CN112646783A

CN112646783A - 表达基因、经基因修饰的受精卵的构建方法和小鼠模型的构建方法

Info

Publication number: CN112646783A
Application number: CN202011626448.6A
Authority: CN
Inventors: 李锋; 王亚萍; 冯成千; 李贤�
Original assignee: Guangzhou Furong Biotechnology Co ltd; Guangzhou 8th People's Hospital
Current assignee: Eighth Affiliated Hospital Of Guangzhou Medical University
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2021-04-13
Anticipated expiration: 2040-12-30
Also published as: CN112646783B

Abstract

本发明涉及一种表达基因、经基因修饰的受精卵的构建方法和小鼠模型的构建方法，该经基因修饰的受精卵的构建方法包括以下步骤：利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术，在小鼠的干扰素受体基因上，敲入表达人干扰素受体的表达基因，制备经基因修饰的受精卵。采用上述构建方法制得的受精卵制得的小鼠模型可以识别人干扰素，正常应答人干扰素的刺激。

Description

表达基因、经基因修饰的受精卵的构建方法和小鼠模型的构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种表达基因、经基因修饰的受精卵的构建方法和小鼠模型的构建方法。

背景技术

据世界卫生组织(WHO)公布的数据，全球有20亿人感染乙型肝炎病毒(HBV)，其中有2.4亿人为慢性HBV感染者，HBV感染可引起各种急性和慢性肝脏疾病，每年全球约有60万人死于HBV相关的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌。

对于慢性乙型肝炎的抗病毒治疗，目前已有两大类药物被批准应用于临床：一类靶向HBV从前基因组RNA(pgRNA)反转录到子代病毒DNA环节的小分子核苷(酸)类似物(NA)，NA可在短时间内完全抑制新病毒产生，但不能清除cccDNA，降低HBsAg作用有限；另一类药物是具有直接抗病毒和免疫调节的干扰素-α(IFN-α)及其聚乙二醇化形式((PegIFN-α)。有研究表明，干扰素能增加抗病毒免疫反应，抑制病毒进入肝细胞，诱导HBV的cccDNA的部分降解，并能通过表观遗传学抑制cccDNA转录及抑制转录后病毒的分泌，因其对HBV感染肝细胞的多个环节起重要调控作用，使其成为能够实现乙肝治愈这一理想终点的潜在药物之一，但干扰素在体内的作用机制尚不明确，需要在动物模型上进一步研究其作用机制。

目前可供研究的干扰素治愈HBV的动物模型可分为以下几类：第一类是自然界天然存在的可供HBV感染复制的动物模型，例如大猩猩、毛里求斯猴、树鼩和土拨鼠等，但是这些HBV感染动物模型实验成本高，而且他们的干扰素受体与人的干扰素受体从进化角度上来看相差较远，因而干扰素在这些动物模型中的作用效果与干扰素在人体内的作用效果有一定的差距；第二类是肝脏人源化小鼠模型，该模型可支持高水平HBV复制，可以测试直接作用于HBV的药物(类似丙肝的DAA类药物)，但用于测评干扰素对HBV的作用则存在根本性缺陷：1)构建同时具有肝脏和免疫系统的双人源化小鼠成本高昂；2)除肝脏和免疫系统外，其它脏器均只表达鼠源干扰素受体，不能正常应答人干扰素的刺激。

发明内容

基于此，有必要提供一种经基因修饰的受精卵的构建方法，采用该构建方法制得的受精卵制备的小鼠模型能够正确识别人干扰素，正常应答人干扰素的刺激。

此外，还有必要提供一种表达基因、小鼠模型的构建方法及构建小鼠模型的试剂盒，该小鼠模型的构建方法的构建成本较低且根据该构建方法构建的小鼠模型能够正确识别人干扰素，正常应答人干扰素的刺激。

一种经基因修饰的受精卵的构建方法，包括以下步骤：

利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术，在野生型小鼠的I型干扰素受体基因上敲入表达基因，制备经基因修饰的受精卵，所述表达基因包括：

第一功能区，所述第一功能区包括编码人I型干扰素受体1的胞外结构域的核酸片段、编码小鼠I型干扰素受体1的跨膜结构域的核酸片段和编码小鼠I型干扰素受体1的胞内结构域的核酸片段；

第二功能区，所述第二功能区包括编码人I型干扰素受体2的胞外结构域的核酸片段、编码小鼠I型干扰素受体2的跨膜结构域的核酸片段、编码小鼠I型干扰素受体2的胞内结构域的核酸片段及转录终止子；及

连接区，用于连接所述第一功能区与所述第二功能区，所述连接区包括编码具有自剪切功能的蛋白的核酸片段。

上述经基因修饰的构建方法成本较低，得到的受精卵用于制备小鼠模型时可以识别人干扰素，正常应答人干扰素的刺激。

一种经基因修饰的受精卵的构建方法，包括以下步骤：

在其中一个实施例中，所述制备经基因修饰的受精卵的步骤包括：

根据靶位点，构建含有表达基因的同源重组载体，所述靶位点位于所述小鼠的I型干扰素受体基因上；

根据所述靶位点设计gRNA；及

将所述同源重组载体、所述gRNA和Cas9蛋白导入所述野生型小鼠的受精卵中，制备经基因修饰的受精卵。

在其中一个实施例中，所述靶位点位于小鼠的IFNAR2基因上的第二个外显子的起始密码子之后的区域。

在其中一个实施例中，所述靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

及/或，所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

及/或，所述同源重组载体的同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示。

在其中一个实施例中，所述野生型小鼠为C57BL/6J小鼠。

一种表达基因，包括：

一种小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

采用上述的经基因修饰的受精卵的构建方法，构建经基因修饰的受精卵；

将所述经基因修饰的受精卵移植到代孕小鼠中，制备小鼠模型。

在其中一个实施例中，在所述将经基因修饰的受精卵移植到代孕小鼠中的步骤之后，还包括：

饲养所述代孕小鼠，制得F0代小鼠；及

对所述F0代小鼠进行纯合子筛选，得到小鼠模型。

一种构建小鼠模型的试剂盒，包括：

同源重组载体，包括两个同源臂和位于两个所述同源臂之间的表达基因，所述同源臂能够与靶位点发生同源重组，所述表达基因包括第一功能区、第二功能区和连接区，所述第一功能区包括编码人I型干扰素受体1的胞外结构域的核酸片段、编码小鼠I型干扰素受体1的跨膜结构域的核酸片段和编码小鼠I型干扰素受体1的胞内结构域的核酸片段，所述第二功能区包括编码人I型干扰素受体2的胞外结构域的核酸片段、编码小鼠I型干扰素受体2的跨膜结构域的核酸片段、编码小鼠I型干扰素受体2的胞内结构域的核酸片段及转录终止子，所述连接区用于连接所述第一功能区与所述第二功能区，所述连接区包括编码具有自剪切功能的蛋白的核酸片段；及

gRNA，根据所述靶位点设计。

在其中一个实施例中，还包括Cas9蛋白。

及/或，所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

附图说明

图1为一实施方式的小鼠模型的转基因策略示意图；

图2为图1所示的实施方式中表达基因表达后形成的人鼠型I型干扰素嵌合受体的结构示意图；

图3为野生型小鼠I型干扰素受体的结构示意图；

图4为测试验证的步骤2中的引物设计示意图；

图5为测试验证的步骤2中的PCR产物的凝胶电泳图；

图6为测序验证的步骤3中的纯合子小鼠的5’端的Knockin结果；

图7为测序验证的步骤3中的纯合子小鼠的3’端的Knockin结果；

图8为IFNAR2小鼠中人IFNAR2的胞外结构域的表达情况；

图9为IFNAR2小鼠在受人干扰素刺激后的MX1基因在肝脏、血液及脾脏中的表达情况；

图10为IFNAR2小鼠在受人干扰素刺激后的ISG15基因在肝脏、血液及脾脏中的表达情况。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以多种形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

干扰素是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒功能的活性蛋白，其活性的发挥受细胞基因的调节和控制。干扰素包括I型干扰素和II型干扰素。I型干扰素有IFN-α和IFN-β，其中IFN-α有二十余个亚型，IFN-β仅有一个亚型。在体内，与IFN-a和IFN-β结合的受体为I型干扰素受体(interferon a/βreceptor，IFNAR)。IFNAR含有a和β两个亚单位，分别被称为I型干扰素受体1(interferon alpha receptor 1，IFNAR1)和I型干扰素受体2(interferonalpha/beta receptor2，IFNAR2)，IFNAR1和IFNAR2的结构均包括用于胞外结构域、跨膜区及胞内结构域。

请参阅图1，本发明一实施方式提供了一种小鼠模型的构建方法，该构建方法包括步骤a～步骤b：

步骤a：利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术，在野生型小鼠的I型干扰素受体基因上，敲入表达基因，制备经基因修饰的受精卵。

具体地，表达基因包括第一功能区、第二功能区和连接区。

第一功能区包括编码人I型干扰素受体1的胞外结构域的核酸片段、和编码小鼠I型干扰素受体1的跨膜结构域的核酸片段和编码小鼠I型干扰素受体1的胞内结构域的核酸片段，第一功能区用于表达人I型干扰素受体1的胞外结构域、小鼠I型干扰素受体1的跨膜结构域和小鼠I型干扰素受体1的胞内结构域。

可选地，在第一功能区，编码人I型干扰素受体1的胞外结构域的核酸片段、编码小鼠I型干扰素受体1的跨膜结构域的核酸片段和编码小鼠I型干扰素受体1的胞内结构域的核酸片段顺次连接。

在本实施方式中，编码人I型干扰素受体1的胞外结构域的核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码小鼠I型干扰素受体1的跨膜结构域的核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；编码小鼠I型干扰素受体1的胞内结构域的核酸片段的核苷酸序列如SEQID NO.7所示。

第二功能区包括编码人I型干扰素受体2的胞外结构域的核酸片段、编码小鼠I型干扰素受体2的跨膜结构域的核酸片段、编码小鼠I型干扰素受体2的胞内结构域的核酸片段及转录终止子，第二功能区用于表达人I型干扰素受体2的胞外结构域、小鼠I型干扰素受体2的跨膜结构域和小鼠I型干扰素受体2的胞内结构域。

可选地，在第二功能区，编码人I型干扰素受体2的胞外结构域的核酸片段、编码小鼠I型干扰素受体2的跨膜结构域的核酸片段、编码小鼠I型干扰素受体2的胞内结构域的核酸片段及转录终止子顺次连接。终止子用于停止转录。可选地，终止子为polyA。

在本实施方式中，编码人I型干扰素受体2的胞外结构域的核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；编码小鼠I型干扰素受体2的跨膜结构域的核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；编码小鼠I型干扰素受体2的胞内结构域的核酸片段的核苷酸序列如SEQID NO.10所示；终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

连接区包括编码具有自剪切功能的蛋白的核酸片段，用于连接第一功能区与第二功能区。可选地，连接区包括编码2A肽的核酸片段。在一个具体示例中，编码2A肽的核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示

更具体地，制备经基因修饰的受精卵的步骤a1～步骤a3：

步骤a1：根据靶位点，构建含有表达基因的同源重组载体。

具体地，靶位点位于小鼠I型干扰素受体基因上。可选地，靶位点位于I型干扰素2基因上。

在本实施方式中，靶位点位于I型干扰素受体2(IFNAR2)基因上的第二个外显子的起始密码子之后的区域。在一个具体示例中，靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。当然，在其他实施方式中，靶位点不限于上述，还可以位于小鼠的I型干扰素受体基因的其他位置。只要能够使得在表达基因敲入后能表达人鼠I型干扰素嵌合受体(人I型干扰素受体2胞外结构域-小鼠I型干扰素受体2跨膜结构域-小鼠I型干扰素受体2胞内结构域，和人I型干扰素受体1胞外结构域-小鼠I型干扰素受体1跨膜结构域-小鼠I型干扰素受体1胞内结构域，形成的人鼠I型干扰素嵌合受体)，且不会表达小鼠I型干扰素受体即可。

具体地，含有表达基因的同源重组载体包括两个同源臂和位于同源臂之间的上述表达基因。同源臂用于与靶位点同源重组。同源臂根据靶位点设计。在本实施方式中，同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示。

构建含有表达基因的同源重组载体的步骤包括：将上述同源臂和上述表达基因插入空载，制备含有表达基因的同源重组载体。

步骤a2：根据靶位点设计gRNA。

本实施方式中，靶位点靠近IFNAR2基因的第二个外显子，靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。因此，本实施方式中的gRNA是根据序列如SEQ ID NO.1的靶位点设计，其中PAM序列为5’-CGG-3’。可选地，gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

当然，在其他实施方式中，gRNA的核苷酸序列不限于上述，还可以是其他。

步骤a3：将同源重组载体、gRNA和Cas9蛋白导入I型干扰素受体缺陷型小鼠的受精卵中，制备含有表达基因的受精卵。

具体地，在gRNA的引导下，Cas9蛋白到达靶位点，并断裂靶位点的双链DNA，同时细胞的修复机制使得同源重组载体上的同源臂与靶位点断裂后形成的两个片段发生同源重组，从而使得表达基因连接到靶位点的连接处，实现表达基因敲入靶位点。

在本实施方式中，野生型小鼠采用C57BL/6小鼠。C57BL/6小鼠品系稳定且易于繁殖，而且还是第一个完成基因组测序的小鼠品系，遗传纯净，应用于基因敲除时，能保证遗传背景上的高度稳定性。

请参阅图2和图3，表达基因表达形成的人鼠I型干扰素嵌合受体(参阅图2)，与野生型小鼠I型干扰素受体的结构(参阅图3)相比，人鼠I型干扰素嵌合受体的胞外结构域为人干扰素受体的胞外结构域。

步骤b：培育含有表达基因的受精卵，制备小鼠模型。

具体地，培育经基因修饰的受精卵，制备小鼠模型的步骤包括步骤b1～b2：步骤b1：培养含有表达基因的受精卵，制得F0代小鼠。

将受精卵转入代孕小鼠体内后培养，得到F0代小鼠。

步骤b2：对F0代小鼠进行纯合子筛选，制备小鼠模型。

具体地，通过对F0代小鼠进行纯合子筛选，得到能够将形状稳定遗传的纯合子小鼠。

可选地，采用经典育种与PCR鉴定相结合的方法进行纯合子的筛选。具体地，将F0代小鼠与野生型小鼠配种繁殖产生F1代小鼠，并通过PCR鉴定出F1代小鼠中的阳性小鼠。然后通过F1代中阳性小鼠的同胞交配产生F2代小鼠。在F2代小鼠中选择数对阳性鼠同胞交配产生F3代小鼠。根据各窝鼠的整合率及PCR测序结果，选出纯合子小鼠。

上述小鼠模型的构建方法至少具有如下优点：

通过CRISPR/Cas9介导的同源重组技术，使得在小鼠中表达人I型干扰素受体的胞外结构域，且保留了小鼠I型干扰素受体的跨膜区结构域和胞内结构域，从而使得构建得到的小鼠能够正确识别人干扰素并诱导小鼠的下游基因的应答。与传统的肝脏人源化小鼠模型相比，上述小鼠模型的构建方法的成本低，且构建的小鼠模型能应答人干扰素的刺激；与传统的转基因小鼠模型相比，上述小鼠模型构建的小鼠模型的I型干扰素受体失活，不会干扰人I型干扰素受体识别人干扰素，可以反映人I型干扰素受体的天然表达方式。与传统的亲源性较远的其他动物模型相比，小鼠模型与人的亲源性更近，更能反应出人干扰素在体内的作用效果。

本发明一实施方式提供了一种表达基因，该表达基因用于表达形成人鼠I型干扰素嵌合受体。也即是，表达基因用于表达人I型干扰素受体1的胞外结构域、小鼠I型干扰素受体1的跨膜结构域和小鼠I型干扰素受体1的胞内结构域，和表达人I型干扰素受体2的胞外结构域、小鼠I型干扰素受体2的跨膜结构域和小鼠I型干扰素受体2的胞内结构域，从而形成人鼠I型干扰素嵌合受体。表达基因的具体组成如上文所述。

此外，本发明一实施方式还提供了一种用于构建小鼠模型的试剂盒，该试剂盒与上述小鼠模型的构建方法相对应，也即是，该试剂盒可用于构建上述小鼠模型。具体地，该试剂盒包括：同源重组载体和gRNA。

具体地，同源重组载体包括两个同源臂和位于两个同源臂之间的表达基因。同源臂的设计和表达基因如上述，此处不再赘述。

在一些实施例中，上述试剂盒还包括Cas9蛋白。

上述用于构建小鼠模型的试剂盒简便，使用该试剂盒制得的小鼠模型能够真实反映人干扰素受体的天然表达方式和正常应答人干扰素的刺激。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。

实施例1

Hu-IFNAR2小鼠的转基因策略示意图如图1所示，具体包括如下步骤。

(1)构建同源重组载体：将包含两个同源臂和位于两个同源臂之间的表达基因插入空载体中，制备同源重组载体。其中：空载体为常规的T载体(pUC-57)，同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示，表达基因由顺次连接的编码人I型干扰素受体1的胞外结构域的核酸片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)、编码小鼠I型干扰素受体1的跨膜结构域的核酸片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)、编码小鼠I型干扰素受体1的胞内结构域的核酸片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)、编码2A肽的核酸片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)、编码人I型干扰素受体2的胞外结构域的核酸片段(核苷酸序列如SEQID NO.8所示)、编码小鼠I型干扰素受体2的跨膜结构域的核酸(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)、编码小鼠I型干扰素受体2的胞内结构域的核酸片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)及转录终止子(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)。

(2)在体外，将同源重组载体、gRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)和Cas9蛋白导入小鼠C57BL/6J的受精卵中，制备含有表达基因的受精卵。

(3)将受精卵转入体内后培养，得到F0代小鼠。

(4)将F0代小鼠与野生型小鼠配种繁殖产生F1代小鼠，并通过PCR鉴定出F1代小鼠中的阳性小鼠。然后通过F1代中阳性小鼠的同胞交配产生F2代小鼠。在F2代小鼠中选择数对阳性鼠同胞交配产生F3代小鼠。根据各窝鼠的整合率及PCR测序结果，选出纯合小鼠。

测试验证

1.提取纯合子小鼠(下文或称IFNAR2小鼠)、杂合子小鼠及野生型小鼠(WT小鼠)的DNA，确认纯合子小鼠的敲入位置：

步骤1：采用组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技)提取纯合子小鼠的DNA，三种类型的小鼠的操作均包括：1)取小鼠肌肉组织20mg，使用研磨器处理为细胞悬液，然后10000rpm(～11200×g)离心1min，倒尽上清，加200μL缓冲液GA；振荡至彻底悬浮；2)加入20uL Proteinase K混匀后，在56℃放置，直至组织溶解；3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液变清亮；4)加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，可见管内出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，12000rpm(～13400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；6)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW(使用前加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；8)重复操作步骤7)；9)将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；10)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL无RNA酶水，室温放置3min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管。

步骤2：PCR扩增待测序的DNA片段：

首先，利用PCR技术从提取的DNA中扩增出不同插入片段(5’端、3’端和全序列，具体示意图如图4所示，如4中“Knock in fragment”指表达基因)，PCR引物信息如下表1所示。

表1

然后，利用

Taq 2×Mix试剂盒(NEB,M0287S)扩增相应DNA片段。其中，扩增体系如表2所示，PCR扩增程序为：预变性94℃5分钟；变性94℃30秒；退火65℃30秒；延伸72℃(引物序号为①和②的反应体系的延伸时间为3分钟，引物序号为③的反应体系的延伸时间为5分钟)；循环数为30次。

表2

最后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示。野生型(Wildtype,WT)、纯合子(Homozygous，Homo)与杂合子(Heterozygous，Heter)已在图中标出)。

由图5可知，纯合子小鼠构建成功，并证明该基因修饰的纯合子小鼠可以正常繁殖。

步骤3：琼脂糖凝胶DNA回收：利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技)回收PCR产物，具体操作包括：1)柱平衡：向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中，称取重量；3)向胶块中加入等倍体积溶液PN溶胶液(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μL，则加入100μL PN溶胶液)，50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；4)将上一步所得溶液加入到一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；5)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；6)重复操作步骤5)；7)将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干；8)将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL无RNA酶水，室温放置2min。12000rpm离心2min收集DNA溶液。

步骤4：将回收的产物送测，结果如图6～图7所示。图6是纯合子小鼠的5’端的Knock in结果，图7是纯合子小鼠的3’端的Knock in结果。

由图6和图7可知，纯合子的Knock in正确。

2.对纯合子小鼠(IFNAR2小鼠)中人IFNAR2的胞外结构域的表达情况：

利用组织总RNA提取试剂盒(天根生化科技)提取纯合子小鼠和WT小鼠的肝组织RNA，具体操作包括：

1)分别取IFNAR2小鼠和WT小鼠肝组织各约20g，用研磨杵将组织彻底研磨，加300μL裂解液RL(含1％β-巯基乙醇)，随后向匀浆液中加入590μL RNase-Free ddH₂O和10μLProteinase K，混匀后56℃处理20min；2)12000rpm离心5min，取上清，缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱中，12000rpm离心60s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；3)向吸附柱中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心360s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；4)向吸附柱中央加入80μL的DNase I工作液(DNaseI工作液的配制：取10μL DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μL RDD缓冲液，轻柔混匀)，室温放置15min；5)向吸附柱中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心60s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；6)向吸附柱中加入500μL漂洗液RW，室温静置2min，12000rpm离心60s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；7)重复步骤6)；8)12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；9)将吸附柱转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL RNase-FreeddH2O，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到RNA溶液。

2)对纯合子小鼠(IFNAR2小鼠)中人IFNAR2的RNA的水平进行检测，具体步骤包括：

a.利用RNA提取试剂盒提取IFNAR2及WT小鼠肝脏RNA；

b.将各RNA分别逆转录为cDNA；

c.采用Bio-rad SYBR检测试剂进行检测。其中人IFNAR2的引物序列为F：CACAAGCCTGAGATCAAG(SEQ ID NO.19)，R：TAGACAGAGACACAGTAGTT(SEQ ID NO.20)。结果如图8所示，在图8中，纵坐标为人IFNAR2基因表达倍数。

由图8可知，人IFNAR2在纯合子小鼠体内表达。

3.纯合子小鼠(IFNAR2小鼠)中人IFNAR2受体的功能鉴定：

(1)纯合子小鼠经皮下注射干扰素PEG-IFNa2a(商品名：派罗欣，罗氏公司)，注射剂量按照10ug/kg进行，注射16小时后，小鼠经安乐死，收集血液和各个脏器。

(2)利用RNA提取试剂盒提取IFNAR2小鼠的血液、肝脏及脾脏的RNA。

(3)将各RNA分别逆转录为cDNA。

(4)采用Bio-rad SYBR检测试剂进行检测。其中：MX1基因和ISG15基因为目标基因，MX1基因的上游引物为：AAGATGGTCCAAACTGCCTTCG(SEQ ID NO.21)；MX1基因的下游引物：GCCTTGGTCTTCTCTTTCTCAGC(SEQ ID NO.22)；ISG15基因的上游引物：AACTGCAGCGAGCCTCTGA(SEQ ID NO.23)；ISG15基因的下游引物：CACCTTCTTCTTAAGCGTGTCTACAG(SEQ ID NO.24)，GAPDH(上游引物：AGGTCGGTGTGAACGGATTTG(SEQ ID NO.25)；下游引物：TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA(SEQ ID NO.26))为内参基因。RT-qPCR的反应液体系如下：

RT-qPCR反应体系如下：预变性95℃3min；变性95℃30s；退火60℃；30s；延伸65℃30s；35个循环。

结果如图9和图10所示，图9是人干扰素刺激后IFNAR2小鼠体内MX1基因在肝脏(liver)、血液(blood)及脾脏(spleen)中的表达情况，图10是人干扰素刺激后IFNAR2小鼠体内ISG15基因在肝脏(liver)、血液(blood)及脾脏(spleen)中的表达情况。在图9中，纵坐标为MX1基因表达倍数，图10中，纵坐标为ISG15基因表达倍数。

由图9和图10可知，实施例1构建的IFNAR2小鼠在人干扰素的刺激下，可以激活小鼠下游基因的应答，也即是能正常应答人干扰素的刺激。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州市第八人民医院

广州福榕生物科技有限公司

<120> 表达基因、经基因修饰的受精卵的构建方法和小鼠模型的构建方法

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agctgagcag gatgcgttca 20

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agctgagcag gatgcgttca cgg 23

<210> 3

<211> 304

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caaacttgct atgtagccga ggatgacctt gaatgcctga cctttccccc acctctctgc 60

ttagaggaca gatgtgacac gcacagtaaa ctcatgcaag tttaacccta atcctaacca 120

atccagggct accacggggc cgcatctgca gctaaatctg gctcgttctt actcgtctct 180

cgttagcgtg tatgtgtcta tcatgtaaat tacaatataa ttgggtgctt ctgagttttg 240

accaactcaa tattgatctc tttcaggtgt gagagcagaa aaacggactt aagagctgag 300

cagg 304

<210> 4

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttgtgggtaa gggctacttc tcagcacagc ccttagagga gaaagcctct gtttctgtca 60

tcacagagag ccctggtgtg gagcagcaca ctgatgtcca tatctggaga acccagatca 120

gcacggccag catcaggcac cccacggggg tcttcccctt cattttagct aagccagaat 180

aatataggct acagccatat tcaggaaacg gccttgttta taattcaaag ggttgcggct 240

ctgcacaccc tgaatctcac gcccggtggc gtttagaagg tggccatccc tttatctctt 300

cccatataaa ctaacttgaa aaatccatcc ctacacattg atttatactc ttcctttctt 360

tttagccctt atcttttcta tatctgtatt tcttcacgtc ctttctgttc cttcctctga 420

<210> 5

<211> 1296

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgatggtgg tgctgctggg cgccaccacc ctggtgctgg tggctgtggc cccatgggtg 60

ctgtctgctg ctgctggcgg caagaacctg aagtcccccc agaaggtgga ggtggacatc 120

attgatgaca acttcatcct gaggtggaac aggtctgatg agtctgtggg caatgtgacc 180

ttctcctttg actaccagaa gacaggcatg gacaactgga tcaagctgtc tggctgccag 240

aacatcacct ccaccaagtg caacttctcc tccctgaaac tgaatgtcta tgaggagatc 300

aagctgagga tcagggctga gaaggagaac acctcctcct ggtatgaggt ggactccttc 360

accccattcc gcaaggccca gattggcccc cctgaagtgc atctggaggc tgaggacaag 420

gccattgtga tccacatctc ccctggcacc aaggactctg tgatgtgggc tctggatggc 480

ctgtccttca cctactccct ggtgatctgg aagaactcct ctggcgtgga ggagaggatt 540

gagaacatct actccaggca caagatctac aagctgtccc ctgagaccac ctactgcctg 600

aaggtgaagg ctgccctgct gacctcctgg aagattggcg tctactcccc tgtgcactgc 660

atcaagacca cagtggagaa tgagctgccc ccccctgaga acattgaggt ctctgtgcag 720

aaccagaact atgtgctgaa gtgggactac acctatgcca acatgacctt ccaagtgcag 780

tggctgcatg ccttcctgaa gaggaaccct ggcaaccatc tgtacaagtg gaagcagatc 840

cctgactgtg agaatgtgaa gaccacccag tgtgtcttcc cccaaaatgt cttccagaag 900

ggcatctacc tgctgagggt gcaggcctct gatggcaaca acacctcctt ctggtctgag 960

gagatcaagt ttgacacaga gatccaggcc ttcctgctgc cccctgtctt caacatccgc 1020

tccctgtctg actccttcca catctacatt ggcgccccca agcagtctgg caacacccct 1080

gtgatccagg actaccccct gatctatgag atcatcttct gggagaacac ctccaatgct 1140

gagaggaaga tcattgagaa gaagacagat gtgacagtgc ccaacctgaa gcccctgaca 1200

gtctactgtg tgaaggccag ggctcacacc atggatgaga agctgaacaa gtcctctgtc 1260

ttctctgatg ctgtctgtga gaagaccaag cctggc 1296

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tccttctcca ccatctggat catcaccggc ctgggcgtgg tcttc 45

<210> 7

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttctctgtga tggtgctgta tgccctgagg tctgtctgga agtacctgtg ccatgtctgc 60

ttcccccccc tgaaaccccc ccgctccatt gatgagttct tctctgagcc cccatccaag 120

aacctggtgc tgctgacagc tgaggagcac acagagcgct gcttcatcat tgagaacaca 180

gacacagtgg ctgtggaggt gaagcatgcc cctgaggagg acctgaggaa gtactcctcc 240

cagacctccc aagactctgg caactactcc aatgaggagg aggagtctgt gggcacagag 300

tctggccagg ctgtgctgtc caaggcccca tgtggcggcc catgctctgt gccatccccc 360

cctggcaccc tggaggatgg cacctgcttc ctgggcaatg agaagtacct gcagtcccct 420

gccctgagga cagagcctgc cctgctgtgc 450

<210> 8

<211> 693

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgctgctgt cccagaatgc cttcatcttc cgctccctga acctggtgct gatggtctac 60

atctccctgg tctttggcat ctcctatgac tcccctgact acacagatga gtcctgcacc 120

ttcaagatct ccctgaggaa cttcaggtcc atcctgtcct gggagctgaa gaaccactcc 180

attgtgccca cccactacac cctgctgtac accatcatgt ccaagcctga ggacctgaag 240

gtggtgaaga actgtgccaa caccaccagg tccttctgtg acctgaccga tgagtggagg 300

tccacccatg aggcctatgt gacagtgctg gagggcttct ctggcaacac caccctgttc 360

tcctgctccc acaacttctg gctggccatt gacatgtcct ttgagccccc tgagtttgag 420

attgtgggct tcaccaacca catcaatgtg atggtgaagt tcccatccat tgtggaggag 480

gagctgcagt ttgacctgtc cctggtgatt gaggagcagt ctgagggcat tgtgaagaag 540

cacaagcctg agatcaaggg caacatgtct ggcaacttca cctacatcat tgacaagctg 600

atccccaaca ccaactactg tgtctctgtc tacctggagc actctgatga gcaggctgtg 660

atcaagtccc ccctgaagtg caccctgctg ccc 693

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctggccagg agtctgagtc tgctgagtct gccattgtgg gcatc 45

<210> 10

<211> 801

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

accacctcct gcctggtggt gatggtcttt gtctccacca ttgtgatgct gaagaggatt 60

ggctacatct gcctgaagga caacctgccc aatgtgctga acttcaggca cttcctgacc 120

tggatcatcc ctgagaggtc cccatctgag gccattgaca ggctggagat catccccacc 180

aacaagaaga agaggctgtg gaactatgac tatgaggatg gctctgactc tgatgaggag 240

gtgcccacag cctctgtgac aggctacacc atgcatggcc tgacaggcaa gcccctgcag 300

cagacctctg acacctctgc ctcccctgag gaccccctgc atgaggagga ctctggcgct 360

gaggagtctg atgaggctgg cgctggcgct ggcgctgagc ctgagctgcc cacagaggct 420

ggcgctggcc catctgagga ccccacaggc ccatatgaga ggaggaagtc tgtgctggag 480

gactccttcc ccagggagga caactcctcc atggatgagc ctggcgacaa catcatcttc 540

aatgtgaacc tgaactctgt cttcctgagg gtgctgcatg atgaggatgc ctctgagacc 600

ctgtccctgg aggaggacac catcctgctg gatgagggtc cccagaggac agagtctgac 660

ctgaggattg ctggcggcga caggacccag ccccccctgc catccctgcc atcccaagac 720

ctgtggacag aggatggctc ctctgagaag tctgacacct ctgactctga tgctgatgtg 780

ggcgatggct acatcatgag g 801

<210> 11

<211> 537

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

actcctcagg tgcaggctgc ctatcagaag gtggtggctg gtgtggccaa tgccctggct 60

cacaaatacc actgagatct ttttccctct gccaaaaatt atggggacat catgaagccc 120

cttgagcatc tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg 180

aattttttgt gtctctcact cggaaggaca tatgggaggg caaatcattt aaaacatcag 240

aatgagtatt tggtttagag tttggcaaca tatgcccata tgctggctgc catgaacaaa 300

ggttggctat aaagaggtca tcagtatatg aaacagcccc ctgctgtcca ttccttattc 360

catagaaaag ccttgacttg aggttagatt ttttttatat tttgttttgt gttatttttt 420

tctttaacat ccctaaaatt ttccttacat gttttactag ccagattttt cctcctctcc 480

tgactactcc cagtcatagc tgtccctctt ctcttatgga gatccctcga cctgcag 537

<210> 12

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggctctggcg ccaccaactt ctccctgctg aagcaggctg gcgatgtgga ggagaaccct 60

gggccc 66

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggtggctacc gtaatgtcgg ta 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agcctccaga tgcacttcag gg 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tggacaactg gatcaagctg tc 22

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggcccagact gtcaacatta ctct 24

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cttagaggac agatgtgaca cgc 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gacatcagtg tgctgctcca cac 23

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cacaagcctg agatcaag 18

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tagacagaga cacagtagtt 20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aagatggtcc aaactgcctt cg 22

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gccttggtct tctctttctc agc 23

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aactgcagcg agcctctga 19

<210> 24

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

caccttcttc ttaagcgtgt ctacag 26

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aggtcggtgt gaacggattt g 21

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tgtagaccat gtagttgagg tca 23

Claims

1.一种经基因修饰的受精卵的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述制备经基因修饰的受精卵的步骤包括：

根据靶位点，构建含有表达基因的同源重组载体，所述靶位点位于所述野生型小鼠的I型干扰素受体基因上；

根据所述靶位点设计gRNA；及

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述靶位点位于小鼠的IFNAR2基因上的第二个外显子的起始密码子之后的区域。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述靶位点的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；

及/或，所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

5.根据权利要求1～4任一项所述的构建方法，其特征在于，所述野生型小鼠为C57BL/6J小鼠。

6.一种表达基因，其特征在于，包括：

7.一种小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用权利要求1～5任一项所述的经基因修饰的受精卵的构建方法，构建经基因修饰的受精卵；

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，在将经基因修饰的受精卵移植到代孕小鼠中的步骤之后，还包括：

饲养所述代孕小鼠，制得F0代小鼠；及

对所述F0代小鼠进行纯合子筛选，得到小鼠模型。

9.一种构建小鼠模型的试剂盒，其特征在于，包括：

gRNA，根据所述靶位点设计。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述靶位点的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；

及/或，所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；