另一个实施方案中，可以提供有效量，其为1-500ml或1-500克每ml或每克具有例如10⁷-10¹¹个细菌的细菌组合物，或胶囊、片剂或栓剂，其具有1mg至1000mg具有10⁷-10¹¹个细菌的冻干粉。接受短期治疗者可以比接受长期施用者(例如医院工作人员或收治于长期护理机构的人员)接受更高的剂量。

如上所述的有效剂量可以例如口服、直肠、静脉内、经由皮下注射或经皮施用。有效剂量可以固体或液体形式提供，并且可以以一种或多种剂型单位(例如，片剂或胶囊剂)存在。

组合疗法

本文所述的包含A.hadrus株的组合物可以与其他治疗疗法和/或药物组合物组合。例如，患有炎性肠病的患者可能已经在服用其医生开的药物来治疗病况。在实施方案中，本文教导的药物组合物能够与患者的现有药物结合施用。

例如，包含如如本文所述的A.hadrus菌株的组合物可以与以下一种或多种组合：益生元、止泻药、5-氨基水杨酸化合物、抗炎剂、抗生素、抗体(例如，靶向炎性细胞因子的抗体，例如，靶向抗细胞因子剂的抗体，例如抗TNF-a，(例如，阿达木单抗、certolizumabpegol、戈利木单抗、英夫利昔单抗、V565)或抗IL-12/IL-23(例如乌斯他单抗，risankizumab、brazikumab、乌斯他单抗)、JAK抑制剂(例如tofacitinib、PF0670084l、PF06651600、filgotinib、upadacitinib)、抗整合蛋白剂(例如vedolizumab，etrolizumab)、SIP抑制剂(例如，etrasimod、ozanimod、amiselimod)，基于细胞的重组剂(例如Cx601)、类固醇、皮质类固醇、免疫抑制剂(例如硫唑嘌呤和巯基嘌呤)、维生素和/或特殊饮食。

可以将具有或不具有一种或多种益生元的组合物与其他药剂以组合疗法模式一起施用，包括抗微生物剂。施用可以是连续的，在数小时或数天的时间段内，或者是同时的。

诊断学

在一些其他实施方案中，可以使用定量PCR(qPCR)检测样品(例如，粪便样品或肠活组织检查样品)中的A.hadrus水平。例如，可以使用普通技术人员已知的方法从样品中提取微生物DNA。在qPCR中，可以使用通用引物扩增来自提取的DNA的16S rRNA基因，并同时使用通用探针进行定量。在相同的qPCR中，可以包含对目标微生物特异性的探针以定量所述微生物的水平。例如，qPCR可以包括用于扩增和量化总微生物16S rRNA基因的通用引物和通用探针以及一种或多种对A.hadrus特异性的探针。

因此，在一些实施方案中，用于在受试者中诊断IBD如UC或CD的方法包括：从受试者获得样品；从粪便样品中提取微生物DNA；从提取的DNA中扩增16S rRNA基因；使用qPCR定量16S rRNA基因的水平；并且当样品中A.hadrus的水平相对于对照样品升高时将受试者诊断为患有CRC或CRA或有形成UC或CD的风险。

以下实施例意图说明而非限制本公开。

实施例

实施例1

本实施例证明了来自健康受试者相对于患病受试者的微生物群的分析，以鉴定与患有IBD的受试者相比在健康受试者中A.hadrus的普遍性显著增加。

A.方法

研究设计和抽样

研究和样品收集由University College Cork Teaching Hospitals的临床研究伦理委员会批准。所有参与个人均提供知情同意，之后在爱尔兰科克的Cork UniversityHospital或Bon Secours Hospital进行胃肠道检查。CD或UC和炎症状态的诊断是基于在标准临床结肠镜检查期间对胃肠道的宏观检查。接受常规监测且未诊断出患有任何消化系统疾病或综合征的成年人(>＝18岁)被视为健康对照。活组织检查样品获自成年IBD患者的发炎组织或对照受试者的健康组织。排除标准是在胃肠调查前一个月或期间使用抗生素。在医院，将活组织检查样品收集在含有3mL RNA-later(Qiagen,Hilden,Germany)的5mL聚丙烯试管(Sarstedt,Numbrecht,Germany)中。将活组织检查样品在4℃贮存24小时，之后在-80℃转移。表1中汇总了相关的人口统计详情和结肠位置。

核酸提取和测序

在使用AllPrep DNA/RNA/Protein Mini试剂盒(Qiagen)进行DNA/RNA纯化之前，将活组织检查样品在RNA-later中完全解冻。将已解冻的活组织检查转移至含有350μL含有β-巯基乙醇的RLT缓冲液(Sigma-Aldrich,St Louis,MO,USA)、三个3.5mm玻璃珠和0.25mL0.1mm玻璃珠(Biospec,Bartlesville,OK,USA)的管中。在MagNA Lyser(Roche,Penzberg,Germany)中以3,500或6,500rpm进行两次破碎和均质化15秒。置换多变量方差分析(Permutational Multivariate Analysis of Variance,PERMANOVA)检验证实，不同的离心速度不显著影响微生物群(数据未显示)。根据试剂盒制造商的说明进行后续的DNA/RNA纯化。根据制造商的说明(Ambion，Carlsbad，CA，USA)，通过Turbo无DNA试剂盒除去RNA样品中的DNA污染。使用Nano-Drop2000分光光度计(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)测量DNA和RNA的浓度。分别在1％琼脂糖凝胶电泳和2100Bioanalyzer系统(AgilentTechnologies)上检查DNA和RNA的完整性。核酸提取物在-80℃贮存，直至进一步下游应用。对于RNA-16S分析，根据制造商的说明(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)，使用高容量cDNA逆转录试剂盒对总RNA进行逆转录。使用带有Nextera转座酶衔接子的34 1F和805R引物组，使用PCR扩增l 6S rRNA V3-V4高变区(Klindworth et al.2013,NucleicAcids.Res.41(1):e1):16S_V3_341F,TCGTCGGCAGCGTC_AGATGTGTATAAGAGACAG_CCTACGGGNGGCWGCAG(SEQ ID NO:8)；16S_V4_805R,GTCTCGTGGGCTCGG_AGATGTGTATAAGAGACAG_GACTACHVGGGTATCTAATCC(SEQ ID NO:9)。将模板DNA或cDNA与浓度为0.2μM的引物和Phusion高保真度DNA聚合酶混合，总体积为30μL(Thermo Scientific)。PCR条件是98℃ 30秒，98℃ 10秒，55℃ 15秒和72℃ 20秒的30个循环，最后在72℃延伸5分钟。用琼脂糖凝胶上的条带的存在验证PCR产物，并使用Agencourt AMPure XP磁珠(Beckman-Coulter,Brea,CA,USA)纯化。纯化的DNA产物用50μL EB缓冲液(Qiagen)洗脱。使用5μL PCR产物作为模板，在最终体积50μL中使用含有Nextera XT索引的Illumina引物和Phusion高保真度DNA聚合酶再进行8个PCR循环，然后使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化。使用Quant-iT Picogreen dsDNA测定试剂盒(Thermo Scientific)测量扩增子浓度。等摩尔合并文库，并在Eurofins Genomics(位置)通过Illumina MiSeq测序以得到2x300 bp读段。将RNA样品的等分试样用于宿主转录物组RNAseq，其由Macrogen(位置)使用TruSeq链mRNA样品制备试剂盒(Illumina)用Illumina HiSeq 4000 2x100读段按照制造商的方案进行。

测序数据处理

使用DADA2(Callahan et al.2016,Nature Methods,13:581-583)对DNA-16S和RNA-16S序列进行去噪音。除了以下项外使用默认参数：对于filterAndTrim,DNA-16S和RNA-16S分别为trimLeft＝c(l 7,21),maxEE＝c(2,2),truncLen＝c(265,215)和c(260,235)；对于mergePairs，DNA-16S和RNA-16S分别为minoverlap＝10和20。在图1中描绘了每个步骤的序列计数分布。在除去嵌合体后，使用StrainSelect 2016(万维网于secondgenome.com/strainselect)将菌株水平分类学分配给核糖体序列变体(RSV)。如果未确定菌株水平分配，则使用DADA2中的assignTaxonomy函数分配更高水平的分类，其中Greengenes v13.8聚簇于97％的同一性。为了减少稀疏性，将低丰度的RSV以5％进行流行性过滤。然后，为了除去非16S-rRNA序列，仅保留超过400bp的序列。具有<5000个读段的样品也从下游分析中除去。对于宿主RNAseq数据，使用具有参数，1:30:10LEADING:20TRAILING:20 SLIDINGWINDOW:4:20 MINLEN:35的Trimmomatic v0.36来修整Illumina衔接子和低质量序列。使用HiSat2 v2.l.0(Kim et al.,2015,Nature Methods,12:357-360)将质量过滤的读段与人类基因组(GRCh38)进行比对，并使用SUBREAD vl.5.2中的featureCounts函数(Liao et al.,2013,Nucleic Acids Res,41:el08)使用默认参数生成计数表。

统计分析

在R统计环境(R核心开发组)中进行了数据分析和可视化。使用phyloseq包计算微生物群的alpha和beta多样性(McMurdie and Holmes,2012,Pac Symp Biocomput,2012:235-246)。使用vegan套装中的adonis函数计算PERMANOVA(Anderson,2001,Austral Ecol,26:32-46)。通过metagenomeSeq包中的零膨胀对数标准化FitFeatureModel确定显著不同的微生物群RSV(Paulson et al.2013,metagenomeSeq:Statistical analysis forsparse high-throughput sequencing.Bioconductor package:1.11.10ed.2013)。由于FitFeatureModel不能估计一组中所有样品均为零序列计数的模型，因此，如果该组中的所有样品在模型估计之前均具有零序列计数，则将1个计数添加到两个最深的测序样品。通过Benjamini-Hochberg方法调整计算的p值。至少一组(CD、UC或对照)中至少75％受试者中的具有校正的p值<0.05，绝对log2倍数变化(abs-log2FC)>1和非零序列计数的RSV定义为动态RSV。使用DESeq包(Love et al.,2014,Genome Biol,15:550)以betaeqor＝DESeq函数的TRUE选项对宿主RNAseq进行差异表达分析。使用ReactomeP A包(Yu and He,2016,Molecular BioSystems)进行途径富集分析。

B.结果

分组人口统计学。

研究分组由平均已经诊断10年并且正在针对急性症状接受IBD药物的IBD患者组成(表1)。

表1.研究分组人口统计学

此分组包括从58名CD、88名UC和39名对照受试者获得的发炎的结肠粘膜的185份活组织检查样品。对照组间的年龄显著更高(卡方检验，p<0.001)，这是预期的，因为老年人更可能进行常规结肠镜检查和组织学。然而，三组之间的性别不是显著不同的(ANOVA p＝0.743)。为了了解是否任何特定的微生物群与年龄相关，在年龄与DNA-16S或RNA-16S RSV丰度之间进行相关性测试。DNA-16S和RNA-16S RSV的最高相关性系数分别为rho＝0.29和0.3，且它们无一是显著的(校正的p>0.05)。根据这些结果，未用年龄调整以下统计检验。

DNA-16S和RNA-16S两者的微生物群组成和多样性与疾病相关

为了对UC、CD和对照中的肠粘膜的微生物群进行概况分析，通过对可用样品的DNA(DNA-16S)以及cDNA (RNA-16S)测序检查16S rRNA基因的丰度和表达：DNA-16S，61个UC、42个CD和29个对照；RNA-16S，75个UC、46个CD和25个对照样品；35个CD、52个UC和15个对照在DNA-16S和RNA-16S之间是共同的。在方法中所述的所有预处理后，DNA-16S和RNA-16S的去噪音的RSV计数分别为14,872±6,048和21,324±7,742(平均值±SD)。对序列进行去噪音，对于DNA-16S和RNA-16S分别产生313和435个RSV。PERMANOVA检验证实了DNA-16S(p＝0.002)和RNA-16S(p＝0.001)中的CD、UC和对照组间RSV组成是显著不同的。此外，在DNA-16S而非RNA-16S中，RSV组成在年龄组中也存在显著差异(p＝0.021)。在两个数据集中，性别均与RSV组成无关(p>0.05)。通过两个数据集中的Kruskal-Wallis检验，Alpha多样性在CD、UC和对照组之间显著不同(p<0.05；图2A(DNA-16S丰富度和Shannon多样性)和图2B(RNA-16S丰富度和Shannon多样性)。Wilcoxon秩和检验用于进一步比较各组之间的差异，除UC与对照组之间的Shannon多样性外，所有组合均在两个数据集中表明显著差异(p<0.05)。

RNA-16S样品的微生物组成表明与DNA-16S样品的迁移

使用具有两个数据集的102个样品比较了DNA-16S和RNA-16S数据。从总共486个RSV，两个数据集之间共享262个，并且51个和173个RSV分别对于DNA-16S和RNA-16S是独特的。在Bray-Curtis相异矩阵上的主坐标分析(PCoA)指示从DNA-16S(圆圈)至RNA-16S(三角形)的显著迁移(图3)，PERMANOVA检验证实了两个数据集之间的显著差异(p＝0.001)。椭圆形表明在DNA-16S和RNA-16S之间根据疾病状态(CD、UC或对照)的相似迁移。

Anaerostipes hadrus代谢活性在UC和CD两者中显著消减

然后，鉴定在DNA-16S和RNA-16S中与对照相比与CD和UC有关的微生物特征。在DNA-16S数据集中，与对照组相比，3和12个RSV分别在CD和UC中显著消减(校正的p<0.05和abs-log2FC>1)(图4)。那些中，仅粪球菌RSV2是CD和UC中都消减的动态RSV(参见上述实施例1方法部分中的定义)。三个另外的RSV是动态的，并且在DNA-16S中的UC样品中消减；Anaerostipes hadrus RSV和其他两种对单个菌株特异性的RSV，灵巧粪球菌GD/7和甲酸牙殖菌(Gemmiger formicilis)X2-56。在RNA-16S数据集中，与对照组相比，10和9个RSV分别在CD和UC中显著消减(校正的p<0.05和abs-log2FC>1)(图4)。那些中，总共10个RSV是动态的，包括A.hadrus RSV(在CD和UC两者中消减)，灵巧粪球菌GD/7(在CD中消减)，G.formicilis X2-56(在UC中消减)，Slackia isoflavoniconvertens HE8(在UC中消减)，Sutterella wadsworthensis 2_1_59BFAA (在CD中富集)，Turicibacter sanguinisMOL361(在CD中消减)，未分类的粪球菌RSV1(在CD中富集)和RSV2(在UC中消减)，未分类的毛螺菌科RSVl(在UC中消减)和RSV2(CD中消减)。

宿主RNAseq确认与对照相比CD和UC中的炎症

将来自162个样品(52个CD、83个UC和27个对照)的RNAseq文库的质量修整的宿主RNAseq读段与32,471个基因进行比对，每个样品的总读段计数为19,590,032±7,012,749(平均值±SD)。使用样品之间的Euclidean距离进行的PERANOVA检验表明，CD、UC和对照组是显著不同的(p＝0.001)，这在主成分分析中显示为CD，UC偏离对照组的迁移(数据未显示)。此外，通过PERMANOVA检验，年龄(p＝0.008)而非性别(p＝0.096)与宿主基因表达显著相关。与对照组相比，CD中的1579个基因是显著差异表达的(校正的p<0.05和abs-log2FC>1)。在那些基因中，FOLH1(log2FC＝4.02)、MTTP(log2FC＝3.71)和CXCL8(log2FC＝3.68)表现出最高的abs-log2FC，并且在CD中均被上调。CXCL8编码嗜中性粒细胞趋化因子，它是炎症应答的主要介质，并且在具有活动疾病状况的IBD患者的肠粘膜中显示升高(Mazzucchelli et al.,1994,Am J Pathol,144:997-1007)。FOLH1编码叶酸水解酶，Raiset al.(2016,JCI Insight,1:e88634)发现该叶酸水解酶在IBD患者中升高。与对照相比，在UC中的1,469个基因显著差异表达，C2CD4A(log2FC＝3.50)、DUOXA2(log2FC＝3.49)和IGHGP(log2FC＝3.37)显示了UC中最高的基因上调。已知C2CD4A参与炎症应答(Warton etal.,2004,Gene,342:85-95)。途径富集分析表明，与对照相比，CD和UC患者两者中的IL-4/IL-13、胞外基质组织化、胶原降解和IL-10信号传导途径的显著变化。这些结果证实与对照相比，CD和UC患者中的炎症应答和粘膜损害增加。

A.hadrus代谢活性与O-聚糖生物合成途径的终止有关

由于与RNA-16S数据集中的对照相比，A.hadrus RSV是在UC和CD两者中唯一动态消减的，进行了进一步的研究以确定其活性是否与宿主基因表达有关，其通过针对宿主RNAseq比较A hadrus RSV RNA-16S丰度，其与宿主疾病状态无关。因此，鉴定出与A.hadrusRSV相关的191个显著差异表达的基因(校正的p值<0.05)，其中与对照相比115个基因在UC或CD之间没有差异表达。对191个基因的途径富集分析鉴定出17个显著富集的途径(校正的p<0.05)。研究了每种途径，以寻找一系列显著差异表达的基因。因此，鉴定出O-聚糖生物合成途径的终止(校正的p＝0.002)，其包括与A.hadrus显著负相关的MUC12、MUC13、ST3GAL4和ST6GALNAC4基因和与A.hadrus显著正相关的MUC6。

实施例2

A.hadrus治疗肠炎性病症的用途

本实施例通过对高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型进行葡萄糖耐量测试(GTT)来研究施用活细菌对葡萄糖稳态的影响。如WO2019067087(其通过引用整体并入本文)中所述制备和使用小鼠。

通过给饮用水补充3％的葡聚糖硫酸钠7天在小鼠中诱导IBD。对于每个每日处理，将A.hadrus液体培养物培养至光密度0.4-0.5，然后通过离心沉淀。将细菌重悬于磷酸盐缓冲盐水中，并在第8天开始通过口管饲法向小鼠施用100μl。每天用A.hadrus悬浮液或单独的磷酸盐缓冲盐水作为阴性对照，每天处理小鼠1周。细菌处理5天后，使用内窥镜检查对活小鼠进行结肠炎评分。通过评估结肠半透明性、纤维蛋白附着、粘膜和血管病理和/或粪便特征来确定内窥镜检查损伤评分。处理7天后处死小鼠，并分离结肠组织。固定远端结肠切片，并对炎症和溃疡评分。治疗5天后观察到的内窥镜检查损伤的减少和/或来自处死小鼠的远端结肠切片的炎症和/或溃疡的减少指示A.hadrus治疗的治疗效果。

尽管已经通过以理解清楚为目的的例示和实例详细地描述了前述发明，然而对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离所附权利要求书中描述的本发明的精神和范围的前提下可以进行某些改变和修改。因此，该描述不应被解释为限制本发明的范围。

Claims (13)

1.用于治疗有此需要的受试者的方法，所述方法包括对所述受试者施用包含治疗有效量的细菌的组合物，其中所述细菌具有与SEQ ID NO:8至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的16SRNA基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细菌具有与SEQ ID NO:8至少99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的16S RNA基因。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中对所述受试者施用的所述细菌是活的。

4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述受试者已被诊断患有胃肠病症。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述胃肠病症选自下组：溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、炎性肠病、肠易激综合征和乳糜泻。

6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述治疗有效量的细菌包含约1x10⁷至1x10¹²个菌落形成单位(CFU)的所述细菌。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细菌是A.Hadrus。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括在约1-52周的时间段内每天一次、两次或三次对所述受试者施用所述组合物。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在施用所述组合物之后所述受试者的体重减轻小于未接受所述组合物施用的可比患者的体重减轻。

10.根据权利要求8所述的方法，其中在施用所述组合物之后所述受试者的体重减轻比未接受所述组合物施用的可比患者的体重减轻小约5lbs、10lbs、15lbs、20lbs、25lbs或30lbs。

11.根据权利要求9所述的方法，其中在第一次施用所述组合物后的3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月时测量所述受试者的体重减轻。

12.用于维持或改善患者的总体健康或状况的方法，所述方法包括：

对所述患者施用治疗组合物，其包含：

i.有效量的包含细菌的组合物，其中所述细菌具有与SEQ ID NO:8至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的16S RNA基因；和

ii.药学上可接受的载体。

13.权利要求11的方法，其中在施用所述组合物之后所述患者的总体健康或状况大于未接受所述组合物施用的可比患者的总体健康或状况。

Images