CN112639082A - 成纤维细胞的制备方法及g-csf阳性成纤维细胞群 - Google Patents

Abstract

提供制备CD106阳性和/或CD90阳性成纤维细胞的方法。此外，提供G‑CSF阳性成纤维细胞群。一种制备CD106阳性和/或CD90阳性成纤维细胞的方法，所述方法包括在选自于由TNF‑α和IL‑4组成的组中的一种以上的存在下培养成纤维细胞以使CD106阳性和/或CD90阳性成纤维细胞增加的步骤。

Description

成纤维细胞的制备方法及G-CSF阳性成纤维细胞群

技术领域

本发明主要涉及CD106阳性和/或CD90阳性成纤维细胞(線維芽細胞)的制备方法，还涉及包含该成纤维细胞的心脏病治疗用药物组合物。此外，涉及包含G-CSF阳性成纤维细胞的细胞群。

背景技术

成纤维细胞是存在于生物体的各种器官中的间质细胞的一种。根据器官、组织的炎症、损伤，进行生长因子、细胞因子的分泌以及细胞外基质的产生和分解，通过多种细胞间相互作用调节器官、组织的功能，起到维持微环境稳态的作用。另一方面，在纤维化、癌等疾病中，成纤维细胞也具有维持病态微环境而使疾病进展的一面。通常，已知成纤维细胞是保留大量细胞质突起的纺锤形细胞，但是已知成纤维细胞表达的基因、蛋白质根据其所定位的各器官而显著不同(参见非专利文献1)。

关于成纤维细胞，本发明人等先前发现，使用血管细胞粘附分子-1(Vascularcell adhesion molecule-1，VCAM-1，CD106)阳性成纤维细胞，可得到功能性心脏细胞片(参见专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2016/006262号

专利文献2：国际公开第2018/155651号

非专利文献

非专利文献1：Chang,H.Y.et al.Diversity,topographic differentiation,andpositional memory in human fibroblasts.Proc.Natl.Acad.Sci.99,12877-12882(2002)

发明内容

发明要解决的技术问题

在专利文献1中，为了得到足够细胞数的CD106阳性成纤维细胞，使用以CD106为标志物的细胞分选等方法。然而，取决于成纤维细胞，存在CD106阳性成纤维细胞的量(细胞数)非常少这样的问题。

另一方面，本发明人等开发了用于治疗心脏病的注射剂，并已经提交了专利申请(参见专利文献2)。此时，发现作为注射剂有效的成纤维细胞除了CD106阳性以外，还优选为CD90阳性。

本发明的课题是提供一种制备CD106阳性和/或CD90阳性成纤维细胞的新方法。

解决技术问题的技术手段

本发明人等为了解决上述课题而进行了研究，发现通过在选自于由作为诱发肿瘤出血性坏死的因子而已知的TNF-α(肿瘤坏死因子-α，Tumor Necrosis Factor-α)和已知具有过敏诱发作用等的IL-4(白介素-4，Interleukin-4)组成的组中的一种以上的存在下培养成纤维细胞，CD106阳性和/或CD90阳性成纤维细胞增加，从而完成了本发明。

本发明包括以下第一方面(发明A)。

(A1)一种制备CD106阳性和/或CD90阳性成纤维细胞的方法，所述方法包括在选自于由TNF-α和IL-4组成的组中的一种以上的存在下培养成纤维细胞以使CD106阳性和/或CD90阳性成纤维细胞增加的步骤。

(A2)如(A1)所述的方法，其中，培养的成纤维细胞是从成体得到的成纤维细胞。

(A3)如(A1)或(A2)所述的方法，其中，所述CD106阳性和/或CD90阳性成纤维细胞为CD106阳性和CD90阳性。

(A4)如(A1)～(A3)中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括浓缩CD106阳性和/或CD90阳性成纤维细胞的步骤。

(A5)如(A4)所述的方法，其中，使用抗CD106抗体和/或抗CD90抗体进行所述浓缩。

此外，本发明包括以下第二方面(发明B)。

(B1)一种包含成纤维细胞的细胞群，所述成纤维细胞包含CD106阳性成体成纤维细胞。

(B2)如(B1)所述的细胞群，其中，相对于成纤维细胞，CD106阳性成体成纤维细胞的比例(细胞数)为3.36％以上，优选为5％以上，更优选所述成纤维细胞的7％以上为CD90阳性、CD106阳性且G-CSF阳性。

(B3)如(B1)或(B2)所述的细胞群，其中，所述成体成纤维细胞为CD106阳性且CD90阳性。

(B4)如(B1)～(B3)中任一项所述的细胞群，其中，所述成体成纤维细胞是利用TNF-α和/或IL-4进行刺激的成体成纤维细胞。

(B5)一种药物组合物，所述药物组合物含有如(B1)～(B4)中任一项所述的细胞群和药学上可接受的赋形剂。

(B6)如(B5)所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为缺血性心脏病治疗药。

(B7)如(B5)或(B6)所述的药物组合物，其中，所述药物组合物用于对成体成纤维细胞所来源的器官进行给药。

本发明包括以下第三方面(发明C)。

(C1)一种制备G-CSF阳性成纤维细胞的方法，所述方法包括在选自于由TNF-α和IL-4组成的组中的一种以上的存在下培养成纤维细胞以使G-CSF的表达量提高并使G-CSF阳性成纤维细胞增加的步骤。

(C2)如(C1)所述的方法，其中，培养的成纤维细胞是从成体得到的成纤维细胞。

(C3)如(C1)或(C2)所述的方法，其中，所述方法还包括在所述培养后浓缩G-CSF阳性成纤维细胞的步骤。

(C4)如(C1)～(C3)中任一项所述的方法，其中，所述浓缩包括用抗CD106抗体和/或抗CD90抗体进行分选的步骤。

(C5)一种细胞群，所述细胞群包含分离的CD106阳性和G-CSF阳性成纤维细胞。

(C6)如(C5)所述的细胞群，其中，相对于成纤维细胞，G-CSF阳性成纤维细胞的比例(细胞数)为6.75％以上。

本发明还包括以下方面(发明D)。

(D1)一种用于治疗心脏病的注射用组合物，所述注射用组合物包含G-CSF阳性成纤维细胞。

(D2)如(D1)所述的注射用组合物，其中，所述注射用组合物中，相对于成纤维细胞，G-CSF阳性成纤维细胞的比例(细胞数)为6.75％以上。

(D3)一种治疗心脏病的方法，所述方法包括以下步骤：

准备包含G-CSF阳性成纤维细胞的成纤维细胞群的步骤；

将所述成纤维细胞群注射到坏死的心脏组织区域或其周围和/或注入冠状动脉内的步骤。

(D4)如(D3)所述的方法，其中，所述成纤维细胞群中，相对于成纤维细胞，G-CSF阳性成纤维细胞的比例(细胞数)为6.75％以上。

有益效果

通过本发明，可提供制备CD106阳性和/或CD90阳性成纤维细胞的新方法。进一步地，可以提供G-CSF阳性成纤维细胞群。

附图说明

[图1]添加TNF-α的成体心脏来源的成纤维细胞的流式细胞术分析图。

[图2](A)是添加IL-4的成体心脏来源的成纤维细胞的流式细胞术分析图。分别地，(B)是示出了根据IL-4浓度的成体心脏来源的成纤维细胞的CD106阳性细胞的比例(％)(N＝3)的图；(C)是示出了根据IL-4浓度的成体心脏来源的成纤维细胞的CD90阳性细胞的比例(％)(N＝3)的图；(D)是示出了根据IL-4浓度的成体心脏来源的成纤维细胞的CD106阳性和CD90阳性细胞的比例(％)(N＝3)的图。

[图3-1](B)是添加TNF-α和IL-4两种试剂的成体心脏来源的成纤维细胞的流式细胞术分析图。另外，(A)为对照，两者均未添加。

[图3-2]在TNF-α和IL-4的添加浓度下，(A)示出了CD106阳性细胞的比例的图；(B)示出了CD90阳性细胞的比例的图；(C)示出了双阳性(DP：double positive)细胞的比例的图(N＝3)。

[图4-1](A)是添加TNF-α(50ng/mL)和IL-4(2ng/mL)得到的胎儿心脏来源的成纤维细胞(F-HCF)和iPS心肌细胞部分(フラクション)来源的成纤维细胞(i-HCF)的流式细胞术分析图。对照示出了未添加TNF-α(50ng/mL)和IL-4(2ng/mL)的F-HCF和i-HCF的流式细胞术分析图。

[图4-2](B)示出了添加TNF-α(50ng/mL)和IL-4(2ng/mL)得到的F-HCF的CD106和CD90阳性细胞的比例(％)(N＝1)。对照示出了未添加TNF-α(50ng/mL)和IL-4(2ng/mL)的F-HCF的CD106和CD90阳性细胞的比例(％)(N＝1)。(C)示出了添加TNF-α(50ng/mL)和IL-4(2ng/mL)得到的i-HCF的CD106和CD90阳性细胞的比例(％)(N＝1)。对照示出了未添加TNF-α(50ng/mL)和IL-4(2ng/mL)的i-HCF的CD106和CD90阳性细胞的比例(％)(N＝1)。

[图5](A)是胎儿心脏来源的CD106阴性成纤维细胞(F-VNCF)的流式细胞术分析图。(B)是胎儿心脏来源的CD106阳性成纤维细胞(F-VCF)的流式细胞术分析图。(C)是成体心脏来源的成纤维细胞(A-HCF)的流式细胞术分析图。(D)添加TNF-α(50ng/mL)和IL-4(2ng/mL)而培养的A-HCF(uA-HCF)的流式细胞术分析图。(E)通过荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)回收的CD106和CD90双阳性uA-HCF细胞群(uA90·106-HCF)的流式细胞术分析图。用FACS仅回收图中封闭的门(P4)的细胞。(F)示出了各种成纤维细胞中G-CSF基因表达量(通过β-肌动蛋白的FPKM而归一化(標準化)的G-CSF的FPKM)的图(F-VCF和F-VNCF为N＝3，其它为N＝2)。(G)示出了各种成纤维细胞中G-CSF基因表达量(通过β-肌动蛋白的FPKM而归一化的G-CSF的FPKM倍数增加；将F-VCF的值设为1)的图(F-VCF和F-VNCF为N＝3，其它为N＝2)。

[图6]示出了与各种心脏成纤维细胞共培养的iPS来源的心肌细胞(iPS-CM)的Ki67·心肌肌钙蛋白T(cTnT)双阳性细胞数的图(第10天，^＊＊＊P＜0.01)。uA90-HCF是指以CD90为指标进行细胞分选的CD90阳性uA-HCF细胞群；uA106-HCF是指以CD106为指标进行细胞分选的CD106阳性uA-HCF细胞群。另外，将与A-HCF共培养的iPS-CM的Ki67·cTnT双阳性细胞数设为1(N＝3)。

[图7-1](A)给予慢性心力衰竭(慢性心不全)模型大鼠的成纤维细胞的流式细胞术分析图。(B)示出了给予慢性心力衰竭模型大鼠的成纤维细胞的CD106阳性细胞的比例、CD90阳性细胞的比例、双阳性(DP：double positive)细胞的比例的图。

[图7-2]大鼠心脏的超声心动图(M模式)(代替图片的照片)。

[图7-3](A)示出了由各种心脏成纤维细胞引起的大鼠心脏的LVEF(％)的变化的图。(B)示出了各种心脏成纤维细胞注射后4周的LVEF的增减比例的图(LVEF(4W)-LVEF(0W)，^＊＊P<0.05，A-HCF和uA-HCF给药组以N＝4实施，uA90-HCF给药组以N＝3实施)。(C)示出了由各种心脏成纤维细胞引起的大鼠心脏的LVFS(％)的变化的图。(D)示出了各种心脏成纤维细胞注射后4周的LVFS的增减比例的图(LVFS(4W)-LVFS(0W)，^＊＊P<0.05，A-HCF和uA-HCF给药组以N＝4实施，uA90-HCF给药组以N＝3实施)。

[图8](A)各种成纤维细胞的流式细胞术分析图。(B)示出了各种成纤维细胞的G-CSF阳性细胞的比例(％)的图(^＊＊＊P<0.01，N＝4)。uA90·106-HCF是通过荧光激活细胞分选(FACS)回收的CD106和CD90双阳性uA-HCF细胞群。用FACS仅回收图中封闭的门(P3)的细胞。

[图9-1]给予各种心脏成纤维细胞的大鼠慢性心力衰竭模型的超声心动图(M模式)(代替图片的照片)。

[图9-2](A)示出了由各种心脏成纤维细胞引起的慢性心力衰竭大鼠模型的LVEF(％)的变化的图(^＊＊＊＊P<0.01vs.A-HCF，^＊＊＊P<0.05vs.uA-HCF，^＊＊P<0.01vs.对照(仅给予培养基(高葡萄糖DMEM+10％新生小牛血清(NBCS))的组)；假手术组(Sham)(进行与对照和细胞给药组同样的开胸手术，但未实施缺血-再灌注处理的假手术组)以N＝6实施，对照以N＝4实施，A-HCF给药组以N＝7实施，uA-HCF给药组以N＝8实施，uA90-HCF给药组以N＝9实施)。(B)示出了各种心脏成纤维细胞注射18周后的LVEF的增减差的图(LVEF(18W)-LVEF(0W)，^＊＊＊＊P<0.01vs.A-HCF，^＊＊＊P<0.01vs.uA-HCF，^＊＊P<0.01vs.对照，^＊P<0.05vs.对照)。(C)示出了由各种心脏成纤维细胞引起的慢性心力衰竭大鼠模型的LVFS(％)的变化的图(^＊＊＊＊P＜0.01vs.A-HCF，^＊＊＊P＜0.05vs.uA-HCF，^＊＊P<0.01vs.对照)。(D)示出了各种心脏成纤维细胞注射后18周的LVFS的增减差的图(LVFS(18W)-LVFS(0W)，^＊＊＊＊P<0.01vs.A-HCF，^＊＊＊P<0.05vs.uA-HCF，^＊＊P<0.01vs.对照)。

具体实施方式

以下，使用具体实施方式对本发明进行详细说明，但本发明并不限定于所示的具体实施方式。

本发明的一个实施方式是制备CD106阳性(也表示为CD106+)和/或CD90阳性(也表示为CD90+)成纤维细胞的方法，所述方法包括在选自于由TNF-α和IL-4组成的组中的一种以上的存在下培养成纤维细胞以使CD106阳性和/或CD90阳性成纤维细胞增加的步骤。通过在选自于由TNF-α和IL-4组成的组中的一种以上的存在下进行培养，可以制备CD106+和/或CD90+成纤维细胞增加的成纤维细胞群。

在本说明书中，“浓缩”是指总细胞数中特定细胞的数量的比率增加的细胞分离操作。然而，在本说明书中，“培养”不包括在“浓缩”中。在本说明书中，“分离”是指将某种成分与组织分离，而“纯化”是指将某种成分与至少一种以上的其它成分分离。

在本说明书中，“阳性”或“positive”是指细胞表达可检测水平的标志物。

在本说明书中，“包含/含有/含”是指也可以含有未指定的第三成分。在本说明书中，“由……组成”是指基本上不含未指定的第三成分。基本上不含以“不排除含有在制备过程中混入的技术上无法除去程度的量的第三成分”的含义而使用。

成纤维细胞是产生胶原和其它细胞外基质的一种间质细胞。成纤维细胞是在体内存在于结缔组织中并成为其主要构成成分的细胞种类。成纤维细胞可以对选自于由作为间质细胞标志物的波形蛋白和DDR2组成的组中的一种以上呈阳性。在一些实施方式中，成纤维细胞不是对心肌细胞特异性标志物心肌肌钙蛋白和α辅肌动蛋白呈阳性的细胞。在一些实施方式中，成纤维细胞不是对VE-钙粘蛋白呈阳性的细胞。例如，成纤维细胞不是血管内皮细胞。例如，成纤维细胞不是血管平滑肌细胞。成纤维细胞可以是肌成纤维细胞，或者也可以不是肌成纤维细胞。

成纤维细胞可以为心脏组织来源的成纤维细胞，例如可以为从心脏组织分离的成纤维细胞。成纤维细胞可以为从心外膜或心内膜分离的成纤维细胞。成纤维细胞可以为从胎儿心外膜或心内膜分离的成纤维细胞。成纤维细胞可以为从成体心外膜或心内膜分离的成纤维细胞。成纤维细胞可以为对选自于由波形蛋白和DDR2组成的组中的一种以上呈阳性且具有胶原产生能力的细胞。在本发明的所有实施方式中，成纤维细胞可以优选是心脏组织来源的成纤维细胞(以下有时称为“心脏成纤维细胞”)，例如可以为从心外膜或心内膜分离的成纤维细胞。

在本发明的实施方式中，可以将在生物体中分化为成纤维细胞的任何细胞用作成纤维细胞的材料。

在本发明的实施方式中，出于移植到心脏中的目的而使用的成纤维细胞可以优选为心脏组织、心外膜或心内膜来源的成纤维细胞。

在本发明的实施方式中，成纤维细胞可以为经浓缩、分离或纯化的成纤维细胞。

成纤维细胞的来源不受到限制，也可以使胚胎干细胞(ES细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞)和Muse细胞等多能干细胞、间充质干细胞等成体干细胞(体干细胞)分化而使用。此外，可以使用从动物(包括人)收集的原代细胞，也可以使用建立细胞株的细胞(株化細胞)。优选使用心外膜或心内膜来源的成纤维细胞，此外，优选为从人成体心脏得到的成纤维细胞，但不限于此。

尽管上文已经描述了成纤维细胞，但在所有实施方式中，成纤维细胞为心脏组织来源的成纤维细胞以及从心外膜或心内膜分离的成纤维细胞时是相同的。在以下实施例中，在示例性使用心脏成纤维细胞作为成纤维细胞的实验中对本发明进行说明。

CD106也称为VCAM-1(VCAM1)，是作为在血管内皮细胞等中表达的细胞粘附分子而已知的蛋白质。CD90也称为Thy-1(Thy1)，是富含糖链的糖基-磷脂酰肌醇(GPI)结合型分子，此外，在神经组织、结缔组织等各种基质细胞中表达，但在心肌细胞中不表达。因此，CD90+成纤维细胞表示不含心肌细胞。另外，这里所说的“CD90+成纤维细胞不含心肌细胞”是指允许稍微含有一些的概念，相对于全部细胞可为5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下、0.5％以下、0.1％以下、0.01％以下。

在CD106+成纤维细胞中，CD90+成纤维细胞的比例(基于细胞数)可以为1％以上，可以为10％以上，可以为20％以上，可以为30％以上，可以为40％以上，可以为50％以上，可以为60％以上，可以为70％以上，可以为80％以上，可以为90％以上，可以为95％以上，可以为98％以上，可以为100％。

成纤维细胞也可以为连接蛋白43(Connexin43)阳性(连接蛋白43+)成纤维细胞。

连接蛋白43是一种跨膜蛋白，已知其在血管表面与动脉硬化斑块一起表达，并作为心肌细胞的间隙连接而与相邻的细胞结合，传递心脏的电兴奋(電気的な興奮)。本发明人认为，通过成为连接蛋白43+，能够进行心脏组织内的电信号交换，在应用于心脏病时，使治疗效果改善。

在CD106+成纤维细胞中，连接蛋白43+成纤维细胞的比例(基于细胞数)可以为1％以上，可以为10％以上，可以为20％以上，可以为30％以上，可以为40％以上，可以为50％以上，可以为60％以上，可以为70％以上，可以为80％以上，可以为90％以上，可以为95％以上，可以为98％以上，可以为100％。

成纤维细胞与选自于由TNF-α和IL-4组成的组中的一种以上的因子(以下也简称为因子)接触的方法不受到特别限定，通常是向含有成纤维细胞的培养基中添加因子，但不限于此。在与多种因子接触的情况下，可以使其分别与成纤维细胞接触，也可以同时接触。作为使因子同时接触的方法，可以在一次混合多种因子后添加到成纤维细胞中。

在本实施方式中，由于可以在添加了因子的培养基中培养成纤维细胞，因此可以在维持成纤维细胞中的CD106和/或CD90的表达水平的状态下培养成纤维细胞。因此，可以制备具有高CD106和/或CD90表达水平的成纤维细胞。

将这些因子添加到培养基(mL)中时，TNF-α的添加量不受到特别限定，通常为0.1ng/mL以上，可以为0.5ng/mL以上，可以为1ng/mL以上，可以为10ng/mL以上。上限不受到特别限定，通常为500ng/mL以下，可以为100ng/mL以下。

此外，IL-4的添加量不受到特别限定，通常为0.1ng/mL以上，可以为0.5ng/mL以上，可以为1ng/mL以上。上限不受到特别限定，通常为10ng/mL以下，可以为5ng/mL以下，可以为1ng/mL以下。

在添加两种因子的情况下，添加的TNF-α与IL-4的比(重量比)TNF-α:IL-4通常为10000:1～1:1，也可以为50000:1～10:1。此外，可以为1:1～1:10000，也可以为1:10～1:50000。

通过进一步培养与这些因子接触的成纤维细胞，可以制备CD106+和/或CD90+成纤维细胞。

只要是在能够成为CD106+和/或CD90+或者适合于该培养的条件下，成纤维细胞的培养就不受到特别限定，可以通过已知的细胞培养方法进行。

用于培养的培养基可以根据所培养的细胞的种类等适当设定，例如可以使用DMEM、α-MEM、RPMI-1640、HFDM-1(+)等。也可以在该培养基中添加FCS、FBS等营养物质和生长因子、细胞因子、抗生素等。此外，也可以在含有TNF-α和/或IL-4的培养基中培养。

培养时间段可以根据直至达到期望的细胞数和/或直至具备期望的功能等目的来适当设定天数。例如，举出1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、2周、1个月、2个月、3个月、6个月等时间段。

培养温度可以根据所培养的细胞的种类适当设定，例如可以为10℃以上、15℃以上、20℃以上、25℃以上、30℃以上，此外可以为60℃以下、55℃以下、50℃以下、45℃以下、40℃以下。

可以通过回收步骤回收培养的成纤维细胞。回收步骤可以通过胰蛋白酶等蛋白酶剥离细胞来进行回收，也可以使用温度响应性培养皿通过温度变化剥离细胞来进行回收。此外，使用抗CD90抗体和/或抗CD106抗体，可以用自动磁性细胞分离装置(例如autoMACS)回收或浓缩，也可以用磁性细胞分离装置(例如MACS)回收或浓缩，也可以用封闭型(閉鎖型)磁性细胞分离装置(例如Prodigy)回收或浓缩，也可以用细胞分选仪(例如FACS)回收或浓缩。此外，也可以在CD90蛋白质和/或CD106蛋白质编码基因的启动子下导入耐药性基因，并用药剂进行选择。

在本实施方式的制备方法中，可以包括使用抗CD90抗体对CD90+成纤维细胞进行分选的步骤，可以包括使用抗CD106抗体对CD106+成纤维细胞进行分选的步骤，也可以同时包括这两个步骤。进行分选的步骤可以在任意时机进行。可以为与上述因子接触前，也可以为与因子接触后、培养前，还可以为培养后。

抗CD90抗体和抗CD106抗体可以使用已知的抗体，可以获得市售品来使用。通过使用抗CD90抗体和/或抗CD106抗体进行分选，可以增加成纤维细胞中的CD106+和/或CD90+成纤维细胞的比例，得到心脏病治疗效果高的CD106+和/或CD90+成纤维细胞。

通过本实施方式的CD106+和/或CD90+成纤维细胞的制备方法，得到CD106和/或CD90的表达提高的成纤维细胞，包含该成纤维细胞的成纤维细胞群是本发明的另一实施方式。特别地，对于包含CD106+和/或CD90+成体成纤维细胞的成纤维细胞的细胞群，通过利用TNF-α和/或IL-4进行刺激，CD106和/或CD90的表达提高，可适合用作药物组合物。

在细胞群中，相对于全部成纤维细胞，CD106+成纤维细胞的比例不受到特别限定，基于细胞数，可以为3.36％以上，可以为5％以上，可以为10％以上，可以为20％以上，可以为30％以上，可以为40％以上，可以为50％以上，可以为60％以上，可以为70％以上，可以为80％以上，可以为90％以上，可以为95％以上。

在细胞群中，相对于全部成纤维细胞，CD90+成纤维细胞的比例不受到特别限定，基于细胞数，可以为5％以上，可以为10％以上，可以为20％以上，可以为30％以上，可以为40％以上，可以为50％以上，可以为60％以上，可以为70％以上，可以为80％以上，可以为90％以上，可以为95％以上。

在细胞群中，相对于全部成纤维细胞，CD106+和CD90+成纤维细胞的比例不受到特别限定，基于细胞数，可以为5％以上，可以为10％以上，可以为20％以上，可以为30％以上，可以为40％以上，可以为50％以上，可以为60％以上，可以为70％以上，可以为80％以上，可以为90％以上，可以为95％以上。

此外，本发明人还发现，通过使成纤维细胞与选自于由TNF-α和IL-4组成的组中的一种以上的因子接触，可以制备G-CSF阳性成纤维细胞。

据报道，G-CSF抑制伴随心力衰竭的心肌细胞死亡并抑制心肌重塑进展(Harada,M.et al.G-CSF prevents cardiac remodeling after myocardial infarction byactivating the Jak-Stat pathway in cardiomyocytes.Nat.Med.11,305-311(2005))。此外，还阐明其促进心肌细胞的细胞增殖(Shimoji,K.et al.G-CSF Promotes theProliferation of Developing Cardiomyocytes InVivo and in Derivation from ESCsand iPSCs.Cell Stem Cell 6,227-237(2010))。

因此，作为本发明的另一实施方式是制备G-CSF阳性成纤维细胞的方法，所述方法包括：使成纤维细胞与选自于由TNF-α和IL-4组成的组中的一种以上接触的接触步骤；以及在提高G-CSF表达的条件下培养所述接触的成纤维细胞的培养步骤。

关于本实施方式的接触步骤和培养步骤等，可以引用与上述CD106+和/或CD90+成纤维细胞的制备方法有关的记载。对于所制备的G-CSF阳性成纤维细胞，使用抗CD90抗体和/或抗CD106抗体，可以用自动磁性细胞分离装置(例如autoMACS)浓缩，也可以用磁性细胞分离装置(例如MACS)浓缩，也可以用封闭型磁性细胞分离装置(例如Prodigy)浓缩，也可以用细胞分选仪(例如FACS)浓缩。此外，也可以在G-CSF蛋白质编码基因的启动子下导入耐药性基因，并用药剂进行选择。

通过本实施方式的G-CSF阳性成纤维细胞的制备方法，得到G-CSF阳性成纤维细胞，含有该G-CSF阳性成纤维细胞的成纤维细胞群也是本发明的另一实施方式，可以合适地用作药物组合物；此外，还可以适用于治疗心脏病的方法，所述方法包括将含有该G-CSF阳性成纤维细胞的细胞群注射到坏死的心脏组织区域或其周围和/或注入冠状动脉内的步骤。

在包含成纤维细胞的细胞群中，相对于全部成纤维细胞，G-CSF阳性成纤维细胞的比例不受到特别限定，基于细胞数，可以为1％以上，可以为5％以上，可以为6.75％以上，可以为10％以上，可以为20％以上，可以为30％以上，可以为40％以上，可以为50％以上，可以为60％以上，可以为70％以上，可以为80％以上，可以为90％以上，可以为95％以上。

此外，在成纤维细胞中，编码G-CSF蛋白质的基因的表达量以β-肌动蛋白归一化(標準化)的FPKM可以为0.01以上，可以为0.02以上，可以为0.03以上，可以为0.04以上，可以为0.05以上，可以为0.1以上。

此外，在成纤维细胞中，与天然(生物体)的成纤维细胞的表达水平相比，编码G-CSF蛋白质的基因的表达量可以为1.1倍以上，可以为2倍以上，可以为5倍以上，可以为10倍以上，可以为20倍以上，可以为50倍以上，可以为100倍以上，可以为200倍以上，可以为500倍以上。

此外，G-CSF阳性成纤维细胞可以对CD106和/或CD90呈阳性，成纤维细胞的比例(基于细胞数)可以为1％以上，可以为10％以上，可以为20％以上，可以为30％以上，可以为40％以上，可以为50％以上，可以为60％以上，可以为70％以上，可以为80％以上，可以为90％以上，可以为95％以上，可以为98％以上，可以为100％。

在包含成纤维细胞的细胞群中，在对CD106和/或CD90呈阳性的成纤维细胞中，G-CSF阳性成纤维细胞的比例(基于细胞数)可以为1％以上，可以为3％以上，可以为5％以上，可以为10％以上，可以为25％以上，可以为50％以上。

特别地，在包含成纤维细胞的细胞群中，基于细胞数，G-CSF阳性、CD106阳性且CD90阳性的成纤维细胞可以为1％以上，可以为5％以上，可以为7％以上，可以为10％以上，可以为20％以上，可以为30％以上，可以为40％以上，可以为50％以上，可以为60％以上，可以为70％以上，可以为80％以上，可以为90％以上，可以为95％以上，可以为98％以上，可以为100％。

除了成纤维细胞的细胞群以外，作为药物组合物的成纤维细胞的细胞群还可以含有作为药物组合物生理学上可接受的其它成分。

本实施方式的药物组合物通过应用于心脏病患者，能够改善其心脏功能。在本实施方式中，心脏病包括起因于心脏组织的失调、缺陷、功能不全等的疾病，举例示出心力衰竭、缺血性心脏病、心肌梗塞、心肌病、心肌炎、肥厚型心肌病、扩张型心肌病等，但不限于此。即，根据本发明，提供了用于改善心脏功能，例如用于在体内使心肌增殖，和/或用于改善心脏射血分数的药物组合物，所述药物组合物是包含CD106+和/或CD90+成纤维细胞或G-CSF+成纤维细胞的药物组合物。根据本发明，还提供了用于抑制心脏组织纤维化进展的药物组合物，所述药物组合物是包含CD106+和/或CD90+成纤维细胞或G-CSF+成纤维细胞的药物组合物。

CD106+和/或CD90+成纤维细胞或G-CSF+成纤维细胞分泌用于维持器官稳态的细胞因子等来调整炎症反应，所分泌的细胞因子、趋化因子等形成适合心肌组织再生的微环境，可以进行心肌细胞的增殖、心肌细胞的搏动调整。此外，CD106+和/或CD90+成纤维细胞或G-CSF+成纤维细胞可以抑制纤维化进展。

药物组合物在心脏病患者中的应用方法的一个例子是注射。

将药物组合物作为注射剂(注射用组合物)使用时，除了CD106+和/或CD90+成纤维细胞或G-CSF+成纤维细胞以外，注射剂中还可以含有其它细胞和其它成分，当含有其它细胞时，相对于注射剂中所含的成纤维细胞总量，基于细胞数，CD106+和/或CD90+成纤维细胞或G-CSF+成纤维细胞的比例可以为0.03％以上，可以为0.1％以上，可以为1％以上，可以为2％以上，可以为4％以上，可以为5％以上，可以为6.75％以上，可以为10％以上，可以为20％以上，可以为30％以上，可以为40％以上，可以为50％以上，可以为60％以上，可以为70％以上，可以为80％以上，可以为90％以上，可以为95％以上，可以为98％以上，可以为99％以上。

此外，作为注射剂时，注射剂中所含的CD106+和/或CD90+及G-CSF+成纤维细胞数可以为1×10⁶个细胞以上，可以为5×10⁶个细胞以上，可以为1×10⁷个细胞以上。

注射用组合物中所含的CD106+和/或CD90+成纤维细胞或者G-CSF+成纤维细胞可以为与其它细胞(例如心肌细胞)共培养的细胞。

注射剂可包含作为注射剂生理学上可接受的其它成分。作为这样的其它成分，举出生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、细胞保存液、细胞培养液、水凝胶、细胞外基质、冷冻保存液等。

注射剂可以通过将成体成纤维细胞注射到心脏组织中(例如坏死的心脏组织区域)或其周围和/或通过注入冠状动脉内或静脉、动脉、淋巴结、淋巴管中，来治疗心脏病。此外，作为上述成体成纤维细胞的来源，也可以通过使用心脏病患者自身的组织来进行自体移植。

此外，成纤维细胞群也可用作其它细胞的培养支架材料(培養足場材料)，也可用于形成器官或组织，例如构建平面或立体的细胞组织。成纤维细胞群可以为在共培养其它细胞(例如心肌细胞)基础上的平面或立体的组织，但即使不共培养，也可以有效地作为平面或立体的组织发挥功能。作为平面或立体的组织，例如，举例示出细胞片、细胞纤维(セルファイバー)、由3D打印机形成的组织等，但不限于此。

通过将这样的平面或立体的组织应用于坏死的心脏组织区域或者通过作为人造器官与坏死的心脏组织进行交换，可以治疗心脏病。

实施例

以下示出实施例来更详细地说明本发明，但并不由此限定本发明的范围。

<动物、细胞和试剂>

本研究中进行的所有动物实验的方案都得到了LSIメディエンス(东京，日本)的伦理审查委员会的批准。另外，对所有动物都实施了痛苦减轻措施。

细胞购自以下制造商：人成体心脏成纤维细胞(Lonza，Basel，瑞士)；人胎儿心脏成纤维细胞(Cell Applications，San Diego，CA)；人iPS细胞来源的心肌细胞(iPS-CM，マイオリッジ，京都，日本)。另外，根据与基底表面的粘附性差异，从iPS-CM中分离了人iPS细胞来源的心脏成纤维细胞。

以下抗体用于免疫荧光染色、流式细胞术分析：BV421小鼠抗人CD106抗体(BDBiosciences，San Jose，CA)；BV421小鼠IgG1；κ同种型对照(BD Biosciences)；人CD90-PE(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)；REA对照(S)-PE(Miltenyi Biotec)；小鼠单克隆抗心肌肌钙蛋白T(cTnT)(Thermo Scientific，Waltham，MA)；兔多克隆抗Ki67(Abcam，Cambridge，UK)；Hoechst33258溶液(同仁化学研究所，熊本，日本)；抗G-CSF的MsmAb(Abcam)；APC山羊抗小鼠IgG(BioLegend，San Diego，CA)。关于定位在细胞质中的蛋白质的分析，在利用荧光显微镜的分析中，将细胞在0.1％Triton-X(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)中实施细胞膜渗透处理30分钟(室温)，进行免疫荧光染色。在流式细胞术分析中，将各种成纤维细胞在0.1％皂苷(ナカライテスク，京都，日本)中实施细胞膜渗透处理15分钟(室温)，进行免疫荧光染色。

<细胞分选>

将F-VNCF(CD106阴性胎儿心脏来源的成纤维细胞)、F-VCF(CD106阳性胎儿心脏来源的成纤维细胞)和uA106-HCF(在成体心脏来源的成纤维细胞中添加TNF-α和IL-4，提高CD90和CD106阳性细胞的比例后，以CD106为指标进行细胞分选的CD106阳性成体心脏来源的成纤维细胞)用人CD106(VCAM-1)-生物素(Miltenyi Biotec)实施一次免疫染色，并用抗生物素微珠(Miltenyi Biotec)进行二次免疫染色。将uA90-HCF(在成体心脏来源的成纤维细胞中添加TNF-α和IL-4，提高CD90和CD106阳性细胞的比例后，以CD90为指标进行细胞分选的CD90阳性成体心脏来源的成纤维细胞)用人CD90-生物素(Miltenyi Biotec)实施一次免疫染色，并用抗生物素微珠(Miltenyi Biotec)进行二次免疫染色。对于染色的细胞，用autoMACS(Miltenyi Biotec)回收CD106和CD90阳性细胞。

对于CD90和CD106阳性细胞比例高的成体心脏成纤维细胞(uA90·106-HCF)，在成体心脏来源的成纤维细胞中添加TNF-α和IL-4，提高CD90和CD106阳性细胞的比例后，用BV421小鼠抗人CD106抗体(BD Biosciences，San Jose，CA)、BV421小鼠IgG1、κ同种型对照(BD Biosciences)、人CD90-PE(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)、REA对照(S)-PE(Miltenyi Biotec)实施免疫染色，采用BD FACS ARIAIII(BD Biosciences)通过细胞分选进行回收。

<流式细胞术>

将经免疫荧光染色的细胞以1.0×10⁶个细胞/试验的浓度进行制备，用流式细胞仪(MACSQuant Analyzer 10，Miltenyi Biotec)进行分析。用FSC-A和SSC-A识别细胞区域后，评价相对于各种标志物蛋白质为阳性细胞的比例(％，换算成细胞数)。

<RNA提取和mRNA测序>

采用Qiagen RNeasy Mini Kit(QIAGEN，Valencia，CA)从各种成纤维细胞中回收RNA。对于CD90和CD106阳性细胞比例高的成体心脏成纤维细胞(uA90·106-HCF)，在成体心脏来源的成纤维细胞中添加TNF-α和IL-4，提高CD90和CD106阳性细胞的比例后，用BD FACSARIAIII(BD Biosciences)通过细胞分选进行回收。用Agilent 2100生物分析仪(AgilentTechnologies，Palo Alto，CA)和NanoDrop One(Thermo Fisher Scientific)分析回收的RNA的浓度和纯度。在文库制备中使用1μg RIN值为7以上的RNA。按照NEBNext Ultra RNALibrary Prep Kit for Illumina的制造商方案实施下一代测序用文库的制备。

poly(A)mRNA的分离使用NEBNext Poly(A)mRNA磁性分离模块(NEB)和Ribo-ZerrRNA去除试剂盒(Illumina)。mRNA片段化和引发(プライミング)使用NEBNext第一链合成反应缓冲液和NEBNext随机引物。

第一链cDNA使用ProtoScript II反转录酶来合成。第二链cDNA的合成使用第二链合成酶混合物。对于用AxyPrep Mag PCR Clean-up(Axygen，UnionCity，CA)纯化的双链cDNA，为了在两端修复和向扩增产物末端添加dA后进行TA克隆，用End Prep Enzyme Mix进行处理。对于连接有接头(adaptor)的DNA的大小，使用AxyPrep Mag PCR Clean-up(Axygen)选择直至360bp的片段。使用P5和P7引物通过PCR将各个样品扩增11个循环。将PCR产物用AxyPrep Mag PCR Clean-up(Axygen)进行纯化，并用Agilent 2100生物分析仪(AgilentTechnologies)进行评价。PCR产物的定量使用Qubit2.0荧光计(Invitrogen，Carlsbad，CA)。

测序使用Illumina HiSeq(Illumina)在2×150bp双端测序(paired-end，PE)配置的条件下实施。图像分析和碱基识别(ベースコール)使用HiSeq控制软件(HCS)+OLB+GAPipeline-1.6(Illumina)。测序通过GENEWIZ(SouthPlainfield，NJ)来实施。

<表达差异分析>

表达差异分析使用DESeq Bioconductor程序包。错误发现率(FDR)的修正通过Benjamini and Hochberg's进行，P值<0.05视为有显著性。

<心肌细胞与成纤维细胞的共培养>

在细胞接种之前，用在高葡萄糖(high-glucose)DMEM中以1:30稀释的Matrigel基底膜基质(Corning，Corning，NY)将384孔板(Thermo Fisher Scientific)以100μL/孔的量在37℃下包被1小时。iPS-CM与成纤维细胞以8:2的比例在DMEM+10％新生小牛血清(NBCS)中共培养(心肌细胞＝16,000个细胞/孔:成纤维细胞＝4,000个细胞/孔)。

共培养开始后第10天用4％多聚甲醛将细胞固定，进行免疫荧光染色。染色样品采用IN Cell Analyzer 2200(GE Healthcare，Buckinghamshire，UK)和IN Cell DeveloperToolbox 1.92(GE Healthcare)进行分析。

<慢性心力衰竭模型大鼠的制作和超声心动图的测量>

裸大鼠(F344/N Jcl-rnu/rnu，8周龄，雄性)购自日本クレア(东京，日本)。驯化1周后，使用实验动物用吸入麻醉机(ソフトランダー(新锐工业株式会社，埼玉，日本))将动物用2％异氟烷(麻醉辅助剂；笑气:氧＝7:3)进行吸入麻醉并剪毛。迅速地进行气管插管，在该状态下将0.5％-2％异氟烷(麻醉辅助剂；笑气:氧＝7:3)吸入麻醉气体与人工呼吸机连接，维持麻醉。在人工呼吸管理下，固定为仰卧位，在左侧第3肋骨至第5肋骨之间在2～3根肋软骨的位置处纵向切断而开胸。通过牵开器扩大手术区域后，剥离心包膜以显露心脏。抬起左心房，使用带血管线的弱弯圆针(弱弯丸針)(6-0：ネスコスーチャー)将线穿至左心室的深度约2mm、长度4-5mm。将线的两端合在一起，穿过用聚乙烯管制作的圈套器(スネア)，使用动脉夹(動脈クレンメ)将线收紧(圈套器法)以使冠状动脉缺血30分钟。30分钟后进行再灌注，待状态稳定后，确认无出血，进行胸腔引流，缝合肌层和皮肤。皮肤进行皮内缝合，但在进行通常缝合的情况下，一边观察术后状态一边进行拆线。在模型制作后1周的细胞给药日前一天，使用超声图像诊断装置(Xario SSA-660A，東芝メディカルシステムズ，栃木，日本)测定超声心动图。将左心室射血分数(LVEF＝(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd3)为55％以下的个体视为慢性心力衰竭模型，进行成纤维细胞的给药实验。

<对慢性心力衰竭模型大鼠的成纤维细胞给药>

在给药实验当天将冷冻保存的各种成纤维细胞解冻，用高葡萄糖DMEM+10％NBCS稀释，作为存活细胞数，对每个个体给予2.0×10⁶个细胞/50μL的细胞悬液。A-HCF和uA-HCF给药组以N＝4实施，uA90-HCF给药组以N＝3实施。将动物以与模型制作时相同的方法维持麻醉，在人工呼吸管理下，使用带30G针的导管将细胞悬液以50μL总量给予至梗塞病变(梗塞巣)的两个部位。待状态稳定后，确认无给药液渗漏和出血，进行胸腔引流，缝合肌层和皮肤。皮肤进行皮内缝合，但在进行通常缝合的情况下，一边观察术后状态一边进行拆线。

<基于超声心动图的慢性心力衰竭模型大鼠的心脏功能评价>

对于进行成纤维细胞给药的慢性心力衰竭模型大鼠，每2周使用超声图像诊断装置(Xario SSA-660A)测定超声心动图，进行过程观察(経過観察)。具体而言，将动物胸部用剪毛器剪毛，将探头放在胸部上，以M模式测定左心室射血分数(LVEF＝(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd3)、左心室短轴缩短率(LVFS＝(LVIDd-LVIDs)×100/LVIDd)。心脏功能值用小数点后1位(将小数点后第2位四舍五入)表示。

<统计分析>

心脏功能评价以平均值±SE(标准误差)表示。其它所有数据均以平均值±SD(标准偏差)表示。2组间的显著性差异通过学生t检验算出。3组以上的方差(変動差)通过单因素方差分析(一元配置分散分析)算出。然后，3组间的显著性差异通过Tukey-Kramer多重比较检验算出。将低于0.05的p值视为有显著性差异。所有统计计算均使用R软件进行。

以下示出所实施的实验结果。

<TNF-α和IL-4引起的心脏成纤维细胞的CD106和CD90表达率提高>

在成体心脏来源的成纤维细胞(A-HCF)中以各种浓度添加TNF-α，在HFDM-1(+)培养基中进行3天培养后，用流式细胞仪评价CD106阳性细胞的比例(％)和CD90阳性细胞的比例(％)。结果示于图1中。

此外，在成体心脏来源的成纤维细胞(A-HCF)中以各种浓度添加IL-4，在HFDM-1(+)培养基中进行3天培养后，用流式细胞仪评价CD106阳性细胞的比例(％)和CD90阳性细胞的比例(％)。结果示于图2中。

由这些结果可以理解，通过添加TNF-α或IL-4，CD106阳性细胞的比例(％)和CD90阳性细胞的比例(％)提高。

接着，在成体心脏来源的成纤维细胞(A-HCF)中混合添加TNF-α和IL-4两种试剂，在HFDM-1(+)培养基中进行3天培养后，用流式细胞仪评价CD106阳性细胞的比例(％)和CD90阳性细胞的比例(％)。结果示于图3-1和图3-2中。由图3-1可以理解，与A中所示的对照(无添加)相比，在B中所示的混合添加TNF-α和IL-4两种试剂的情况下，CD106阳性细胞的比例(％)和CD90阳性细胞的比例(％)大幅提高。

进而，在胎儿心脏来源的成纤维细胞(F-HCF)和iPS细胞来源的心脏成纤维细胞(i-HCF)中混合添加TNF-α(50ng/mL)和IL-4(2ng/mL)两种试剂，在HFDM-1(+)培养基中进行3天培养后，用流式细胞仪评价CD106阳性细胞的比例(％)和CD90阳性细胞的比例(％)。结果示于图4-1和图4-2中。

由图4-1和图4-2可以理解，即使心脏成纤维细胞的来源不同，在混合添加TNF-α和IL-4两种试剂的情况下，CD106阳性细胞的比例(％)和CD90阳性细胞的比例(％)也大幅提高。

接着，将用抗CD106抗体对F-HCF进行细胞分选而得的CD106和CD90阳性细胞的比例大幅提高的成纤维细胞(F-VCF)与CD106阳性细胞的比例大幅减少的成纤维细胞(F-VNCF)作为对照，实施如下细胞的基因表达差异分析：A-HCF；通过在A-HCF中混合添加TNF-α(50ng/mL)和IL-4(2ng/mL)两种试剂并在HFDM-1(+)培养基中培养3天而得的CD106和CD90阳性细胞的比例提高的成纤维细胞(uA-HCF)；从uA-HCF仅对CD106和CD90双阳性细胞通过细胞分选进行回收的成纤维细胞(uA90·106-HCF)。其结果示于图5中。由图5可知，在各种心脏成纤维细胞中，粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF)蛋白质编码基因的表达量有很大不同。可以看出，F-VNCF和F-VCF、A-HCF的G-CSF基因表达量(通过β-肌动蛋白的FPKM而归一化的G-CSF的FPKM)分别为0.000178、0.000125、0.000553；与此相对，uA-HCF表达为0.101496，uA90·106-HCF表达为0.229072。可以看出，将F-VCF的值设定为1时，F-VNCF和A-HCF的G-CSF基因表达量(通过β-肌动蛋白的FPKM而归一化的G-CSF的FPKM倍数增加)分别为1.42、4.41；与此相对，uA-HCF表达为810.21，uA90·106-HCF表达为1828.61。

因此，可以看出，通过在A-HCF中添加TNF-α和IL-4两种试剂，提高CD106和CD90阳性细胞的比例，可以大幅提高G-CSF的表达量。此外，还可知通过对uA-HCF进行细胞分选，提高CD90和CD106阳性细胞的比例，可以进一步提高G-CSF的表达量。根据以前的研究，据报道，G-CSF抑制伴随心力衰竭的心肌细胞死亡并抑制心肌重塑进展；此外，还阐明其促进心肌细胞的细胞增殖。由该结果教导了，通过TNF-α和IL-4人为地提高G-CSF表达量的uA-HCF、uA90-HCF、uA106-HCF、uA90·106-HCF的心肌细胞增殖能力和心力衰竭治疗效果高。

<由CD106和CD90的表达水平提高的心脏成纤维细胞引起的人iPS细胞来源的心肌细胞的增殖效果>

按照表1的记载，通过混合添加TNF-α(50ng/mL)和IL-4(2ng/mL)两种试剂并在HFDM-1(+)培养基中培养3天来准备CD90和CD106阳性细胞的比例提高的心脏成纤维细胞。此外，作为对照，准备不添加TNF-α和IL-4而培养的心脏成纤维细胞。

通过用抗CD90抗体或抗CD106抗体对所准备的CD90和CD106阳性细胞的比例提高的心脏成纤维细胞进行细胞分选，可以有效地回收CD90和CD106双阳性(DP：双阳性)的成纤维细胞。

[表1]

表1

接着，将表1中记载的各心脏成纤维细胞与iPS来源的心肌细胞(iPS-CM)共培养，进行心脏成纤维细胞引起的心肌增殖效果的评价。iPS-CM使用心肌细胞特异性标志物心肌肌钙蛋白T(cTnT)为92.22％阳性的细胞。将各种成纤维细胞与iPS-CM共培养10天，测定Ki67和心肌肌钙蛋白T(cTnT)双阳性的处于增殖状态的心肌细胞数。结果示于图6中。

根据图6，与A-HCF相比，在添加了TNF-α和IL-4的uA-HCF的共培养条件下确认处于增殖状态的心肌细胞数增加，在uA90-HCF和uA106-HCF的共培养条件下观察到处于增殖状态的心肌细胞数显著增加。

<由CD90和CD106阳性细胞的比例提高的心脏成纤维细胞引起的大鼠慢性心力衰竭的长期治疗效果>

对通过上述缺血-再灌注制作的慢性心力衰竭模型大鼠用注射器心肌内给予表1所示的A-HCF、uA-HCF、uA90-HCF，用超声心动图评价各种成纤维细胞引起的大鼠心力衰竭的治疗效果。假手术组以N＝6实施、对照以N＝4实施、A-HCF给药组以N＝7实施、uA-HCF给药组以N＝8实施、uA90-HCF给药组以N＝9实施。另外，用流式细胞仪对制作的各种成纤维细胞群的CD90和CD106阳性细胞的比例进行评价时，A-HCF中CD90和CD106双阳性细胞(DP)为1.77％；与此相对，uA-HCF的DP为21.36％，uA90-HCF的DP为61.25％。结果示于图7-1、图7-2和图7-3中。

由图7-1、图7-2及图7-3可以理解，通过A-HCF给药不能确认心力衰竭的治疗效果，但uA-HCF和uA90-HCF在移植后4周可以大幅改善LVEF和LVFS。

此外可以理解，对各种成纤维细胞引起的LVEF和LVFS的增减比例(Delta-LVEF，Delta-LVFS)进行比较分析时，uA-HCF和uA90-HCF相比细胞移植前提高了Delta-LVEF和Delta-LVFS；并且与A-HCF相比uA90-HCF能够显著改善Delta-LVEF和Delta-LVFS。

<人成纤维细胞的G-CSF阳性细胞比例以及由添加TNF-α和IL-4引起的G-CSF阳性细胞比例的提高>

按照表2的记载，通过混合添加TNF-α(50ng/mL)和IL-4(2ng/mL)两种试剂并在HFDM-1(+)培养基中培养3天来准备CD90和CD106阳性细胞的比例提高的心脏成纤维细胞(uA-HCF)。进而，准备用抗CD90抗体和抗CD106抗体进行细胞分选的心脏成纤维细胞(uA90·106-HCF)。此外，作为对照，准备不添加TNF-α和IL-4而培养的心脏成纤维细胞(A-HCF)、胎儿心脏来源的CD106阴性成纤维细胞(F-VNCF)、胎儿心脏来源的CD106阳性成纤维细胞(F-VCF)。

[表2]

表2.作为分析样品使用的各种成纤维细胞

用流式细胞术对各种成纤维细胞的G-CSF阳性细胞的比例进行评价时，F-VNCF中G-CSF阳性细胞的比例为9.04％；与此相对，F-VCF为4.35％，A-HCF为6.75％，uA-HCF为24.70％，uA90·106-HCF为92.50％(图8)。由该结果可知，天然存在的CD106阳性细胞(F-VCF)中G-CSF阳性细胞的比例较低；与TNF-α和IL-4接触而人工制备的CD106阳性和/或CD90阳性心脏成纤维细胞中，随着CD106和/或CD90阳性细胞的比例提高，G-CSF阳性细胞的比例提高。

<由CD106和CD90阳性细胞的比例提高的心脏成纤维细胞引起的大鼠慢性心力衰竭的长期治疗效果>

对通过缺血-再灌注制作的慢性心力衰竭模型大鼠用注射器心肌内给予A-HCF、uA-HCF、uA90-HCF，用超声心动图评价各种成纤维细胞引起的大鼠心力衰竭的长期治疗效果。其结果是，通过A-HCF给药不能确认心力衰竭的治疗效果，移植后18周的LVEF显示为44.1±2.8％，LVFS显示为17.8±1.4％(图9-1和图9-2A和图9-2C)。进一步以CD90抗原为指标进行细胞分选的uA90-HCF则确认在长时间内(移植后12周以后)观察到LVEF和LVFS的改善效果，移植后18周的LVEF显示为61.0±2.2％，LVFS显示为27.2±1.4％。

此外，对各种成纤维细胞的给药引起的LVEF和LVFS的增减比例(Delta-LVEF，Delta-LVFS)进行比较分析时，A-HCF给药组在移植后18周时示出-6.9±2.6％的Delta-LVEF值，并示出-3.5±1.3％的Delta-LVFS值(图9-2B和图9-2D)。另一方面，uA-HCF给药组在移植后18周时示出-1.8±3.4％的Delta-LVEF值，并示出-0.6±1.8％的Delta-LVFS值。此外，uA90-HCF给药组在移植后18周时示出9.2±2.6％的Delta-LVEF值，并示出5.6±1.6％的Delta-LVFS值。因此可以理解，uA90-HCF可以在很长一段时间内显著地改善心肌功能不足(不全心筋の機能)。另外，主要项目(LVEF，LVFS)明细和次要项目(LVEDV，LVESV，LVIDd，LVIDs，LVAWd，LVPWTd，HR)明细示于表3～表11中。

Claims (15)

1.一种制备CD106阳性和/或CD90阳性成纤维细胞的方法，所述方法包括在选自于由TNF-α和IL-4组成的组中的一种以上的存在下培养成纤维细胞以使CD106阳性和/或CD90阳性成纤维细胞增加的步骤。

2.如权利要求1所述的方法，其中，培养的成纤维细胞是从成体得到的成纤维细胞。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述CD106阳性和/或CD90阳性成纤维细胞为CD106阳性和CD90阳性。

4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括浓缩CD106阳性和/或CD90阳性成纤维细胞的步骤。

5.如权利要求4所述的方法，其中，使用抗CD106抗体和/或抗CD90抗体进行所述浓缩。

6.一种制备G-CSF阳性成纤维细胞的方法，所述方法包括在选自于由TNF-α和IL-4组成的组中的一种以上的存在下培养成纤维细胞以使G-CSF的表达量提高并使G-CSF阳性成纤维细胞增加的步骤。

7.如权利要求6所述的方法，其中，培养的成纤维细胞是从成体得到的成纤维细胞。

8.如权利要求6或7所述的方法，其中，所述方法还包括在所述培养后浓缩G-CSF阳性成纤维细胞的步骤。

9.如权利要求8所述的方法，其中，使用抗CD106抗体和/或抗CD90抗体进行所述浓缩。

10.一种细胞群，所述细胞群包含分离的CD106阳性和G-CSF阳性成纤维细胞。

11.如权利要求10所述的细胞群，其中，相对于成纤维细胞，G-CSF阳性成纤维细胞的比例以细胞数计为6.75％以上。

12.一种细胞群，所述细胞群是包含从成体得到的成纤维细胞的细胞群，所述成纤维细胞的5％以上为CD106阳性。

13.一种细胞群，所述细胞群是包含从成体得到的成纤维细胞的细胞群，所述成纤维细胞的7％以上为CD90阳性、CD106阳性且G-CSF阳性。

14.一种药物组合物，所述药物组合物含有如权利要求10～13中任一项所述的细胞群和药学上可接受的赋形剂。

15.如权利要求14所述的药物组合物，其中，所述药物组合物用于改善心脏功能。

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