CN112626037B - 一种绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒的构建及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒的构建及其应用。采用同源重组的方法将eGFP和Flag标签插入到主要衣壳蛋白编码基因的C端，进而通过细胞分选仪和极限稀释法筛选出绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒。针对目标病毒，通过Western Blot来验证eGFP和Flag标签是否插入预设的位置，并进一步通过病毒基因组测序确定eGFP和Flag插入的确切位置。最后利用透射电镜和原子力显微镜观察绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒和野生型的结构差异，结果显示二者结构大小基本一致，无明显差异。该重组病毒作为一种可研究病毒与宿主相互作用的分子工具，在免疫学研究中具有重要的价值，为进一步研究鱼类抗病毒免疫提供了新的工具。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域。
背景技术
随着经济的高速发展，人们的生活水平逐步提高，高蛋白的水产品的需求也日益增加。水产业规模的扩大越来越受到环境和养殖技术的制约，特别是由病毒引发的大规模病害，造成了巨大的经济损失。
虹彩病毒(SGIV)是一种对经济鱼类具有致命感染力的病毒，也是近年来多次引发养殖动物大量死亡的元凶之一，其免疫机制的研究已取得了较多的进展。但要真正了解清楚SGIV的致病机理以及防治方法，仍然需要对病毒的感染过程中的细节进行更深入的探究。
发明内容
在本项目的重组虹彩病毒中，绿色荧光蛋白成功标记上了病毒的部分主要衣壳蛋白，该重组病毒不仅能使受感染的细胞在荧光显微镜下呈现绿色，而且其在石斑鱼体内能正常地进行感染和复制，对受感染的血细胞进行通过流式分选分析，检测到绿色荧光信号。该病毒的成功构建使得人们可以实时观察虹彩病毒感染宿主的全过程，是探索虹彩病毒与宿主相互作用的一种有效工具。
本发明所采取的技术方案是：
本发明以野生石斑鱼虹彩病毒(Singapore Grouper Iridovirus,SGIV)为改造对象，以表达主要衣壳蛋白(Major Capsid Protein，MCP)的ORF72R基因的C端为插入位点，构建带有eGFP和Flag标签与ORF72R融合表达的质粒，用脂质体转染的方法将其转进石斑鱼胚胎干细胞中，利用流式分选仪筛选出目的病毒，即有绿色荧光信号的细胞，进而通过极限稀释法纯化目标病毒，得到的病毒命名为SGIV-72R-eGFP。然后Western Blot和免疫沉淀分析eGFP和Flag标签是否正确插入预设位置，并且利用透射电镜观察到重组绿色荧光虹彩病毒和野生型石斑鱼虹彩病毒在结构大小上具有相似的特征，两者无明显差异。
绿色荧光蛋白标记绿色荧光蛋白标记与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
重组病毒作为一种可研究病毒与宿主相互作用的分子工具，在免疫学研究中具有重要的价值。目前对哺乳动物重组病毒的研究较多，有关水产病毒的重组病毒则相对较少，本发明构建的绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒为进一步研究鱼类抗病毒免疫提供了新的工具。
附图说明
图1是绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒感染石斑鱼胚胎干细胞的荧光显微镜图；
图2是纯化的绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒与野生型病毒对比图；
图3是绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒与野生型病毒对比的Western Blot图；
图4是野生型虹彩病毒和绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒的免疫沉淀分析图；
图5是绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒与野生型病毒对比的透射电镜图；
图6是基于流式分选分析感染重组绿色荧光虹彩病毒的血细胞绿色荧光蛋白标记。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒病毒的构建、筛选及纯化
1)选择SGIV中表达MCP的ORF72R基因作为靶基因来构建重组质粒，将eGFP和Flag标签插入的MCP的C端。
2)重组病毒由野生型病毒与重组质粒之间的同源重组而来，重组质粒通过脂质体转染法进入处于生长对数期的石斑鱼胚胎干细胞，接种野生型病毒48h后，用荧光显微镜观察是否有重组病毒产生。
3)收集受感染的细胞，利用流式细胞分选仪筛选出带有绿色荧光的细胞，此筛选过程重复数次，将获得的受感染细胞用超声破碎的方法制备成病毒悬液。
实施例2：绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒病毒的筛选及纯化
1)对实施例1所得的病毒悬液进行梯度稀释，并接种于96孔板，48h后出现显著的细胞病变效应CPE。利用倒置荧光显微镜筛选出检测到单个绿色荧光CPE的孔，即为单个绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒克隆。图1为绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒感染石斑鱼胚胎细胞的显微镜图。
2)绿色荧光蛋白标记通过细胞培养获取含有大量病毒的细胞悬液，使用处于生长对数期的石斑鱼胚胎干细胞，加入MOI＝10的重组病毒。约3-4天后，受感染的细胞离壁，悬浮于培养基中，即可收集细胞，并使用0.01M PBS洗涤细胞数次。
3)将细胞悬浮液超声破碎至溶液澄清，然后进行蔗糖密度梯度离心，设置的蔗糖密度梯度为30％、40％、50％、60％。经超声破碎的细胞悬液铺设在最上层的30％蔗糖溶液，20000rpm 4℃离心1h，可见绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒颗粒悬浮于50-60％蔗糖层中。取出该层的病毒悬浮物，以适量的0.01M PBS稀释，20000rpm 4℃离心30min,得到的淡黄色沉淀即为纯化绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒，适量TN buffer重悬，于-80℃保存。图2为纯化的绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒和野生型虹彩病毒在UV下的对照图。
实施例3：绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒的鉴定
1)取纯化的野生型虹彩病毒和绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒进行WesternBlot，一抗分别是Anti-MCP,Anti-eGFP和Anti-Flag。结果显示在野生型虹彩病毒中，MCP的条带位置在50kDa左右，而重组病毒MCP的条带位于75kDa左右，即MCP与eGFP和Flag标签融合表达后的大小，且eGFP和Flag的抗体在重组病毒中同样检测到了该条带，表明eGFP和Flag标签正确插入到MCP中。图3为野生型虹彩病毒和绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒的Western Blot图。
2)对纯化的野生型虹彩病毒和绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒进行免疫沉淀分析，利用Flag标签抗体进行互作蛋白的检测。结果显示，在重组虹彩病毒中，在75kDa左右检测到了差异条带，即MCP-eGFP-Flag，进一步证明了eGFP和Flag标签正确插入到MCP中。图4为野生型虹彩病毒和绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒的免疫沉淀分析。
3)取约10ul纯化的绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒和野生型虹彩病毒悬液，滴加至200目普通碳膜的铜网上，静置10min,吸去多余液体后用2％PFA进行负染，染色5min后吸去多余液体。利用透射电子显微镜观察，可见重组绿色荧光虹彩病毒与野生型虹彩病毒相比，其结构大小基本一致，绿色荧光蛋白标记无明显差异。图5为绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒(a)和野生型虹彩病毒(b)的透射电镜图。
实施例4：绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒的初步应用
1)取购自养殖场并已暂养30天的石斑鱼幼苗，设置对照组与实验组，对照组注射100μL PBS,实验组注射100μL纯化的重组虹彩病毒SGIV-72R-eGFP，攻毒浓度为1×106.5pfu/ml，用1mL无菌注射器从鱼的腹腔注射攻毒；
2)14d后对其进行抽血，用湿布覆盖其鳃，并通过湿布捏住其身，采用尾静脉取血的方法抽取鱼血，所用的1mL针管需加适量的抗凝剂以防止凝血现象，随后4℃1000×g离心5min，收集鱼的血细胞以进行流式分选分析。
3)将鱼的血细胞用0.01M PBS重悬，上机前过流式管的滤膜，收集10,000个细胞进行分析。可见感染重组虹彩病毒的血细胞中有明显的绿色荧光信号，表明绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒可在石斑鱼体内进行感染与复制，且能通过流式细胞仪检测到绿色荧光信号。图6为基于流式分选分析感染绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒的血细胞。
Claims (2)
1.绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒的构建方法，其特征在于，包括步骤：
1）构建重组质粒，选择石斑鱼虹彩病毒的ORF72R基因的C端作为eGFP和Flag标签的插入位点，重组质粒中含有与eGFP和Flag标签融合的ORF72R基因；
2）重组病毒由野生型病毒与重组质粒之间通过同源重组而来，重组质粒通过脂质体转染法进入处于生长对数期的石斑鱼胚胎干细胞，然后对所述石斑鱼胚胎干细胞接种野生型虹彩病毒；
3）收集受感染的细胞，筛选出带有绿色荧光的细胞，提取细胞内病毒即为绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒；
4）将筛选出纯化的绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒扩大培养后，以蔗糖密度梯度离心的方法分离，所述绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒悬浮于50-60%蔗糖溶液中。
2.根据权利要求1所述的绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒的构建方法，其特征在于，步骤4）后还包括步骤：
5）通过蛋白质印迹法鉴定步骤4）所得的绿色荧光蛋白标记重组虹彩病毒。
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