CN112679701B - 一种固定化赖氨酸内肽酶及其制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程领域，特别是涉及一种固定化赖氨酸内肽酶及其制备方法与用途，所述制备方法首先通过环氧载体的环氧基团与D‑谷氨酸‑1‑叔丁酯的氨基进行反应，将D‑谷氨酸‑1‑叔丁酯修饰到环氧载体上，然后用氨基酸羧基活化剂活化D‑谷氨酸‑1‑叔丁酯，获得活化的D‑谷氨酸‑1‑叔丁酯修饰的改性环氧载体；用该改性环氧载体与Lys‑C孵育，获得固定化Lys‑C；再利用固定化Lys‑C制备胰岛素类似物。本发明的方法创新性的使用共价结合法固定化Lys‑C，固定化效率高，固定化Lys‑C容易回收，可重复使用，重复使用10次酶活保留为原始活力的70％以上。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别是涉及一种固定化赖氨酸内肽酶及其制备方法与用途。
背景技术
赖氨酰内肽酶(Lysyl endopeptidase，EC 3.4.21.50)是一种丝氨酸蛋白酶，又称Lys-C内切酶，最初由Masaki等人从土壤细菌中发现并分离得到的[Biochim BiophysActa.1981；660(1):44-50.Proteolytic Enzymes:Serine and Cysteine Peptidases,126–137.]，据报道，赖氨酰内肽酶前期主要采用野生菌株表达的方法获得，但是利用野生菌表达Lys-C时表达水平太低，无法满足工业化需求，例如来源溶杆菌的Lys-C天然表达量低于60U/L发酵液，来源无色杆菌的Lys-C天然表达量仅为32U/L发酵液[FEMSMicrobiology Letters,213(1),13–20.Journal of Biological Chemistry,273(27),16792–16797.Protein Expression and Purification,118,31–38.]；为了克服野生菌株表达水平低的缺点，采用基因重组的方法制备重组赖氨酰内肽酶，但是Lys-C的产量没有明显提高，因此其价格昂贵。Lys-C内切酶具有广泛的pH耐受性和更强的表面活性剂耐受性，可特异性地识别和切割肽链中赖氨酸残基，与胰蛋白酶相比具有更高的活性和特异性[CN109486800B]，作为一种重要的工具酶，Lys-C广泛应用于蛋白质组学[RapidCommunications in Mass Spectrometry,27(14),1669–1672.]和生物制药等领域，特别是用于胰岛素的制备[CN102816785A，Biotechnology and Bioengineering,37(7),693–695.ChemBioChem,9(18),2989–2996.]，例如地特胰岛素(Insulin Detemir)、德谷胰岛素(Insulin Degludec)和门冬胰岛素(Insulin Aspart)[Expert Opinion on BiologicalTherapy,14(6),799–808.]。
由于Lys-C的反应一般是在水溶液中进行，反应完成后会导致底物、产物和酶难于从溶液中分离出来，不利于其重复使用，但是固定化可以解决上述问题，US4634671报道了一种基于交联法固定Lys-C酶的方法，但是该固定化方法难以很好地控制反应条件，固定化时间最高达72小时，固定化酶产率较低(14.7～48％)，对于固定化酶的回收采用凝胶过滤、超滤等方法，操作相对繁琐，不利于工业化应用。
共价结合法使酶与载体间连接牢固，具有良好的稳定性及重复使用性，所以，成为目前研究最活跃的一种方法之一[Applied Science and Convergence Technology,2017,26(6):157-163]。环氧载体中的环氧基团可以与酶分子上的功能基团(氨基、硫醇和酚类)共价结合，使酶分子固定于载体表面，虽然共价固定提高了酶的稳定性，但降低了亲和反应中的酶活性，并且重现性差；此外，在固定化的过程中，可能会改变酶的构象，从而导致酶失去活力。
由于环氧基团可以和蛋白的N-末端氨基以及赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸等的侧链基团反应，导致酶和载体之间形成多位点固定，从而影响酶的活性，用传统环氧固定化方法对Lys-C进行固定后得到的固定化Lys-C酶活极低，因此亟需对环氧载体进行修饰，开发一种改性的环氧载体并对Lys-C进行固定，以及利用固定化Lys-C制备胰岛素的方法。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种固定化赖氨酸内肽酶及其制备方法与用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种改性的环氧载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
1)将D-谷氨酸-1-叔丁酯与环氧载体混合，获得D-谷氨酸-1-叔丁酯修饰的环氧载体；
2)将步骤1)的D-谷氨酸-1-叔丁酯修饰的环氧载体与氨基酸羧基活化剂混合，获得活化的D-谷氨酸-1-叔丁酯修饰的环氧载体即为改性的环氧载体。
本发明还提供一种改性的环氧载体，所述改性的环氧载体由上述方法制备获得。
本发明还提供一种固定化Lys-C的制备方法，所述制备方法包括将Lys-C与所述改性的环氧载体混合，得到固定化Lys-C。
本发明还提供一种固定化Lys-C，所述固定化Lys-C由上述方法制备获得。
所述的固定化Lys-C在制备胰岛素类似物中间体或胰岛素类似物中的用途。
本发明还提供一种胰岛素类似物中间体的制备方法，所述制备方法包括将胰岛素前体蛋白与所述的固定化Lys-C混合反应，反应结束后，分别回收固定化Lys-C和酶切产物，酶切产物即为胰岛素类似物中间体。
本发明还提供一种胰岛素类似物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将所述胰岛素类似物中间体进行转肽反应。
如上所述，本发明的一种固定化赖氨酸内肽酶及其制备方法与用途，具有以下有益效果：
(1)本发明方法创新性的使用共价结合法固定化Lys-C，其固定化效率高，酶活回收率高。
(2)本发明方法的固定化Lys-C容易回收，可重复使用，重复使用10次，酶活保留为原始活力的70％以上。
(3)本发明方法操作简单，成本低，利于工业化应用。
附图说明
图1显示为本发明的环氧载体的改性与固定化Lys-C示意图，其中A为L-Glu-OtBu修饰环氧载体的示意图；B为活化L-Glu-OtBu的示意图；C为改性后的环氧载体固定化Lys-C示意图。
图2显示为缺B30位苏氨酸人胰岛素(D30蛋白)序列图。
图3显示为缺B30位苏氨酸门冬胰岛素(M30蛋白)序列图。
图4显示为人胰岛素前体序列示意图。
图5显示为门冬胰岛素前体序列示意图。
图6显示为本发明的人胰岛素前体蛋白酶切反应检测图。
图7显示为本发明的缺B30苏氨酸人胰岛素(D30)分子量检测图。
图8显示为本发明的门冬胰岛素前体蛋白酶切反应检测图。
图9显示为本发明的M30蛋白转肽反应检测图。
图10显示为本发明的门冬胰岛素苏氨酸酯分子量检测图。
图11门冬胰岛素苏氨酸酯干粉脱保护基团反应示意图。
具体实施方式
本发明提供一种改性的环氧载体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
1)将D-谷氨酸-1-叔丁酯与环氧载体混合，获得D-谷氨酸-1-叔丁酯修饰的环氧载体；
2)将步骤1)的D-谷氨酸-1-叔丁酯修饰的环氧载体与氨基酸羧基活化剂混合，获得活化的D-谷氨酸-1-叔丁酯修饰的环氧载体。
所述环氧载体为表面含有环氧基官能团的载体。所述环氧载体与D-谷氨酸-1-叔丁酯的质量摩尔比为1g：0.05～0.1M。在一种实施方式中，所述环氧载体选自环氧固定化酶载体。
在一种实施方式中，步骤1)在有机溶剂中进行反应。所述有机溶剂选自DMF、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、二氧六环和N-甲基吡咯烷酮的一种或多种的任意混合。
在一种实施方式中，步骤1)中D-谷氨酸-1-叔丁酯的浓度为0.05～0.1mol/L。
在一种实施方式中，步骤1)的反应温度为32～40℃。
在一种实施方式中，步骤1)的反应时间为10～14h。
在一种实施方式中，步骤1)的D-谷氨酸-1-叔丁酯(即L-Glu-OtBu)与环氧载体反应结束后还将产物进行洗涤和封闭。
在一种实施方式中，洗涤液选自有机溶剂。所述有机溶剂选自DMF、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、二氧六环和N-甲基吡咯烷酮的一种或多种的任意混合。
“封闭”的目的是将未与D-谷氨酸-1-叔丁酯发生反应的环氧基团反应完毕，避免环氧基团参与下一步的反应，影响反应效率。在一种实施方式中，封闭缓冲液选自甘氨酸或乙醇胺。产物与封闭缓冲液的质量体积比为1g：3～12mL。
在一种实施方式中，环氧载体为LX-1000EP(西安蓝晓科技新材料股份有限公司)，步骤1)的反应示意图如图1A。
在一种实施方式中，步骤2)中D-谷氨酸-1-叔丁酯修饰的环氧载体与氨基酸羧基活化剂的质量摩尔比为1g：0.05～0.1M。
在一种实施方式中，步骤2)在有机溶剂中进行反应，氨基酸羧基活化剂的浓度为0.05～0.1mol/L。
在一种实施方式中，步骤2)的反应条件为22～28℃。
在一种实施方式中，步骤2)的反应时间为6～10h。
在一种实施方式中，步骤2)反应完成后用有机溶剂洗涤。
在一种实施方式中，步骤2)的反应示意图如图1B。
所述氨基酸羧基活化剂选自O-(N-琥珀酰亚胺基)-NNNN-四甲基四氟硼酸脲(TSTU)、二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)、N,N-二环乙基碳二亚胺(DCC)、N-羟基苯丙三唑(HOBt)、五氟苯酚脂(PfP脂)、羟基二咪唑(CDI)中的一种或几种。
上述反应得到的改性的环氧载体为琥珀酰亚胺基活化的D-谷氨酸-1-叔丁酯修饰的环氧载体(LX-1000EP-D-Glu-OtBu-TSTU)。
本发明还提供上述方法获得的改性的环氧载体。
本发明还提供一种固定化Lys-C的制备方法，所述制备方法包括将Lys-C与所述改性的环氧载体混合，得到固定化Lys-C。
在一种实施方式中，所述改性的环氧载体与Lys-C的质量比为1g：0.001～0.1g。
具体的，所述制备方法在固定缓冲液中进行，Lys-C的浓度为0.1～100mg/mL。在一种实施方式中，所述固定缓冲液包括1，4丁二醇、DMSO和水。
在一种实施方式中，反应温度为20～30℃。
在一种实施方式中，反应体系的pH为8.5～9.5。
在一种实施方式中，反应时间为20～40min。
反应结束后，过滤收集产物，并用洗涤缓冲液洗涤，最终获得固定化Lys-C。
在一种实施方式中，反应示意图如图1C。
所述制备方法使用共价结合法固定化Lys-C，固定化效率高，酶活回收率可达70％。
本发明还提供上述方法获得的固定化Lys-C。
本发明的固定化Lys-C容易回收，可重复使用，重复使用10次，酶活保留为原始活力的70％以上。
本发明还提供所述固定化Lys-C在制备胰岛素类似物中的用途。
所述胰岛素类似物是指既可模拟正常胰岛素的分泌，同时在结构上与胰岛素也相似的物质。
本发明提供一种胰岛素类似物中间体的制备方法，所述制备方法包括将胰岛素前体蛋白与所述固定化Lys-C混合反应，反应结束后，分别回收固定化Lys-C和酶切产物，酶切产物即为胰岛素类似物中间体。
目前用于产业化表达重组胰岛素的系统包括酿酒酵母和毕赤酵母，因为在酵母系统中不能表达完整人胰岛素原，而通过在编码胰岛素原cDNA的分子中去除B30位苏氨酸，并用短C肽代替C肽后，可显著提高单链胰岛素前体的分泌表达。在此基础上，通过在前导肽的C端和短C肽的C端设计用于赖氨酰内肽酶进行切割的赖氨酸位点，因而可采用赖氨酰内肽酶对胰岛素原进行酶切。
制备不同的胰岛素类似物中间体，所使用的胰岛素前体蛋白不同。例如制备缺B30苏氨酸人胰岛素类似物(D30蛋白，序列如图2所示)和缺失B30苏氨酸的门冬胰岛素(M30蛋白，序列如图3所示)分别使用的人胰岛素前体蛋白和门冬胰岛素前体蛋白。前导肽和C肽的序列因不同厂家工艺不同，序列亦不同，但是其具有共有部分，人胰岛素前体蛋白和门冬胰岛素前体蛋白的序列示意图分别如图4和图5所示，因前导肽和C肽无统一的序列，因此图中未示出具体的氨基酸。
所述胰岛素类似物中间体包括D30蛋白和M30蛋白。将所述胰岛素类似物中间体继续进行反应，可以得到不同的胰岛素。对D30蛋白进行转肽反应，可以获得重组人胰岛素；在D30蛋白的B链29位的赖氨酸残基上连接一个14C的脂肪酸侧链可得到地特胰岛素、在D30蛋白B链29位的赖氨酸残基上通过谷氨酸连接子连接一个16C脂肪酸侧链可以得到德谷胰岛素；对M30蛋白进行转肽反应，可以获得门冬胰岛素。
在一种实施方式中，所述胰岛素前体蛋白与固定化Lys-C的质量比为50：1～3。
在一种实施方式中，反应温度为25～37℃。
在一种实施方式中，反应pH为8.5～10.5。
在一种实施方式中，反应时间为8～16h。
在一种实施方式中，反应在缓冲液中进行。所述缓冲液为Tris溶液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(20mM)、硼砂-氢氧化钠缓冲液(50mM)及磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液(50mM)。
在一种实施方式中，首先将胰岛素前体蛋白溶解于缓冲液中，预热至反应温度、调节至反应pH后再加入固定化Lys-C。反应结束后还对反应产物进行纯化、沉淀、洗滤、干燥等常规操作。
本发明还提供一种胰岛素类似物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将所述胰岛素类似物中间体进行转肽反应。
所述转肽反应指是酶促合成的反应，即利用蛋白酶的逆转反应来进行肽键合成的反应。
在一种实施方式中，还包括将转肽反应获得的产物进行脱保护基团反应。
例如，对M30蛋白进行转肽反应，得到门冬胰岛素苏氨酸酯，再进一步对门冬胰岛素苏氨酸酯进行脱保护基团反应，反应结束后即可收获门冬胰岛素。
具体的，所述门冬胰岛素的制备方法包括以下步骤：
1)将胰岛素类似物中间体M30蛋白与苏氨酸酯、酶混合，获得门冬胰岛素苏氨酸酯；
2)将门冬胰岛素苏氨酸酯进行脱保护基团反应，获得门冬胰岛素。
在一种实施方式中，步骤1)中所述M30蛋白与苏氨酸酯质量比为1：7～13。
在一种实施方式中，步骤1)中反应温度为25～37℃。
在一种实施方式中，步骤1)中反应pH为8.0～10.0。
在一种实施方式中，步骤1)中反应时间为16～24h。
在一种实施方式中，步骤1)的反应在缓冲液与有机溶剂的混合溶液中进行。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1改性的环氧载体的制备
①修饰：称取1g环氧载体LX-1000EP(西安蓝晓科技新材料股份有限公司)，加入0.1M溶于DMF的D-谷氨酸-1-叔丁酯溶液，37℃搅拌反应12h，反应完成后，离心收集环氧载体，并用DMF洗涤环氧载体，然后加入12倍体积的封闭缓冲液(3M甘氨酸，pH 8.5)，在37℃搅拌反应12h，封闭完成后，离心去除封闭液，获得D-谷氨酸-1-叔丁酯修饰的环氧载体；
②活化：在步骤①获得的D-谷氨酸-1-叔丁酯修饰的环氧载体中加入0.1M溶于四氢呋喃的O-(N-琥珀酰亚胺基)-NNNN-四甲基四氟硼酸脲溶液，25℃搅拌反应8h，反应完成后，离心收集载体，并用四氢呋喃洗涤，获得琥珀酰亚胺基活化的D-谷氨酸-1-叔丁酯修饰的环氧载体(LX-1000EP-D-Glu-OtBu-TSTU)；
实施例2固定化赖氨酸内肽酶(Lys-C)
称取50mg修饰的环氧载体(LX-1000EP-D-Glu-OtBu-TSTU)，加入0.8U Lys-C于固定缓冲液(1，4丁二醇：DMSO：水＝1：1：2)，在25℃下搅拌反应30min；同时称取50mg未经修饰的环氧载体(LX-1000EP)，加入0.8U Lys-C于1M磷酸盐缓冲液中(pH 7.0)，在20℃下搅拌反应24h[Biomacromolecules 2003,4,772-777]，作为对照组。
反应完成后，通过离心去除上清，用5倍体积的PBS缓冲液(0.1M，pH 7.5)洗涤载体5次，获得固定化的Lys-C。检测固定前后Lys-C上清的酶活，计算Lys-C的固定量和固定化效率。相关计算公式如下：
Lys-C固定量(U)＝固定前总酶活(U)-固定后总酶活(U)(1)
实施例3 Lys-C活性检测
Lys-C酶活测定原理：Lys-C催化Nα-苯甲酰-DL-赖氨酸-4-硝基苯胺氢溴酸盐水解生成对硝基苯胺，在405nm处具有最大吸光度。
游离Lys-C酶活检测：将2.6mL0.2mol/L AMP(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇)缓冲液(pH9.5)与0.3mL 2.5mmol/L底物(Nα-苯甲酰-DL-赖氨酸-4-硝基苯胺氢溴酸盐)溶液混合，在30℃下孵育5分钟后，加入0.1mL酶液(在2mmol/L Tris-HCl缓冲液中，pH 8.0)，立即混合均匀，在30℃孵育25分钟，然后加入1mL终止液(55mL水和45mL乙酸混合溶液)，测量其在405nm的吸光度。其中空白对照组不加入酶液。一个Lys-C活性单位(U)定义为在30℃，pH9.5时，每分钟产生1μmol对硝基苯胺所需的酶量。
其中，ΔA/min—表示每分钟吸光度的变化值，即为斜率；S—对硝基苯胺的摩尔消光系数(9.62cm2/μmoL)；d—光程(比色皿光程约为1cm)；Vt—表示反应液的总体积(4mL)；Vs—表示样品酶液的体积(0.1mL)；X—表示样品酶液的稀释倍数。
固定化Lys-C酶活检测：将2.6mL 0.2mol/L AMP(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇)缓冲液(pH 9.5)与0.3mL 2.5mmol/L底物(Nα-苯甲酰-DL-赖氨酸-4-硝基苯胺氢溴酸盐)溶液混合，在30℃下孵育5分钟后，加入5mg固定化Lys-C，立即混合均匀，在30℃孵育25分钟，然后加入1mL终止液(55mL水和45mL乙酸混合溶液)，取上清测量其在405nm的吸光度。其中空白对照组不加入固定化Lys-C。
其中，ΔA/min—表示每分钟吸光度的变化值，即为斜率；S—对硝基苯胺的摩尔消光系数(9.62cm2/μmoL)；d—光程(比色皿光程约为1cm)；Vt—表示反应液的总体积(4mL)；M—表示固定化酶的称样量(0.005g)。
固定化结果如表1所示，修饰后的环氧载体对于Lys-C的固定化效率和酶活回收率在80％以上，分别为97％、85％；而传统环氧固定化方法对于Lys-C的固定化效率为82％，酶活回收率仅为31％。
表1环氧载体固定化Lys-C的结果
实施例4不同条件下固定Lys-C
不同温度下固定Lys-C：分别称取50mg修饰的环氧载体(LX-1000EP-D-Glu-OtBu-TSTU)，加入0.8U Lys-C，分别于20℃、25℃、30℃下搅拌反应30min，固定化结果如表2所示。
不同pH下固定Lys-C：分别称取50mg修饰的环氧载体(LX-1000EP-D-Glu-OtBu-TSTU)，加入0.8U Lys-C，分别调整固定缓冲液(1，4丁二醇：DMSO：水＝1：1：2)的pH值至8.0、8.5、9.0、9.5和10.0，于25℃下搅拌反应30min，固定化结果如表3所示。
环氧载体与Lys-C不同比例的固定：分别称取50mg修饰的环氧载体(LX-1000EP-D-Glu-OtBu-TSTU)，分别加入0.2U、0.4U、0.8U及1.6U Lys-C，在25℃下搅拌反应30min。固定化结果如表4所示。
反应完成后，通过离心去除上清，用5倍体积的PBS缓冲液(0.1M，pH 7.5)洗涤载体5次，获得固定化的Lys-C。检测固定前后Lys-C上清的酶活，计算Lys-C的固定量、固定化效率和酶活回收率。相关计算方法分别如公式(1)、(2)和(5)所示。
表2修饰后的环氧载体在不同温度下固定化Lys-C的结果
修饰后的环氧载体在不同温度下固定化Lys-C的结果如表2所示，从20℃～30℃，修饰后的环氧载体对于Lys-C的固定化效率和酶活回收率都在增加，分别从74％增加到95％，65％增加到86％，其中从25℃～30℃时效率增加不明显。
表3修饰后的环氧载体在不同pH下固定化Lys-C的结果
环氧载体在不同pH下固定化Lys-C的结果如表3所示，从pH 8.0～10.0，修饰后的环氧载体对于Lys-C的固定化效率从72％增加到97％，但酶活回收率差距较大，从pH 8.5～9.5，酶活回收率在81～89％之间；当在pH 8.0和10.0时，其酶活回收率分别仅为55％和63％。
表4不同质量的Lys-C的固定化结果
不同质量的Lys-C固定化结果如表4所示，随着Lys-C投入量的增加，其固定化效和酶活回收率都逐渐下降。
实施例5固定化Lys-C重复使用情况
将2.6mL 0.2mol/L AMP(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇)缓冲液(pH 9.5)与0.3mL2.5mmol/L底物(Nα-苯甲酰-DL-赖氨酸-4-硝基苯胺氢溴酸盐)溶液混合，在30℃下孵育5分钟后，加入5mg固定化Lys-C，立即混合均匀，在30℃孵育25分钟，然后加入1mL终止液(55mL水和45mL乙酸混合溶液)，过滤回收固定化Lys-C，同时取上清测量其在405nm的吸光度，计算固定化Lys-C的酶活，作为原始的酶活数据；将回收的固定化Lys-C加入到已在30℃下预热5分钟的AMP(2.6mL 0.2mol/L)和底物(0.3mL 2.5mmol/L)混合溶液中，立即混合均匀，在30℃孵育25分钟，然后加入1mL终止液(55mL水和45mL乙酸混合溶液)，过滤回收固定化Lys-C，同时取上清测量其在405nm的吸光度，计算固定化Lys-C的酶活，作为第二次反应的酶活数据；依此类推，将回收的固定化Lys-C继续反应10次，分别计算每次固定化Lys-C的酶活(空白对照组不加入固定化Lys-C)。结果如表5所示。
表5固定化Lys-C重复使用情况
如表5所示，固定化Lys-C在重复反应10次后，其活力仍然保留为原始活力的70％以上。
实施例6固定化Lys-C应用于缺B30苏氨酸的人胰岛素类似物的制备
目前用于产业化表达重组人胰岛素的系统包括酿酒酵母和毕赤酵母，因为在酵母系统中不能表达完整人胰岛素原，而通过在编码胰岛素原cDNA的分子中去除B30位苏氨酸，并用短C肽代替C肽后，可显著提高单链胰岛素前体的分泌表达。在此基础上，通过在前导肽的C端和短C肽的C端设计用于赖氨酰内肽酶进行切割的赖氨酸位点，因而可采用赖氨酰内肽酶对胰岛素原进行酶切，获得缺失B30苏氨酸的人胰岛素(以下简称D30蛋白)。对D30蛋白进行转肽，可以获得重组人胰岛素。在D30蛋白的B链29位的赖氨酸残基上连接一个14C的脂肪酸侧链，可得到地特胰岛素。在D30蛋白B链29位的赖氨酸残基上通过谷氨酸连接子连接一个16C脂肪酸侧链，可以得到德谷胰岛素。本实施例采用固定化的赖氨酰内肽酶进行胰岛素前体蛋白的酶切反应，制备D30蛋白。
按照参考文献(刘海峰.重组胰岛素前体转化成人胰岛素和地特胰岛素的工艺研究[D].华东理工大学,2014)制备人胰岛素前体蛋白。取人胰岛素前体蛋白冻干粉2000mg，溶解于100mL 50mM Tris溶液中，预热至30℃，用氢氧化钠溶液调节pH为9.0，加入0.12g固定化Lys-C，30℃搅拌反应8h，过滤反应液，回收固定化Lys-C。
采用C18色谱柱(直径4.6mm，长度200mm，粒径5μm)测定酶切效率。流动相A：0.05％三氟乙酸-水，流动相B：0.05％三氟乙酸-乙腈；洗脱梯度：20％B-35B，30min，流速1mL/min。取反应液20μL，注入色谱仪，柱温30℃，波长214nm，记录色谱图，如图6。计算酶切效率为83.19％(采用面积归一法，计酶切产物缺失B30苏氨酸人胰岛素峰面积占总面积比例为酶切效率)。与游离的Lys-C酶切相比，酶切效率无显著差异。
对酶切反应液进行反相层析纯化，收集D30馏分，沉淀、洗滤、干燥后得到的产物分子量与D30理论分子量(5706.48Da)一致。
实施例7固定化Lys-C应用于门冬胰岛素的制备
门冬胰岛素的制备工艺包括门冬胰岛素前体的酶切，即采用工具酶进行特定位点的切割，得到缺失B30苏氨酸的门冬胰岛素(以下简称M30蛋白)；使用工具酶，对M30蛋白进行转肽反应，得到门冬胰岛素苏氨酸酯，对门冬胰岛素酯进行脱保护反应，可以得到门冬胰岛素；本实施例采用固定化的赖氨酰内肽酶进行门冬胰岛素前体的酶切反应和M30蛋白的转肽反应。
按照参考文献(李磊.短C肽门冬胰岛素的制备与纯化[D].重庆大学,2017.)制备门冬胰岛素前体。取门冬胰岛素前体冻干粉2000mg，溶解于100mL 100mM Tris溶液中，预热至37℃，用1M氢氧化钠溶液调节pH为9.5，加入0.12g固定化Lys-C，37℃搅拌反应16h后，过滤反应液，回收固定化Lys-C。
采用C18色谱柱(直径4.6mm，长度200mm，粒径5μm)测定酶切效率。流动相A：0.05％三氟乙酸-水，流动相B：0.05％三氟乙酸-乙腈；洗脱梯度：20％B-35B，30min，流速1mL/min。取反应液20μL，注入色谱仪，柱温30℃，波长214nm，记录色谱图，如图8。计算酶切效率为85.45％(采用面积归一法，计酶切产物M30峰面积占总面积比例为酶切效率)。与游离的Lys-C酶切相比，酶切效率无显著差异。
对酶切反应液进行沉淀，将沉淀湿粉溶解于20mL100mM硼酸溶液中，加入20mL DMF和40mL乙醇，加入叔丁醚苏氨酸叔丁酯(苏氨酸酯)，用氢氧化钠或硼酸调节pH 8.0，加入1.2g固定化Lys-C，30℃搅拌反应16h，过滤反应液，回收固定化Lys-C。
采用C4色谱柱(直径4.6mm，长度200mm，粒径5μm)测定转肽效率。流动相A：0.1％三氟乙酸-水，流动相B：0.1％三氟乙酸-乙腈；洗脱梯度：25％B-40％B，30min，流速1mL/min。取反应液20μL，注入色谱仪，柱温30℃，波长214nm，记录色谱图，如图9。计算转肽效率为75.14％(采用面积归一法，计转肽产物门冬胰岛素苏氨酸酯峰面积占总面积比例为酶切效率)。
对转肽反应液进行反向层析，收集门冬胰岛素苏氨酸酯馏分，沉淀、洗滤、干燥后得到门冬胰岛素苏氨酸酯。质谱分析结果见图10，固定化Lys-C酶切和转肽得到的产物分子量与理论分子量一致。
对收获的门冬胰岛素苏氨酸酯干粉进行脱保护基团反应，门冬胰岛素苏氨酸酯干粉与TFA质量体积比为5g：1ml，反应示意图如图11所示。
反应后经反向层析可收获门冬胰岛素馏分，经沉淀、洗虑、干燥后得到门冬胰岛素。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种改性的环氧载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
1)将D-谷氨酸-1-叔丁酯与环氧载体混合，获得D-谷氨酸-1-叔丁酯修饰的环氧载体，所述环氧载体与D-谷氨酸-1-叔丁酯的质量摩尔比为1g：0.05～0.1M，步骤1)的反应示意图为：
2)将步骤1)的D-谷氨酸-1-叔丁酯修饰的环氧载体与氨基酸羧基活化剂混合，获得活化的D-谷氨酸-1-叔丁酯修饰的环氧载体即为改性的环氧载体，步骤2)中D-谷氨酸-1-叔丁酯修饰的环氧载体与氨基酸羧基活化剂的质量摩尔比为1g：0.05～0.1M；所述氨基酸羧基活化剂选自TSTU、DIPCDI、DCC、HOBt、PfP脂、CDI中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)还包括以下特征中的一种或多种：
a)步骤1)在有机溶剂中进行反应；
b)D-谷氨酸-1-叔丁酯的浓度为0.05～0.1mol/L；
c)反应温度为32～40℃；
d)反应时间为10～14h；
e)D-谷氨酸-1-叔丁酯与环氧载体反应结束后还将产物进行洗涤和/或封闭。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)还包括以下特征中的一种或多种：
a)步骤2)在有机溶剂中进行反应；
b)氨基酸羧基活化剂的浓度为0.05～0.1mol/L；
c)反应温度为22～28℃；
d)反应时间为6～10h；
e)反应完成后用有机溶剂洗涤；
f)步骤2)得到的改性的环氧载体为琥珀酰亚胺基活化的D-谷氨酸-1-叔丁酯修饰的环氧载体，反应示意图为：
4.一种改性的环氧载体，其特征在于，所述改性的环氧载体由权利要求1-3任一所述的方法制备获得。
5.一种固定化Lys-C的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将Lys-C与权利要求4所述的改性的环氧载体混合，得到固定化Lys-C。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括以下特征中的一种或多种：
a)所述改性的环氧载体与Lys-C的质量比为1g：0.001～0.1g；
b)在固定缓冲液中进行反应；
c)Lys-C的浓度为0.1～100mg/mL；
d)反应温度为20～30℃；
e)反应体系的pH为8.5～9.5；
f)反应时间为20～40min；
g)反应结束后，过滤收集产物，并用洗涤缓冲液洗涤，最终获得固定化Lys-C；
h)反应示意图为：
7.一种固定化Lys-C，其特征在于，所述固定化Lys-C由权利要求5-6任一所述的方法获得。
8.权利要求7所述的固定化Lys-C在制备胰岛素类似物中间体中的用途，所述胰岛素类似物中间体选自缺失B30苏氨酸的人胰岛素和缺失B30苏氨酸的门冬胰岛素。
9.一种胰岛素类似物中间体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将胰岛素前体蛋白与权利要求7所述的固定化Lys-C混合反应，反应结束后，分别回收固定化Lys-C和酶切产物，酶切产物即为胰岛素类似物中间体，所述胰岛素类似物中间体选自缺失B30苏氨酸的人胰岛素和缺失B30苏氨酸的门冬胰岛素，所述胰岛素前体蛋白包括人胰岛素前体蛋白和门冬胰岛素前体蛋白。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，还包括以下特征中的一种或多种：
a)所述胰岛素前体蛋白与固定化Lys-C的质量比为50：1～3；
b)反应温度为25～37℃；
c)反应pH为8.5～10.5；
d)反应时间为8～16h。
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| CN112679701A (zh) | 2021-04-20 |
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