CN112639081A

CN112639081A - 从免疫工程化多能干细胞衍生的嵌合抗原受体t细胞

Info

Publication number: CN112639081A
Application number: CN201980056559.7A
Authority: CN
Inventors: S·施雷普费尔; T·德塞
Original assignee: University of California San Diego UCSD
Current assignee: University of California San Diego UCSD
Priority date: 2018-07-17
Filing date: 2019-07-17
Publication date: 2021-04-09
Also published as: EA202190295A1; WO2020018620A1; MX2021000607A; KR20210032449A; IL279854A; JP2021530999A; EP3824075A4; BR112021000639A2; US20210308183A1; AU2019305586A1; CA3106022A1; SG11202100156UA; EP3824075A1

Abstract

本发明提供了普遍可接受的“现成的”低免疫性多能(HIP)细胞和来源于HIP细胞的低免疫性嵌合抗原受体T(CAR‑T)细胞。可将工程化的治疗细胞作为基于细胞的过继免疫疗法施用至受试者以治疗癌症。

Description

从免疫工程化多能干细胞衍生的嵌合抗原受体T细胞

I.相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年7月17日提交的62/698,941的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

II.发明领域

本发明涉及过继免疫疗法领域。本发明提供了从包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸的低免疫原性多能(HIP)干细胞分化的表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，例如T细胞。对工程化的HIP细胞进行基因修饰以使其纯和地不含β-2微球蛋白(B2M)基因，纯和地不含II类反式激活因子(CIITA)基因，并过表达CD47。

III.发明背景

过继细胞免疫疗法利用抗原特异性免疫细胞，例如T细胞或自然杀伤(NK)细胞来治疗许多疾病，包括癌症和抗体介导的移植物排斥。不幸的是，由于缺乏通用的肿瘤特异性T细胞，目前的过继性T细胞疗法受到限制。例如，Kymriah^TM(tisagenlecleucel,Novartis)和Yescarta^TM(axicabtagene ciloleucel,Kite)使用患者自身的T细胞来进行CAR-T治疗。

这样的过继性T细胞疗法基于自体细胞转移。T淋巴细胞从患者中回收，进行基因修饰或离体选择，在体外培养以扩增细胞数量，最后注入患者体内。除了淋巴细胞输注外，还可以对患者使用放射或化学疗法进行预处理，并施用淋巴细胞生长因子(例如IL-2)以促进和支持T细胞的植入和/或治疗反应。

每个患者接受使用患者自身的淋巴细胞的个别制造的治疗。这种自体疗法面临大量的技术和后勤问题。例如，治疗细胞必须在配备有专业人员的昂贵的专用设施中产生，并且它们必须在患者诊断后的短时间内产生。在某些情况下，由于对患者的预处理，分离的淋巴细胞可能很差地发挥功能并且以非常低的数量存在，因此使得其难以产生有效量的治疗细胞用于治疗患者。

因此，需要用于过继免疫疗法的“现成的(off-the-shelf)”治疗性抗原特异性T细胞。

IV.发明概述

一方面，本发明提供了分离的低免疫原性或低免疫性多能干细胞(HIP细胞)，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，其中已消除内源性β-2微球蛋白(B2M)基因活性和内源性II类反式激活因子(CIITA)基因活性，并且已增加CD47表达。CAR可包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，细胞外结构域与选自CD19、CD20、CD22、CD38、CD123、CD171、CS1、BCMA、MUC16、ROR1和WT1的抗原结合。在某些实施方案中，细胞外结构域包含单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD3ζ、CD4、CD8α、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3和BTLA。在某些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3和BTLA。

在某些实施方案中，CAR包含抗CD19 scFv结构域、CD28跨膜结构域和CD3ζ信号传导细胞内结构域。在一些实施方案中，CAR包含抗CD19 scFv结构域、CD28跨膜结构域、4-1BB信号传导细胞内结构域和CD3ζ信号传导细胞内结构域。

在各种实施方案中，在已消除B2M基因活性和CIITA基因并且已增加CD47表达之后，将编码CAR的核酸引入HIP细胞。

在特定的实施方案中，人HIP细胞是人工程化诱导多能干细胞(人工程化iPSC)，B2M基因是人B2M基因，CIITA基因是人B2M基因，并且增加的CD47表达是由将至少一个拷贝的人CD47基因导入所述人工程化iPSC中处于启动子的控制下引起的。在其他实施方案中，小鼠HIP细胞是小鼠工程化iPSC，B2M基因是小鼠B2M基因，CIITA基因是小鼠B2M基因，并且增加的CD47表达是由于将至少一个拷贝的小鼠CD47基因导入所述小鼠工程化iPSC中处于启动子的控制下而产生的。该启动子可以是组成型启动子。

在一些实施方案中，B2M基因活性的消除是由破坏B2M基因的两个等位基因的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9反应引起的。在某些实施方案中，CIITA基因活性的消除是由破坏CIITA基因的两个等位基因的CRISPR/Cas9反应引起的。

在一些实施方案中，自杀基因是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因，并且触发剂是更昔洛韦。在一些情况下，HSV-tk基因编码与SEQ ID NO：4具有至少90％序列同一性的蛋白质。在某些情况下，HSV-tk基因编码包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的蛋白质。

在某些实施方案中，自杀基因是大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因，并且触发剂是5-氟胞嘧啶(5-FC)。CD基因可编码与SEQ ID NO：5具有至少90％序列同一性的蛋白质。在某些情况下，CD基因编码包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的蛋白质。

在各个实施方案中，自杀基因编码诱导型胱天蛋白酶9蛋白，并且触发剂是二聚化的化学诱导剂(CID)。在某些情况下，诱导型胱天蛋白酶9蛋白与SEQ ID NO：6具有至少90％的序列同一性。在其他情况下，诱导型胱天蛋白酶9蛋白包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供了通过体外分化本文所述的任何HIP细胞而产生的分离的低免疫性CAR-T(HI-CAR-T)细胞。

在一些实施方案中，HI-CAR-T细胞是细胞毒性的低免疫性CAR-T细胞。

在各种实施方案中，体外分化包括在包含选自bFGF、EPO、Flt3L、IGF、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-15、GM-CSF、SCF和VEGF的一种或多种生长因子或细胞因子的培养基中培养携带CAR构建体的HIP细胞。在一些实施方案中，培养基还包含选自以下的一种或多种：BMP激活剂、GSK3抑制剂、ROCK抑制剂、TGFβ受体/ALK抑制剂和NOTCH激活剂。

在特定的实施方案中，通过体外分化携带CAR-T构建体的任何一种HIP产生的分离的HI-CAR-T细胞用作癌症的治疗。

在本发明的另一方面，提供了通过施用包含治疗有效量的本文所述的任何分离的HI-CAR-T细胞的组合物来治疗癌症患者的方法。在一些实施方案中，该组合物还包含治疗有效的载体。

在一些实施方案中，施用步骤包括静脉内施用、皮下施用、结内施用、肿瘤内施用、鞘内施用、胸膜内施用和腹膜内施用。在某些情况下，所述施用还包括推注或通过连续灌注。

在一些实施方案中，癌症是选自白血病、淋巴瘤和骨髓瘤的血液癌。在各种实施方案中，癌症是实体瘤癌或液体瘤癌。

在另一方面，本发明提供了通过包括体外分化的方法从携带CAR构建体的分离的HIP细胞群衍生的纯的HI-CAR-T细胞群，其中分离的HIP细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸和可诱导HIP细胞死亡的被触发剂激活的自杀基因，其中在HIP细胞中已消除内源性β-2微球蛋白(B2M)基因活性和内源性II类反式激活因子(CIITA)基因活性，并且已增加CD47表达。

在一些实施方案中，所述自杀基因是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因和所述触发剂是更昔洛韦，所述自杀基因是大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因和所述触发剂是5-氟胞嘧啶(5-FC)，或者所述自杀基因编码诱导型胱天蛋白酶9蛋白和所述触发剂是二聚化的化学诱导剂(CID)。

在一些实施方案中，体外分化包括在包含选自bFGF、EPO、Flt3L、IGF、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-15、GM-CSF、SCF和VEGF的一种或多种生长因子或细胞因子的培养基中培养HIP细胞。在一些实施方案中，培养基还包含选自以下的一种或多种：BMP激活剂、GSK3抑制剂、ROCK抑制剂、TGFβ受体/ALK抑制剂和NOTCH激活剂。在一些情况下，体外分化包括在饲养细胞上培养HIP细胞。在一些实施方案中，饲养细胞是内皮细胞。在某些实施方案中，饲养细胞是来源于HIP细胞例如但不限于人HIP细胞的内皮细胞。在一些实施方案中，体外分化包括在模拟的微重力下培养。在某些实施方案中，在模拟的微重力下的培养持续至少72小时。在各种实施方案中，该方法还包括在包含触发剂以诱导HIP细胞死亡的阴性选择培养基中培养HI-CAR-T细胞，从而产生基本上不含或完全不含HIP细胞的分离的HI-CAR-T细胞群。这样的分离的HI-CAR-T细胞可以用于治疗癌症。

在一些实施方案中，本文提供了通过施用包含治疗有效量的任一种纯的分离的HI-CAR-T细胞群的组合物来治疗癌症患者的方法。所述组合物还可包含治疗有效的载体。

在一些实施方案中，施用步骤包括静脉内施用、皮下施用、结内施用、肿瘤内施用、鞘内施用、胸膜内施用和腹膜内施用。在某些情况下，施用还包括推注或通过连续灌注。

在另一方面，本发明提供了一种制备本文所述的任何分离的低免疫性CAR-T细胞(HI-CAR-T细胞)的方法。该方法包括体外分化本发明的任何一种HIP细胞，其中所述体外分化包括在包含选自bFGF、EPO、Flt3L、IGF、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-15、GM-CSF、SCF和VEGF的一种或多种生长因子或细胞因子的培养基中培养所述HIP细胞。在一些实施方案中，培养基还包含选自以下的一种或多种：BMP激活剂、GSK3抑制剂、ROCK抑制剂、TGFβ受体/ALK抑制剂和NOTCH激活剂。

在一些实施方案中，体外分化包括在饲养细胞上培养HIP细胞。在各种实施方案中，体外分化包括在模拟的微重力下培养。在某些情况下，在模拟的微重力下培养至少72小时。

V.附图的简要说明

图1显示了与小鼠自然杀伤(NK)细胞(约95％NK细胞和5％巨噬细胞)一起孵育的小鼠B2m-/-Ciita-/-CD47 tg iPSC的Elispot结果。

图2显示了与人NK细胞(约95％的NK细胞和5％的巨噬细胞)一起孵育的人B2M-/-CIITA-/-CD47 tg iPSC的Elispot结果。

图3显示了与人NK细胞(约95％的NK细胞和5％的巨噬细胞)一起孵育的小鼠B2m-/-Ciita-/-CD47 tg iPSC的Elispot结果。

图4显示了与小鼠NK细胞(约95％NK细胞和5％巨噬细胞)一起孵育的人B2M-/-CIITA-/-CD47 tg iPSC的Elispot结果。

图5显示了与人巨噬细胞共培养的萤火虫萤光素酶标记的人B2M-/-CIITA-/-CD47tg iPSC的吞噬作用测定结果。

图6显示了与小鼠巨噬细胞共培养的萤火虫萤光素酶标记的小鼠B2m-/-Ciita-/-CD47tg iPSC的吞噬作用测定结果。

图7显示了与小鼠巨噬细胞共培养的萤火虫萤光素酶标记的人B2M-/-CIITA-/-CD47tg iPSC的吞噬作用测定结果。

图8显示了与人巨噬细胞共培养的萤火虫萤光素酶标记的小鼠B2m-/-Ciita-/-CD47tg iPSC的吞噬作用测定结果。

图9显示了本文所述的HIP细胞向T细胞的分化。

图10A和10B显示了HIP细胞分化为CD3+细胞、CD4+细胞和CD8+细胞。图10A显示了在OP9-DL1细胞上分化的第23天(D23)的细胞。图10B显示了在脱离饲养细胞的分化的第30天(D30)并使用CD3/CD28刺激的细胞。

图11显示了饲养细胞上的分化的第23天(D23)并使用CD3/CD28刺激的HIP细胞分化为T细胞(例如，CD3+细胞、CD4+细胞和CD8+细胞)。

图12显示了来源于HIP细胞的内皮祖细胞。

图13A-13C显示了用内皮祖细胞(EPC)培养的人HIP细胞，其分化为CD4+T细胞(图13A)、幼稚CD4+细胞(CD45RA+CCR7+CD4+细胞；图13B)和中央记忆CD4+T细胞(CD45RA-CCR7+CD4+细胞；图13C)。**表示p<0.001；未配对学生t检验。

图14A和14B显示了使用持续72小时的模拟的微重力(sμg)从人HIP细胞衍生的人T细胞。图14A显示了来源于人HIP细胞的人T细胞的形态。图14B显示了人T细胞的细胞活力。P＝n.s.；未配对学生t检验。

图15显示了使用持续72小时的模拟的微重力(sμg)从人HIP细胞衍生的人CD8+T细胞。*表示p<0.05；未配对学生t检验。

图16显示了使用持续72小时和10天的模拟的微重力(sμg)从人HIP细胞衍生的人CD8+T细胞。

图17显示了使用持续72小时的模拟的微重力(sμg)然后以1g处理72小时从人HIP细胞衍生的人CD8+CD45RA+CCR7+T细胞和人CD8+CD45RA+CCR7-T细胞。*表示p<0.05；未配对学生t检验。

图18显示了使用模拟的微重力和细胞因子刺激从人HIP细胞衍生的人CD8+T细胞。

VI.发明详述

A.介绍

本发明提供了由于本文概述的几种遗传操作而避免宿主免疫反应的低免疫原性多能(“HypoImmunogenic Pluripotent，HIP”)细胞。这些细胞缺乏主要的免疫抗原，这些抗原触发免疫反应，并经过工程化以避免吞噬作用。这允许衍生“现成的”细胞产品以用于产生特定的组织和器官。能够在人患者中使用人同种异体HIP细胞衍生物的益处带来了显著的益处，包括避免通常在同种异体移植中所见的长期的辅助免疫抑制疗法和药物使用的能力。由于可以使用细胞疗法而无需为每个患者进行单独治疗，因此其还提供显著的成本节省。最近已经显示从自体细胞来源产生的细胞产品可以在具有很少或甚至一个抗原突变的情况下变得经受免疫排斥。因此，自体细胞产品并非固有地非免疫原性的。此外，细胞工程化和质量控制非常耗费人力和成本，并且自体细胞不可用于急性治疗方案。如果可以克服免疫障碍，那么只有同种异体细胞产品才能用于更大的患者群体。HIP细胞将用作通用细胞来源用于产生普遍可接受的衍生物。

本发明涉及利用存在于孕妇中的母胎耐受性。尽管胎儿的人白细胞抗原(HLA)的一半是父系遗传的，并且胎儿表达主要HLA错配抗原，但母体免疫系统无法将胎儿识别为同种异体实体，并且不会启动免疫反应，例如如在“宿主对抗移植物”类型的免疫反应中所见的。母胎耐受主要由胎儿-母体界面中的合体滋养层细胞介导。合体滋养层细胞显示很少或没有主要组织相容性复合物I和II(MHC-I和MHC-II)的蛋白质，以及CD47的增加的表达，CD47被称为“不要吃我”的蛋白质，其抑制吞噬性先天免疫监视和无HLA的细胞的消除。出人意料的是，防止怀孕期间胎儿排斥的相同的致耐受性机制也允许本发明的HIP细胞逃脱排斥，并促进异体移植后这些细胞的长期存活和移植。

这些结果另外令人惊讶的是发现该母胎耐受性可以在少至三个基因修饰(与起始的iPSC、例如人iPSC相比)的情况下引入，两个是活性的降低(如本文进一步描述的“敲除”)和一个是活性的增加(如本文所述“敲入”)。通常，本领域的其他技术人员已经尝试抑制iPSC的免疫原性，但是仅部分成功：参见Rong等人,Cell Stem Cell14:121-130(2014)和Gornalusse等人,Nature Biotech doi:10.1038/nbt.3860)。

本申请与2018年1月14日提交的国际申请号PCT/US18/13688和2017年1月13日提交的美国临时申请号62/445,969有关，其全部公开内容(尤其是实施例、附图、附图说明以及产生低免疫原性多能干细胞并将这样的细胞分化为其他细胞类型的描述)通过引用并入本文。

因此，本发明提供了从多能干细胞产生HIP细胞，及其随后的维持、分化和最终将其衍生物移植到需要其的患者中。

B.定义

术语“多能细胞”是指可以自我更新并增殖同时保持未分化状态并且可以在适当条件下被诱导以分化为专门的细胞类型的细胞。如本文所用，术语“多能细胞”涵盖胚胎干细胞和其他类型的干细胞，包括胎儿、羊膜或体细胞干细胞。示例性的人干细胞系包括H9人胚胎干细胞系。其他示例性干细胞系包括可通过National Institutes of Health HumanEmbryonic Stem Cell Registry和Howard Hughes Medical Institute HUES collection获得的那些(描述于Cowan,C.A.等人,New England J.Med.350:13.(2004)，其通过引用整体并入本文)

如本文所用，“多能干细胞”具有分化成三个胚层中的任一个的潜力：内胚层(例如，胃连接、胃肠道、肺等)，中胚层(例如，肌肉、骨骼、血液，泌尿生殖组织等)或外胚层(例如表皮组织和神经系统组织)。如本文所用，术语“多能干细胞”还涵盖“诱导多能干细胞”或“iPSC”，其是来源于非多能细胞的一种多能干细胞。亲代细胞的例子包括已经通过各种方式被重新编程以诱导多能的未分化表型的体细胞。这样的“iPS”或“iPSC”细胞可以通过诱导某些调节基因的表达或通过外源施加某些蛋白质来产生。诱导iPS细胞的方法是本领域已知的，并在下文进一步描述。(参见例如，Zhou等人,Stem Cells 27(11):2667-74(2009)；Huangfu等人,Nature Biotechnol.26(7):795(2008)；Woltjen等人,Nature 458(7239):766-770(2009)；和Zhou等人,Cell Stem Cell 8:381-384(2009)；每篇文献均通过引用整体并入本文)。诱导多能干细胞(iPSC)的生成概述于下文。如本文所用，“hiPSC”是人诱导多能干细胞，“miPSC”是鼠诱导多能干细胞。

“多能干细胞特征”是指将多能干细胞与其他细胞区分开的细胞特征。能够在适当条件下分化为共同证明与来自所有三个生发层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞谱系相关的特征的细胞类型的后代的能力是多能干细胞特征。分子标志物的某些组合的表达或不表达也是多能干细胞特征。例如，人多能干细胞表达以下非限制性列表中的至少几种和在一些实施方案中所有标志物：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-钙粘蛋白、UTF-1、Oct4、Rex1和Nanog。与多能干细胞相关的细胞形态也是多能干细胞特征。如本文所述，细胞不需要通过多能性以被重新编程为内胚层祖细胞和/或肝细胞。

如本文所用，“专能”或“专能细胞”是指可以产生有限数量的其他特定细胞类型的细胞类型。例如，诱导的专能细胞能够形成内胚层细胞。此外，专能血液干细胞可以将自身分化为几种类型的血细胞，包括淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞等。

如本文所用，术语“寡能”是指成体干细胞分化为仅几种不同细胞类型的能力。例如，淋巴样或髓样干细胞能够分别形成淋巴样或髓样谱系的细胞。

如本文所用，术语“单能”是指细胞形成单一细胞类型的能力。例如，精原干细胞仅能够形成精子细胞。

如本文所用，术语“全能”是指细胞形成整个生物体的能力。例如，在哺乳动物中，仅受精卵和第一分裂阶段卵裂球是全能的。

如本文所用，“非多能细胞”是指不是多能细胞的哺乳动物细胞。这样的细胞的例子包括分化的细胞以及祖细胞。分化细胞的实例包括但不限于来自选自骨髓、皮肤、骨骼肌、脂肪组织和外周血的组织的细胞。示例性的细胞类型包括但不限于成纤维细胞、肝细胞、成肌细胞、神经元、成骨细胞、破骨细胞和T细胞。用于产生诱导的专能细胞、内胚层祖细胞和肝细胞的起始细胞可以是非多能细胞。

分化的细胞包括但不限于专能细胞、寡能细胞、单能细胞、祖细胞和终末分化细胞。在特定的实施方案中，相对于更多能性的细胞，较少能性的细胞被认为是“分化的”。

“体细胞”是形成生物体的身体的细胞。体细胞包括构成生物体中的器官、皮肤、血液、骨骼和结缔组织的细胞，但非生殖细胞。

细胞可以来自例如人或非人哺乳动物。示例性非人哺乳动物包括但不限于小鼠、大鼠、猫、狗、兔、豚鼠、仓鼠、羊、猪、马、牛和非人灵长类动物。在一些实施方案中，细胞来自成年人或非人哺乳动物。在一些实施方案中，细胞来自新生人、成年人或非人哺乳动物。

如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指任何动物，例如家养动物、动物园动物或人。“受试者”或“患者”可以是哺乳动物，如狗、猫、鸟、家畜或人。“受试者”和“患者”的具体例子包括但不限于患有与肝脏、心脏、肺、肾脏、胰腺、脑、神经组织、血液、骨骼、骨髓等相关的疾病或病症的个体(特别是人)。

哺乳动物细胞可以来自人或非人哺乳动物。示例性非人哺乳动物包括但不限于小鼠、大鼠、猫、狗、兔、豚鼠、仓鼠、羊、猪、马、牛和非人灵长类动物(例如黑猩猩、猕猴和猿)。

在本文中，“低免疫原性多能细胞”、“低免疫性多能干细胞”、“低免疫性多能细胞”或“HIP细胞”是指保留其多能特征并且当转移到同种异体宿主中时引起减少的免疫排斥反应的多能细胞。在优选的实施方案中，HIP细胞不引起免疫反应。因此，“低免疫原性”或“低免疫性”是指与本文概述的免疫工程化之前的亲代(即“野生型”或“wt”)细胞的免疫反应相比，显著降低或消除的免疫反应。在许多情况下，HIP细胞在免疫学上是沉默的，但仍保留了多能能力。HIP特征的测定概述于下文中。

“HLA”或“人白细胞抗原”复合物是编码人中主要组织相容性复合物(MHC)蛋白的基因复合物。构成HLA复合物的这些细胞表面蛋白负责调节对抗原的免疫反应。在人中，有两种MHC，即I类和II类，“HLA-I”和“HLA-II”。HLA-I包括三种蛋白质，即HLA-A、HLA-B和HLA-C，它们从细胞内部呈递肽，而HLA-I复合物呈递的抗原吸引杀伤性T细胞(也称为CD8+T-细胞或细胞毒性T细胞)。HLA-I蛋白与β-2微球蛋白(B2M)相关。HLA-II包括五种蛋白质，即HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOB、HLA-DQ和HLA-DR，它们将抗原从细胞外呈递给T淋巴细胞。这刺激CD4+细胞(也称为T辅助细胞)。应当理解，“MHC”或“HLA”的使用并不意味着是限制性的，因为它取决于基因是来自人(HLA)还是鼠(MHC)。因此，由于它涉及哺乳动物细胞，这些术语在本文中可以互换使用。

本文的“基因敲除”是指使特定基因在其所驻留的宿主细胞中失活的过程，导致不产生感兴趣的蛋白质或形成失活形式。如本领域技术人员将理解的并且在下文中进一步描述，这可以通过许多不同的方式来完成，包括从基因中去除核酸序列，或用其他序列中断序列，改变阅读框，或改变核酸的调节组分。例如，感兴趣的基因的编码区的全部或部分可以被去除或被“无义”序列替代，调节序列如启动子的全部或一部分可以被去除或替代，翻译起始序列可以被去除或替代等。

本文中的“基因敲入”是指向宿主细胞增加遗传功能的过程。这导致编码的蛋白的水平增加。如本领域技术人员将理解的，这可以通过几种方式来实现，包括将基因的一个或多个其他拷贝添加至宿主细胞或改变内源基因的调节组分，从而增加蛋白质的表达。这可以通过修饰启动子、添加不同的启动子、添加增强子或修饰其他基因表达序列来实现。

“β-2微球蛋白”或“β2M”或“B2M”蛋白是指具有下文显示的氨基酸和核酸序列的人β2M蛋白；人基因的登录号为NC_000015.10:44711487-44718159。

“CD47蛋白”蛋白是指具有下文显示的氨基酸和核酸序列的人CD47蛋白；人基因的登录号为NC_000003.12:108043094-108094200。

“CIITA蛋白”蛋白是指具有下文显示的氨基酸和核酸序列的人CIITA蛋白；人基因的登录号为NC_000016.10:10866208-10941562。

在细胞的上下文中，“野生型”是指自然界中发现的细胞。然而，如本文所用的，在多能干细胞的背景下，它也意指可能包含导致多能性的核酸变化但未经历本发明的基因编辑程序以获得低免疫原性的iPSC。

本文中的“同基因”是指宿主生物体和细胞移植物的遗传相似性或同一性，其中存在免疫学相容性；例如没有产生免疫反应。

本文中的“同种异体”是指宿主生物和细胞移植物的遗传不相似性，其中产生免疫反应。

本文中的“B2M-/-”是指二倍体细胞在两个染色体中均具有失活的B2M基因。如本文所述，这能够以多种方式来完成。

本文中的“CIITA-/-”是指二倍体细胞在两个染色体中均具有失活的CIITA基因。如本文所述，这能够以多种方式来完成。

本文中的“CD47 tg”(代表“转基因”)或“CD47+”)是指宿主细胞表达CD47，在某些情况下，其具有至少一个额外拷贝的CD47基因。

“Oct多肽”是指转录因子的Octamer家族的任何天然存在的成员或其维持转录因子活性的变体，与最相关的天然存在的家族成员是相似的(至少50％、80％或90％的活性之内)，或至少包含天然存在的家族成员的DNA结合结构域并且可以还包含转录激活结构域的多肽。示例性的Oct多肽包括Oct-1、Oct-2、Oct-3/4、Oct-6、Oct-7、Oct-8、Oct-9和Oct-11。Oct3/4(在本文中称为“Oct4”)包含POU结构域，其是在Pit-1、Oct-1、Oct-2和uric-86中保守的150个氨基酸序列。(参见Ryan,A.K.&Rosenfeld,M.G.,Genes Dev.11:1207-1225(1997)，其通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，变体与天然存在的Oct多肽家族成员(例如与上文列出的那些或GenBank登录号NP-002692.2(人Oct4)或NP-038661.1(小鼠Oct4)中列出的那些)相比在其整个序列上具有至少85％、90％或95％的氨基酸序列同一性。Oct多肽(例如Oct3/4或Oct 4)可以来自人、小鼠、大鼠、牛、猪或其他动物。通常，相同种类的蛋白质将与被操纵的细胞种类一起使用。Oct多肽可以是能够帮助诱导非多能细胞中的多能性的多能因子。

“Klf多肽”是指Krüppel样因子(Klf)家族的任何天然存在的成员(其是含有与果蝇胚胎模式调节因子Krüppel相似的氨基酸序列的锌指蛋白)，或保持与最相关的天然存在的家族成员相似的(至少50％、80％或90％的活性之内)活性的天然存在成员的变体，或至少包含天然存在的家族成员的DNA结合结构域并且可以还包含转录激活结构域的多肽。(参见Dang,D.T.,Pevsner,J.&Yang,V.W.,Cell Biol.32:1103-1121(2000)，其通过引用整体并入本文)。示例性的Klf家族成员包括Klf1、Klf2、Klf3、Klf-4、Klf5、Klf6、Klf7、Klf8、Klf9、Klf10、Klf11、Klf12、Klf13、Klf14、Klf15、Klf16和Klf17。Klf2和Klf-4被发现是能够在小鼠中产生iPS细胞的因子，并且相关基因Klf1和Klf5也是这样，尽管具有降低的效率。(参见Nakagawa等人，Nature Biotechnology 26：101-106(2007)，其通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，变体与天然存在的Klf多肽家族成员(例如与上文列出的那些或GenBank登录号CAX16088(小鼠Klf4)或CAX14962(人Klf4)中列出的那些)相比在其整个序列上具有至少85％、90％或95％的氨基酸序列同一性。Klf多肽(例如，Klf1，Klf4和Klf5)可以来自人、小鼠、大鼠、牛、猪或其他动物。通常，相同种类的蛋白质将与被操纵的细胞种类一起使用。Klf多肽可以是多能因子。Klf4基因或多肽的表达可以帮助在起始细胞或起始细胞群中诱导多能性。

“Myc多肽”是指Myc家族的任何天然成员。(参见例如，Adhikary,S.&Eilers,M.,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.6:635-645(2005)，其通过引用整体并入本文)。它还包括与最相关的天然存在的家族成员相比维持相似转录因子活性(即至少50％、80％或90％的活性之内)的变体。它还包括至少包含天然存在的家族成员的DNA结合结构域并且可以还包含转录激活结构域的多肽。示例性的Myc多肽包括例如c-Myc、N-Myc和L-Myc。在一些实施方案中，变体与天然存在的Myc多肽家族成员(例如与上文列出的那些或Genbank登录号CAA25015(人Myc)中列出的那些)相比在其整个序列上具有至少85％、90％或95％的氨基酸序列同一性。Myc多肽(例如c-Myc)可以来自人、小鼠、大鼠、牛、猪或其他动物。通常，相同种类的蛋白质将与被操纵的细胞种类一起使用。Myc多肽可以是多能因子。

“Sox多肽”是指SRY相关HMG-盒(Sox)转录因子的任何天然存在的成员，其特征在于存在高迁移率基团(HMG)结构域或其与最相关的天然存在的家族成员相比维持相似转录因子活性(即至少50％、80％或90％的活性之内)的变体。它还包括至少包含天然存在的家族成员的DNA结合结构域并且可以还包含转录激活结构域的多肽。(参见例如，Dang,D.T.等人,Int.J.Biochem.Cell Biol.32:1103-1121(2000),，其通过引用整体并入本文)。示例性的Sox多肽包括例如Sox1、Sox-2、Sox3、Sox4、Sox5、Sox6、Sox7、Sox8、Sox9、Sox10、Sox11、Sox12、Sox13、Sox14、Sox15、Sox17、Sox18、Sox-21和Sox30。Sox1已被显示产生具有与Sox2相似的效率的iPS细胞，并且基因Sox3、Sox15和Sox18也以被显示产生iPS细胞，尽管效率略低于Sox2。(参见Nakagawa,等人,Nature Biotechnology26:101-106(2007)，其通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，变体与天然存在的Sox多肽家族成员(例如与上文列出的那些或Genbank登录号CAA83435(人Sox2)中列出的那些)相比在其整个序列上具有至少85％、90％或95％的氨基酸序列同一性。Sox多肽(例如Sox1、Sox2、Sox3、Sox15或Sox18)可以来自人、小鼠、大鼠、牛、猪或其他动物。通常，相同种类的蛋白质将与被操纵的细胞种类一起使用。Sox多肽可以是多能因子。如本文所述，SOX2蛋白发现了在iPSC的产生中的特定用途。

在本文中，“分化的低免疫原性多能细胞”或“分化的HIP细胞”或“dHIP细胞”是指经过工程化以具有低免疫原性(例如，通过敲除B2M和CIITA以及敲入CD47)并随后分化为用于最终移植入受试者的细胞类型的iPS细胞。因此，例如，HIP细胞可以分化为肝细胞(“dHIP肝细胞”)、β样胰腺细胞或胰岛类器官(“dHIPβ细胞”)、内皮细胞(“dHIP内皮细胞”)等。

在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一性”百分比是指当就最大对应性进行比较和比对时具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列，如使用下文描述的序列比较算法之一(例如，BLASTP和BLASTN或本领域技术人员可用的其他算法)或通过目视检查测量的。取决于应用，“同一性”百分比可以存在于被比较的序列的区域上，例如存在于功能结构域上，或者可替代地存在于要被比较的两个序列的全长上。对于序列比较，通常将一个序列用作与测试序列进行比较的参考序列。使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜寻方法，通过这些算法的计算机实施(Wisconsin Genetics Software Package,GeneticsComputer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过目视检查(一般参见Ausubel等人，见下文)来进行。

BLAST算法是适合确定序列同一性和序列相似性百分数的算法的一个例子，其描述于Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。可通过美国国家生物技术信息中心公开获得用于进行BLAST分析的软件。

“抑制剂”、“激活剂”和“调节剂”影响生物学相关分子的功能或表达。术语“调节剂”包括抑制剂和激活剂。它们可以使用体外和体内测定针对靶分子的表达或活性进行鉴定。

“抑制剂”是指例如抑制表达或结合靶分子或蛋白质的试剂。它们可以部分或全部阻断刺激或具有蛋白酶抑制剂活性。它们可以减少、降低、防止或延迟激活，包括所描述的靶蛋白活性的失活、脱敏或下调。调节剂可以是靶分子或蛋白质的拮抗剂。

“激活剂”是指例如诱导或激活靶分子或蛋白质的功能或表达的试剂。它们可以结合、刺激、增加、打开、激活或促进靶分子活性。激活剂可以是靶分子或蛋白质的激动剂。

“同源物”是在核苷酸序列、肽序列、功能或结构水平上与参考分子相似的生物活性分子。同源物可以包括与参考序列具有一定百分比同一性的序列衍生物。因此，在一个实施方案中，同源或衍生序列共有至少70％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，同源或衍生序列共有至少80％或85％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，同源或衍生序列共有至少90％的序列同一性。在一个具体的实施方案中，同源或衍生序列共有至少95％的序列同一性。在一个更具体的实施方案中，同源或衍生序列共有至少50、55、60、65、70、75、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96，97、98或99％的序列同一性。同源或衍生核酸序列也可以通过它们在高严格性杂交条件下保持与参考核酸序列结合的能力来定义。与参考分子具有结构或功能相似性的同源物可以是参考分子的化学衍生物。检测、产生和筛选结构和功能同源物以及衍生物的方法是本领域已知的。

“杂交”通常取决于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时，变性的DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间所需的同源性程度越高，可以使用的相对温度越高。结果，由此得出结论，较高的相对温度将倾向于使反应条件更严格，而较低的温度则不太严格。对于杂交反应的严格性的其他细节和解释，参见Ausubel等人,Current Protocols inMolecular Biology,Wiley Interscience Publishers(1995)，其全部内容通过引用并入本文。

杂交反应的“严格性”是本领域普通技术人员容易确定的，并且通常是取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算结果。通常，较长的探针需要较高的温度才能进行适当的退火，而较短的探针则需要较低的温度。

如本文所定义的“严格条件”或“高严格条件”可以通过以下方式鉴定：(1)采用低离子强度和高温用于洗涤，例如在50℃下的0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交过程中在42℃使用变性剂，例如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/pH 6.5的50Mm磷酸钠缓冲液，具有750Mm氯化钠、75Mm柠檬酸钠；或(3)在使用50％甲酰胺、5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50Mm磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt溶液、超声处理的鲑鱼精DNA(50μl/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖硫酸盐的溶液中在42℃下杂交过夜，在42℃下在0.2xSSC(氯化钠/柠檬酸钠)中洗涤10分钟，然后在55℃下在由含EDTA的0.1x SSC组成的高严格洗涤液中洗涤10分钟。

意欲的是贯穿本说明书给出的每个最大数值限制包括每个较低的数值限制，就像在本文明确地写出这些较低的数值限制一样。贯穿本说明书给出的每个最小数值限制将包括每个更高的数值限制，就像在本文中明确写出这些更高的数值限制一样。贯穿本说明书给出的每个数值范围将包括落入这样的较宽数值范围内的每个较窄数值范围，就像在本文中明确写出这些较窄数值范围一样。

如本文所用，术语“修饰”是指将修饰的分子与亲本分子物理区分的改变。在一个实施方案中，根据本文所述方法制备的CD47、HSVtk、EC-CD或iCasp9变体多肽中的氨基酸变化将其与未根据本文所述方法修饰的相应亲本(例如野生型蛋白、天然存在的突变蛋白或不包括这样的变体多肽的修饰的其他工程化蛋白)区分开。在另一个实施方案中，变体多肽包括一个或多个修饰，其将变体多肽的功能与未修饰的多肽区分开。例如，变体多肽中的氨基酸变化影响其受体结合特征谱。在其他实施方案中，变体多肽包含取代、缺失或插入修饰或其组合。在另一个实施方案中，变体多肽包括一个或多个修饰，其与未修饰的多肽的亲和力相比增加其对受体的亲和力。

在一个实施方案中，变体多肽包括相对于相应的天然或亲本序列的一个或多个取代、插入或缺失。在某些实施方案中，变体多肽包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21，22、23、24、25、26、27、28、29、30、31-40、41至50或51个或更多个修饰。

本文的“附加体载体”是指可以在细胞的细胞质中存在并自主复制的遗传载体；例如它没有整合到宿主细胞的基因组DNA中。许多附加体载体是本领域已知的，并描述于下文。

在基因的上下文中，“敲除”是指具有该敲除的宿主细胞不产生该基因的功能性蛋白质产物。如本文所述，敲除可以以多种方式从去除全部或部分编码序列、引入移码突变以使得不产生功能性蛋白(截短或无义序列)、去除或改变调节组分(例如启动子)以使得基因不被转录、通过与mRNA结合而阻止翻译等来产生。通常，敲除在基因组DNA水平上实现，使得细胞的后代也永久地携带敲除。

在基因的上下文中，“敲入”是指具有该敲入的宿主细胞在该细胞中具有更多的具有活性的功能蛋白。如本文所述，敲入可以以多种方式完成，通常通过将至少一个拷贝的编码蛋白质的转基因(tg)引入细胞中，尽管这也可以通过替换调节组分来完成，例如，通过向内源基因添加组成型启动子。通常，敲入技术导致转基因的额外拷贝整合到宿主细胞中。

VII.低免疫原性多能(HIP)细胞

本发明提供了用于产生HIP细胞的组合物和方法，其从野生型细胞开始，使其具有多能性(例如制备诱导多能干细胞或iPSC)，然后从iPSC群体产生HIP细胞。

A.用于基因改变的方法

本发明包括修饰细胞内或无细胞条件下的核酸序列以产生多能细胞和HIP细胞的方法。示例性技术包括同源重组、敲入、ZFN(锌指核酸酶)、TALEN(转录激活因子样效应核酸酶)、大范围核酸酶(例如归巢内切核酸酶)、CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)/Cas9以及其他位点特异性核酸酶技术。这些技术使得能够在所需的基因座位点进行双链DNA断裂。这些受控的双链断裂促进特定基因座位点的同源重组。该过程集中于用核酸内切酶靶向核酸分子(例如染色体)的特定序列，所述核酸内切酶识别并结合该序列并诱导核酸分子中的双链断裂。双链断裂通过易错的非同源末端连接(NHEJ)或通过同源重组(HR)修复。

如本领域技术人员将理解的，可以使用许多不同的技术来工程化本发明的多能细胞以及工程化iPSC以使其变得如本文所述的具有低免疫原性。

通常，这些技术可以单独或组合使用。例如，在HIP细胞的产生中，可以使用CRISPR/Cas技术来降低工程化细胞中活性B2M和/或CIITA蛋白的表达，并利用病毒技术(例如逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒)来敲入CD47功能性。此外，如本领域技术人员将理解的，尽管一个实施方案顺序地利用CRISPR/Cas步骤敲除B2M，随后通过CRISPR/Cas步骤敲除CIITA，最后一步利用慢病毒敲入CD47功能性，但这些基因可以使用不同的技术以不同的顺序进行操作。

如下文更充分讨论的，通常进行重编程基因的瞬时表达以产生/诱导多能干细胞。

a.CRISPR/Cas技术

在一个实施方案中，使用本领域已知的成簇规律间隔短回文重复序列/Cas(“CRISPR”)技术来操纵细胞。CRISPR/Cas可用于生成起始iPSC或从iPSC生成HIP细胞。存在大量基于CRISPR/Cas的技术，参见例如Doudna and Charpentier,Science doi:10.1126/science.1258096，其通过引用并入本文。CRISPR技术和试剂盒是商业出售的。

b.TALEN技术

在一些实施方案中，本发明的HIP细胞使用转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)方法制备。TALEN是与可以被工程化以结合并实际上切割任何所需的DNA序列的核酸酶组合的限制性酶。TALEN试剂盒是商业出售的。

c.锌指技术

在一个实施方案中，使用锌指核酸酶技术操纵细胞。锌指核酸酶是通过将锌指DNA结合结构域融合至DNA切割结构域而产生的人工限制性酶。锌指结构域可以被工程化以靶向特定的所需DNA序列，这使得锌指核酸酶能够靶向复杂基因组中的独特序列。类似于CRISPR和TALEN，通过利用内源性DNA修复机制，这些试剂可用于精确地改变高等生物的基因组。

d.基于病毒的技术

有多种病毒技术可用于产生本发明的HIP细胞(以及用于iPSC的原始产生)，包括但不限于使用逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和仙台病毒载体。下文描述了用于产生iPSC的附加体载体。

e.使用干扰RNA的基因下调

在其他实施方案中，编码在HLA分子中使用的蛋白质的基因通过RNA干扰(RNAi)技术下调。RNAi是指其中RNA分子通常通过引起特定的mRNA分子降解来抑制基因表达的过程。两种类型的RNA分子(微RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA))可用于RNA干扰。它们与靶mRNA分子结合并增加或降低其活性。RNAi帮助细胞防御寄生核酸，例如来自病毒和转座子的核酸。RNAi还影响发育。

根据特定的实施方案，抑制性核酸是抑制靶基因例如B2M基因和CIITA基因的表达的反义寡核苷酸。这样的反义寡核苷酸可以是在细胞条件下与编码靶蛋白的细胞mRNA和/或基因组DNA特异性杂交(例如结合)从而抑制基因的转录和/或翻译的核酸(DNA或RNA)。结合可以通过常规碱基对互补性进行。可选择地，例如在结合DNA双链体的情况下，结合可以通过双螺旋的大沟中的特异性相互作用进行。尽管是优选的，但是绝对互补性不是必需的。

因此，根据一个实施方案，反义寡核苷酸是单链或双链DNA分子，更优选双链DNA分子。根据另一个实施方案，反义寡核苷酸是单链或双链RNA分子，更优选地是单链RNA分子。在一些情况下，反义寡核苷酸是对内源核酸酶例如核酸外切酶和/或核酸内切酶具有抗性的修饰的寡核苷酸，因此在体内和体外是稳定的。

可以在碱基部分、糖部分或磷酸主链上修饰反义寡核苷酸，例如以改善分子的稳定性。反义寡核苷酸可包括其他附加基团，例如肽(例如，用于靶向宿主细胞受体)或促进跨细胞膜转运的试剂。反义寡核苷酸可以与另一种分子例如肽或转运剂缀合。在一些情况下，反义寡核苷酸包含至少一个修饰的碱基部分，其选自包括但不限于以下的组：5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羟基三乙基)尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷，5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶(carboxymethylanninonnethyluracil)，二氢尿嘧啶，β-D-半乳糖基鸟苷，肌苷，N6-异戊烯腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2,2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-甘露糖基鸟苷，5-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸(oxyacetic acid)(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，鸟苷，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶，(acp3)w和2,6-二氨基嘌呤。

在某些实施方案中，反义寡核苷酸包含至少一个修饰的糖部分，其选自包括但不限于以下的组：阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。在其他实施方案中，反义寡核苷酸包含至少一个修饰的磷酸主链，其选自包括但不限于以下的组：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯和甲缩醛(formacetal)或其类似物。

sdRNA分子是一类不对称的siRNA，其包含19-21个碱基的引导(反义)链。它们可以包含5'磷酸、2'Ome或2'F修饰的嘧啶以及在3'位置的六个硫代磷酸酯(phosphotioate)。它们可以含有有义链，该有义链包含3'缀合的固醇部分、3'位置的2硫代磷酸酯(phosphotioate)和2'Ome修饰的嘧啶。两条链均可以含有2’Ome嘌呤，其中未修饰嘌呤的连续区段的长度不超过3。美国专利号8,796,443中公开了sdRNA，该专利全文以引用方式并入本文。

对于所有这些技术，使用众所周知的重组技术来产生如本文概述的重组核酸。在某些实施方案中，重组核酸(不编码所需多肽，例如CD47，或破坏序列)可以可操作地连接至表达构建体中的一个或多个调节核苷酸序列。调节核苷酸序列通常将适合于宿主细胞和待治疗的受试者。对于多种宿主细胞，多种类型的合适的表达载体和合适的调节序列是本领域已知的。通常，一个或多个调节核苷酸序列可包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活序列。还考虑了本领域已知的组成型或诱导型启动子。这些启动子可以是天然存在的启动子，也可以是结合多于一个启动子的元件的杂合启动子。表达构建体可以存在于附加体例如质粒或载体的细胞中，或者表达构建体可以被插入到染色体中。在一个具体的实施方案中，表达载体包括选择标记基因，以允许选择转化的宿主细胞。某些实施方案包括表达载体，该表达载体包含与至少一个调节序列可操作连接的编码变体多肽的核苷酸序列。用于本文的调节序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。在某些实施方案中，表达载体被设计用于选择要转化的宿主细胞，希望被表达的特定变体多肽，载体的拷贝数，控制该拷贝数的能力或载体编码的任何其他蛋白质如抗生素标志物的表达。

合适的启动子的实例包括，例如，来自以下基因的启动子：仓鼠的泛素/S27a启动子(WO 97/15664)、猿猴空泡病毒40(SV40)早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-I启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)的长末端重复区、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子(MMTV)、莫洛尼鼠白血病病毒长末端重复区和人巨细胞病毒(CMV)的早期启动子。其他异源哺乳动物启动子的实例是肌动蛋白、免疫球蛋白或热休克启动子。在一些实施方案中，使用延伸因子1-α启动子。

在另外的实施方案中，用于哺乳动物宿主细胞的启动子可以从病毒的基因组中获得，所述病毒为例如多瘤病毒、鸡痘病毒(1989年7月5日公开的UK 2,211,504)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)。在其他实施方案中，使用异源哺乳动物启动子。实例包括肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子和热休克启动子。SV40的早期和晚期启动子可方便地以SV40限制性片段的形式获得，其中还包含SV40病毒的复制起点。Fiers等人，Nature 273：113-120(1978)。人巨细胞病毒的立即早期启动子可以作为HindIII E限制性片段方便地获得。Greenaway,P.J.等人,Gene 18:355-360(1982)。前述参考文献通过引用整体并入本文。

B.多能细胞的产生

本发明提供了从多能细胞产生非免疫原性多能细胞的方法。因此，第一步是提供多能干细胞。

小鼠和人多能干细胞(通常称为iPSC：鼠细胞为miPSC或人细胞为hiPSC)的生成在本领域中是众所周知的。如本领域技术人员将理解的，存在多种用于生成iPSC的方法。最初的诱导是使用四种转录因子即Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的病毒导入从小鼠胚胎或成年成纤维细胞完成的：参见Takahashi and Yamanaka Cell 126:663-676(2006)，其全部内容(特别是其中概述的技术)通过引用并入本文。从那时起，开发了许多方法：综述参见Seki等人,World J.Stem Cells7(1):116-125(2015)，以及Lakshmipathy and Vermuri,editors,Methods in Molecular Biology:Pluripotent Stem Cells,Methods and Protocols,Springer 2013，在此通过引用将它们的全部内容(尤其是用于生成hiPSC的方法(参见例如，后一参考文献的第3章))明确地并入本文。

一般而言，iPSC是通过宿主细胞中一种或多种“重编程因子”的瞬时表达(通常使用附加体载体引入的)而产生的。在这些条件下，少量的细胞被诱导成为iPSC(通常，此步骤的效率很低，因为没有使用选择标志物)。一旦细胞被“重新编程”并变得多能，它们就会失去附加体载体并利用内源基因产生因子。附加体载体的这样的损失导致被称为“零足迹”细胞的细胞。这是期望的，因为遗传修饰越少(尤其是在宿主细胞的基因组中)越好。因此，优选所得的hiPSC不具有永久的遗传修饰。

如本领域技术人员还理解的，可以使用或所使用的重编程因子的数量可以变化。通常，当使用较少的重编程因子时，将细胞转化为多能状态的效率以及例如“多能性”降低，例如较少的重编程因子可以导致不完全多能性但可仅能够分化为较少的细胞类型的细胞。

在一些实施方案中，使用单个重编程因子OCT4。在其他实施方案中，使用两个重编程因子OCT4和KLF4。在其他实施方案中，使用三个重编程因子OCT4、KLF4和SOX2。在其他实施方案中，使用四个重编程因子OCT4、KLF4、SOX2和c-Myc。在其他实施方案中，可以使用选自SOKMNLT：SOX2、OCT4(POU5F1)、KLF4、MYC、NANOG、LIN28和SV40L T抗原的5、6或7个重编程因子。

通常，这些重编程因子基因在附加体载体上提供，如本领域已知的和可商购的。例如，ThermoFisher/Invitrogen出售一种用于hiPSC的零足迹生成的仙台病毒重编程试剂盒，参见目录号A34546。ThermoFisher还销售基于EBNA的系统，参见目录号A14703。

另外，有许多可商购的hiPSC细胞系可用：参见例如，

Episomal hiPSC细胞系，K18945，其为零足迹、无病毒整合的人iPSC细胞系(还参见Burridge等人，2011，同上)。

通常，如本领域已知的，iPSC由非多能细胞例如CD34+脐带血细胞、成纤维细胞等通过瞬时表达如本文所述的重编程因子制成。

例如，尽管省略了C-Myc，但是仅使用Oct3/4、Sox2和Klf4尽管具有降低的重编程效率也产生了成功的iPSC。

通常，iPSC的特征在于某些因子的表达，这些因子包括KLF4、Nanog、OCT4、SOX2、ESRRB、TBX3、c-Myc和TCL1。为了本发明的目的，这些因子的新的或增加的表达可以是通过内源基因座的诱导或调节或来自转基因的表达。

例如，可以使用Diecke等人,Sci Rep.2015,Jan.28；5:8081(doi:10.1038/srep08081)(在此通过引用整体特别是针对用于产生miPSC的方法和试剂并入本文)的方法产生鼠iPSC。还参见例如Burridge等人，PLoS One，2011 6(4)：18293，其通过引用整体特别是针对其中概述的方法并入本文。

在一些情况下，如本文概述的那样测量或确认细胞的多能性，例如通过测定PCT/US18/13688中通常显示的重编程因子或通过进行其中例如实施例中概述的分化反应。

C.低免疫原性多能(HIP)细胞的产生

本发明涉及如本文所定义的将低免疫原性细胞产生、操纵、生长和移植到患者中。从多能细胞生成HIP细胞使用少至三个遗传改变进行，导致细胞活性的最小破坏，但赋予细胞免疫沉默。

如本文所讨论的，一个实施方案利用MHC I和II(当细胞是人的时为HLA I和II)的蛋白质活性的降低或消除。这可以通过改变编码其组分的基因来完成。在一个实施方案中，使用CRISPR/Cas破坏基因的编码区或调节序列。在另一个实施方案中，使用干扰RNA技术减少基因翻译。第三个变化是调节对巨噬细胞吞噬作用的敏感性的基因例如CD47的变化，并且这通常是使用病毒技术的基因“敲入”。

HIP细胞的其他描述可见于2018年1月14日提交的国际申请号PCT/US18/13688和2017年1月13日提交的美国临时申请号62/445,969，其全部公开内容(特别是实施例、附图、附图描述以及产生低免疫原性的多能干细胞并将这样的细胞分化为其他细胞类型的描述)通过引用并入本文。

在一些情况下，在使用CRISPR/Cas进行遗传修饰的情况下，可以使用包含Cas9构建体的hiPSC细胞，所述Cas9构建体使得能够实现细胞系的高效编辑：参见例如，来自LifeTechnologies的人附加体Cas9 iPSC细胞系A33124。

1.HLA-I减少

本发明的HIP细胞包括MHC I功能(当细胞来源于人细胞时为HLA I)的降低。

如本领域技术人员将理解的，功能的降低可以以多种方式实现，包括从基因中去除核酸序列，用其他序列中断序列或改变该核酸的调节组分。例如，感兴趣的基因的编码区的全部或一部分可以被去除或被“无义”序列取代，可以进行移码突变，调节序列如启动子的全部或一部分可以被去除或取代，可以去除或取代翻译起始序列等。

如本领域技术人员将理解的，可以使用本领域已知并如下文所述的技术；例如，使用结合HLA复合物的标记的抗体的FACS技术；例如，使用与人主要组织相容性HLA I类抗原的α链结合的市售HLA-A、B、C抗体来测量多能细胞中的MHC I功能(当细胞来源于人细胞时为HLA I)的成功降低。

B2M改变

在一个实施方案中，通过破坏多能干细胞中β-2微球蛋白基因(本文公开了其人序列)的表达来完成HLA-I活性的降低。该改变在本文中通常被称为基因“敲除”，并且在本发明的HIP细胞中，其在宿主细胞中的两个等位基因上完成。通常，进行两次破坏的技术是相同的。

一个特别有用的实施方案使用CRISPR技术来破坏基因。在某些情况下，CRISPR技术用于将小的缺失/插入引入基因的编码区中，使得不产生功能蛋白，这通常是移码突变的结果，其导致终止密码子的生成，使得产生截短的非功能性蛋白。

因此，有用的技术是使用被设计为靶向小鼠中的B2M基因或人中的B2M基因的编码序列的CRISPR序列。基因编辑后，将转染的iPSC培养物解离为单个细胞。将单细胞扩增至全尺寸集落，并通过筛选来自CRISPR切割位点的异常序列的存在来评估CRISPR/Cas编辑。挑选在两个等位基因中都具有缺失的克隆。如通过PCR所示的，这样的克隆不表达B2M，并且如通过FACS分析所示的，这样的克隆不表达HLA-I(参见例如PCT/US18/13688的实施例1和6)。

测试B2M基因是否已被失活的测定是已知的并在本文中描述了。在一个实施方案中，该测定是用针对B2M蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹。在另一个实施方案中，重逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)证实了失活改变的存在。

此外，可以评估细胞以确认HLA I复合物不在细胞表面上表达。这可以通过使用针对如上文所讨论的一种或多种HLA细胞表面组分的抗体的FACS分析来测定。

值得注意的是，当试图使两个等位基因上的B2M基因沉默时，其他公开的结果较差。参见例如Gornalusse等人,Nature Biotech.Doi/10.1038/nbt.3860)。

2.HLA-II减少

除了减少HLA I外，本发明的HIP细胞还缺乏MHC II功能(当细胞来源于人细胞时为HLA II)。

如本领域技术人员将认识到的，功能的降低可以通过多种方式实现，包括从基因中去除核酸序列，向基因中添加核酸序列，破坏阅读框，用其他序列中断序列或改变该核酸的调节组分。在一个实施方案中，感兴趣的基因的编码区的全部或一部分可以被去除或被“无义”序列取代。在另一个实施方案中，调节序列例如启动子可以被去除或取代，可以去除或取代翻译起始序列等。

多能细胞或其衍生物中MHC II功能(当细胞来源于人细胞时为HLA II)的成功降低可以使用本领域已知的技术测量，例如使用针对蛋白质的抗体的蛋白质印迹、FACS技术、rt-PCR技术等。

CIITA改变

在一个实施方案中，通过破坏多能干细胞中CIITA基因(本文显示了其人序列)的表达来完成HLA-II活性的降低。该改变在本文中通常被称为基因“敲除”，并且在本发明的HIP细胞中，其在宿主细胞中的两个等位基因上完成。

测试CIITA基因是否已被失活的测定是已知的并在本文中描述了。在一个实施方案中，该测定是用针对CIITA蛋白的抗体探测的细胞裂解物的蛋白质印迹。在另一个实施方案中，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)证实了失活改变的存在。

此外，可以评估细胞以确认HLA II复合物不在细胞表面上表达。再次，如下文所述，该测定如本领域已知进行(参见例如PCT/US18/13688的图21)，并且通常使用基于与人HLA II类HLA-DR、DP和大多数DQ抗原结合的商业抗体的蛋白质印迹或FACS分析进行。

一个特别有用的实施方案使用CRISPR技术来破坏CIITA基因。CRISPR被设计用于靶向小鼠中的CIITA基因或人中的CIITA基因(所有MHC II分子必不可少的转录因子)的编码序列。基因编辑后，将转染的iPSC培养物解离成单个细胞。它们被扩增为全尺寸集落，并通过筛选来自CRISPR切割位点的异常序列的存在来评估成功的CRISPR编辑。如通过PCR确定的，具有缺失的克隆不表达CIITA，并且如通过FACS分析确定的，其不表达MHC II/HLA-II。

3.巨噬细胞吞噬作用和/或NK细胞杀伤的减少

除了通常使用B2M和CIITA敲除来减少HLA I和II(或MHC I和II)之外，本发明的HIP细胞具有降低的对巨噬细胞吞噬作用和NK细胞杀伤的敏感性。产生的HIP细胞由于一种或多种CD47转基因的表达而“逃避”了免疫巨噬细胞和先天途径。

在PCT/US18/13688的图14A-14C和34A-34C中显示了HIP细胞和来源于HIP细胞的细胞逃避或逃脱NK细胞杀伤和/或巨噬细胞吞噬作用的能力，该专利申请的内容特别是附图、附图描述和实施例通过引用并入本文。例如，图14B-14C显示了小鼠HIP细胞(例如，B2m-/-Ciita-/-CD47转基因小鼠iPSC)不能诱导NK细胞的CD107a表达，因此没有引起NK细胞反应。另外，已证明这样的小鼠HIP细胞不诱导NK细胞的激活或IFNγ的释放。当将NK细胞与来源于HIP细胞的分化细胞(例如内皮细胞、平滑肌细胞和心肌细胞)一起孵育时，不诱导NK细胞反应(参见例如，PCT/US18/13688的图34A-34C)。

增加的CD47表达

在一些实施方案中，降低的巨噬细胞吞噬作用和NK细胞杀伤敏感性是由HIP细胞表面上增加的CD47引起的。如本领域技术人员将理解的，这以几种方式使用“敲入”或转基因技术完成。在某些情况下，增加的CD47表达由一个或多个CD47转基因引起。

因此，在一些实施方案中，在诱导型或组成型启动子的控制下，将一个或多个拷贝的CD47基因添加至HIP细胞，其中组成型启动子是优选的。在一些实施方案中，如本文所述或本领域已知的使用慢病毒构建体。如本领域中已知的，CD47基因可以在合适的启动子的控制下整合到宿主细胞的基因组中。

HIP细胞系从B2M-/-CIITA-/-iPSC产生。使用杀稻瘟菌素标志物选择含有表达CD47的慢病毒载体的细胞。合成CD47基因序列，并将DNA克隆到具有杀稻瘟菌素抗性的慢病毒pLenti6/V5质粒中(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)。

在一些实施方案中，可以通过改变内源性CD47基因的调节序列来增加CD47基因的表达，例如，通过将内源性启动子交换为组成型启动子或不同的诱导型启动子。通常可以使用已知技术(例如CRISPR)来完成此操作。

一旦改变，就可以使用已知技术，例如实施例中所述的技术，例如使用抗CD47抗体的蛋白质印迹、ELISA测定或FACS测定，来测定足够的CD47表达的存在。通常，本文中的“足够”是指HIP细胞表面上CD47的表达的增加，这使NK细胞杀伤和/或巨噬细胞吞噬作用沉默。细胞上的天然表达水平过低而不能保护它们在其MHC I被移除后免受NK细胞裂解的影响。

4.自杀基因

在一些实施方案中，本发明提供了包含“自杀基因”或“自杀开关”的低免疫原性的多能细胞。这些被掺入以起到“安全开关”的作用，其可在低免疫原性的多能细胞以不希望的方式生长和分裂时导致低免疫原性的多能细胞的死亡。“自杀基因”消融方法在编码蛋白质的基因转移载体中包括自杀基因，其仅在被特定化合物激活时才导致细胞杀伤。自杀基因可以编码选择性地将无毒化合物转化为高毒性代谢产物的酶。结果是特异性消除表达该酶的细胞。在一些实施方案中，自杀基因是疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因，并且触发剂是更昔洛韦。在其他实施方案中，自杀基因是大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(EC-CD)基因，并且触发剂是5-氟胞嘧啶(5-FC)(Barese等人,Mol.Therap.20(10):1932-1943(2012),Xu等人,CellRes.8:73-8(1998)，两者均通过引用整体并入本文)。

在其他实施方案中，自杀基因是诱导型胱天蛋白酶。诱导型胱天蛋白酶蛋白包含能够诱导凋亡的胱天蛋白酶蛋白的至少一部分。在一个实施方案中，胱天蛋白酶的一部分在SEQ ID NO：6中示例。在优选的实施方案中，诱导型胱天蛋白酶是iCasp9。它包含具有F36V突变的人FK506结合蛋白FKBP12的序列，其通过一系列氨基酸与编码人胱天蛋白酶9的基因相连。FKBP12-F36V与小分子二聚剂AP1903高亲和力结合。因此，本发明中iCasp9的自杀功能通过二聚化的化学诱导剂(CID)的施用来触发。在一些实施方案中，CID是小分子药物AP1903。二聚化导致凋亡的快速诱导。(参见WO2011146862；Stasi等人,N.Engl.J.Med365；18(2011)；Tey等人,Biol.Blood Marrow Transplant.13:913-924(2007)，其各自通过引用整体并入本文)。

5.HIP表型和多能性保留的测定

一旦产生了HIP细胞，就可以如本文和实施例中一般描述的那样测定它们的低免疫原性和/或多能性保留。

例如，使用PCT/US18/13688的图13和图15例示的多种技术测定低免疫原性。这些技术包括移植到同种异体宿主中和监测逃避宿主免疫系统的HIP细胞生长(例如畸胎瘤)。HIP衍生物被转导以表达萤光素酶，然后可以使用生物发光成像进行追踪。类似地，分析宿主动物对HIP细胞的T细胞和/或B细胞反应，以确认HIP细胞不在宿主动物中引起免疫反应。T细胞功能通过Elispot、ELISA、FACS、PCR或质谱细胞计量术(CYTOF)进行评估。使用FACS或luminex评估B细胞反应或抗体反应。另外或可替代地，可以测定细胞避免先天免疫反应例如NK细胞的杀伤的能力，如PCT/US18/13688的图14A-14C一般所示的。在体外或体内评估NK细胞裂解活性(如PCT/US18/13688的图15A-15B所示)。

类似地，以多种方式评估多能性的保留。在一个实施方案中，通过某些多能特异性因子的表达来测定多能性，如本文一般所述和PCT/US18/13688的图29所示。另外地或可替代地，作为多能性的指示，HIP细胞被分化成一种或多种细胞类型。

D.HIP细胞的优选实施方案

本文提供了具有低免疫原性的多能干细胞(“HIP细胞”)，当其被移植到同种异体宿主例如人患者中(作为HIP细胞或作为HIP细胞的分化产物)时，其表现出多能性但不导致宿主免疫反应。

在一个实施方案中，通过以下方式使人多能干细胞例如人诱导多能干细胞具有低免疫原性：a)每个等位基因处的B2M基因的破坏(例如B2M-/-)，b)每个等位基因处的CIITA基因的破坏(例如CIITA-/-)，以及c)通过CD47基因的过表达(CD47+，例如通过引入CD47基因的一个或多个额外拷贝或激活基因组基因)。这使得hiPSC群体为B2M-/-CIITA-/-CD47tg。在一个优选的实施方案中，细胞是非免疫原性的。在另一个实施方案中，如上文所述使HIP细胞成为非免疫原性的B2M-/-CIITA-/-CD47转基因，但是通过包含在需要时被诱导以体内杀死细胞的诱导型自杀基因来进一步修饰。

E.HIP细胞的维持

一旦生成，HIP细胞就可以如对于维持iPSC所已知的维持在未分化状态。例如，使用防止分化并保持多能性的培养基在基质胶(Matrigel)上培养HIP细胞。

F.HIP细胞的分化

本文所述的HIP细胞可以分化成不同的细胞类型。HIP的多能性可以通过将细胞分化为内胚层、中胚层和外胚层细胞类型进行评估。在某些情况下，通过畸胎瘤形成评估HIP细胞。

如本领域技术人员将理解的，用于分化的方法取决于使用已知技术的所需细胞类型。细胞在悬浮液中分化，然后置于凝胶基质形式例如基质胶、明胶或纤维蛋白/凝血酶形式中以促进细胞存活。如本领域已知的，通常通过评估细胞特异性标志物的存在来测定分化。

在一些实施方案中，HIP细胞分化成肝细胞以解决肝细胞功能的丧失或肝硬化。有许多技术可用于将HIP细胞分化为肝细胞：参见例如Pettinato等人,doi:10.1038/spre32888,Snykers等人,Methods Mol Biol 698:305-314(2011),Si-Tayeb等人,Hepatology 51:297-305(2010)和Asgari等人,Stem Cell Rev(:493-504(2013)，所有这些文献均明确地通过引用全文(特别是针对用于分化的方法和试剂)并入本文。如本领域已知地测定分化，通常通过评估肝细胞相关和/或特异性标志物(包括但不限于白蛋白、甲胎蛋白和纤维蛋白原)的存在。还可以在功能上例如氨的代谢、LDL储存和吸收、ICG吸收和释放以及糖原存储测定分化。

在一些实施方案中，HIP细胞分化成β样细胞或胰岛类器官用于移植以治疗I型糖尿病(T1DM)。细胞系统是解决T1DM的有前途的方法，参见例如Ellis等人，doi/10.1038/nrgastro.2017.93，其通过引用并入本文。此外，Pagliuca等人报道了成功地从hiPSC分化出β细胞的方法(参见doi/10.106/j.cell.2014.09.040，通过引用全文(特别是其中概述的用于从人多能干细胞大规模生产功能性人β细胞的方法和试剂)并入本文)。此外，Vegas等人显示了从人多能干细胞产生人β细胞，然后进行封装以避免被宿主免疫排斥；(doi：10.1038/nm.4030，通过引用全文(特别是其中概述的用于从人多能干细胞大规模生产功能性人β细胞的方法和试剂)并入本文)。

如本领域已知的，通常通过评估β细胞相关或特异性标志物(包括但不限于胰岛素)的存在来测定分化。分化也可以在功能上进行测量，例如测量葡萄糖代谢，一般参见Muraro等人，doi：10.1016/j.cels.2016.09.002，在此通过引用全文(特别是针对其中概述的生物标志物)并入本文。

一旦产生了来源于HIP细胞的β细胞，就可以将它们(作为细胞悬浮液或在本文讨论的凝胶基质内)移植到门静脉/肝、大网膜、胃肠道粘膜、骨髓、肌肉或皮下袋中。

在一些实施方案中，HIP细胞分化成视网膜色素上皮(RPE)以解决眼睛的视力障碍疾病。使用Kamao等人,Stem Cell Reports2014:2:205-18(在此通过引用全文(特别是针对其中概述的用于分化技术和试剂的方法和试剂)并入本文)中概述的技术将人多能干细胞分化为RPE细胞；还参见Mandai等人，doi：10.1056/NEJMoa1608368，其也针对用于产生RPE细胞片和移植到患者中的技术整体并入本文。

如本领域已知的，通常可以通过评估RPE相关和/或特异性标志物的存在或通过功能性测量来测定分化。参见例如Kamao等人，doi：10.1016/j.stemcr.2013.12.007，其通过引用整体(特别是针对结果部分第一段中概述的标志物)并入本文。

在一些实施方案中，HIP细胞分化成心肌细胞以解决心血管疾病。用于将hiPSC分化为心肌的技术是本领域已知的，并且在实施例中进行了讨论。可以如本领域中已知的来测定分化，通常通过评估心肌细胞相关或特异性标志物的存在或通过功能性测量来进行：参见例如Loh等人，doi：10.1016/j.cell.2016.06.001，其通过引用整体(特别是针对分化干细胞包括心肌细胞的方法)并入本文。

在一些实施方案中，HIP细胞分化成内皮集落形成细胞(ECFC)以形成新的血管以解决外周动脉疾病。分化内皮细胞的技术是已知的。参见例如，Prasain等人，doi：10.1038/nbt.3048，其通过引用整体(特别是针对用于从人多能干细胞产生内皮细胞的方法和试剂，以及针对移植技术)并入本文。可以如本领域中已知的来测定分化，通常通过评估内皮细胞相关或特异性标志物的存在或通过功能性测量来进行。

在一些实施方案中，HIP细胞分化为可分泌甲状腺激素的甲状腺祖细胞和甲状腺滤泡类器官以解决自身免疫性甲状腺炎。分化甲状腺细胞的技术是本领域已知的。参见例如Kurmann等人，doi：10.106/j.stem.2015.09.004，其通过引用整体(特别是针对从人多能干细胞产生甲状腺细胞的方法和试剂以及针对移植技术)并入本文。如本领域已知的来测定分化，通常通过评估甲状腺细胞相关或特异性标志物的存在或通过功能性测量来进行。

VIII.来源于HIP细胞的低免疫性嵌合抗原受体T细胞

本发明提供了从HIP细胞分化的工程化T细胞，所述HIP细胞包含编码包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的CAR的核酸。在一些实施方案中，CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域的细胞内信号传导结构域。在本发明的另一方面，本文提供了低免疫原性的多能细胞，其包含编码包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的CAR的核酸。可以将这种低免疫原性的多能细胞体外分化为T细胞，以产生低免疫原性的CAR-T(HI-CAR-T)细胞。

在一些实施方案中，低免疫原性CAR-T细胞缺乏MHC I功能或HLA-1功能。例如，低免疫原性CAR-T细胞具有表达降低的HLA-A蛋白、HLA-B蛋白和HLA-C蛋白或缺乏其表达。在特定情况下，低免疫原性CAR-T细胞具有遗传修饰以使编码HLA-A蛋白的基因、编码HLA-B蛋白的基因、编码HLA-C蛋白的基因失活。在某些情况下，低免疫原性CAR-T细胞具有表达降低的β-2微球蛋白或缺乏其表达。在一些实施方案中，此类细胞具有使编码β-2微球蛋白的基因失活的遗传修饰。这种低免疫原性CAR-T细胞可以从缺乏HLA-1功能的低免疫原性多能细胞分化而来。在一些实施方案中，低免疫原性多能细胞具有使编码β-2微球蛋白的基因失活的遗传修饰。

在某些实施方案中，低免疫原性CAR-T细胞缺乏MHC II功能或HLA-II功能。在某些情况下，低免疫原性CAR-T细胞表达降低的HLA-DP蛋白、HLA-DR蛋白和HLA-DQ蛋白或缺乏其表达。低免疫原性CAR-T细胞可能具有遗传修饰，以使编码HLA-DP蛋白的基因、编码HLA-DR蛋白的基因、编码HLA-DQ蛋白的基因失活。在一些实施方案中，低免疫原性CAR-T细胞具有表达降低的CIITA蛋白或缺乏其表达。在一些实施方案中，此类细胞具有使编码CIITA的基因失活的遗传修饰。这种低免疫原性CAR-T细胞可以从缺乏HLA-II功能的低免疫原性多能细胞分化而来。在一些实施方案中，低免疫原性多能细胞具有使编码CIITA的基因失活的基因修饰。

在一些实施方案中，与野生型或天然T细胞相比，低免疫原性CAR-T细胞具有增加的CD47蛋白表达。在其他实施方案中，与野生型或天然多能细胞相比，低免疫原性多能细胞具有增加的CD47蛋白表达。CD47表达的增加可能是由于内源性CD47基因的遗传修饰所致。在其他情况下，表达增加是由于表达外源CD47基因，例如编码CD47的外源核酸。这种低免疫原性CAR-T细胞可以从过表达CD47蛋白的低免疫原性多能细胞分化而来。在一些实施方案中，低免疫原性多能细胞具有增加的CD47蛋白表达。

在一些实施方案中，低免疫原性CAR-T细胞包含自杀基因，例如但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因，大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因和编码诱导型胱天蛋白酶-9蛋白的基因。自杀基因可以在使包含基因的细胞暴露于引起细胞死亡的化学试剂(例如化学触发剂)后被激活。HSV-tk的化学触发剂可以是双脱氧核苷类似物，例如更昔洛韦。EC-CD的化学触发剂可以是5-氟胞嘧啶(5-FC)。胱天蛋白酶-9的化学触发剂可以是二聚化的化学诱导剂(CID)，例如化合物AP1903。因此，低免疫原性多能细胞包含自杀基因，并分化为本文所述的任一种低免疫原性CAR-T细胞。

关于胞嘧啶脱氨酶自杀基因系统的描述可以在例如Mullin等人，CancerResearch，1994，54：1503-1506中找到。关于胸苷激酶自杀基因系统的细节可以在例如Moolten，Cancer Research，1986，46(10)：5276-5281中找到。诱导型胱天蛋白酶-9自杀基因系统的详细描述可以在例如Gargett and Brown，Front Pharmacol，2014，5：235中找到。

A.嵌合抗原受体

在各种实施方案中，抗原结合结构域结合靶细胞例如癌细胞上的抗原。如本领域所知，抗原结合结构域(也称为细胞外结构域)可以结合抗原。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体、非人抗体、纳米抗体、单链可变片段(scFv)、F(ab')2、Fab'、Fab、Fv等。

抗原结合结构域可包括信号肽。另外，CAR可以在抗原结合结构域与跨膜结构域之间包含间隔区。间隔区应该足够柔韧性以允许抗原结合结构域在不同方向上定向以促进抗原识别。间隔区可以是来自IgG1的铰链区，或者是免疫球蛋白的CH2和CH3区以及CD3的部分。

抗原结合结构域可以连接至CAR的跨膜结构域。在一些实施方案中，将编码抗原结合结构域的核酸可操作地连接至编码CAR的跨膜结构域的核酸。

在一些实施方案中，跨膜结构域可以来源于膜结合或跨膜蛋白。在某些实施方案中，与膜结合蛋白或跨膜蛋白的跨膜结构域的野生型氨基酸序列相比，跨膜结构域包含一个或多个，例如1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个氨基酸修饰(例如，取代，插入和缺失)。CAR的跨膜结构域的非限制性实例至少包括T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε(CD3ξ)、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或促红细胞生成素受体的跨膜区域。在其他实施方案中，跨膜结构域是包含疏水氨基酸残基(例如，亮氨酸和缬氨酸)的重组或合成结构域。在某些情况下，跨膜结构域在该结构域的一个或两个末端包括苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸。

跨膜结构域将抗原结合结构域连接至CAR的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，将编码抗原结合结构域的核酸可操作地连接至编码跨膜结构域的核酸，其可操作地连接至编码胞内信号传导结构域的核酸。

在一些实施方案中，CAR的细胞内信号传导结构域包含信号激活或信号转导结构域。这样，细胞内信号传导结构域包括本领域已知足以转导或传递信号例如激活信号或介导细胞内的细胞应答的蛋白质的细胞内信号传导结构域的任何部分。

在一些实施方案中，编码本发明CAR的核酸可操作地连接至启动子，例如合成启动子、组成型启动子或诱导型启动子。有用的组成型启动子包括泛素C启动子，延伸因子-1α启动子(EF1α启动子)，CMV启动子和本领域技术人员已知的任何其他组成型启动子。有用的诱导型启动子在例如Ede等人，ACS Synth Biol，2016，5(5)：395-404中描述，并且可包括细胞类型特异性启动子和诱导型开关启动子。举例说明性组成型启动子描述于PLoS One，2010，5(8)：e12413。在一些实施方案中，启动子是EF1α启动子。

可使用载体诸如表达载体、病毒载体或非病毒载体将本文所述的CAR引入HIP细胞。在某些情况下，病毒载体是逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺相关载体。在一些实施方案中，将编码CAR的核酸引入基因基因座，例如细胞的安全港基因座。在其他实施方案中，使用非病毒载体将CAR引入HIP细胞，所述非病毒载体包括但不限于小环DNA载体、裸DNA、脂质体、聚合剂和分子缀合物。

目前，有两种方法完成使用载体的基因掺入，即病毒系统和非病毒系统。在基础研究和临床研究中，基因治疗的主要载体是病毒，因为其转移效率高，达到培养T细胞的临床所需数量所需的时间相对较短，以及具有不同表达特征的不同病毒的可用性。病毒载体包括逆转录病毒(包括慢病毒)，腺病毒和腺伴随病毒。其中，最流行的基因递送工具是基因工程化逆转录病毒(例如，Hu等人，Pharmacol Rev.2000；52(4)：493-511)。非病毒载体包括但不限于裸DNA、脂质体、聚合剂和分子缀合物可用于将CAR构建体引入HIP细胞。不含质粒细菌DNA序列的小环DNA载体是新型的非病毒载体，其可以在细菌中从亲本质粒产生，并且可以在体内以高水平持续表达转基因。小环DNA系统可用于临床背景。小环DNA载体的详细描述可以在例如Chen等人,Hum Gene Ther.2005；16(1):126–131；Kay等人,NatBiotechnol.2010；28(12):1287–1289中找到。

B.将HIP细胞分化为HI-CAR-T细胞

可以使用本领域技术人员认可的任何方法将包含编码CAR的核酸的HIP细胞分化为表达CAR的免疫细胞，例如CAR T细胞。

用于使干细胞分化至免疫细胞(例如，免疫干细胞、免疫祖细胞、免疫专能祖细胞、T细胞前体祖细胞、NK细胞前体祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞和B细胞)的有用方法描述于例如US2018/0072992、US2017/0296649和US2016/0009813中。

T细胞可以是αβT细胞、δγT细胞、辅助/调节性T细胞、细胞毒性T细胞、祖细胞T细胞(例如，祖细胞T细胞是CD34+CD7+CD1a–或CD34+CD7+CD5+CD1a-)、幼稚T细胞、中央记忆T细胞、效应T细胞、末端效应T细胞、未成熟T细胞、成熟T细胞、自然杀伤性T细胞等。换句话说，T细胞可以是幼稚T细胞、幼稚中央记忆T细胞(TCM细胞)、效应记忆T细胞(TEM细胞)和效应记忆RA T细胞(TEMRA细胞)。幼稚T细胞可以表达CCR7、CD27、CD28和CD45RA。幼稚中央T细胞可以表达CCR7、CD27、CD28和CD45RO。效应记忆T细胞可以表达PD1、CD27、CD28和CD45RO。效应记忆RA T细胞可以表达PD1、CD57和CD45RA。

在一些实施方案中，在包含BMP途径激活剂、WNT途径激活剂、MEK抑制剂、NOTCH途径抑制剂、ROCK抑制剂、TGFβ受体/ALK抑制剂、生长因子、细胞因子及其任何组合的培养基中培养包含编码CAR的核酸序列的HIP细胞。

BMP途径激活剂可包括但不限于BMP-2激活剂、BMP-4激活剂、BMP-5激活剂、BMP-6激活剂、BMP-7激活剂、BMP-8激活剂，其类似物及其变体。

GSK3抑制剂可包括但不限于CHIR99021，其类似物及其变体。NOTCH途径激活剂可以包括但不限于Jag1、Jag2、DLL-1、DLL-3、DLL-4，其类似物及其变体。ROCK抑制剂可包括但不限于Y27632、法舒地尔、AR122-86、Y27632 H-1152、Y-30141、Wf-536、HA-1077、羟基-HA-1077、GSK269962A、SB-772077-B、N-(4-吡啶基)-N'-(2,4,6-三氯苯基)脲、3-(4-吡啶基)-1H-吲哚和(R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-氨基乙基)-环己烷甲酰胺、US8044201中公开的其他ROCK抑制剂，其类似物及其变体。生长因子可包括但不限于bFGF、EPO、Flt3L、GM-CSF、IGF、TPO、SCF、VEGF，其类似物及其变体。细胞因子可包括但不限于IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-11、IL-15，其类似物及其变体。

在一些实施方案中，将携带CAR构建体的HIP细胞培养在饲养细胞上以促进T细胞分化。术语“饲养细胞”可以包括不同组织类型和通常不同基因组的细胞，其可以起到促进与其共培养的细胞的增殖和/或控制其分化的作用。可以将未分化的HIP细胞与引导朝向特定组织类型(例如，T细胞或特定T细胞亚型)分化的饲养细胞共培养。在一些实施方案中，将鼠HIP细胞在OP9或OP9-DL饲养细胞上培养。鼠HIP细胞可以在饲养细胞上培养约15天或更长时间。在其他实施方案中，将HIP细胞在饲养细胞上培养，然后在特定天数后在无饲养细胞的情况下培养。在某些实施方案中，不将HIP细胞在饲养细胞上培养以用于分化为T细胞。在一些情况下，将HIP细胞在促进CD3刺激以及另外地CD28刺激的培养基中培养。

在各种实施方案中，将人HIP细胞在饲养细胞例如来源于人HIP细胞的内皮祖细胞上培养。在一些实施方案中，将来源于HIP细胞的人T细胞在来源于人HIP细胞的内皮祖细胞(EPC)上培养。可以将细胞在饲养细胞上培养约15天或更长时间。在其他实施方案中，将细胞在饲养细胞上培养，然后在特定天数后在无饲养细胞的情况下培养。在某些实施方案中，人EPC促进HIP衍生的T细胞的产生。在各种实施方案中，人EPC促进HIP衍生的幼稚CD4+T细胞的产生。在某些实施方案中，人EPC阻碍了HIP衍生的T细胞的某些亚型例如中央记忆CD4+T细胞的产生。

在一些实施方案中，在模拟的微重力(sμg)中培养来源于HIP的T细胞。在特定的实施方案中，这种T细胞是通过使用sμg分化HIP细胞产生的。可以将人HIP衍生的T细胞在sμg中培养至少72小时。在一些实施方案中，将人HIP衍生的T细胞在sμg中培养72小时至10天或更长时间。在某些情况下，在sμg中培养细胞可用于生成CD8+T细胞。在一些实施方案中，sμg增加TEMRA CD8+T细胞的数量或百分比。在其他实施方案中，sμg不增加幼稚CD8+T细胞的数量或百分比。

在一些实施方案中，在模拟的微重力(sμg)中和在包含IL-2、IL-7或IL-2和IL-7的组合的培养基中培养HIP衍生的T细胞。在一些实施方案中，在sμg中和在IL-2的存在下培养HIP衍生的T细胞，以产生中央记忆CD8+T细胞。在其他实施方案中，在sμg中和在IL-7的存在下培养HIP衍生的T细胞，以产生中央记忆CD8+T细胞。在其他实施方案中，在sμg中并且在IL-2和IL-7的存在下培养HIP衍生的T细胞，以产生中央记忆CD8+T细胞。

评估来源于HIP细胞的表达CAR的免疫细胞的方法包括但不限于免疫细胞化学、流式细胞术、细胞因子分析、T细胞激活/刺激测定、靶细胞细胞毒性测定、抗原反应性测定以及使用动物模型的体内功能测定。

C.使用HI-CAR T细胞的方法

在一些方面，本文提供了通过施用治疗有效量的HIP细胞衍生的CAR-T细胞来治疗患者例如人患者的癌症的方法。在某些情况下，将HIP细胞衍生的CAR-T细胞与治疗有效的载体一起施用。

“治疗有效量”包括足以在治疗后产生有益或期望的临床结果的量。治疗有效量可以以一个或多个剂量施用至受试者。就治疗而言，有效量是足以缓解、改善、稳定、逆转或减慢疾病进展或以其他方式减少疾病的病理后果的量。有效量通常由医师根据具体情况确定，并且在本领域技术人员的能力范围内。确定合适的剂量以达到有效量时，通常考虑几个因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重、所治疗的疾病、疾病的严重程度以及所施用的抗原结合片段的形式和有效浓度。

治疗性细胞治疗可以通过本领域已知的任何方法施用，包括但不限于静脉内施用、皮下施用、结内施用、肿瘤内施用、鞘内施用、胸膜内施用，腹膜内施用和直接施用至胸腺。治疗性细胞可以以推注施用或通过连续灌注施用。

癌症可以选自血液癌、实体瘤癌和液体瘤癌。在一些实施方案中，血液癌是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。肿瘤癌包括但不限于胶质母细胞瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、腺癌、神经胶质瘤、软组织肉瘤和各种癌(包括小细胞肺癌)。合适的癌可包括肿瘤学领域中任何已知的癌，包括但不限于星形细胞瘤、纤维肉瘤、粘肉瘤、脂肪肉瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、原始神经外胚层肿瘤(PNET)、软骨肉瘤、成骨肉瘤、胰腺导管腺癌、小细胞和大细胞肺腺癌、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、上皮腺癌、以及其肝转移、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、肝癌、胆管癌、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、基底细胞癌、汗腺癌、乳头状癌、皮脂腺癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆斯氏瘤、睾丸肿瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症和重链病、乳腺肿瘤、如导管和小叶腺癌、子宫颈鳞状和腺癌、子宫和卵巢上皮癌、子宫上皮性腺癌、子宫上皮性癌、子宫上皮性腺癌、子宫上皮性腺癌、前列腺腺癌、膀胱移行鳞状细胞癌、B和T细胞淋巴瘤(结节性和弥漫性)浆细胞瘤、恶性黑素瘤、软组织肉瘤和平滑肌肉瘤。

IX.示例性实施方案的详细描述

在一些实施方案中，本发明的小鼠低免疫原性多能干(小鼠HIP)细胞包含消除B2M活性的基因组修饰、消除CIITA活性的基因组修饰、编码CD47的外源核酸序列和编码CAR构建体的外源核酸序列。在其他实施方案中，小鼠低免疫原性多能干细胞还包含诱导型自杀基因。

在其他实施方案中，本发明的人低免疫原性多能干(人HIP)细胞包含消除B2M活性的基因组修饰、消除CIITA活性的基因组修饰、编码CD47的外源核酸序列和编码CAR构建体的外源核酸序列。在其他实施方案中，人低免疫原性多能干细胞还包含诱导型自杀基因。

在特定的实施方案中，本发明的低免疫原性多能干细胞包含消除B2M活性的基因组修饰、消除CIITA活性的基因组修饰、编码CD47的外源核酸序列、编码CAR构建体的外源核酸序列和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因。在一些实施方案中，本发明的低免疫原性多能干细胞包含消除B2M活性的基因组修饰、消除CIITA活性的基因组修饰、编码CD47的外源核酸序列、编码CAR构建体的外源核酸序列和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因。在某些实施方案中，本发明的低免疫原性多能干细胞包含消除B2M活性的基因组修饰、消除CIITA活性的基因组修饰、编码CD47的外源核酸序列、编码CAR构建体的外源核酸序列和编码诱导型胱天蛋白酶9蛋白的外源基因。

在各种实施方案中，本发明的小鼠CAR-T细胞由小鼠低免疫原性多能干细胞产生，所述小鼠低免疫原性多能干细胞具有消除B2M活性的基因组修饰、消除CIITA活性的基因组修饰、编码CD47的外源核酸序列以及编码CAR构建体的外源核酸序列。在其他实施方案中，小鼠低免疫原性多能干细胞还包含诱导型自杀基因。因此，小鼠CAR-T细胞减少或缺乏主要组织相容性抗原复合物I(MHC I)和主要组织相容性抗原复合物II(MHC II)功能，并且过表达CD47蛋白。小鼠CAR-T细胞对于NK细胞的杀伤可以是不太敏感的。

在其他实施方案中，本发明的人CAR-T细胞由人低免疫原性多能干细胞产生，所述人低免疫原性多能干细胞包含消除B2M活性的基因组修饰、消除CIITA活性的基因组修饰、编码人CD47的外源核酸序列以及编码CAR构建体的外源核酸序列。在其他实施方案中，人低免疫原性多能干细胞还包含诱导型自杀基因。因此，人CAR-T细胞减少或缺乏HLA-1和HLA-II功能，并且过表达CD47蛋白。在一些实施方案中，人CAR-T细胞具有降低的或缺乏HLA-A、HLA-B或HLA-C的表达，具有降低的或缺乏HLA-DP、HLA-DR或HLA-DQ的表达，和过表达人CD47蛋白。人CAR-T细胞对于NK细胞的杀伤可以是不太敏感的。

在一些实施方案中，本发明的人CAR-T细胞由人低免疫原性多能干细胞产生，所述人低免疫原性多能干细胞包含消除B2M活性的基因组修饰、消除CIITA活性的基因组修饰、编码人CD47的外源核酸序列以及编码抗CD19 CAR构建体的外源核酸序列。

X.实施例

实施例1：小鼠诱导多能干细胞的产生

本文所述的方法改编自Diecke等人，Sci Rep，2015，8081。

用IV型胶原酶(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)解离并分离小鼠的鼠尾尖成纤维细胞，并用含10％胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺、4.5g/L葡萄糖、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)在37℃、20％O₂和5％CO₂下维持在潮湿培养箱中。

然后使用表达四个重编程因子Oct4、KLF4、Sox2和c-Myc的新的密码子优化的微型内含子质粒(co-MIP)(10-12μm DNA)使用Neon转染系统对1×10⁶个鼠成纤维细胞进行重编程。转染后，将成纤维细胞铺板在鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上，并在加入丁酸钠(0.2mM)和50μg/mL抗坏血酸的情况下保存在成纤维细胞培养基中。

当出现ESC样集落时，将培养基更改为包含DMEM、20％FBS、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸(NEAA)、β-巯基乙醇和10ng/mL白血病抑制因子(LIF)的小鼠iPSC培养基。2次传代后，将鼠iPSC转移至0.2％明胶包被的板中并进一步扩增。对于每次传代，使用磁性激活细胞分选(MACS)对iPSC针对鼠多能标志物SSEA-1进行分选。

分离的小鼠iPSC可以根据上述方法用于产生小鼠低免疫原性的iPSC。

实施例2：人诱导多能干细胞的产生

使用三质粒、七因子(SOKMNLT：SOX2、OCT4(POU5F1)、KLF4、MYC、NANOG、LIN28和SV40L T抗原)基于EBNA的附加体系统从CD34+脐带血衍生Gibco^TM人附加体iPSC细胞系(目录号A18945,ThermoFisher)。该iPSC细胞系被认为是零足迹，因为没有来自重编程事件的在基因组中的整合。其已被显示不含所有重编程基因。在产品手册中提供了用于解冻、培养和传代人iPSC的方案。

可以通过体内畸胎瘤测定和体外多能基因表达测定(例如，PCR和阵列)或通过针对多能标志物的荧光染色来测定人iPSC的多能性。

Gibco^TM人附加体iPSC细胞系具有正常的核型和多能标志物如OCT4、SOX2和NANOG(如RT-PCR所示)和OCT4、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81(如ICC所示)的内源表达。全基因组表达和表观遗传学特征谱分析表明，该附加体hiPSC细胞系与人胚胎干细胞系在分子上无法区分(Quintanilla等人,PloS One,2014,9(1):e85419)。在定向分化和畸胎瘤分析中，这些hiPSC保留其对于外胚层、内胚层和中胚层谱系的分化潜能(Burridge等人,PLoS One,2011,6(4):e18293)。另外，以稳健的效率衍生了血管、造血、神经和心脏谱系(Burridge等人，同上)。

表1.用于培养人iPSC(例如Cas9 iPSC)的举例说明性方案

分离的人iPSC可用于根据上文描述的方法产生人低免疫原性iPSC。

实施例3：低免疫原性多能细胞对NK细胞杀伤和巨噬细胞吞噬作用较不敏感。

进行此实施例以评估低免疫原性多能细胞(例如，小鼠b2m-/-ciita-/-CD47 tgiPSC和人B2M-/-CIITA-/-CD47 tg iPSC)逃避免疫先天反应途径的能力。

具体而言，进行了酶联免疫斑点(Elispot)测定。将NK细胞与小鼠HIP细胞或人HIP细胞(小鼠B2m-/-Ciita-/-CD47 tg iPSC或人B2M-/-CIITA-/-CD47 tg iPSC)共培养，并测量IFNγ的释放(例如，使用Elispot读板仪测量先天的IFNγ斑点频率。在一些实例中，通过使用抗CD47抗体阻断CD47。

与小鼠NK细胞例如约95％NK细胞和5％巨噬细胞共培养的小鼠B2m-/-Ciita-/-CD47 tg iPSC未能刺激NK细胞激活(图1)。在Elispot测定中，小鼠B2m-/-Ciita-/-iPSC触发NK细胞的IFNγ释放，而小鼠B2m-/-Ciita-/-CD47 tg iPSC却没有。阻断CD47(例如使用抗CD47抗体)对小鼠B2m-/-Ciita-/-iPSC没有影响。但是，CD47阻断完全消除了B2m-/-Ciita-/-CD47tg iPSC具有的保护作用。已知激活NK细胞并因此释放IFNγ的YAC-1细胞用作对照。

与人NK细胞共培养的人B2M-/-CIITA-/-CD47 tg iPSC也未能刺激NK细胞激活。图2显示在Elispot测定中人B2M-/-CIITA-/-iPSC触发了NK细胞的IFNγ释放，而人B2M-/-CIITA-/-CD47 tg iPSC却没有。CD47的阻断对人B2M-/-CIITA-/-iPSC没有影响，但它确实消除了人B2M-/-CIITA-/-CD47 tg iPSC具有的保护作用。已知激活NK细胞并因此释放IFNγ的K562细胞用作对照。

图3显示了与人NK细胞(约95％的NK细胞和5％的巨噬细胞)一起孵育的小鼠B2m-/-Ciita-/-CD47 tg iPSC的Elispot结果。小鼠B2m-/-Ciita-/-iPSC和小鼠B2m-/-Ciita-/-CD47 tg iPSC触发人NK细胞的IFNγ释放。CD47的阻断对NK细胞反应没有影响。YAC-1细胞引起人NK细胞的强烈IFNγ释放，并用作对照。

图4显示了与小鼠NK细胞(约95％NK细胞和5％巨噬细胞)一起孵育的人B2M-/-CIITA-/-CD47 tg iPSC的Elispot结果。人B2M-/-CIITA-/-iPSC和人B2M-/-CIITA-/-CD47tg iPSC触发小鼠NK细胞的IFNγ释放。CD47的阻断对NK细胞反应没有影响。人K562细胞引起小鼠NK细胞的强烈IFNγ释放，并用作对照。

还进行巨噬细胞吞噬作用测定以确定本发明的HIP细胞是否易受巨噬细胞吞噬作用的影响。简而言之，将本文所述的HIP细胞用萤火虫萤光素酶标记并与巨噬细胞共培养。通过萤光素酶报告基因测定来分析HIP细胞的活力或存在。

图5显示了与人巨噬细胞共培养的萤火虫萤光素酶标记的人B2M-/-CIITA-/-CD47tg iPSC的吞噬作用测定结果。当与巨噬细胞孵育时，人B2M-/-CIITA-/-iPSC的活力信号显著下降。另一方面，在人巨噬细胞的存在下，人B2M-/-CIITA-/-CD47 tg iPSC的活力信号没有改变。杀死所有HIP细胞的TritonX-100用作对照。CD47的阻断消除了人B2M-/-CIITA-/-CD47 tg iPSC的保护性特征，并使它们易受巨噬细胞吞噬或消除。

当与巨噬细胞孵育时，小鼠B2m-/-Ciita-/-iPSC的活力信号显著下降。相反，在小鼠巨噬细胞的存在下，小鼠B2m-/-Ciita-/-CD47 tg iPSC的活力信号没有改变。杀死所有HIP细胞的TritonX-100用作对照。CD47的阻断消除了小鼠B2M-/-CIITA-/-CD47 tg iPSC的保护性特征，并使它们易受巨噬细胞吞噬或消除。杀死所有HIP细胞的TritonX-100用作对照。

图7显示了与小鼠巨噬细胞共培养的萤火虫萤光素酶标记的人B2M-/-CIITA-/-CD47tg iPSC的吞噬作用测定结果。当与小鼠巨噬细胞共培养时，人B2M-/-CIITA-/-iPSC和人B2M-/-CIITA-/-CD47 tg iPSC的活力信号均显著下降。杀死所有HIP细胞的TritonX-100用作对照。

图8显示了与人巨噬细胞共培养的萤火虫萤光素酶标记的小鼠B2m-/-Ciita-/-CD47tg iPSC的吞噬作用测定结果。与人巨噬细胞共培养时，小鼠B2m-/-Ciita-/-iPSC和小鼠B2m-/-Ciita-/-CD47 tg iPSC的活力信号均显著下降。杀死所有HIP细胞的TritonX-100用作对照。

本文提供的结果表明，小鼠B2m-/-Ciita-/-CD47tg iPSC和人B2M-/-CIITA-/-CD47tg iPSC能够逃避先天免疫反应，例如NK细胞激活和巨噬细胞吞噬作用。

实施例4：从HIP细胞产生T细胞

此实施例显示了HIP细胞(例如，小鼠HIP细胞和人HIP细胞)被分化成T细胞，包括CD8+低、CD8+高、CD4+、CD4+/CD8+高和CD4+/CD8+低T细胞。此实施例还显示，刺激信号和细胞因子用于指导分化成不同的T细胞亚型。结果表明，内皮祖细胞(EPC)例如HIP衍生的EPC，被用于增加幼稚CD4+T细胞的数量，并减少中央记忆CD4+T细胞的数量。此实施例还证明单独的或与细胞因子(例如IL-2、IL-7或IL-2和IL-2的组合)组合的模拟的微重力(sμg)刺激诱导HIP衍生的T细胞分化为中央记忆CD8+T细胞。

将小鼠HIP细胞在D0(分化开始)在OP9细胞上培养。在OP9-DL1饲养细胞上分化的D15，所得细胞类似于T细胞(图9)。FACS分析显示，在D23，在OP9-DL1上培养的小鼠HIP细胞分化为CD3+T细胞(69.8％)、CD8+高T细胞(18.5％)、CD8+低T细胞(12.4％)、CD4+T细胞(3.6％)、CD4+/CD8+高T细胞(1.6％)和CD4+/CD8+低T细胞(0.8％)(图10A)。FACS分析还显示，在D30，脱离饲养细胞并且在存在CD3和CD28刺激的情况下培养的小鼠HIP细胞分化为CD3+T细胞(92.6％)、CD8+高T细胞(8.1％)、CD8+低T细胞(9.6％)、CD4+T细胞(7.7％)，CD4+/CD8+高T细胞(0.7％)和CD4+/CD8+低T细胞(1.5％)(图10B)。FACS分析还显示，在D23，在饲养细胞(例如OP9-DL1细胞)上并且在存在CD3和CD28刺激的情况下培养的小鼠HIP细胞分化为CD3+T细胞(88.4％)、CD8+高T细胞(5.5％)、CD8+低T细胞(17.6％)、CD4+T细胞(5.9％)、CD4+/CD8+高T细胞(0.9％)和CD4+/CD8+低T细胞(1.9％)(图11)。结果表明，小鼠HIP细胞分化为T细胞，并且可以通过使用不同的刺激信号和细胞因子(例如CD3、CD28、IL-2、IL-15和IL-7)获得特定的T细胞亚型。在这些条件下，与CD3+细胞和CD8+细胞的百分比相比，HIP衍生的CD4+T细胞的百分比仍然较低。

T细胞可以是幼稚T细胞、幼稚中央记忆T细胞(TCM细胞)、效应记忆T细胞(TEM细胞)和效应记忆RA T细胞(TEMRA细胞)。幼稚T细胞可以表达CCR7、CD27、CD28和CD45RA。幼稚中央T细胞可以表达CCR7、CD27、CD28和CD45RO。效应记忆T细胞可以表达PD1、CD27、CD28和CD45RO。效应记忆RA T细胞可以表达PD1、CD57和CD45RA。

进行实施例以产生从人HIP细胞分化的CD4+T细胞。假设将来源于人HIP细胞的T细胞与来源于HIP细胞的内皮祖细胞(EPC)的共培养可以增加HIP衍生的CD4+T细胞的数量。图12提供了来源于人HIP细胞的EPC的图像。在一些实施方案中，通过在包含以下一种或多种因子的培养基中分化人HIP细胞来产生EPC：bFGF、VEGF、FGF、Rock抑制剂(例如Y-27632)、TGFβ途径抑制剂(例如SB-431542)、GSK3抑制剂(CHIR-99021)或其任何组合。与不存在人EPC的情况相比，人EPC和来源于人HIP细胞的人T细胞的共培养增加了CD4+T细胞的数量(图13A)。图13B显示了与人HIP衍生的EPC的共培养诱导分化为幼稚CD45RA+CCR7+CD4+T细胞。图13C显示了与人HIP衍生的EPC的共培养防止分化为中央记忆CD45RA-CCR7+CD4+T细胞。这项研究表明，通过与HIP衍生的内皮祖细胞共培养增加CD4+T细胞分化。与EPC的共培养增加来源于人HIP细胞的幼稚CD4+T细胞的数量，并减少中央记忆CD4+T细胞的数量。

进行另外的实施例以开发通过HIP细胞的T细胞分化产生特定T细胞亚型的新方法。这些实施例评估了使用模拟的微重力(sμg)对所得T细胞的影响。Sμg可以使用随机定位机(Airbus)或类似的旋转系统(例如但不限于Synthecon的带有旋转底座的干细胞培养系统)来产生。将人HIP衍生的T细胞在sμg条件下培养72小时。作为对照，将细胞在1g(标准重力)下培养72小时。图14A显示了以sμg培养的T细胞的形态与以1g(1重力)培养的T细胞的形态不同。T细胞的活力在sμg条件和标准条件之间没有差异。CD8+T细胞的分析表明，模拟的微重力产生较少的CD8+T细胞和较少的幼稚CD8+(CD8+CD45RA+CCR7+)T细胞(图15)。与标准培养条件相比，模拟的微重力还增加了TEMRA CD8+(CD8+CD45RA+CCR7)细胞的数量(图15)。图16显示了增加sμg的孵育时间没有提供有益的效果。持续72小时的sμg是足够的，10天的长时间暴露并没有显著增加CD8+T细胞或CD8+T细胞的不同亚型的数量。

还分析了以sμg培养HIP衍生的人T细胞72小时并且然后以1g再培养72小时是否影响T细胞分化。结果表明，使用sμg的T细胞分化是不可逆的。与仅sμg相比，以sμg和1g的处理对分化没有显著影响(图17)。

还显示了以sμg和在一种或多种细胞因子的存在下分化HIP衍生的人T细胞诱导中央记忆CD8+(CD8+CD45RA-CCR7+)T细胞的产生。图18显示了当将细胞以sμg和使用IL-2、IL-7或IL-2和IL-7的组合培养10天时，诱导了中央记忆CD8+T细胞。

该实施例清楚表明，在模拟的微重力下培养HIP衍生的人T细胞72小时减少了产生的幼稚CD8+T细胞的数量。这种培养条件增加了CD8+TEMRA细胞的数量。在sμg中72小时后，所得的T细胞是存活的。当与细胞因子刺激组合时，sμg培养增加CD8+CM T细胞的数量。

此实施例提供的数据表明小鼠和人HIP细胞分化为T细胞。使用特定的培养条件诱导某些T细胞亚型。使用饲养细胞以及任选地CD3和CD28刺激，将HIP细胞分化为T细胞。HIP衍生的人T细胞与HIP衍生的内皮细胞共培养，以产生HIP衍生的CD4+T细胞。在某些情况下，此类HIP衍生的CD4+T细胞为CD4+幼稚T细胞。将HIP衍生的人T细胞以sμg培养至少72小时，以生成TEMRA CD8+T细胞。将HIP衍生的人T细胞以sμg培养，并用细胞因子刺激至少72小时(例如10天)以产生中央记忆CD8+T细胞。本文所述的方法可用于获得可应用于CAR技术的特定T细胞群。该方法还可用于多能干细胞衍生的T细胞分化、造血干细胞衍生的T细胞分化以及其他免疫细胞群的分化。

本文公开或引用的所有出版物和专利文件通过引用整体并入本文。仅出于举例说明和描述的目的给出了前面的描述。该描述无意将本发明限制为所公开的精确形式。

本发明的范围旨在由所附的权利要求书限定。

非正式序列表

SEQ ID NO：1–人β-2-微球蛋白

MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDI

SEQ ID NO：2–人CIITA蛋白，160个氨基酸的N端

MRCLAPRPAGSYLSEPQGSSQCATMELGPLEGGYLELLNSDADPLCLYHFYDQMDLAGEEEIELYSEPDTDTINCDQFSRLLCDMEGDEETREAYANIAELDQYVFQDSQLEGLSKDIFKHIGPDEVIGESMEMPAEVGQKSQKRPFPEELPADLKHWKP

SEQ ID NO：3–人CD47蛋白

MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVE

SEQ ID NO：4–单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)蛋白

MASYPCHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRLEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWQVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHVGGEAGSSHAPPPALTLIFDRHPIAALLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQGGGSWWEDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRPMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMVQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN

SEQ ID NO：5–大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)蛋白

MSNNALQTIINARLPGEEGLWQIHLQDGKISAIDAQSGVMPITENSLDAEQGLVIPPFVEPHIHLDTTQTAGQPNWNQSGTLFEGIERWAERKALLTHDDVKQRAWQTLKWQIANGIQHVRTHVDVSDATLTALKAMLEVKQEVAPWIDLQIVAFPQEGILSYPNGEALLEEALRLGADVVGAIPHFEFTREYGVESLHKTFALAQKYDRLIDVHCDEIDDEQSRFVETVAALAHHEGMGARVTASHTTAMHSYNGAYTSRLFRLLKMSGINFVANPLVNIHLQGRFDTYPKRRGITRVKEMLESGINVCFGHDDVFDPWYPLGTANMLQVLHMGLHVCQLMGYGQINDGLNLITHHSARTLNLQDYGIAAGNSANLIILPAENGFDALRRQVPVRYSVRGGKVIASTQPAQTTVYLEQPEAIDYKR

SEQ ID NO：6–截短的人胱天蛋白酶9蛋白

GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS

Claims

1.分离的低免疫原性诱导多能干细胞(HIP)，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，

其中已消除内源性β-2微球蛋白(B2M)基因活性和内源性II类反式激活因子(CIITA)基因活性，并且已增加CD47表达。

2.权利要求1的分离的HIP细胞，其中所述CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。

3.权利要求2的分离的HIP细胞，其中所述细胞外结构域与选自CD19、CD20、CD22、CD38、CD123、CD171、CS1、BCMA、MUC16、ROR1和WT1的抗原结合。

4.权利要求2或3的分离的HIP细胞，其中所述细胞外结构域包含单链可变片段(scFv)。

5.权利要求2至4中任一项的分离的HIP细胞，其中所述跨膜结构域包含CD3ζ、CD4、CD8α、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3和BTLA。

6.权利要求2至5中任一项的分离的HIP细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3ζ、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3和BTLA。

7.权利要求2至6中任一项的分离的HIP细胞，其中在已消除B2M基因活性和CIITA基因并且已增加CD47表达之后，将编码CAR的核酸引入iPSC。

8.权利要求1至7中任一项的分离的HIP细胞，其中所述HIP细胞是人诱导多能干细胞，所述B2M基因是人B2M基因，所述CIITA基因是人B2M基因，并且增加的CD47表达是由将至少一个拷贝的人CD47基因导入所述iPSC中处于启动子的控制下引起的。

9.权利要求1至7中任一项的分离的HIP细胞，其中所述HIP细胞是小鼠诱导多能干细胞，所述B2M基因是小鼠B2M基因，所述CIITA基因是小鼠B2M基因，并且增加的CD47表达是由于将至少一个拷贝的小鼠CD47基因导入所述iPSC中处于启动子的控制下而产生的。

10.权利要求8或9的分离的HIP细胞，其中所述启动子是组成型启动子。

11.权利要求1至10中任一项的分离的HIP细胞，其中B2M基因活性的消除是由破坏所述B2M基因的两个等位基因的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9反应引起的。

12.权利要求1至11中任一项的分离的HIP细胞，其中CIITA基因活性的消除是由破坏所述CIITA基因的两个等位基因的CRISPR/Cas9反应引起的。

13.权利要求1至12中任一项的分离的HIP细胞，其还包含诱导所述低免疫原性多能细胞死亡的被触发剂激活的自杀基因。

14.权利要求13的分离的HIP细胞，其中所述自杀基因是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因，并且所述触发剂是更昔洛韦。

15.权利要求14的分离的HIP细胞，其中所述HSV-tk基因编码与SEQ ID NO：4具有至少90％序列同一性的蛋白质。

16.权利要求14的分离的HIP细胞，其中所述HSV-tk基因编码包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的蛋白质。

17.权利要求13的分离的HIP细胞，其中所述自杀基因是大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因，并且所述触发剂是5-氟胞嘧啶(5-FC)。

18.权利要求17的分离的HIP细胞，其中所述CD基因编码与SEQ ID NO：5具有至少90％序列同一性的蛋白质。

19.权利要求17的分离的HIP细胞，其中所述CD基因编码包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的蛋白质。

20.权利要求13的分离的HIP细胞，其中所述自杀基因编码诱导型胱天蛋白酶9蛋白，并且所述触发剂是二聚化的化学诱导剂(CID)。

21.权利要求20的分离的HIP细胞，其中所述诱导型胱天蛋白酶9蛋白与SEQ ID NO：6具有至少90％的序列同一性。

22.权利要求20的分离的HIP细胞，其中所述诱导型胱天蛋白酶9蛋白包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

23.权利要求20至22中任一项的分离的HIP细胞，其中所述CID是化合物AP1903。

24.通过体外分化权利要求1至23中任一项的HIP细胞产生的分离的低免疫性CAR-T细胞。

25.权利要求24的分离的低免疫性CAR-T细胞，其中所述CAR-T细胞是低免疫性细胞毒性CAR-T细胞。

26.权利要求24或25的分离的低免疫性CAR-T细胞，其中所述体外分化包括在包含选自bFGF、EPO、Flt3L、IGF、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-15、GM-CSF、SCF和VEGF的一种或多种生长因子或细胞因子的培养基中培养所述HIP细胞。

27.权利要求24至26中任一项的分离的低免疫性CAR-T细胞，其中所述培养基还包含选自以下的一种或多种：BMP激活剂、GSK3抑制剂、ROCK抑制剂、TGFβ受体/ALK抑制剂和NOTCH激活剂。

28.权利要求24至27中任一项的分离的低免疫性CAR-T细胞，其中所述体外分化包括在饲养细胞上培养所述HIP细胞。

29.权利要求24至28中任一项的分离的低免疫性CAR-T细胞，其中所述体外分化包括在模拟的微重力下培养。

30.权利要求29的分离的低免疫性CAR-T细胞，其中在模拟的微重力下的培养持续至少72小时。

31.权利要求24至30中任一项的分离的低免疫性CAR-T细胞，其用于治疗癌症。

32.一种通过施用包含治疗有效量的权利要求24至27中任一项的分离的低免疫性CAR-T细胞的组合物来治疗癌症患者的方法。

33.权利要求32的方法，其中所述组合物还包含治疗有效的载体。

34.权利要求32或33的方法，其中所述施用包括静脉内施用、皮下施用、结内施用、肿瘤内施用、鞘内施用、胸膜内施用和腹膜内施用。

35.权利要求32至34中任一项的方法，其中所述施用还包括推注或通过连续灌注。

36.权利要求32至35中任一项的方法，其中所述癌症是选自白血病、淋巴瘤和骨髓瘤的血液癌。

37.权利要求32至35中任一项的方法，其中所述癌症是实体瘤癌或液体瘤癌。

38.通过包括体外分化的方法从分离的HIP细胞群衍生的纯的低免疫性CAR-T细胞群，

其中分离的HIP细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸和能够诱导HIP细胞死亡的被触发剂所激活的自杀基因，和

其中在HIP细胞中已消除内源性β-2微球蛋白(B2M)基因活性和内源性II类反式激活因子(CIITA)基因活性，并且已增加CD47表达。

39.权利要求38的纯的分离的低免疫性CAR-T细胞群，其中所述自杀基因是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因和所述触发剂是更昔洛韦、所述自杀基因是大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因和所述触发剂是5-氟胞嘧啶(5-FC)、或者所述自杀基因编码诱导型胱天蛋白酶9蛋白和所述触发剂是二聚化的化学诱导剂(CID)。

40.权利要求38或39的纯的分离的低免疫性CAR-T细胞群，其中所述CAR-T细胞是低免疫性细胞毒性CAR-T细胞。

41.权利要求38至40中任一项的纯的分离的低免疫性CAR-T细胞群，其中所述体外分化包括在包含选自bFGF、EPO、Flt3L、IGF、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-15、GM-CSF、SCF和VEGF的一种或多种生长因子或细胞因子的培养基中培养所述HIP细胞。

42.权利要求38至41中任一项的纯的分离的低免疫性CAR-T细胞群，其中所述培养基还包含选自以下的一种或多种：BMP激活剂、GSK3抑制剂、ROCK抑制剂、TGFβ受体/ALK抑制剂和NOTCH激活剂。

43.权利要求38至42中任一项的纯的分离的低免疫性CAR-T细胞群，其中所述体外分化包括在饲养细胞上培养所述HIP细胞。

44.权利要求38至43中任一项的纯的分离的低免疫性CAR-T细胞群，其中所述体外分化包括在模拟的微重力下培养。

45.权利要求44的纯的分离的低免疫性CAR-T细胞群，其中在模拟的微重力下的培养持续至少72小时。

46.权利要求38至42中任一项的纯的分离的低免疫性CAR-T细胞群，其中所述方法还包括在包含触发剂以诱导HIP细胞死亡的阴性选择培养基中培养所述低免疫性CAR-T细胞，从而产生基本上不含或完全不含低免疫原性iPSC的分离的低免疫性CAR-T细胞群。

47.一种通过施用包含治疗有效量的权利要求38至46中任一项的纯的分离的低免疫性CAR-T细胞群的组合物来治疗癌症患者的方法。

48.权利要求47的方法，其中所述组合物还包含治疗有效的载体。

49.权利要求47或48的方法，其中所述施用包括静脉内施用、皮下施用、结内施用、肿瘤内施用、鞘内施用、胸膜内施用和腹膜内施用。

50.权利要求47至49中任一项的方法，其中所述施用还包括推注或通过连续灌注。

51.权利要求47至50中任一项的方法，其中所述癌症是选自白血病、淋巴瘤和骨髓瘤的血液癌。

52.权利要求47至50中任一项的方法，其中所述癌症是实体瘤癌或液体瘤癌。

53.一种制备权利要求24至27中任一项的分离的低免疫性CAR-T细胞的方法，所述方法包括体外分化权利要求1至23中任一项的任一种HIP细胞，其中所述体外分化包括在包含选自bFGF、EPO、Flt3L、IGF、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-15、GM-CSF、SCF和VEGF的一种或多种生长因子或细胞因子的培养基中培养所述HIP细胞。

54.权利要求53的方法，其中所述培养基还包含选自以下的一种或多种：BMP激活剂、GSK3抑制剂、ROCK抑制剂、TGFβ受体/ALK抑制剂和NOTCH激活剂。

55.权利要求53或54的方法，其中所述体外分化包括在饲养细胞上培养所述HIP细胞。

56.权利要求53至55中任一项的方法，其中所述体外分化包括在饲养细胞上培养所述HIP细胞。

57.权利要求53至56中任一项的方法，其中所述体外分化包括在模拟的微重力下培养。

58.权利要求57的方法，其中在模拟的微重力下的培养持续至少72小时。