CN112750498B - 靶向逆转录引物结合位点从而抑制hiv病毒复制的方法 - Google Patents
靶向逆转录引物结合位点从而抑制hiv病毒复制的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112750498B CN112750498B CN202011625974.0A CN202011625974A CN112750498B CN 112750498 B CN112750498 B CN 112750498B CN 202011625974 A CN202011625974 A CN 202011625974A CN 112750498 B CN112750498 B CN 112750498B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hiv
- znf417
- znf587
- zinc finger
- pbs
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 title claims abstract description 86
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 title claims abstract description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title claims abstract description 4
- 101000976596 Homo sapiens Zinc finger protein 417 Proteins 0.000 claims abstract description 64
- 102100023558 Zinc finger protein 417 Human genes 0.000 claims abstract description 64
- 101000976376 Homo sapiens Zinc finger protein 587 Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 102100023891 Zinc finger protein 587 Human genes 0.000 claims abstract description 62
- 101710185494 Zinc finger protein Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 102100023597 Zinc finger protein 816 Human genes 0.000 claims abstract description 53
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 12
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 claims description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 10
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 241001213909 Human endogenous retroviruses Species 0.000 claims description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 4
- 230000004719 natural immunity Effects 0.000 abstract description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 108020004437 Endogenous Retroviruses Proteins 0.000 description 9
- 102100022012 Transcription intermediary factor 1-beta Human genes 0.000 description 9
- 101710177718 Transcription intermediary factor 1-beta Proteins 0.000 description 7
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 5
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 5
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 4
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 4
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- 108010034791 Heterochromatin Proteins 0.000 description 3
- 101710160287 Heterochromatin protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 210000004458 heterochromatin Anatomy 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 2
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000684609 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase SETDB1 Proteins 0.000 description 2
- 101000753286 Homo sapiens Transcription intermediary factor 1-beta Proteins 0.000 description 2
- 241000713887 Human endogenous retrovirus Species 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 101100545343 Mus musculus Zfp809 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 101710167800 Capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010196 ChIP-seq analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 1
- 102100023696 Histone-lysine N-methyltransferase SETDB1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101710130420 Probable capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710204410 Scaffold protein Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000008143 early embryonic development Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 230000020509 sex determination Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000037426 transcriptional repression Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
- G16B20/30—Detection of binding sites or motifs
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B35/00—ICT specially adapted for in silico combinatorial libraries of nucleic acids, proteins or peptides
- G16B35/20—Screening of libraries
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B5/00—ICT specially adapted for modelling or simulations in systems biology, e.g. gene-regulatory networks, protein interaction networks or metabolic networks
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Library & Information Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
- Software Systems (AREA)
- Public Health (AREA)
- Evolutionary Computation (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Databases & Information Systems (AREA)
- Data Mining & Analysis (AREA)
- Bioethics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Artificial Intelligence (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明属于基础研究领域，尤其涉及一种靶向逆转录引物结合位点从而抑制HIV病毒复制的方法。首先公开了一种从数据库中筛选出HIV抑制因子的方法，包括：S1：从数据库提取锌指蛋白ChIP结合峰的记录数据文件；S2：整理HIV靶点序列，利用MEME工具获得靶点基序Motif；获得人类基因组上含有的HIV靶点的位置信息；S3：将锌指蛋白ChIPseq结合峰文件与人类基因组上HIV靶点的位置信息文件进行比对，得到潜在的HIV靶向抑制的锌指蛋白。本发明提供了一种寻找HIV限制因子的方法，找到了HIV的两个限制性锌指蛋白ZNF417和ZNF587，填补了人体对于HIV的天然免疫作用这一领域的空白。
Description
技术领域
本发明属于基础研究领域，尤其涉及一种靶向逆转录引物结合位点从而抑制HIV病毒复制的方法。
技术背景
逆转录病毒(retrovirus)长期依附于人类及其他高等动物，与其共同存活进化，并与各种生物学现象息息相关。逆转录病毒根据其与宿主的关系可以分为内源性和外源性。内源性病毒(endogenous retrovirus,ERV)来源于古外源性逆转录病毒对哺乳动物生殖细胞的入侵，在长期进化中逐渐积累下来成为基因组的一部分。小鼠和人类基因组中约有10％序列属于ERVs，这些ERVs大部分处于转录沉默状态，以维持基因组的稳定。与ERVs相比，外源性逆转录病毒则具有更强的致病性。例如较为熟知的逆转录病毒人类免疫缺陷病毒HIV(human immunodeficiency virus)，作为获得性人体免疫缺陷综合征(艾滋病，acquired immune deficiency syndrome，AIDS)致病原，仍是公共健康安全的重要威胁之一。
逆转录病毒的逆转录过程是其复制周期的核心。逆转录病毒的基因组上有一段序列，与宿主的tRNA 3’端匹配。因此，逆转录病毒可以利用tRNA作为引物，以基因组RNA为模板合成DNA完成逆转录过程。这一段与tRNA结合的序列就是PBS(primer binding site，引物结合位点)。不同病毒的PBS匹配着不同的tRNA，人类免疫缺陷病毒HIV利用赖氨酸(Lys)tRNA。目前，逆转录酶的作用机理已有初步研究。其结构已在2018年被初步解析，证实tRNA可以直接与PBS结合，起始逆转录病毒的逆转录过程。因此，PBS对于逆转录病毒的复制非常重要，而且其序列相对保守，适合作为靶点研究。
KRAB-ZFPs是C2H2串联型锌指蛋白(ZFP)家族中最大的亚群，是小鼠和人类基因组中最大的转录因子家族。KRAB-ZFPs含有两个结构域：N端KRAB结构域和C端C2H2锌指串联结构域。KRAB结构域介导招募TRIM28(也称为KAP1,Tif1β或KRIP-1)，从而作为组蛋白修饰复合体的支架结构，这个复合体包括组蛋白H3K9me3甲基转移酶——SETDB1、组蛋白脱乙酰酶HDAC和异染色质蛋白1(HP1)，催化异染色质形成和转录抑制。在早期胚胎发育过程中，KRAB/TRIM28诱导的基因沉默也可以通过诱导DNA甲基化来促进可遗传的表观遗传沉默，这种甲基化甚至可以在TRIM28耗竭消逝后维持。此外，在某些情况下，KRAB/TRIM28诱导的异染色质沉默可以沿着染色体在较长的基因组距离上传播，这可能是由H3K9me3识别蛋白HP1促进的，H3K9me3可以通过SETDB1的招募而进一步传播。
已有研究报道，KRAB-ZFPs参与许多生物学过程，包括胚胎发育、基因组印记、细胞分化、代谢控制和性别决定。分子生物学研究发现，KRAB-ZFPs在基因组范围内的结合位点多为ERVs。敲除与KRAB结构域相互作用的支架蛋白TRIM28或其伴侣组蛋白甲基转移酶SETDB1可激活包括小鼠和人类胚胎干细胞(ESCs)中特异表达的多种ERVs。在抑制ERVs表达的KRAB-ZFPs中，研究比较深入的是基因ZFP809。通过分析小鼠白血病病毒(MuLV)脯氨酸引物结合序列(PBS-Pro)的结合蛋白，首次鉴定出ZFP809和TRIM28，发现这两个蛋白可以在小鼠胚胎干细胞中抑制具有PBS-Pro元件的ERVs表达。然而锌指蛋白是否对HIV病毒以及其引物结合序列PBS-Lys有何作用，作用机理如何还未见报道。
发明内容
发明人在近期的研究中，通过大规模分析文献中已发表的锌指蛋白数据库，从中找到了潜在的结合赖氨酸Lys tRNA的引物结合位点PBS-Lys的锌指蛋白，该发现对于进一步探究锌指蛋白抑制HIV病毒的作用提供了研究基础。
具体的，本发明的技术方案如下：
本发明第一个方面公开了一种从数据库中筛选出HIV抑制因子的方法，包括：
S1：从GEO数据库获取人类KRAB-ZFPs家族锌指蛋白的ChIPseq数据，并提取锌指蛋白ChIP结合峰的记录数据BED文件；
S2：整理HIV靶点序列，输出FASTA文件；根据FATSA文件利用MEME工具获得靶点基序Motif；利用FIMO工具在人类基因组寻找包含该motif的位置，并与人类内源性逆转录病毒的注释信息BED文件比对；获得人类基因组上含有的HIV靶点的位置信息，输出为BED文件；
S3：将锌指蛋白ChIPseq结合峰BED文件与人类基因组上HIV靶点的位置信息BED文件利用BEDTools工具进行比对，得到潜在的HIV靶向抑制的锌指蛋白，即HIV抑制因子。
优选的，在S1中，通过GEO数据库的GSE78099，GSE76496两组高通量的锌指蛋白ChIPseq数据，从中整理出人类KRAB-ZFPs结合位点信息文件。
优选的，在S2-S3中，确定HIV靶点PBS-Lys，获得PBS-Lys的motif以及在基因组上的定位信息；
将PBS-Lys位点信息和KRAB-ZFPs的数据比对，得到了潜在的HIV抑制因子锌指蛋白ZNF417(NP_689688.2)和ZNF587(NP_116217.1)。
更优选的，还包括步骤S4：验证ZNF417和ZNF587对于HIV病毒的抑制作用。
较佳的，步骤S4包括：
S41：构建ZNF417和ZNF587表达载体，通过ChIP实验和报告基因实验确定了ZNF417和ZNF587对于PBS-Lys的结合作用；
S42：运用CRSPR-cas9系统构建ZNF417和ZNF587敲除的细胞系，在该细胞系中感染HIV假病毒；或
在过表达ZNF417和ZNF587的细胞中感染HIV假病毒，验证ZNF417和ZNF587对于HIV病毒的抑制作用。
本发明第二个方面公开了一种锌指蛋白ZNF417和ZNF587在制备治疗HIV药物中的应用。
优选的，所述药物为抑制HIV病毒复制的药物。
本发明第三个方面公开了一种锌指蛋白ZNF417和ZNF587在制备靶逆转录HIV引物结合位点药物中的应用。
本发明第四个方面公开了一种抑制HIV病毒复制的方法，通过锌指蛋白结合HIVPBS-Lys，从而抑制HIV病毒的复制。
本发明第五个方面公开了一种抑制HIV病毒复制的药物，所述药物包含锌指蛋白ZNF417和/或ZNF587。
在本发明的一些优选实施例中，一种可以鉴定出HIV抑制因子的方法，该方法包括以下步骤：
1.从GEO数据库(Gene Expression Omnibus https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)获取人类KRAB-ZFPs家族锌指蛋白的ChIPseq数据，并提取锌指蛋白ChIP结合峰的记录数据BED文件。
2.整理HIV靶点序列，输出FASTA文件。根据FATSA文件利用MEME(http://meme-suite.org/)工具获得靶点基序Motif。利用FIMO(http://meme-suite.org/)工具在人类基因组寻找包含该motif的位置，并与人类内源性逆转录病毒(HERV)的注释信息BED文件比对。获得人类基因组上含有的HIV靶点的位置信息，输出为BED文件。
3.将锌指蛋白ChIPseq结合峰BED文件与人类基因组上HIV靶点的位置信息BED文件利用BEDTools(http://dx.doi.org/10.1093/bioinformatics/btq033)工具进行比对。得到潜在的HIV靶向抑制的锌指蛋白。
在本发明的另一些优选实施例中，根据上述方法鉴定出的锌指蛋白ZNF417和ZNF587抑制HIV的方法，包括以下步骤：
1.通过GEO数据库的GSE78099,GSE76496两组高通量的锌指蛋白ChIPseq数据，从中整理出人的KRAB-ZFPs结合位点信息文件。
2.通过确定HIV靶点——PBS-Lys，获得PBS-Lys的motif以及在基因组上的定位信息。
3.将PBS-Lys位点信息和KRAB-ZFPs的数据比对，得到了潜在的靶向HIV的PBS的锌指蛋白ZNF417和ZNF587。
4.构建ZNF417和ZNF587表达载体，通过ChIP实验和报告基因实验确定了ZNF417和ZNF587对于PBS-Lys的结合作用。
5.运用CRISPR-cas9系统构建ZNF417和ZNF587敲除的细胞系，在该细胞系中感染HIV假病毒；或者在过表达ZNF417和ZNF587的细胞中感染HIV假病毒，验证ZNF417和ZNF587对于HIV病毒的抑制作用。并进一步验证本发明中第一方面提供的鉴定HIV的限制性因子的方法的正确性和实用性。
本发明的创新点在于：1)首创性地着眼于逆转录病毒的PBS这一调控元件，以及锌指蛋白特异性识别DNA序列的特点，筛选锌指蛋白作为潜在的HIV病毒的抑制因子。2)目前，HIV如何被宿主细胞识别并抵御的机制仍不清楚。本发明从内源性逆转录病毒入手，结合全基因组水平的二代以上的深度测序以及生物信息学分析手段，从锌指蛋白与内源性逆转录病毒相互作用的数据库中筛选出靶向HIV的PBS的锌指蛋白。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)提供了一种寻找HIV限制因子的方法，找到了HIV的两个限制性锌指蛋白ZNF417和ZNF587。为锌指蛋白靶向逆转录引物结合位点抑制逆转录病毒的机制又提供了一例佐证。
(2)本发明有助于填补人体对于逆转录病毒，尤其是HIV的天然免疫作用这一领域的空白。
(3)本发明为探究锌指蛋白作为哺乳动物进化而来的抑制逆转录病毒的转录因子家族，对于HIV这一近数十年来威胁人类生命健康的病毒，其发挥的作用机制提供了一块重要内容；提供了一种新的可能的抑制HIV病毒的方法。
附图说明
图1中A表示GEO数据库中锌指蛋白与PBS-Lys位点吻合的结合峰数量统计。B表示荧光素酶报告基因验证ZNF417和ZNF587对于PBS-Lys的结合作用。图中“peak counts”指“ChIP结合峰计数”；“relative luciferase activity”指“相对荧光素酶活性”。
图2中A表示ZNF417和ZNF587与GFP融合表达后的ChIPseq验证，ZNF417和ZNF587的结合基序motif与PBS-Lys吻合。B表示验证ChIPseq分析ZNF417和ZNF587结合在基因组上的位点热图。C和D表示两个ZNF417和ZNF587典型的结合靶点示意图。图中“PBS-Lys sites”指“PBS-Lys位点”。
图3表示通过双荧光素酶报告基因验证ZNF417和ZNF587对于HIV的LTR(启动子)转录能力的抑制作用。
图4中AB两图表示两种不同的HIV假病毒在锌指蛋白ZNF417/587过表达(上)或者敲除(下)的细胞中不同的感染程度。病毒感染情况以RFP的表达程度显示，由流式细胞术检测。图中“ZNFs overexpression”指“ZNFs过表达”。
图5表示在人的CD4+T细胞中敲除ZNF417和ZNF587后HIV感染情况。病毒感染以流式细胞术分析检测。
图6表示ZNF417和ZNF587在HIV一个复制周期中起到抑制作用的示意图。
具体实施方式
下面通过详细的实施例对本申请进行进一步的阐述，应该理解，下述实施例仅是为了用于说明本申请，并不对发明内容进行限定。
实施例中所用仪器、设备、试剂均可通过各种渠道获得，例如购买得到，或可以制备而得。
实施例1：结合锌指蛋白高通量测序数据库鉴定出ZNF417和ZNF587为潜在的结合PBS-Lys的锌指蛋白。
一、目的：鉴定出结合HIV靶点PBS-Lys的锌指蛋白
二、方法：
1.通过GEO数据库的GSE78099,GSE76496两组高通量的锌指蛋白ChIPseq数据与PBS-Lys位点比较，筛选出候选的锌指蛋白。
2.通过在报告基因载体promoter前插入PBS-Lys位点，与锌指蛋白ZNF417、ZNF587表达质粒共同表达，检测报告基因活性验证ZNF417和ZNF587对于PBS-Lys的结合能力。
3.通过在HEK293T细胞过表达GFP-tag的ZNF417和ZNF587后进行ChIP实验并进行高通量测序，验证ZNF417和ZNF587对于PBS-Lys位点的抑制作用。
三、结果与讨论
通过GEO的数据分析，我们得到了潜在的结合PBS-Lys的锌指蛋白ZNF417和ZNF587(图1A)。对其进行报告基因检测，我们观察到了ZNF417和ZNF587显著的结合PBS-Lys的能力(图1B)。对ZNF417和ZNF587进行再次的ChIPseq验证我们发现，ZNF417和ZNF587的结合基序与PBS-Lys吻合(图2A)，并且在含有PBS-Lys的人的内源性逆转录病毒位点上有显著的ZNF417和ZNF587的结合(图2B)，并且在这些位点，ZNF417和ZNF587可以招募抑制因子KAP1，并在此形成异染色质修饰H3K9me3来形成对于PBS-Lys的抑制作用(图2B-D)。
实施例2：HIV假病毒感染实验验证ZNF417和ZNF587对于HIV的抑制作用
一、目的：验证ZNF417和ZNF587抑制HIV的能力
二、方法：
1.通过HIV的LTR(类似启动子)驱动荧光素酶报告基因，与ZNF417和ZNF587共同表达，验证ZNF417和ZNF587抑制HIV转录的能力。
2.通过设计HIV假病毒(这里利用了HIV全长病毒pNL4.3以及骨架病毒pSicoR来表达RFP，以RFP表达情况指征HIV病毒感染效率)在ZNF417和ZNF587过表达或者基于CRSIPRcas9系统进行基因敲除的细胞中进行感染，以流式细胞术进行检测，来判断ZNF417和ZNF587是否可以抑制HIV感染。
3.通过在人的CD4+T细胞中敲除ZNF417和ZNF587后感染HIV假病毒，模拟在真实情况下HIV攻击宿主细胞时，ZNF417和ZNF587在其中发挥的作用。
三、结果与讨论
通过报告基因系统，ZFP961作为小鼠的结合PBS-Lys的锌指蛋白作为阳性对照，空载质粒(control)作为阴性对照，我们证实了ZNF417和ZNF587的靶向PBS-Lys抑制HIV转录的能力(图3)。通过在HEK293T中过表达ZNF417和ZNF587后感染HIV病毒，我们验证了ZNF417和ZNF587对于HIV的抑制作用(图4A、B上)并且在一系列的ZNF417和ZNF587基因敲除的细胞系中，体现出了更强的病毒感染效果(图4A、B下)。在ZNF417和ZNF587基因敲除的CD4+T细胞中，HIV更容易感染(图5)，证明了锌指蛋白ZNF417和ZNF587在机体面对HIV病毒感染时作为抑制因子的功能。图6表示ZNF417和ZNF587在HIV一个复制周期中起到抑制作用的示意图。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种从数据库中筛选出HIV抑制因子的方法，其特征在于，包括：
S1：从GEO数据库获取人类KRAB-ZFPs家族锌指蛋白的ChIPseq数据，并提取锌指蛋白ChIP结合峰的记录数据BED文件；
S2：整理HIV靶点序列，输出FASTA文件；根据FATSA文件利用MEME工具获得靶点基序Motif；利用FIMO工具在人类基因组寻找包含该motif的位置，并与人类内源性逆转录病毒的注释信息BED文件比对；获得人类基因组上含有的HIV靶点的位置信息，输出为BED文件；
S3：将锌指蛋白ChIPseq结合峰BED文件与人类基因组上HIV靶点的位置信息BED文件利用BEDTools工具进行比对，得到潜在的HIV靶向抑制的锌指蛋白，即HIV抑制因子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S1中，通过GEO数据库的GSE78099，GSE76496两组高通量的锌指蛋白ChIPseq数据，从中整理出人类KRAB-ZFPs结合位点信息文件。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S2-S3中，确定HIV靶点PBS-Lys，获得PBS-Lys的motif以及在基因组上的定位信息；
将PBS-Lys位点信息和KRAB-ZFPs的数据比对，得到了潜在的HIV抑制因子锌指蛋白ZNF417和ZNF587。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括步骤S4：验证ZNF417和ZNF587对于HIV病毒的抑制作用。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S4包括：
S41：构建ZNF417和ZNF587表达载体，通过ChIP实验和报告基因实验确定了ZNF417和ZNF587对于PBS-Lys的结合作用；
S42：运用CRSPR-cas9系统构建ZNF417和ZNF587敲除的细胞系，在该细胞系中感染HIV假病毒；或
在过表达ZNF417和ZNF587的细胞中感染HIV假病毒，验证ZNF417和ZNF587对于HIV病毒的抑制作用。
6.锌指蛋白ZNF417和ZNF587在制备治疗HIV药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物为抑制HIV病毒复制的药物。
8.锌指蛋白ZNF417和ZNF587在制备靶逆转录HIV引物结合位点药物中的应用。
9.一种抑制HIV病毒复制的药物，其特征在于，所述药物包含锌指蛋白ZNF417和/或ZNF587。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011625974.0A CN112750498B (zh) | 2020-12-30 | 2020-12-30 | 靶向逆转录引物结合位点从而抑制hiv病毒复制的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011625974.0A CN112750498B (zh) | 2020-12-30 | 2020-12-30 | 靶向逆转录引物结合位点从而抑制hiv病毒复制的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112750498A CN112750498A (zh) | 2021-05-04 |
| CN112750498B true CN112750498B (zh) | 2022-06-24 |
Family
ID=75650591
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011625974.0A Active CN112750498B (zh) | 2020-12-30 | 2020-12-30 | 靶向逆转录引物结合位点从而抑制hiv病毒复制的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112750498B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115322996A (zh) * | 2022-06-16 | 2022-11-11 | 同济大学 | 一种靶向特定dna序列的人类krab锌指蛋白的筛选方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101801419A (zh) * | 2007-06-08 | 2010-08-11 | 米尔纳疗法公司 | 作为治疗干预的靶标的miR-34调控的基因和路径 |
| CN110637090A (zh) * | 2016-11-02 | 2019-12-31 | D·基维利希 | 用于表达大型核酸转基因的质粒载体 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1297914A (zh) * | 1999-11-26 | 2001-06-06 | 上海博容基因开发有限公司 | 一种新的多肽——人锌指蛋白58和编码这种多肽的多核苷酸 |
| US20020106798A1 (en) * | 2000-03-02 | 2002-08-08 | Robinson Harriet L. | DNA expression vectors and methods of use |
| US6689877B2 (en) * | 2000-11-06 | 2004-02-10 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Methods and compositions for the treatment of human immunodeficiency virus infection |
| FI20086014A0 (fi) * | 2008-10-24 | 2008-10-24 | Keijo Viiri | Nukleiinihappoja sitova peptidi |
| CN105602989B (zh) * | 2012-01-20 | 2019-04-02 | 中国农业科学院上海兽医研究所 | 一种重组载体及其在制备或筛选抗流感药物中的应用 |
| CN103361328B (zh) * | 2012-03-30 | 2017-08-18 | 复旦大学 | 介导整合的hiv‑1前病毒基因敲除的锌指核酸内切酶及其制法和应用 |
| CN106032550A (zh) * | 2015-03-12 | 2016-10-19 | 上海市公共卫生临床中心 | 基于高通量RNAi筛选HIV-1活性的决定因子的方法 |
| PT3310909T (pt) * | 2015-06-17 | 2021-09-09 | Poseida Therapeutics Inc | Composições e métodos para dirigir proteínas para loci específicos no genoma |
| AU2016332706A1 (en) * | 2015-09-29 | 2018-04-12 | Agenovir Corporation | Compositions and methods for latent viral transcription regulation |
| ES2938210T3 (es) * | 2016-07-13 | 2023-04-05 | Vertex Pharma | Métodos, composiciones y kits para aumentar la eficiencia de edición del genoma |
| CN108103094B (zh) * | 2016-11-25 | 2021-07-02 | 复旦大学 | 用于靶向抑制hiv-1前病毒表达的表达载体及其制备方法和应用 |
| US12269804B2 (en) * | 2018-01-17 | 2025-04-08 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Quinoxalinone compounds, compositions, methods, and kits for increasing genome editing efficiency |
| CN109657698B (zh) * | 2018-11-20 | 2021-09-03 | 同济大学 | 一种基于点云的磁悬浮轨道障碍物检测方法 |
-
2020
- 2020-12-30 CN CN202011625974.0A patent/CN112750498B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101801419A (zh) * | 2007-06-08 | 2010-08-11 | 米尔纳疗法公司 | 作为治疗干预的靶标的miR-34调控的基因和路径 |
| CN110637090A (zh) * | 2016-11-02 | 2019-12-31 | D·基维利希 | 用于表达大型核酸转基因的质粒载体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112750498A (zh) | 2021-05-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Geis et al. | Silencing and transcriptional regulation of endogenous retroviruses: an overview | |
| Xiao et al. | Isolation and characterization of 2019-nCoV-like coronavirus from Malayan pangolins | |
| Russ et al. | Endogenous retroviruses as modulators of innate immunity | |
| Barzon et al. | Applications of next-generation sequencing technologies to diagnostic virology | |
| Gallot-Lavallée et al. | A glimpse of nucleo-cytoplasmic large DNA virus biodiversity through the eukaryotic genomics window | |
| Bello-Morales et al. | HSV-1 and endogenous retroviruses as risk factors in demyelination | |
| Chin et al. | Identification of a major restriction in HIV-1 intersubtype recombination | |
| Yutin et al. | A new family of hybrid virophages from an animal gut metagenome | |
| Tweedy et al. | Complete genome sequence of germline chromosomally integrated human herpesvirus 6A and analyses integration sites define a new human endogenous virus with potential to reactivate as an emerging infection | |
| Jamal et al. | Novel victorivirus from a Pakistani isolate of Alternaria alternata lacking a typical translational stop/restart sequence signature | |
| CN115087750B (zh) | 基于全基因组分析的真核生物物种鉴定方法及应用 | |
| Torma et al. | Combined short and long-read sequencing reveals a complex transcriptomic architecture of African swine fever virus | |
| CN112750498B (zh) | 靶向逆转录引物结合位点从而抑制hiv病毒复制的方法 | |
| Zhang et al. | Transcriptional regulation of endogenous retroviruses and their misregulation in human diseases | |
| Zhao et al. | A 1.5-Mb continuous endogenous viral region in the arbuscular mycorrhizal fungus Rhizophagus irregularis | |
| Li et al. | HIV-1 natural antisense transcription and its role in viral persistence | |
| Hafez et al. | Characterization of the EBV-induced persistent DNA damage response | |
| Gainor et al. | Detection and complete genome analysis of circoviruses and cycloviruses in the small indian mongoose (Urva auropunctata): Identification of novel species | |
| Ertl et al. | Transcriptional profiling of the host cell response to feline immunodeficiency virus infection | |
| Wright et al. | NanoHIV: a bioinformatics pipeline for producing accurate, near full-length HIV proviral genomes sequenced using the oxford nanopore technology | |
| Lovšin et al. | The intricate interplay between APOBEC3 proteins and DNA tumour viruses | |
| Jones et al. | The causes and consequences of DNA damage and chromosomal instability induced by human papillomavirus | |
| Costa et al. | Exploring HERV-K (HML-2) influence in cancer and prospects for therapeutic interventions | |
| Prochasson et al. | The complex relationship between HTLV-1 and nonsense-mediated mRNA decay (NMD) | |
| Holmes et al. | Effects of TDP2/VPg unlinkase activity on picornavirus infections downstream of virus translation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |