CN112695033A

CN112695033A - 基于美洲大蠊雄性附腺生殖相关基因SP28设计的siRNA及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN112695033A
Application number: CN202011593780.7A
Authority: CN
Inventors: 李昭昕; 都二霞; 李胜
Original assignee: Guangmeiyuan R & D Center Key Laboratory Of Insect Developmental Biology And Applied Technology Huashi Meizhou City; South China Normal University
Current assignee: Guangmeiyuan R & D Center Key Laboratory Of Insect Developmental Biology And Applied Technology Huashi Meizhou City; South China Normal University
Priority date: 2020-12-29
Filing date: 2020-12-29
Publication date: 2021-04-23
Anticipated expiration: 2040-12-29
Also published as: CN112695033B

Abstract

本发明公开了基于美洲大蠊雄性附腺生殖相关基因SP28设计的siRNA及其制备方法与应用，所述siRNA为由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列及与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列组成的双链RNA经切割而成，将该siRNA导入美洲大蠊体内，能够显著抑制SP28基因的表达，进而影响雌虫孵化率和孵化个体数，进而导致蟑螂后代数量显著的减少，从而实现防治害虫的最终目的，为害虫防治提供了新的分子靶标。

Description

基于美洲大蠊雄性附腺生殖相关基因SP28设计的siRNA及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及基于美洲大蠊雄性附腺生殖相关基因SP28设计的 siRNA及其制备方法与应用。

背景技术

美洲大蠊(蟑螂)是地球上最古老的昆虫之一，在全球范围内广泛分布，是世界公认卫生害虫。蟑螂偏爱阴暗潮湿的环境，例如厨房、厕所、仓库、下水道、地下室等处群居。蟑螂作为一种杂食性的昆虫，食物种类非常广泛，包括米饭、面包、水果、甜食、熟食等等，不仅会污染食物，还会传播疾病，是多种细菌、病毒和寄生虫的携带者，给人类的生活和安全带来了极大的危害。除此之外，蟑螂具有极强的繁殖力，一只成熟的雌蟑螂一身中可以多次产卵，每颗卵可以孵化出约16只幼虫。由于蟑螂的这些特质，导致它成为一种最为难以防治的卫生害虫之一。

随着全世界对卫生害虫的重视，市面上出现的多种多样的蟑螂药。这些蟑螂药对防治蟑螂具有一定效果，但是并不能完全的控制蟑螂，一段时间内蟑螂又再次爆发，而且这些药物往往具有一定的毒性，对生态环境具有一定的影响。随着长期大量的使用蟑螂出现了耐药性，意味着那些杀蟑螂药，很难再对蟑螂起到控制作用。卫生害虫与人们生活质量和食品一系列问题的矛盾日益凸显。开发环境友好、高效、低毒的蟑螂防治方法是对于国家经济发展、社会进步和食品安全具有重要意义。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种基于美洲大蠊雄性附腺生殖相关基因SP28设计的siRNA，能够特异沉默基因SP28导致雌虫的生殖力和孵化率显著降低。

本发明还提出上述siRNA的制备方法。

本发明还提出提供编码上述siRNA的基因及含有该编码基因的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。

本发明还提出上述siRNA的应用。

根据本发明的第一方面实施方式的基于美洲大蠊雄性附腺生殖相关的SP28基因设计的 siRNA，所述siRNA为由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列及与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列组成的双链RNA经切割而成。

根据本发明的一些实施方式，所述切割采用内切酶。

根据本发明的第二方面实施方式的上述siRNA的制备方法，包括以下步骤：

S1、根据美洲大蠊SP28基因序列设计dsRNA靶向序列；

S2、根据dsRNA靶向序列设计引物，通过PCR扩增克隆至质粒载体中；

S3、基于重组质粒载体设计两端含有T7启动子的引物，进行PCR扩增；

S4、将步骤S3得到的PCR产物转录合成得到dsRNA；

S5、将合成的dsRNA切割成siRNA。

根据本发明的一些实施方式，步骤S2所述载体选自p18T载体。

根据本发明的一些实施方式，步骤S4所述转录合成采用T7RiboMAX Express RNAiSystem。

根据本发明的一些实施方式，步骤S5所述的切割dsRNA采用试剂盒

RNaseIII。

根据本发明的一些实施方式，步骤S5所述切割而成的siRNA的分子量约为21nt。

根据本发明的第三方面实施方式的编码上述siRNA的基因。

根据本发明的一些实施方式，所述基因的制备方法包括以下步骤：基于上述基因核苷酸序列设计启动子引物对，进行PCR扩增即得。

根据本发明的一些实施方式，所述基因还包括含有上述基因的表达载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌。

根据本发明第四方面实施方式的上述siRNA的应用，所述siRNA在制备美洲大蠊防治药物中的应用。

根据本发明的一些实施方式，所述siRNA在制备用于防治美洲大蠊或控制美洲大蠊雌性成虫生殖的产品中的应用。

一种防治美洲大蠊的方法，包括以下步骤：将上述siRNA导入到美洲大蠊体内。

根据本发明的一些实施方式，所述导入操作通过注射的方式；优选地，所述注射操作为显微注射。

根据本发明的一些实施方式，所述导入操作为导入至美洲大蠊腹部内。

根据本发明的一些实施方式，所述导入操作还可以通过饲喂的方式。

根据本发明的一些实施方式，所述导入操作在操作前对美洲大蠊进行CO₂麻醉。

根据本发明的一些实施方式，所述导入操作是在刚羽化后的第二天和第四天分别注射一次。

本发明至少具有如下有益效果：本发明方案通过设计靶向沉默美洲大蠊雄性附腺生殖力相关基因SP28的siRNA，将该siRNA导入美洲大蠊体内，能够显著抑制SP28基因的表达，进而影响雌虫孵化率和孵化个体数，进而导致蟑螂后代数量显著的减少，从而实现防治害虫的最终目的，为害虫防治提供了新的分子靶标；且本发明使用的siRNA具有更小的片段，能够更容易的进入组织或细胞高度特异的介导靶标基因沉默。基于siRNA技术的害虫防治策略具有专一性，对非靶标生物安全，且无毒无污染，是一种绿色的卫生害虫的生物学防治手段。

附图说明

图1为本发明实施例2中RNAi表达水平检测结果图；

图2为本发明实施例2中虫卵孵化数量图；

图3为本发明实施例2中虫卵孵化数量图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1siRNA的设计与合成

siRNA的设计与合成包括以下步骤：

(1)引物设计

根据已有的美洲大蠊基因组信息，蛋白质谱鉴定获得SP28基因的完整序列(如SEQID No.1所示)，利用dsRNA设计网站E-RNAi(https://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/)，将美洲大蠊SP28基因开放阅读框序列复制粘贴到网站中，通过设计参数筛选得到最佳的dsRNA靶向序列，得到靶向沉默美洲大蠊SP28基因的dsRNA序列(由SEQ ID No.2所示)。根据序列SEQ ID No.2所示的核苷酸序列设计引物，正向引物SP28-FP：CTGAAAATAGATGCGGAATA(如SEQ ID No.3所示)和反向引物SP28-RP：CTCGGTTTGATGCTGACT(如SEQ ID No.4 所示)。

美洲大蠊SP28基因序列(SEQ ID No.1)具体如下：

ATGTTCGTGTTTGCTGTCTGCATCCTGCTTGTAGCGGAGGTCTACTGCAATGGAAAA CAAGATGGTCAATTGATTCTACACCTGGATCCACCGGGACAGACATTAACCGTGCCCGC TTCCGTGATCAACAATCGACTAGTGAAAGACAATGAACATCAGTTCCTGGAAGCCGTTA AAGATTTTGAATACTCCATTGCTGATATTATCGACACCGCACTGAAAATAGATGCGGAAT ACGATTATGTGCATCATCAAGATGAGACTGGTTATCATGGTGAAGTGGGGGTGGACTATA ACAGGCGAAGAGTTTCAGATGTATTAAATGCTGCAGCAGAGGCAATACACGAATTAACT AGAGCTCCCACGAAGCATGCTGGCTTGCTCATTGGTCCTGTCGCAACATCTTCTAAAAA GATACAAGAATTGGAGAAGAAATATGACGTCGACTTGAAGGATGTTGTGCAAAGAGCA AAGCATGCCTACCGACACTATAACCTCTACGTCGACAGTTTGGACTATACTGCCAAAGAA AAAACTTCGCGAATTGTAGCAGCTGAGAAATTCTACTCTTCTCTCTGTCATGCTCTACAGAGTGGAAGGATACTAGAAGGCGAACAACCAATAGTCAGCATCAAACCGAGTGTCATTCCTAACCCTCAAATCGGATTACAGCAC AGAAGAGGCCTGTACCGTTTCGGTTAG

靶向沉默美洲大蠊SP28基因的dsRNA序列(由SEQ ID No.2所示)，具体如下：

CTGAAAATAGATGCGGAATACGATTATGTGCATCATCAAGATGAGACTGGTTATCAT GGTGAAGTGGGGGTGGACTATAACAGGCGAAGAGTTTCAGATGTATTAAATGCTGCAGC AGAGGCAATACACGAATTAACTAGAGCTCCCACGAAGCATGCTGGCTTGCTCATTGGTC CTGTCGCAACATCTTCTAAAAAGATACAAGAATTGGAGAAGAAATATGACGTCGACTTG AAGGATGTTGTGCAAAGAGCAAAGCATGCCTACCGACACTATAACCTCTACGTCGACAGTTTGGACTATACTGCCAAAGAAAAAACTTCGCGAATTGTAGCAGCTGAGAAATTCTACT CTTCTCTCTGTCATGCTCTACAGAGTGGAAGGATACTAGAAGGCGAACAACCAATAGTC AGCATCAAACCGAG

(2)目的片段的克隆与载体的构建

使用TRIzol(LifeTechnologies)方法提取美洲大蠊附性腺总RNA，然后使用PrimeScript II reverse transcriptase(Takara Bio，Shiga，Japan)合成cDNA。以cDNA为模板扩增得到含有靶向序列的DNA片段，并将其克隆改到p18T载体(Aidlab，China)中，测序验证序列是否存在碱基突变，挑选没有任何突变的克隆用于后续实验，载体命名为p18T-SP28。

(3)重组载体的转化

将构建好的载体连接转化感受态细菌(DH5α)，制作成重组菌株。筛选出阳性克隆，扩大培养后提取重组质粒。

(4)合成SP28 dsRNA

采用PCR在靶向序列两侧引入T7启动子，具体方法为用设计两端含有T7启动子的引物， TAATACGACTCACTATAGGCTGAAAATAGATGCGGAATA(SEQ ID No.5)和 TAATACGACTCACTATAGGCTCGGTTTGATGCTGACT(SEQ ID No.6)。以p18T-SP28载体为模板进行扩增，得到两端含有T7启动子的PCR产物，然后利用T7RiboMAXTM Express RNAi System(PromegaCorporation)来合成双链RNA。将合成的dsRNA用试剂盒

RNase III(NewEngland Biolabs，catalog NO.M0245S)切割成约21nt的siRNA。

实施例2siRNA对SP28基因干扰影响

挑选刚羽化的美洲大蠊进行饲养，分为实验组和对照组(注射无法靶向美洲大蠊任何基因的siCK)，在其羽化后的第二天和第四天将其CO₂麻醉后，然后使用显微注射方法将靶向SP28基因的siRNA注射2μl(500ng/μl)到美洲大蠊腹部内。第七天与雌虫交配，统计雌虫的产卵的孵化率和每颗卵的孵化个体数。其中，实验组和对照组各三个生物学重复，每个重复使用的美洲大蠊为15只。

1、siRNA对SP28基因干扰效果验证

利用primer premier5引物设计软件设计qPCR引物。荧光定量PCR检测所用到引物如下所示：GTTCCACGTGATCGACGCTT(SEQ ID No.7)和CCGGCAGCTGCTCCTTTACA(SEQ IDNo.8)。使用SYBR Green qPCR mix(yisheng，China)进行基因表达定量检测，反应体系如下：2×HieffTM qPCR

Green Master Mix 10μl，Forward Primer(10μM)1μl，Reverse Primer(10μM)1μl，cDNA 2μl，RNase-Free ddH₂O 6μl反应程序如下：95℃1min；95℃10sec，60℃20sec，72℃30sec，共40个循环，通过对定量结果进行分析，检测靶基因干扰效果，

结果如图1所示，从图1中可以看出，虽然dsRNA可以部分的降低美洲大蠊雄性附腺靶基因SP28的表达，但是效果并不是很好。相比于dsRNA，siRNA具有更高沉默靶基因的效率，可以显著干扰靶基因SP28的表达(图中“*”和“***”代表处理组和对照组之间相对表达量有显著差异(“*”代表P<0.1，“***”代表P<0.001，Student’s t-test))。

2、卵的孵化率的统计

siRNA靶向沉默SP28基因后雌虫产的卵的孵化率和每颗卵的孵化个体数量的实验结果如图2和图3所示，其中，图2中A为实验组和对照组孵化数量的对比，B为实验组和对照组卵的形态的对比，从图中可以看出，siRNA靶向沉默SP28基因后会到导致雌虫产的卵一部分不能够正常的孵化，即使部分能够孵化的卵的后代个体数也显著的减少。

小干扰RNA(siRNA)，是一类双链RNA分子，长度为20-25个碱基对，类似于miRNA，并且在RNA干扰(RNAi)途径内操作。它干扰了表达与互补的核苷酸序列的特定基因的转录后降解的mRNA，从而防止翻译siRNA。相对双链RNA(dsRNA)，siRNA具有更小的片段，能够更容易的进入组织或细胞高度特异的介导靶标基因沉默。基于siRNA技术的害虫防治策略具有专一性，对非靶标生物安全，且无毒无污染，是一种绿色的卫生害虫的生物学防治手段，本发明通过合成siRNA干扰SP28基因表达来影响蟑螂的生殖，解决现有技术中的常规双链无法有效作用昆虫附腺的技术难题，在影响胚胎发育的基础上通过降低孵化率和后代数量达到蟑螂防治的目的，取得了意料之外的效果。

美洲大蠊雄性附腺在羽化之后，随着发育过程逐渐成熟，分泌大量的附腺蛋白，在交配后随着精子传递到雌虫体内。大量研究表明昆虫的雄性附腺会对雄性的生殖能力具有重要的影响。基因SP28在美洲大蠊的雄性中特异的表达，siRNA特异沉默基因SP28会导致雌虫的生殖力和孵化率显著的。通过这种机制可以有效的控制蟑螂的数量，为蟑螂的生物防治带来了契机，一种理想的控制蟑螂数量的策略。

综上所述，通过siRNA干扰技术靶向沉默SP28基因能够有效影响雌虫孵化率和孵化个体数，进而导致蟑螂后代数量显著的减少，达到防治美洲大蠊的目的。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 华南师范大学

梅州市华师昆虫发育生物学与应用技术重点实验室广梅园研发中心

<120> 基于美洲大蠊雄性附腺生殖相关基因SP28设计的siRNA及其制备方法与应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgttcgtgt ttgctgtctg catcctgctt gtagcggagg tctactgcaa tggaaaacaa 60

gatggtcaat tgattctaca cctggatcca ccgggacaga cattaaccgt gcccgcttcc 120

gtgatcaaca atcgactagt gaaagacaat gaacatcagt tcctggaagc cgttaaagat 180

tttgaatact ccattgctga tattatcgac accgcactga aaatagatgc ggaatacgat 240

tatgtgcatc atcaagatga gactggttat catggtgaag tgggggtgga ctataacagg 300

cgaagagttt cagatgtatt aaatgctgca gcagaggcaa tacacgaatt aactagagct 360

cccacgaagc atgctggctt gctcattggt cctgtcgcaa catcttctaa aaagatacaa 420

gaattggaga agaaatatga cgtcgacttg aaggatgttg tgcaaagagc aaagcatgcc 480

taccgacact ataacctcta cgtcgacagt ttggactata ctgccaaaga aaaaacttcg 540

cgaattgtag cagctgagaa attctactct tctctctgtc atgctctaca gagtggaagg 600

atactagaag gcgaacaacc aatagtcagc atcaaaccga gtgtcattcc taaccctcaa 660

atcggattac agcacagaag aggcctgtac cgtttcggtt ag 702

<210> 2

<211> 425

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgaaaatag atgcggaata cgattatgtg catcatcaag atgagactgg ttatcatggt 60

gaagtggggg tggactataa caggcgaaga gtttcagatg tattaaatgc tgcagcagag 120

gcaatacacg aattaactag agctcccacg aagcatgctg gcttgctcat tggtcctgtc 180

gcaacatctt ctaaaaagat acaagaattg gagaagaaat atgacgtcga cttgaaggat 240

gttgtgcaaa gagcaaagca tgcctaccga cactataacc tctacgtcga cagtttggac 300

tatactgcca aagaaaaaac ttcgcgaatt gtagcagctg agaaattcta ctcttctctc 360

tgtcatgctc tacagagtgg aaggatacta gaaggcgaac aaccaatagt cagcatcaaa 420

ccgag 425

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgaaaatag atgcggaata 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcggtttga tgctgact 18

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taatacgact caggctgact ataaaataga tgcggaata 39

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taatacgact cactataggc tcggtttgat gctgact 37

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gttccacgtg atcgacgctt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccggcagctg ctcctttaca 20

Claims

1.基于美洲大蠊雄性附腺生殖相关基因SP28设计的siRNA，其特征在于：所述siRNA为由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列及与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列组成的双链RNA经切割而成。

2.如权利要求1所述的siRNA的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、根据美洲大蠊SP28基因序列设计dsRNA靶向序列；

S4、将步骤S3得到的PCR产物转录合成得到dsRNA；

S5、将合成的dsRNA切割成siRNA。

3.编码如权利要求1所述siRNA的基因。

4.如权利要求3所述的基因的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：基于如权利要求3所述的基因设计启动子引物对，进行PCR扩增即得。

5.含有如权利要求3所述的基因的表达载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌。

6.如权利要求1所述的siRNA在制备美洲大蠊防治药物中的应用。

7.如权利要求1所述的siRNA在制备用于防治美洲大蠊或控制美洲大蠊雌性成虫生殖的产品中的应用。

8.一种防治美洲大蠊的方法，其特征在于：包括以下步骤：将如权利要求1所述的siRNA导入到美洲大蠊体内。

9.根据权利要求8所述的防控美洲大蠊的方法，其特征在于：所述导入操作通过注射的方式。

10.根据权利要求8所述的防控美洲大蠊的方法，其特征在于：所述导入操作是在刚羽化后的第二天和第四天分别注射一次。