CN112694441B - C20二萜生物碱、其制备及治疗疼痛相关疾病的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了C₂₀二萜生物碱、其制备及治疗疼痛相关疾病的用途，具体而言，本发明公开了C₂₀二萜生物碱类化合物在安全剂量下可剂量依赖性发挥的镇痛作用活性。

Description

C20二萜生物碱、其制备及治疗疼痛相关疾病的用途

技术领域

本发明涉及从中药附子中提取分离纯化得到的具有新颖骨架的C₂₀二萜生物碱以及以提取分离得到的C₂₀二萜生物碱—宋果灵经简单反应而获得的产物，及其衍生物和药用盐类在制备预防和治疗急性炎症、急性或慢性疼痛等疾病中的应用。属医药技术领域。

背景技术

附子为毛茛科乌头属植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的侧根，采挖去母根除须根和泥沙，晾晒干燥，即得“泥附子”或生附子，经不同方法炮制后的药材品种包括“盐附子”、“黑顺片”和“白附片”等^[1]。附子具有回阳救逆，补火助阳，散寒止痛之功效，中医用于亡阳虚脱，肢冷脉微，心阳不足，胸痹心痛，虚寒吐泻，脘腹冷痛，肾阳虚衰，阳痿宫冷，阴寒水肿，阳虚外感，寒湿痹痛等症候治疗。《黄帝内经》将附子与人参、熟地、大黄列为“药中四维”；《神农本草经》记附子“主风寒咳逆邪气，温中，金疮，破癥坚积聚，血瘕，寒湿踒躄，拘挛膝痛，不能行步”；《名医别录》载附子“脚疼冷弱，腰脊风寒，心腹冷痛，霍乱转筋，下痢赤白，坚肌骨，强阴，又堕眙，为百药长”；《伤寒论》和《金匮要略》中，使用附子的方剂分别达到23和29个之多^[2,3]。据统计，所有包含有附子的3074个中药复方中，有960个复方可治疗各种疼痛；含有附子的224个中成药中，具有止痛作用的有134个(药智数据https://db.yaozh.com/)。可见镇痛是附子最主要的基本功效之一，附子在传统中药中的地位及其在疼痛治疗方面应用的广泛应用。

附子的现代药理和毒性及其化学成分的研究分别始于20世纪30年代和60年代，相关研究结果显示附子提取物及其化学成分的药理活性主要包括强心、镇痛、镇静、抗炎、抗心律失常、抗肿瘤、增强免疫、降血糖、降血脂、抗衰老、保肾等；毒性主要包括心脏毒性、神经毒性、胚胎毒性和肾毒性等；镇痛活性成分和毒性成分均为乌头烷型C₁₉-二萜生物碱，而主要强心等功效的有效成分为去甲乌药碱(附子一号)、去甲猪毛菜碱、氯化甲基多巴胺以及C₁₉-二萜生物碱。具体如下：

水煎物的药效和毒性：附子水煎剂、水提醇沉液在热板法和小鼠醋酸扭体实验中显示有良好的镇痛活性^[4,5]；盐附子、黑顺片、白附片、蒸附片、炒附片、淡附片的水煎剂均可以明显减少醋酸引起的小鼠扭体反应次数，在尾压法试验和小鼠甩尾试验中均可延长小鼠对热痛反应的潜伏期^[6-10]。生附子以及炮制附子水煎剂对离体心脏、在体心脏及实验性衰竭心脏等均有明显的强心作用，生附子和炮制附子在不同模型上表现出的强心作用强度和心脏毒性均有差别，炮制附子心脏毒性明显降低^[11,12]。另外，附子水煎剂对巴豆油所致小鼠耳部炎症、甲醛所致大鼠脚拓种胀有显著抑制作用^[13]、对氯仿所致小鼠室颤有预防作用^[14]和对主动脉舒张具有内皮依赖性作用^[15]等，提示附子水煎剂亦具有抗炎和抗心律失常等药理活性。

鉴于附子的毒性，临床应用中通常采用炮制、久煎以及严格控制剂量的方法来减少附子的毒副作用，附子水煎煮用药的方式一直广泛应用^[16]。研究显示附子水煎煮提取物的毒性小于浸泡提取物，煎煮3-6小时，总生物碱含量趋于稳定，而毒性成分—酯型生物碱含量显著降低^[17-21]；脂溶性生物碱表现的毒效比原药材大，而在水溶性部位未发现有类似于原药材的毒性存在^[22]。同时，据报道附子的主产地之一陕西周至和户县一带的居民一直有大剂量食用附子的习惯，他们将附子用水煎煮4h以上，并且与甘草配伍，日食量可达200-400g，远远超过附子的药用剂量^[23]。总之，比较生附子与经过不同时间水煎煮的附子的毒性和活性发现，附子的传统水煎煮的应用方式可以有效降低附子的毒性，同时保持其显著的镇痛等活性^[24]。

可见，附子水提取物镇痛等作用肯定明确，附子经炮制和水煎煮减毒的科学性均得到现代实验研究的确证。但是确切的功效成分尚不完全清楚。

化学成分：目前，已报道从附子中分离鉴定了120余个化合物，结构类型包括乌头烷型C₁₉-二萜生物碱、多种骨架类型的C₂₀-二萜生物碱、苄基异喹啉类生物碱和其它类型生物碱，以及黄酮、苹果酸、神经酰胺、脂肪酸、甘油双糖苷以及多糖等^[30-40]，其中乌头烷型C₁₉-二萜生物碱为主。

镇痛成分：乌头烷型C₁₉-二萜生物碱镇痛活性强度与其结构中酯基的种类、数量和位置，以及A环N原子的取代、D环的饱和度等均有相关^[41,42]，镇痛活性强度新乌头碱＞乌头碱＞次乌头碱；在2mg/kg时，lipomesaconitine(含量0.0062％) 对小鼠醋酸致扭体次数的抑制率与乌头碱(0.2mg/kg)和中乌头碱(0.1mg/kg) 相当，但LD₅₀(10-40mg/kg)分别为乌头碱和中乌头碱的20和40倍^[43]。它们镇痛作用的发挥主要通过激活或抑制Na⁺通道、激活下行抑制剂α₂-肾上腺素和5-羟色胺能神经元等^[44-46]。

毒性成分：附子的中毒症状与单用乌头碱引起的症状相似，化学成分含量和毒价的相关分析结果确证3-乙酰乌头碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱、去氧乌头碱、10-羟基新乌头碱和10-羟基乌头碱是生附子及炮制附子的主要毒性相关物质，故认为乌头烷型C₁₉-二萜生物碱是附子的关键毒性成分。其毒性主要包括心脏毒性、神经毒性、胚胎毒性和肾毒性等^[47]。这些生物碱结构中均存在两个有机酸酯基，而在附子炮制和长时间煎煮过程中，双酯型C₁₉-二萜生物碱会发生水解，且含量随煎煮时间显著降低，故认为附子炮制和久煎应用减毒或去毒是因双酯型生物碱含量降低。

然而，已有的研究结果显示，附子的镇痛和毒性成分重叠，绝大多数有镇痛作用的成分是双酯型C₁₉-二萜生物碱。

综上所述，经过数十年的研究，我国科学家在经典中药附子的研究方面已取得了大量研究结果。然而，虽然发现双酯型C₁₉-二萜生物碱具有显著镇痛作用，但也是附子的关键毒性物质，炮制和久煎可使它们降解，进而其在水煎剂中的含量极低或不复存在。然而，水解产物中低毒或无毒性的单酯型C19-二萜生物碱无镇痛作用或作用强度远远达不到水煎剂的效果。因此，附子镇痛功效的关键成分和作用机制是需要深入研究阐明的关键科学问题。

抗炎镇痛药物在临床上的使用非常广泛，无论是处方药物，还是非处方药物，都具有非常大的使用量。目前，临床上应用范围最广的抗炎镇痛药物为传统的非甾体类药物，代表性药物主要为阿司匹林、对乙酰氨基酚和布洛芬。然而，传统的非甾体类抗炎镇痛药物治疗过程中通过抑制环氧合酶Ⅱ作用的发挥，进而抑制炎症性前列腺素合成来实现抗炎和镇痛。但在药物作用发挥过程中，环氧合酶Ⅰ也会受到抑制，从而导致生理性前列腺素的合成大量减少，导致患者出现胃肠道副反应，比如胃肠粘膜糜烂、溃疡等，严重时，患者会出现凝血功能障碍、肾脏毒性等症状。此外，血液系统症状、心血管系统症状等也为抗炎镇痛药物服用过程中经常发生的不良反应，严重影响患者用药的安全性病极大限制了传统抗炎镇痛药物的临床应用范围。因此，急需研制出副作用小、临床应用范围广的新型抗炎镇痛药物。

从天然产物中寻找抗炎镇痛活性成分逐渐成为近年来的研究热点。研究发现，皂苷、多糖、生物碱、黄酮、香豆素等天然产物均具有一定的抗炎镇痛作用，其效果主要表现为可以显著抑制化学及物理刺激引起的炎性肿胀或肉芽肿，并可降低致炎后腹腔毛细血管的通透性，抑制炎症因子及其基因的表达等；天然产物的镇痛作用，通常可表现为能延长多种致痛因素如热痛、压痛以及化学刺激的痛阈值等。本申请中的化合物即为从传统中药附子中分离获取得到的具有抗炎镇痛作用的天然产物。

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尽管文献报道从附子中得到了如上所述多种多样的化学成分以及附子提取物和部分附子中化学成分的药理活性，但是到目前为止，本发明涉及的C₂₀二萜类生物碱及其衍生物，尚无报道这些化合物或其衍生物具有镇痛的功能；同时本发明涉及的具有新颖骨架的化合物尚无相关的结构报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一类新的具有镇痛作用的药物。

为解决本发明的技术问题，本发明提供如下技术方案：

本发明技术方案的第一方面是提供了一种如通式(I)-(Ⅳ)所示的C₂₀二萜类生物碱及其衍生物。

具体而言，提供了如通式(I)所示的化合物及其药学上可接受的盐：

其中，R₁选自H、CH₃、CH₂CH₃；R₂选自CH₃、OH、OCH₃、OCH₂CH₃。

一种如式(II)所示的化合物及其药学上可接受的盐：

其中，R₁选自H、CH₃、CH₂CH₃；R₂选自H、CH₃、OH、OCH₃、OCH₂CH₃； X选自SO₃、HSO₄、OH、CF₃COO、CH₃COO、HCOO、Cl、Br、I。

一种如式(Ⅲ)所示的化合物及其药学上可接受的盐：

其中，R₁选自H、CH₃、CH₂CH₃；R₂选自H、OH、OCH₃、OCH₂CH₃、SO₃H、 SO₃ ^-；R₃选自H、CH₃、CH₂CH₃、OH、OCH₃、OCH₂CH₃。

一种如式(Ⅳ)所示的化合物及其药学上可接受的盐：

其中，R₁选自H、CH₃、CH₂CH₃；R₂选自H、OH、OCH₃、OCH₂CH₃、SO₃H、 SO₃ ^-；R₃选自H、CH₃、CH₂CH₃、OH、OCH₃、OCH₂CH₃。

本发明进一步优选的化合物选自如下群组：

本发明技术方案的第二方面是提供了第一方面所述化合物的制备方法。

干燥附子，粉碎后用蒸馏水在35～50℃下提取2～4次，每次4～8小时，提取液合并，减压回收溶剂得到浸膏，用大孔树脂柱色谱分离，依次用水：乙醇1:0～0:1 梯度洗脱，TLC或HPLC监测，每个流分均洗脱至样品无明显被洗脱下来，减压回收溶剂得到相应的洗脱部分，其中50％乙醇部分用MCI树脂分离，依次用水：乙醇1:0～0:1梯度洗脱，TLC或HPLC监测合并相同组分；其中，水：乙醇7:3洗脱部位用MCI树脂分离，依次用水：乙醇1:0～0:1梯度洗脱，TLC或HPLC监测合并相同组分，得到相应洗脱部分C2-1-C2-4；水洗脱部分C2-1采用浓氨水，调节pH值为10以后，用乙酸乙酯萃取，得到有机相C2-1-A和水相C2-1-C；C2-1-A 经碱性pH 8-9硅胶柱色谱分离，石油醚-丙酮-二乙胺15:1:1-4:1:1梯度洗脱，分离得到C2-1-A-1-C2-1-A-6；C2-1-A-3用反相硅胶MPLC色谱分离，甲醇-水梯度洗脱，得到C2-1-A-3-1-C2-1-A-3-5；C2-1-A-3-3经甲醇重结晶得到化合物宋果灵及 (I)和(Ⅱ)；宋果灵与亚硫酸钠在50％甲醇水溶液中加热反应8小时后，用反相 HPLC制备获得化合物1和2；水相C2-1-C用6NHCl调pH值为4，再用正丁醇萃取，所获得的水相C2-1-C经正相硅胶柱色谱，氯仿-甲醇50:1～0:1梯度洗脱， TLC或HPLC监测合并相同组分，得到相应洗脱部分C2-1-C-1-C2-1-C-6；C2-1-C-5 经Sephadex LH-20柱色谱，水为流动相，进行分离后得到组分 C2-1-C-5-1-C2-1-C-5-6，其中C2-1-C-5-1用HW-40C柱色谱，水为流动相，分离得到C2-1-C-5-1-1-C2-1-C-5-1-6；C2-1-C-5-1-4经半制备苯基柱，反相HPLC制备获得化合物(Ⅲ)和(Ⅳ)。

本发明技术方案的第三方面是提供了一种药物组合物，其中包括作为有效成分的如通式(I)-(Ⅳ)所示的C₂₀二萜类生物碱以及以附子中的常量成分宋果灵为原料反应获得的产物1和2，和制药领域中常用的载体。

通常本发明药物组合物含有0.1-95％重量的本发明化合物。

本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明的化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等，优选口服。

本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射和皮内注射等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。

本发明提取物或化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成分本发明提取物或化合物与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

例如，将本发明提取物或化合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物、药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。本发明化合物的每天的合适剂量范围本发明的提取物或化合物的用量为0.001-150mg/kg体重，优选为 0.01-100mg/kg体重，更优选为0.01-60mg/kg体重，最优选为0.1-10mg/kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

每一种治疗所需总剂量可分成多次或按一次剂量给药。本发明的化合物、组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。

本发明技术方案的第四方面是提供了如通式(I)-(Ⅳ)所示的C₂₀二萜类生物碱以及化合物1和2在制备用于躯体性疼痛、内脏性疼痛、神经性疼痛或癌性疼痛等疾病的药物中应用。

本发明还涉及附子提取物在制备预防或治疗急性或慢性疼痛等疾病的应用。所述的各种疼痛包括与中枢神经系统或外周神经系统有关的疼痛、各种急性或慢性疼痛、伤害感受性疼痛、躯体性疼痛、内脏性疼痛、神经性疼痛或癌性疼痛。

发明人发现本发明的化合物(I)-(Ⅳ)以及化合物1和2及药学上可接受的盐具一定的镇痛作用。因此，本发明的化合物(I)-(Ⅳ)以及化合物1和2 及药学上可接受的盐另一方面涉及治疗、改善与镇痛相关的疾病的方法。所述方法包括对需要治疗的患者给予治疗有效量的式(I)-(Ⅳ)以及化合物1和2或药学上可接受的盐的化合物或其药物组合物。

本发明显示化合物(I)-(Ⅳ)以及化合物1在整体动物水平很好的具有镇痛作用，2-4呈现弱的镇痛作用，但均有剂量依赖性。化合物(I)-(Ⅳ)或药学上可接受的盐未见公开报道化合物；化合物1和2未见镇痛活性应用的公开报道。

有益技术效果

本发明的发明人在对传统中药附子的活性成分研究过程中，通过活性跟踪的方法从附子中分离得到了具有新颖骨架的C₂₀二萜类生物碱3和4，以及常量成分宋果灵，并利用简易反应，制备获得了化合物1和2。通过醋酸扭体实验，对该类化合物进行了活性评价，结果显示化合物1在整体动物水平具有很好的镇痛作用， 2-4具有弱的镇痛作用，但均具有剂量依赖性，属于镇痛药物研发过程中的的先导化合物。

附图说明

图1、化合物1-4的制备流程

具体实施方式

下面的实验实施例可进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1、化合物1和2为从附子中提取分离纯化的新型C₂₀二萜类生物碱，其分离纯化鉴定过程如下：

干燥附子50Kg，粉碎后用水在40℃下提取3次，每次6小时，提取液合并，减压回收溶剂至120L，用大孔树脂(HPD-110,19kg)柱色谱(20×200cm)分离，依次用水(50L)、30％乙醇(120L)、50％乙醇(120L)、和95％乙醇(100L) 洗脱，减压回收溶剂得到相应的洗脱部分A(水)、B(30％乙醇)、C(50％乙醇)、 D(95％乙醇)，其中C部分用MCI树脂(CHP 20P)分离，依次用水(10L)、30％乙醇(30L)、50％乙醇(20L)和95％乙醇(10L)洗脱得到相应洗脱部分(C1-C4)。 30％乙醇洗脱部位(C2，750g)用MCI树脂分离，依次用水(3L)、30％乙醇(4L)、50％乙醇(4L)和95％乙醇(1L)洗脱，得到相应洗脱部分(C2-1-C2-4)。C2-1 (200g)用浓氨水调节pH值为10，用乙酸乙酯萃取(500ml×4)，分别获得有机相 C2-1-A和水相C2-1-C。有机相(C2-1-A，60g)，经碱性硅胶(pH 8-9)柱色谱分离，石油醚-丙酮-二乙胺15:1:1-4:1:1梯度洗脱，分离得到C2-1-A-1-C2-1-A-6。 C2-1-A-3(3.0g)用反相硅胶MPLC色谱分离，甲醇-水1:0～0:1梯度洗脱，得到 C2-1-A-3-1-C2-1-A-3-5。C2-1-A-3-3(2.5g)经甲醇重结晶得到化合物宋果灵(1g)。宋果灵与亚硫酸钠溶于50％甲醇水，加热反应8小时，再经HPLC(苯基柱，20％甲醇，含0.2％TFA，2ml/min))制备获得化合物1(t_R＝36min)和2(t_R＝41min)。C2-1-C 用6N HCl调整pH值至4，用正丁醇萃取(500ml×4)，水相C2-1-C(32g)用硅胶柱色谱，氯仿-甲醇50:1～0:1梯度洗脱，获得C2-1-C-1-C2-1-C-6。其中，C2-1-C-5(13 g)经SehpadexLH-20柱色谱分离(水)得到C2-1-C-5-1-C2-1-C-5-6。C2-1-C-5-1(800 mg)经HW-40C柱色谱分离(水)得到C2-1-C-5-1-1-C2-1-C-5-1-6。C2-1-C-5-1-4(28 mg)经半制备苯基柱HPLC(20％甲醇，含0.2％TFA，2ml/min)分离，得到化合物3(7 mg,t_R＝56min)和4(3mg,t_R＝51min)。分离流程图见图1。

化合物1:白色无定型粉末；(+)-ESIMS m/z 330[M+H]⁺,342[M+Na]⁺； (+)-HR-ESIMS m/z 330.20697[M+H]⁺(calcd.for C₂₀H₂₈NO₃,330.20637).

化合物2:白色无定形粉末；(+)-ESIMS m/z 356[M+H]⁺；(+)-HR-ESIMS m/z356.22238[M+H]⁺(calcd.for C₂₀H₂₈NO₃,356.22202)..

化合物3：白色无定型粉末；[α]²⁰ _D-38.1(c 0.28,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε): 202(2.24),223(sh,1.62),267(0.89)nm；CD(MeOH)200(Δε-1.18),290(Δε-0.43), 329(Δε+0.04)；IRν_max 3393,2970,2922,2850,1738,1678,1485,1466,1420,1321, 1202,1140,1049,957,879,838,801,722cm^-1；(+)-ESIMS m/z 438[M+H]⁺,460 [M+Na]⁺,(-)-ESIMS m/z436[M-H]^-；(+)-HR-ESIMS m/z 438.1954[M+H]⁺(calcd. for C₂₂H₃₂NO₆S,438.1945),(-)-HR-ESIMS m/z 436.1813[M-H]^-(calcd.for C₂₂H₃₀NO₆S,436.1799).

化合物4：白色无定型粉末；[α]²⁰ _D-37.4(c 0.14,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε) 202(2.46),219(sh,1.65)nm；CD(MeOH)200.0(Δε–0.54),296(Δε–0.65)；IRν_max 3394,2920,2850,1736(sh),1680,1543,1448,1358,1203,1140,1053,983,956,907, 880,842,802,724cm^-1；(+)-ESI-MS:m/z 438[M+H]⁺,460[M+Na]；(-)-ESI-MS: m/z 436[M-H]^-；(+)-HR-ESI-MS:m/z 438.1945[M+H]⁺(calcd for C₂₂H₃₂NO₆S, 48.1945),(-)-HR-ESIMS m/z436.1814[M-H]^-(calcd.for C₂₂H₃₀NO₆S,436.1799).

实验例2镇痛作用、化合物1-4对醋酸致小鼠疼痛的影响

醋酸扭体实验是通过醋酸刺激引起小鼠腹膜炎症而产生疼痛，是外周镇痛的经典模型，常作为评价和筛选镇痛药的方法之一。将一定容积和浓度的醋酸注入小鼠腹腔内，刺激脏层和壁层腹膜，引起深部较大面积、较长时间的炎性疼痛，致使小鼠出现腹部内凹、躯干与后肢伸张、臀部高起等行为反应，称为扭体反应。该反应在注射后15min内出现频率高，故以注射后15min内发生的扭体次数或发生反应的鼠数为疼痛定量指标。[魏伟,吴希美,李元建.药理实验方法学.人民卫生出版社.第4版.p770.]

试验动物：健康成年雌性ICR小鼠，清洁级，体重18-22g。实验动物饲养于12h-12h昼夜交替的独立环境中，室温维持在24±2℃，自由饮水和摄食，在适应环境1周后进行实验。对动物的所有处理均遵循国际疼痛研究协会伦理委员会的要求。

受试化合物：受试物为化合物1-4，阳性药为3-乙酰乌头碱

方法：将ICR雌性小鼠分为5组，每组10只，分别为模型对照组(生理盐水)、阳性对照组(吗啡，0.3mg/kg)；化合物高剂量组(1.0mg/kg)、化合物中剂量组 (0.3mg/kg)、化合物低剂量组(0.1mg/kg)。除模型组外，其余生理盐水蒸馏水。各组均于给药后30分钟腹腔注射化学刺激物醋酸溶液1％(0.1ml/10g)，记录注射醋酸后15min内小鼠扭体数，按下式计算药物对扭体反应的抑制率，评判药物镇痛效果：

抑制率％＝[(阴性对照组扭体均数-实验组扭体均数)/(阴性对照组扭体均数)]×100％。

实验结果：与模型组比较，化合物1-4高、中、低剂量组的扭体次数均少于模型组，具有明显的剂量依赖作用。阳性药物的镇痛效果非常明显，镇痛抑制率达 71.28％。结果表明化合物1具有明显的镇痛作用，2-4在高剂量组具有一定的镇痛作用，且具有剂量依赖性。具体结果见表1。

表1.化合物1-4的镇痛作用

注：数据以均数±标准误表示,**p<0.01，***p<0.001表示与模型组比较的显著性。

Claims (10)

1.一种如式(IV)所示的化合物及其药学上可接受的盐：

其中，R₁选自H、CH₃、CH₂CH₃；R₂选自SO₃ ^-；R₃选自H、CH₃、CH₂CH₃。

2.一组化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物选自如下群组：

3.根据权利要求1和2任一项所述的化合物及其药学上可接受的盐，其中，所述药学上可接受的盐选自所述化合物与有机酸或无机酸所成的盐。

4.权利要求1-3任一项所述的化合物及其药学上可接受盐的制备方法，其特征在于，所述化合物的制备方法如下：

干燥附子，粉碎后用蒸馏水在35～50℃下提取2～4次，每次4～8小时，提取液合并，减压回收溶剂得到浸膏，用大孔树脂柱色谱分离，依次用水：乙醇1:0～0:1梯度洗脱，TLC或HPLC监测，每个流分均洗脱至样品无明显被洗脱下来，减压回收溶剂得到相应的洗脱部分，其中50％乙醇部分用MCI树脂分离，依次用水：乙醇1:0～0:1梯度洗脱，TLC或HPLC监测合并相同组分；其中，水：乙醇7:3洗脱部位用MCI树脂分离，依次用水：乙醇1:0～0:1梯度洗脱，TLC或HPLC监测合并相同组分，得到相应洗脱部分C2-1-C2-4；水洗脱部分C2-1采用浓氨水，调节pH值为10以后，用乙酸乙酯萃取，得到有机相C2-1-A和水相C2-1-C；C2-1-A经碱性pH8-9硅胶柱色谱分离，石油醚-丙酮-二乙胺15:1:1-4:1:1梯度洗脱，分离得到C2-1-A-1-C2-1-A-6；C2-1-A-3用反相硅胶MPLC色谱分离，甲醇-水梯度洗脱，得到C2-1-A-3-1-C2-1-A-3-5；C2-1-A-3-3经甲醇重结晶得到化合物宋果灵；宋果灵与亚硫酸钠在50％甲醇水溶液中加热反应8小时后，用反相HPLC制备获得化合物1；水相C2-1-C用6N HCl调pH值为4，再用正丁醇萃取，所获得的水相C2-1-C经正相硅胶柱色谱，氯仿-甲醇50:1～0:1梯度洗脱，TLC或HPLC监测合并相同组分，得到相应洗脱部分C2-1-C-1-C2-1-C-6；C2-1-C-5经Sephadex LH-20柱色谱，水为流动相，进行分离后得到组分C2-1-C-5-1-C2-1-C-5-6，其中C2-1-C-5-1用HW-40C柱色谱，水为流动相，分离得到C2-1-C-5-1-1-C2-1-C-5-1-6；C2-1-C-5-1-4经半制备苯基柱，反相HPLC制备获得化合物3，

5.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括权利要求1和2任一项所述的化合物及其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体或赋形剂。

6.权利要求1和2任一项所述的化合物及其药学上可接受的盐或权利要求5所述的药物组合物在制备预防或治疗疼痛的药物中的应用。

7.如下1化合物及其药学上可接受的盐在制备预防或治疗疼痛的药物中的应用

8.根据权利要求6-7任一项的应用，其特征在于，所述的疼痛与中枢神经系统或外周神经系统有关。

9.根据权利要求6-7任一项中的应用，其特征在于，所述疼痛包括急性疼痛或慢性疼痛。

10.根据权利要求6-7任一项中的应用，其特征在于，所述疼痛是躯体性疼痛、内脏性疼痛或神经性疼痛。

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