CN112748195A - 一种利用gc-nci-ms对脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸同时检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用GC‑NCI‑MS对脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸同时检测的方法，属于分析检测技术领域。本发明利用氯甲酸酯类衍生剂对脂肪酸、氨基酸、多官能团有机酸同时衍生化，具有常温条件下衍生快速、重现性好、衍生产物稳定性高的优点，且能实现对短链脂肪酸羧基、短链多官能团有机酸羧基以及支链氨基酸的氨基和羧基同时衍生化。且GC‑NCI‑MS法基质干扰小、质谱图简单干净、能保留分子离子信息，利用得到的分子/准分子离子信息进行人工解谱定性，结合相应标准曲线，实现对脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的准确定量。实施例数据表明：本发明提供的方法具有抗干扰能力强、灵敏度高、适用范围广、检测结果稳定的优点。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种利用GC-NCI-MS对脂肪酸、氨基酸和有机酸同时检测的方法。
背景技术
气相色谱-质谱联用法(GC-MS)以其高灵敏度、高分辨率、高重现性一直用作检测挥发性、低沸点、热稳定物质的标准检测方法。同时这些条件也限制了该法对极性、高沸点以及热不稳定物质的检测分析。脂肪酸、氨基酸、多官能团有机酸都是生物体内常见小分子有机物，因其结构中都带有羧基、氨基、羟基等基团，而具有较强的极性和热不稳定性。为了使GC-MS法应用于脂肪酸/氨基酸/多官能团有机酸的检测，对样品的衍生化处理是必不可少的。
柱前衍生化是使极性、热不稳定、高沸点分子具有充分挥发性和缩小沸点的有效方法。常见的衍生化方法包括硫酸-甲醇法、氢氧化钾-甲醇法、乙酰氯-甲醇法、氨水-乙醇法等等，它们的衍生原理都是采用不同酸碱条件下的皂化反应，利用醇与长链脂肪酸的羧基发生酯化反应，使长链脂肪酸转化成酯类。这些常规衍生法的缺点是不能对短链脂肪酸和短链有机酸的羧基以及氨基酸中的氨基进行衍生，因而无法实现对氨基酸和多官能团有机酸的衍生处理。
目前，用于测定脂肪酸、氨基酸、多官能团有机酸的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、离子色谱法(IC)、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、氨基酸自动分析仪法、比色法等。待测物结构复杂，脂肪酸分成长链、中链、短链，多官能团有机酸具有多个羧基、羟基，氨基酸带有多个氨基、羧基，还可能带有支链、环状结构等，这都增加了检测的难度，通常需要多种方法相互配合才能实现同时检出。
因此，开发出一种适用范围广、灵敏度高、重现性好，并能实现脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的同时定性与定量的方法具有重要的理论和实践意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用GC-NCI-MS对脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸同时检测的方法，本发明提供的方法能够实现对脂肪酸、氨基酸、多官能团有机酸的同时衍生化，结合GC-NCI-MS实现对脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的同时定性与定量。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
一种利用GC-NCI-MS对脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸同时检测的方法，包括以下步骤：
将待测溶液、碱性试剂、烷基化试剂和氯甲酸酯类衍生剂混合，进行衍生反应，得到衍生液；
将所述衍生液进行GC-NCI-MS检测，得到衍生液中衍生物质的分子离子信息和峰面积，基于得到的衍生物质的分子离子信息，对脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的种类进行定性；
基于定性的脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸结果，建立相应脂肪酸浓度-峰面积标准曲线、氨基酸浓度-峰面积标准曲线和多官能团有机酸浓度-峰面积标准曲线；
将所述衍生液中的衍生物质的峰面积，代入所述峰面积-脂肪酸浓度标准曲线、峰面积-氨基酸浓度标准曲线和峰面积-多官能团有机酸浓度标准曲线中，得到待测溶液中脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的含量；
所述待测溶液中包括脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸，所述多官能团有机酸为不包括脂肪酸和氨基酸的有机酸；
所述GC-NCI-MS检测的参数包括：
气相色谱条件：
色谱柱：HP-5MS或相当型号的色谱柱；
进样量：1μL；
分流比：1～50：1；
进样口温度：250℃；
载气：氦气，流速：1mL/min；
升温程序：80℃保持0～5min，1～10℃/min升温至180℃保持0～5min；1～10℃/min升温至200℃保持0～5min，后运行230℃保持0～5min；
NCI-MS条件：
电离方式：NCI；
电离能：50eV；
离子源温度：180℃；
发射电流：200μA；
传输线温度：250℃；
溶剂延迟：0～10min；
反应气：甲烷；
扫描范围：m/z 50～650。
优选的，所述氯甲酸酯类衍生剂为氯甲酸甲酯、氯甲酸乙酯或氯甲酸丙酯；所述碱性试剂为氢氧化钠、氢氧化钾、吡啶和铵盐中的一种或几种；所述烷基化试剂为醇类。
优选的，所述待测溶液中脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的总物质的量、烷基化试剂的物质的量和氯甲酸酯类衍生剂的物质的量的比值为(1～50)：(10～100)：(1～10)。
优选的，所述衍生反应的温度为50～90℃，pH值≥10，时间为30～60min。
优选的，所述衍生反应后，还包括：将得到的衍生体系进行后处理，所述后处理包括以下步骤：将所得衍生体系和有机萃取剂混合，进行萃取，控制萃取过程的pH值为10～14；静置分层后，所得有机萃取剂层为衍生液；所述有机萃取剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、正己烷和乙酸乙酯中的一种或几种。
优选的，所述待测溶液由待测样品制备得到；所述待测样品为发酵乳或香菇；
所述发酵乳制备待测溶液包括以下步骤：
将发酵乳和氨水混合后，进行加热处理；所得料液与乙醇和乙醚混合，进行第一超声；所得第一超声料液与石油醚混合，进行第二超声，重复第二超声3～5次；所得第二超声料液离心，合并有机层；减压蒸馏除去有机层中的有机溶剂后，所得液体作为待测溶液。
优选的，所述氨水的体积浓度为25～28％；所述发酵乳、氨水、乙醇、乙醚和石油醚的体积比为(10～50)：(2～20)：(10～20)：(25～50)：(25～50)。
优选的，所述乙醇为无水乙醇。
优选的，所述加热处理的温度为60～80℃，时间为15～30min；所述第一超声的时间为2～10min；所述第二超声的时间为2～10min；所述离心的转速为2000～10000r/min，时间为15～30min。
优选的，所述香菇制备待测溶液包括以下步骤：
将香菇烘干、破碎、过筛，得到香菇粉末；
将所述香菇粉末与水混合，进行超声，得到所述待测溶液；所述香菇粉末和水的用量比为(0.1～10)g：(10～200)mL；所述超声的时间为10min。
本发明提供了一种利用GC-NCI-MS对脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸同时检测的方法，包括以下步骤：将待测溶液、碱性试剂、烷基化试剂和氯甲酸酯类衍生剂混合，进行衍生反应，得到衍生液；将所述衍生液进行GC-NCI-MS检测，得到衍生液中衍生物质的分子离子信息和峰面积，基于得到的衍生物质的分子离子信息，对脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的种类进行定性；基于定性的脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸结果，建立相应脂肪酸浓度-峰面积标准曲线、氨基酸浓度-峰面积标准曲线和多官能团有机酸浓度-峰面积标准曲线；将所述衍生液中的衍生物质的峰面积，代入所述峰面积-脂肪酸浓度标准曲线、峰面积-氨基酸浓度标准曲线和峰面积-多官能团有机酸浓度标准曲线中，得到待测溶液中脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的含量。本发明利用氯甲酸酯类衍生剂实现对脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的同时衍生化，且具有常温条件下衍生快速、重现性好、衍生产物稳定性高的优点，且能实现对短链脂肪酸羧基、短链多官能团有机酸羧基以及支链氨基酸的氨基和羧基同时衍生化；再结合GC-NCI-MS获得衍生物质的分子离子信息，通过人工解谱，能够简单、准确地对脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸进行定性；再结合相应的酸-峰面积标准曲线，实现对脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的定量。实施例的数据表明：本发明提供的方法具有优异的最低检出限(LOD)、最低定量限(LOQ)、可重复性、重现性、准确度和精确度。
附图说明
图1为癸酸梯度溶液的总离子流图；
图2为富马酸梯度溶液的总离子流图；
图3为琥珀酸梯度溶液的总离子流图；
图4为丙氨酸梯度溶液的总离子流图；
图5为缬氨酸梯度溶液的总离子流图；
图6为异亮氨酸梯度溶液的总离子流图；
图7为甘氨酸梯度溶液的总离子流图；
图8为癸酸浓度-峰面积标准曲线；
图9为富马酸浓度-峰面积标准曲线；
图10为琥珀酸浓度-峰面积标准曲线；
图11为丙氨酸浓度-峰面积标准曲线；
图12为缬氨酸浓度-峰面积标准曲线；
图13为异亮氨酸浓度-峰面积标准曲线；
图14为甘氨酸浓度-峰面积标准曲线；
图15为GC-NCI-MS法检测发酵乳所得的总离子流图；
图16为GC-NCI-MS法检测发酵乳所得物质1和2的质谱图；
图17为GC-NCI-MS法检测香菇所得的总离子流图；
图18为GC-NCI-MS法检测香菇所得物质1～8的质谱图；
图19为硫酸-甲醇衍生/GC-EI-MS法和氯甲酸酯类衍生/GC-NCI-MS法检测混合标准品溶液所得的总离子流比较图。
具体实施方式
本发明提供了一种利用GC-NCI-MS对脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸同时检测的方法，包括以下步骤：
将待测溶液、碱性试剂、烷基化试剂和氯甲酸酯类衍生剂混合，进行衍生反应，得到衍生液；
将所述衍生液进行GC-NCI-MS检测，得到衍生液中衍生物质的分子离子信息和峰面积，基于得到的衍生物质的分子离子信息，对脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的种类进行定性；
基于定性的脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸结果，建立相应脂肪酸浓度-峰面积标准曲线、氨基酸浓度-峰面积标准曲线和多官能团有机酸浓度-峰面积标准曲线；
将所述衍生液中的衍生物质的峰面积，代入所述峰面积-脂肪酸浓度标准曲线、峰面积-氨基酸浓度标准曲线和峰面积-多官能团有机酸浓度标准曲线中，得到待测溶液中脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的含量。
本发明将待测溶液、碱性试剂、烷基化试剂和氯甲酸酯类衍生剂混合，进行衍生反应，得到衍生液。在本发明中，所述待测溶液包括脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸，所述多官能团有机酸为不包括脂肪酸和氨基酸的有机酸。在本发明中，所述氯甲酸酯类衍生剂为氯甲酸甲酯(MCF)或氯甲酸乙酯(ECF)或氯甲酸丙酯(PCF)；所述碱性试剂优选为氢氧化钠、氢氧化钾、吡啶和铵盐中的一种或几种，进一步优选为氢氧化钠；所述氢氧化钠优选以氢氧化钠水溶液的形式使用，所述氢氧化钠水溶液的浓度优选为1mol/L；所述烷基化试剂优选为醇类，进一步优选为正丙醇。在本发明中，所述待测溶液中脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的总物质的量、烷基化试剂的物质的量和氯甲酸酯类衍生剂的物质的量的比值优选为(1～50)：(10～100)：(1～10)，进一步优选为1：50：2。在本发明中，所述待测溶液中脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的总物质的量的获取优选通过查找文献报道的待测样品中脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的物质的量而确定检测溶液取样量；对于全新的待测溶液可以通过类比的方法确定脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的物质的量。本发明对所述碱性试剂的用量不做具体限定，只要能够使衍生反应的pH值为需要的数值即可。在本发明中，所述衍生反应的温度优选为50～90℃，进一步优选为80℃；pH值优选≥10，进一步优选为12；时间优选为30～60min，进一步优选为60min；所述衍生反应优选在水浴的条件下进行。
所述衍生反应后，本发明优选还包括后处理，所述后处理优选包括以下步骤：将所得衍生体系和有机萃取剂混合，进行萃取，控制萃取过程的pH值为10～14；静置分层后，所得有机萃取剂层为衍生液。在本发明中，所述有机萃取剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、正己烷和乙酸乙酯中的一种或几种，进一步优选为二氯甲烷。在本发明中，所述萃取过程的pH值优选为12。在本发明中，所述待测溶液和有机萃取剂的体积比优选为(1～10)：(1～10)，进一步优选为1：1；所述控制萃取过程pH值用试剂优选为碳酸氢钠，所述碳酸氢钠的浓度优选为50mmol/L。
在本发明中，所述待测溶液优选由待测样品制备得到；所述待测样品优选为只要含有脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的物质即可，具体优选但不限于发酵乳或香菇。在本发明中，所述发酵乳制备待测溶液优选包括以下步骤：
将发酵乳和氨水混合后，进行加热处理；所得料液、乙醇和乙醚混合，进行第一超声；所得第一超声料液与石油醚混合，进行第二超声，重复第二超声3～5次；所得第二超声料液离心，合并有机层；减压蒸馏除去有机层中的有机溶剂后，所得液体作为待测溶液。在本发明中，所述氨水的体积浓度优选为25％；所述乙醇优选为无水乙醇；所述发酵乳、氨水、乙醇、乙醚和石油醚的体积比优选为(10～50)：(2～20)：(10～20)：(25～50)：(25～50)，进一步优选为50：2：10：25：25；所述加热处理的温度优选为60～80℃，进一步优选为60℃，时间优选为15～30min，进一步优选为15min；所述第一超声的时间优选为2～10min，进一步优选为2min；所述第二超声的时间优选为2～10min，进一步优选为2min；所述离心的转速优选为2000～10000r/min，进一步优选为2000r/min，时间优选为15～30min，进一步优选为15min；本发明对所述减压蒸馏的方式不做具体限定，采用本领域技术人员熟知的参数即可，只要能够将有机层中的有机溶剂去除即可。
在本发明中，所述香菇制备待测溶液包括以下步骤：
将香菇烘干、破碎、过筛，得到香菇粉末；将所述香菇粉末与水混合，进行超声，得到所述待测溶液。在本发明中，所述香菇在烘干前优选用水洗净。在本发明中，所述烘干的温度优选为150～250℃，本发明对所述烘干的温度不做具体限定，只要能够将香菇烘干即可；本发明对所述破碎的方式不做具体限定，采用本领域技术人员熟知的技术手段即可，只要能够使破碎后的物料过50目筛即可。在本发明中，所述香菇粉末和水的用量比优选为(0.1～10)g：(10～200)mL，进一步优选为3g：90mL；所述超声的时间优选为10min。所述超声后，本发明优选还包括将超声所得料液分离，所得液体即为待测溶液。
本发明中利用氯甲酸酯类衍生剂能够实现对脂肪酸、氨基酸、多官能团有机酸的同时衍生化；尤其是，氯甲酸酯类氯甲酸酯类衍生剂是一种不需要加热就能快速与氨基和/或羧基衍生化的优良试剂，具有常温条件下衍生快速、重现性好、衍生产物稳定性高的优点；且能实现对短链脂肪酸羧基、短链多官能团有机酸羧基以及支链氨基酸的氨基和羧基的同时衍生化。
得到衍生液后，本发明将所述衍生液进行GC-NCI-MS检测，得到衍生液中衍生物质的分子离子信息和峰面积。在本发明中，所述所述GC-NCI-MS检测的参数包括：
气相色谱条件：
色谱柱：HP-5MS或相当型号的色谱柱；
进样量：1μL；
分流比：1～50：1，优选为10：1；
进样口温度：250℃；
载气：氦气，流速：1mL/min；
升温程序：80℃保持0～5min，1～10℃/min升温至180℃保持0～5min；1～10℃/min升温至200℃保持0～5min，后运行230℃保持0～5min；
NCI-MS条件：
电离方式：NCI；
电离能：50eV；
离子源温度：180℃；
发射电流：200μA；
传输线温度：250℃；
溶剂延迟：0～10min，优选为3min；
反应气：甲烷；
扫描范围：m/z 50～650。
经GC-NCI-MS检测，得到衍生液中衍生物质的分子离子信息和峰面积，基于得到的衍生物质的分子离子信息，对脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的种类进行定性。在本发明中，对脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的种类进行定性的方式优选为人工解谱。在本发明中，NCI作为一种软电离技术，其利用甲烷大分子(相对于电子)对待测物进行轰击，速度低、能量小，能使大部分待测物质的分子/准分子离子得以保留；其次，轰击能量低，产生的待测物碎片少，图谱简单且保留分子离子信息，易于人工解析质谱图，大大增加了定性的准确性；其三，NCI源对含有电负性基团(如-N＝、-Cl、-F、C＝O、-O-、-P＝)的分析物具有高选择性和高灵敏度，可有效减少基质干扰，提高灵敏度。
当人工解谱对脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸进行定性后，根据定性结果，建立相应的脂肪酸浓度-峰面积标准曲线、氨基酸浓度-峰面积标准曲线和多官能团有机酸-峰面积标准曲线。在本发明的具体实施例中，当发酵乳经人工解谱后，发现含有辛酸和癸酸后，建立辛酸浓度-峰面积的标准曲线和癸酸浓度-峰面积标准曲线；当香菇经人工解谱后，发现含有富马酸、琥珀酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸；建立富马酸浓度-峰面积标准曲线、琥珀酸浓度-峰面积标准曲线、丙氨酸浓度-峰面积标准曲线、缬氨酸浓度-峰面积标准曲线、异亮氨酸浓度-峰面积标准曲线、亮氨酸浓度-峰面积标准曲线、甘氨酸浓度-峰面积标准曲线和脯氨酸浓度-峰面积标准曲线。在本发明中，建立相应的脂肪酸浓度-峰面积标准曲线、氨基酸浓度-峰面积标准曲线和多官能团有机酸-峰面积标准曲线的方法优选包括以下步骤：
分别配制梯度浓度的定性确定的脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的标准液；
将所述标准液分别和碱性试剂、烷基化试剂和氯甲酸酯类衍生剂混合，进行衍生反应，得到各标准液的衍生液；
将所述衍生液进行GC-NCI-MS检测，得到各衍生液中衍生物质的峰面积；
将脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的浓度分别和相应峰面积进行线性拟合，得到脂肪酸浓度-峰面积标准曲线、氨基酸浓度-峰面积标准曲线和多官能团有机酸-峰面积标准曲线。
在本发明中，所述碱性试剂、烷基化试剂和氯甲酸酯类衍生剂的种类与用量比优选与上述技术方案一致，在此不再赘述。在本发明中，所述衍生反应的条件优选与上述技术方案一致，在此不再赘述。
在本发明中，所述GC-NCI-MS的参数优选与上述技术方案一致，在此不再赘述。
本发明对所述线性拟合的方式不做具体限定，采用本领域技术人员熟知的线性拟合方式即可。
经GC-NCI-MS检测后，还得到了衍生液中衍生物质的峰面积；将所述衍生液中的衍生物质的峰面积，代入所述峰面积-脂肪酸浓度标准曲线、峰面积-氨基酸浓度标准曲线和峰面积-多官能团有机酸浓度标准曲线中，得到待测溶液中脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的含量。
本发明提供的方法能实现对脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的同时定性、定量分析，具有适用范围广、衍生化操作简洁、衍生物稳定、脂肪酸/有机酸/氨基酸检出全面、线性和重现性好，灵敏度高的优点。
下面结合实施例对本发明提供的利用GC-NCI-MS对脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸同时检测的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例所述GC-NCI-MS检测的参数均为：所述气相色谱条件包括：色谱柱：HP-5MS色谱柱；进样量：1μL；分流比：10：1；进样口温度：250℃；载气：氦气，流速：1mL/min；升温程序：80℃保持3min，10℃/min升温至180℃，保持4min；10℃/min升温至200℃保持1min，后运行230℃保持3min；所述NCI-MS条件包括：电离方式：NCI；电离能：50eV；离子源温度：180℃；发射电流：200μA；传输线温度：250℃；溶剂延迟：3min；反应气：甲烷；扫描范围：m/z 50～650。
所述GC-EI-MS：气相色谱条件包括：色谱柱：HP-5MS色谱柱；进样量：1μL；分流比：10：1；进样口温度：250℃；载气：氦气(纯度99.999％)，流速：1mL/min；升温程序：80℃保持3min，10℃/min速度升温至180℃，保持4min，10℃/min升温至200℃保持1min，后运行230℃保持3min。EI-MS条件包括：电离方式：EI；电子能量：70ev；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；溶剂延迟：3min；反应气：氦气(纯度≥99.999％)；扫描范围：m/z 50-650。
实施例1
标准曲线的建立
配制浓度为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L和5mmol/L的系列癸酸标准液；同时，配制相同的系列富马酸标准液、系列琥珀酸标准液、系列丙氨酸标准液、系列缬氨酸标准液、系列异亮氨酸标准液和系列甘氨酸标准液；
将1mL系列癸酸标准液分别与0.6mL 1mol/L氢氧化钠、3.2mL正丙醇和0.2mL氯甲酸甲酯混合摇匀，80℃水浴加热60min，冷却至室温；加入1mL二氯甲烷萃取、50mmoL/L碳酸氢钠调节pH值为12，静置分层，用玻璃注射器吸取二氯甲烷层过0.22μm有机相滤膜，得到系列衍生液；
采用上述GC-NCI-MS检测参数对系列衍生液进行检测，得到系列癸酸标准液的总离子流，结果如图1；按照上述方法对其他酸标准液进行检测，所得总离子流图如图2～图7所示；其中，图1为癸酸梯度溶液的总离子流图；图2为富马酸梯度溶液的总离子流图；图3为琥珀酸梯度溶液的总离子流图；图4为丙氨酸梯度溶液的总离子流图；图5为缬氨酸梯度溶液的总离子流图；图6为异亮氨酸梯度溶液的总离子流图；图7为甘氨酸梯度溶液的总离子流图。
同时，还得到了不同浓度癸酸的峰面积；将癸酸的浓度和峰面积进行线性拟合，得到癸酸浓度-峰面积标准曲线，结果如图8所示，按照此方法对其他酸标准液浓度和峰面积进行拟合，得到其它酸浓度-标准曲线，结果如图9～14所示，图8为癸酸浓度-峰面积标准曲线；图9为富马酸浓度-峰面积标准曲线；图10为琥珀酸浓度-峰面积标准曲线；图11为丙氨酸浓度-峰面积标准曲线；图12为缬氨酸浓度-峰面积标准曲线；图13为异亮氨酸浓度-峰面积标准曲线；图14为甘氨酸浓度-峰面积标准曲线。
1、LOD和LOQ
将7个系列的酸标准液进行衍生化处理后，使用GC-NCI-MS重复测定3次。根据3倍信噪比计算LOD，10倍信噪比计算LOQ。结果如下：癸酸：LOD为0.05mmol/L，LOQ为0.16mmol/L；富马酸：LOD为0.05mmol/L，LOQ为0.26mmol/L；琥珀酸：LOD为0.03mmol/L，LOQ为0.15mmol/L；丙氨酸：LOD为0.04mmol/L，LOQ为0.10mmol/L；缬氨酸：LOD为0.03mmol/L，LOQ为0.11mmol/L；异亮氨酸：LOD为0.04mmol/L，LOQ为0.08mmol/L；甘氨酸：LOD为0.02mmol/L，LOQ为0.12mmol/L。
2、重复性
选取7个系列的酸标准液中的0.2mmol/L、1mmol/L和5mmolL浓度，以一式三份进行检测得到峰面积如表1所示。
表1三种浓度的标准品三次平行实验测得峰面积
计算出每个浓度检出峰面积的相对标准偏差(RSD)，重复性表示为这些相对标准偏差的平均值，癸酸对应数值为0.95％，富马酸对应数值为0.87％，琥珀酸对应数值为0.09％，丙氨酸对应数值为0.10％，缬氨酸对应数值为0.28％，异亮氨酸对应数值为0.26％，甘氨酸对应数值为0.34％。
3、重现性
同一研究者在不同的三天里对选取7个酸的浓度为1mmol/L的标准液以一式三份进行测定得出峰面积如表2所示。
表2标准品三次重复检测的峰面积
计算得出其峰面积的相对标准偏差的平均值，其数值为癸酸的标准偏差对应数值为0.96％，富马酸的标准偏差对应数值为1.53％，琥珀酸的标准偏差对应数值为2.16％，丙氨酸的标准偏差对应数值为0.20％，缬氨酸的标准偏差对应数值为1.00％，异亮氨酸的标准偏差对应数值为2.73％，甘氨酸的标准偏差对应数值为0.11％。
4、准确度和精确度
香菇前处理：香菇去根，用清水洗干净，将其置入烘箱150℃烘干捣碎，过50目筛备用；使用万分之一天平称取3g香菇粉末，加入90mL蒸馏水超声提取10min，离心，取上清液作为待测溶液。
准确度以回收率表示，在三份相同的待测溶液分别添加七种标准品分别为5μg、10μg和15μg的标准品；精确度以变异系数表示，变异系数(CV％)为添加7种标准品的同一样品的三个平行样的标准偏差与平均值的比值；回收率和CV％的计算数值如表3所示。
表3 GC-NCI-MS法的准确度(回收率)和精确度(变异系数，％)
从表3可以看出：此方法呈现出优良的准确度和精确度，通过在氯甲酸甲酯衍生的香菇样品中添加已知量的标准品，经计算，添加癸酸回收率在91％到103％之间，变异系数在3.13％到3.58％之间；添加富马酸回收率在96％到105％之间，变异系数在3.09％到3.25％之间；添加琥珀酸回收率在91％到109％之间，变异系数在2.81％到3.93％之间；添加丙氨酸回收率在95％到105％之间，变异系数在2.11％到3.41％之间；添加缬氨酸回收率在104％到116％之间，变异系数在3.16％到4.31％之间；添加异亮氨酸回收率在96％到102％之间，变异系数在3.48％到3.58％之间；添加甘氨酸回收率在94％到106％之间，变异系数在2.5％到2.93％之间；该方法的回收率满足80％-120％，变异系数全部满足0～5％。
将各项评价指标汇总得到表4。
表4 GC-NCI-MS法检测方法学指标汇总
实施例2
发酵乳前处理：取发酵乳50mL于250mL锥形瓶，加入2mL体积分数为25％的氨水溶液，加塞，摇匀，60℃水浴加热15min，冷却至室温；加入10mL无水乙醇和25mL乙醚，加塞摇匀，超声2min；加入25mL石油醚，超声2min；2000r/min离心15min，上述提取过程重复2次，将提取的有机层合并，减压蒸馏除去溶剂，得到待测溶液。
香菇前处理：香菇去根，用清水洗干净，将其置入烘箱150℃烘干捣碎，过50目筛备用；使用万分之一天平称取3g香菇粉末，加入90mL蒸馏水超声提取10min，离心，取上清液作为待测溶液。
待测溶液的衍生
取1mL待测溶液，依次加入0.6mL 1mol/L氢氧化钠、3.2mL正丙醇、0.2mL氯甲酸甲酯摇匀，80℃水浴加热60min，冷却至室温；加入1mL二氯甲烷萃取、50mmoL/L碳酸氢钠调节pH值为12，静置分层，用玻璃注射器吸取二氯甲烷层过0.22μm有机相滤膜，得到衍生液；
按照上述GC-NCI-MS检测的参数对发酵乳所得衍生液进行检测，得到衍生液中衍生物质的分子离子信息，基于分子离子信息采用人工解谱的方式，对发酵乳中的物质进行定性确定，确定发酵乳含有辛酸和癸酸；
建立辛酸浓度-峰面积标准曲线和癸酸浓度-峰面积标准曲线，将相应酸的峰面积带入上述标准曲线，得到发酵乳中辛酸和癸酸的含量。
图15为GC-NCI-MS法检测发酵乳所得的总离子流图，图16为GC-NCI-MS法检测发酵乳所得物质1和2的质谱图。从图15～16可以看出：发酵乳中检测出两种物质，分别为辛酸和癸酸。
使用NIST标准谱库和人工复检进行详细分析，图15和图16中的1和2的详细信息(分子信息、保留时间和峰面积)参见表5。
表5 GC-NCI-MS法检测发酵乳样品结果汇总
按照上述GC-NCI-MS检测的参数对香菇所得衍生液进行检测，得到衍生液中衍生物质的分子离子信息，基于分子离子信息采用人工解谱的方式，对香菇中的物质进行定性确定，确定香菇含有富马酸、琥珀酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸；
建立富马酸浓度-峰面积标准曲线、琥珀酸浓度-峰面积标准曲线、丙氨酸浓度-峰面积标准曲线、缬氨酸浓度-峰面积标准曲线、异亮氨酸浓度-峰面积标准曲线、亮氨酸浓度-峰面积标准曲线、甘氨酸浓度-峰面积标准曲线、脯氨酸浓度-峰面积标准曲线，将相应酸的峰面积代入上述标准曲线，得到香菇中各酸的含量。
图17为GC-NCI-MS法检测香菇所得的总离子流图，图18为GC-NCI-MS法检测香菇样品所得物质1～8的质谱图。
使用NIST标准谱库和人工复检进行分析，对图17和图18的8种物质分子信息、保留时间和峰面积进行汇总得到表6。从图17～18和表6可以看出：GC-NCI-MS法识别出8种物质，其中有2种物质为有机酸，6种物质为氨基酸，具体情况见表6。
表6 GC-NCI-MS法检测香菇样品结果汇总
由表5～6可以看出：GC-NCI-MS法可以对发酵乳和香菇样品中脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸实现同时定性及定量检出。在发酵乳和香菇样品中共检出了10种物质，分别为脂肪酸(辛酸、癸酸)，多官能团有机酸(富马酸、琥珀酸)，氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、脯氨酸)，实现了对脂肪酸、有机酸和氨基酸实现同时定性、定量。
实施例3
配制庚酸、辛酸、山梨酸、富马酸、癸酸、苯甲酸、琥珀酸、水杨酸、亮氨酸、甘氨酸的浓度分别为5mmol/L的混合标准品溶液；
硫酸-甲醇衍生/GC-EI-MS法：
取1mL混合标准品溶液，加入2mL 20％硫酸-甲醇，80℃水浴加热60min，取反应后溶液1mL，加入0.5mL蒸馏水、1mL三氯甲烷萃取，静置分层，用玻璃注射器吸取三氯甲烷层过0.22μm有机相滤膜，得到对比衍生液。
氯甲酸酯类衍生/GC-NCI-MS法：
取1mL混合标准品溶液，依次加入0.6mL 1mol/L氢氧化钠、3.2mL正丙醇、0.2mL氯甲酸甲酯摇匀，80℃水浴加热60min，冷却至室温；加入1mL二氯甲烷萃取、50mmoL/L碳酸氢钠调节pH值为12，静置分层，用玻璃注射器吸取二氯甲烷层过0.22μm有机相滤膜，得到衍生液；
分别按照GC-EI-MS和GC-NCI-MS检测条件对对比衍生液和衍生液进行检测。最终将氯甲酸酯类衍生/GC-NCI-MS法与硫酸-甲醇衍生/GC-EI-MS法测定混合标准品溶液的效果进行了比较，如图19所示。
硫酸-甲醇衍生/GC-EI-MS法具体结果信息见表7，氯甲酸酯类衍生/GC-NCI-MS法具体结果信息见表8。
表7硫酸-甲醇衍生/GC-EI-MS法检测物质成分汇总
表8氯甲酸酯类衍生/GC-NCI-MS法检测物质成分汇总
从图19及表7～表8可以看出：硫酸-甲醇衍生/GC-EI-MS法检测样品中检测得到的脂肪酸、氨基酸以及有机酸在种类和含量上均少于氯甲酸酯类衍生/GC-NCI-MS法的结果，并且对于苹果酸和柠檬酸，由于衍生剂对有机酸衍生不彻底，只检测到了微量含量。氯甲酸酯类衍生/GC-NCI-MS法的结果在得到的脂肪酸、氨基酸以及有机酸在种类和含量上均多于硫酸-甲醇衍生/GC-EI-MS法衍生，氯甲酸酯类衍生/GC-NCI-MS法对于脂肪酸、氨基酸以及有机酸具有较全面而稳定的检出。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种利用GC-NCI-MS对脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸同时检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待测溶液、碱性试剂、烷基化试剂和氯甲酸酯类衍生剂混合，进行衍生反应，得到衍生液；
将所述衍生液进行GC-NCI-MS检测，得到衍生液中衍生物质的分子离子信息和峰面积，基于得到的衍生物质的分子离子信息，对脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的种类进行定性；
基于定性的脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸结果，建立相应脂肪酸浓度-峰面积标准曲线、氨基酸浓度-峰面积标准曲线和多官能团有机酸浓度-峰面积标准曲线；
将所述衍生液中的衍生物质的峰面积，代入所述峰面积-脂肪酸浓度标准曲线、峰面积-氨基酸浓度标准曲线和峰面积-多官能团有机酸浓度标准曲线中，得到待测溶液中脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的含量；
所述待测溶液中包括脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸，所述多官能团有机酸为不包括脂肪酸和氨基酸的有机酸；
所述GC-NCI-MS检测的参数包括：
气相色谱条件：
色谱柱：HP-5MS或相当型号的色谱柱；
进样量：1μL；
分流比：1～50：1；
进样口温度：250℃；
载气：氦气，流速：1mL/min；
升温程序：80℃保持0～5min，1～10℃/min升温至180℃保持0～5min；1～10℃/min升温至200℃保持0～5min，后运行230℃保持0～5min；
NCI-MS条件：
电离方式：NCI；
电离能：50eV；
离子源温度：180℃；
发射电流：200μA；
传输线温度：250℃；
溶剂延迟：0～10min；
反应气：甲烷；
扫描范围：m/z 50～650。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氯甲酸酯类衍生剂为氯甲酸甲酯、氯甲酸乙酯或氯甲酸丙酯；所述碱性试剂为氢氧化钠、氢氧化钾、吡啶和铵盐中的一种或几种；所述烷基化试剂为醇类。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述待测溶液中脂肪酸、氨基酸和多官能团有机酸的总物质的量、烷基化试剂的物质的量和氯甲酸酯类衍生剂的物质的量的比值为(1～50)：(10～100)：(1～10)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生反应的温度为50～90℃，pH值≥10，时间为30～60min。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述衍生反应后，还包括：将得到的衍生体系进行后处理，所述后处理包括以下步骤：将所得衍生体系和有机萃取剂混合，进行萃取，控制萃取过程的pH值为10～14；静置分层后，所得有机萃取剂层为衍生液；所述有机萃取剂包括二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、正己烷和乙酸乙酯中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测溶液由待测样品制备得到；所述待测样品为发酵乳或香菇；
所述发酵乳制备待测溶液包括以下步骤：
将发酵乳和氨水混合后，进行加热处理；所得料液与乙醇和乙醚混合，进行第一超声；所得第一超声料液与石油醚混合，进行第二超声，重复第二超声3～5次；所得第二超声料液离心，合并有机层；减压蒸馏除去有机层中的有机溶剂后，所得液体作为待测溶液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述氨水的体积浓度为25～28％；所述发酵乳、氨水、乙醇、乙醚和石油醚的体积比为(10～50)：(2～20)：(10～20)：(25～50)：(25～50)。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述乙醇为无水乙醇。
9.根据权利要求6、7或8所述的方法，其特征在于，所述加热处理的温度为60～80℃，时间为15～30min；所述第一超声的时间为2～10min；所述第二超声的时间为2～10min；所述离心的转速为2000～10000r/min，时间为15～30min。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述香菇制备待测溶液包括以下步骤：
将香菇烘干、破碎、过筛，得到香菇粉末；
将所述香菇粉末与水混合，进行超声，得到所述待测溶液；所述香菇粉末和水的用量比为(0.1～10)g：(10～200)mL；所述超声的时间为10min。
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