CN112618710B - 一种植物糖原猪口服接种疫苗纳米佐剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物糖原猪口服接种疫苗纳米佐剂及其制备方法与应用。方法为：(1)将抗原加入到植物糖原水溶液中，振荡吸附，得到混合液；(2)冰浴条件下，将脂肪酸加入到混合液中，超声，得到乳液，透析，得到植物糖原猪口服接种疫苗纳米佐剂；植物糖原猪口服接种疫苗纳米佐剂中，植物糖原的含量为0.5～10wt％，抗原的含量为0.01～2wt％，脂肪酸的含量为0～20wt％。制得的植物糖原基纳米佐剂不仅耐受降解能够延缓抗原的释放，与脂肪酸混合所形成的水包油型乳剂的抗氧化性更强，可提高整体的稳定性，能够更好的保护抗原，来源安全可靠，以植物糖原作为疫苗佐剂，成本低、安全高效，对动物具有良好的预防保护能力。

Description

一种植物糖原猪口服接种疫苗纳米佐剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种植物糖原猪口服接种疫苗纳米佐剂及其制备方法与应用。

背景技术

口服免疫，在现代化养殖产业中是一种最简单易行、最易于实施的免疫途径。然而，口服免疫途径面临挑战，限制了其广泛应用。由于需要经过消化道，疫苗成分常常发生降解，因而免疫原性较弱，难以引起有效免疫应答甚至有时无免疫应答，需要添加一定剂量的安全有效的佐剂。疫苗免疫佐剂已经成为组成新型疫苗不可缺少的一部分。佐剂现已被用于提高部分灭活疫苗的免疫原性、增强低应答人群的免疫应答、改善疫苗经黏膜途径接种的免疫原性及调节不恰当的免疫应答等从而提高保护性免疫力。已被证实由佐剂活性的物质包括铝佐剂、脂质体乳剂、蛋白多糖、细菌样颗粒等。

虽然很多物质被证明是有佐剂效应的，但选择或开发一种优良的佐剂需要综合考虑多方面的因素。首先需要的就是佐剂的安全性。由于佐剂有其自身的药理学特性，可能会影响疫苗抗原的免疫原性和安全性。应用最广泛的铝佐剂，虽然免疫效果较好，但也存在局限性和不足。冷冻后的铝佐剂结构会发生改变，出现聚集现象。因为铝佐剂的冷冻敏感性，而无法冷冻贮存，需要再添加一定的冷冻保护剂，增加安全风险。另有报道发现铝佐剂也可诱导产生IgE，有可能引起超敏反应，严重时注射部分发生溃烂，局部发生炎症反应。除了传统的铝佐剂，水包油乳剂的应用也越来越广泛。常用来制备水包油乳剂的是一种角鲨烯油，能在高压条件下形成均一性较好的滴状乳液，稳定性较高。然而水包油乳剂的副作用比铝佐剂还严重，更容易引起注射部位的炎症反应，长期使用还会引起肝损伤。其它佐剂，如核酸类佐剂在动物模型中发现能诱发自身免疫性疾病，出现了安全问题。因此，佐剂对动物的免疫系统产生的刺激作用必须在合适的、可预期的范围内。开发生物安全的新型佐剂已成为疫苗发展的研究趋势。世界卫生组织在2012年启动了全球疫苗安全行动，目的是为了加强疫苗药物警戒能力，实施全球疫苗安全。目前已有报道使用环糊精衍生物作为疫苗佐剂，然而环糊精衍生化修饰后分离提纯步骤复杂，工作量大，难以大规模生产。

发明内容

为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种植物糖原猪口服接种疫苗纳米佐剂的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述方法制得的一种植物糖原猪口服接种疫苗纳米佐剂。所述植物糖原猪口服接种疫苗纳米佐剂由高度分支的可溶性多糖即植物糖原制得。

本发明的再一目的在于提供上述一种植物糖原猪口服接种疫苗纳米佐剂在制备生物医药材料领域中的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种植物糖原猪口服接种疫苗纳米佐剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）将抗原加入到植物糖原水溶液中，4~30℃振荡吸附0.5~12h，得到混合液；

（2）冰浴条件下，将脂肪酸加入到步骤（1）的混合液中，超声1~4h，得到乳液，透析，得到植物糖原猪口服接种疫苗纳米佐剂；

其中，植物糖原猪口服接种疫苗纳米佐剂中，植物糖原的含量为0.5~10wt%，抗原的含量为0.01~2wt%，脂肪酸的含量为0.5~5wt%。

优选地，步骤（1）所述抗原为猪回肠炎活疫苗、猪繁殖与呼吸综合症灭活疫苗、猪支原体肺炎灭活疫苗、猪伪狂犬灭活疫苗、猪口蹄疫灭活疫苗、猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗、猪链球菌双价灭活疫苗和副猪嗜血杆菌病灭活疫苗中的至少一种。

优选地，步骤（1）所述植物糖原水溶液中的植物糖原、抗原和步骤（2）所述脂肪酸的质量比为（0.5~10）：（0.01~2）：（0.5~5），更优选为（2~3）：（0.5~1）：3.2。

优选地，步骤（1）所述抗原优选以抗原水溶液的形式加入，所述抗原水溶液的浓度为0.1~2 mg/mL。

优选地，步骤（1）所述植物糖原水溶液的浓度为1~15 mg/mL。

优选地，步骤（1）所述植物糖原水溶液中的植物糖原的分支密度占4~5%。

优选地，步骤（1）所述植物糖原水溶液中的植物糖原提取于玉米种子和/或水稻种子。

优选地，步骤（1）所述振荡的速度为50~300 rpm。

优选地，步骤（2）所述脂肪酸为油酸，亚油酸，亚麻酸，花生四烯酸，二十碳五烯酸和油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸的衍生物中的至少一种。

优选地，步骤（2）所述透析所使用的透析袋的截留分子量为100000，透析时间为10~20h。所述透析的温度为冰浴。

优选地，步骤（2）所述透析后，还可进行浓缩，得到植物糖原猪口服接种疫苗纳米佐剂。

上述方法制得的一种植物糖原猪口服接种疫苗纳米佐剂。

上述一种植物糖原猪口服接种疫苗纳米佐剂在制备生物医药材料领域中的应用。

优选地，所述应用为：在制备猪口服接种疫苗药物中的应用。

本发明的技术原理是：所采用的植物糖原是一种在植物胚乳内形成的高度支链化分子结构的多糖纳米颗粒。植物糖原分支密度占4~5%，平均每隔20~25个葡萄糖残基出现一个分支，可溶于水，且溶液黏度较低。植物糖原分支短而多，结构紧密，因而可形成半径约39nm的纳米球形颗粒。植物糖原释放葡萄糖的速度小于蜡质玉米淀粉和普通淀粉，在消化道内不会被迅速消化，可以在一定时间内维持其纳米形态从而达到保护抗原的效果，随着逐渐被淀粉酶分解，又可起到缓慢释放抗原的功能。本发明利用脂肪酸与植物糖原相互作用，生成既亲油又亲水的两性植物糖原，植物糖原可提高脂肪酸的氧化稳定性，从而有效提高植物糖原猪口服接种疫苗纳米佐剂的氧化稳定性。植物糖原原料来源于玉米、水稻等植物，动物对植物糖原耐受性好，在安全性方面具有天然的优势。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明所用植物糖原是在玉米、水稻等植物胚乳内形成的高度支链化分子结构的多糖形纳米颗粒，是一种类似支链淀粉的、高度分支的可溶性多糖。由于其天然的纳米尺度效应，免疫系统能够有效识别植物糖原纳米佐剂，更易于刺激机体产生T细胞。利用脂肪酸与植物糖原相互作用，得到既亲油又亲水的两性植物糖原纳米佐剂。由于植物糖原的保护作用，抗原受到保护免受降解，脂肪酸受到保护免于氧化分解，因而所得的纳米佐剂乳液稳定性好，易于储存。植物糖原来源于猪群饲料主粮如玉米等植物，在安全性方面具有天然的优势；动物对植物糖原的耐受性良好，不会因此产生超敏反应和自身免疫的产生等。制得的植物糖原基纳米佐剂不仅耐受降解能够延缓抗原的释放，与脂肪酸混合所形成的水包油型乳剂的抗氧化性更强。毒性测试结果显示，啮齿动物重复高剂量给予植物糖原纳米佐剂是安全的。本发明提供的疫苗纳米佐剂原料来源广泛，成本低，加工工艺简便，易于推广。

附图说明

图1为本发明所述植物糖原猪口服接种疫苗纳米佐剂的制备过程示意图。

图2为实施例1中玉米植物糖原水溶液、玉米植物糖原-抗原水溶液及制备得到的猪口服接种疫苗（玉米）植物糖原纳米佐剂的粒径分布图。

图3为实施例2中水稻植物糖原水溶液及制备得到的猪口服接种疫苗（水稻）植物糖原纳米佐剂的粒径分布图。

图4为实施例4中不同浓度猪口服接种疫苗植物糖原纳米佐剂水乳液对HEP2细胞存活率的影响。

图5为实施例6中Balb/c鼠在免疫第0天和第14天后，肠道、气管分泌型sIgA及血清IgG效价变化图，其中图5（a）为肠道中分泌型sIgA效价变化图，图5（b）为气管中分泌型sIgA效价变化图，图5（c）为血清抗体IgG效价变化图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本申请实施例所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本申请实施例和对比例中所述市售的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗购买于勃林格殷格翰；所述副猪嗜血杆菌病灭活疫苗和猪链球菌双价灭活疫苗（即实施例和对比例中制备原料）购买于西班牙海博莱生物大药厂。

实施例 1

参考文献方法（S.H. Yun and N.K. Matheson.Carbohydr. Res. 1993, 243,307-321）将玉米种子粉碎并提取玉米植物糖原固体粉末。称取玉米植物糖原固体粉末0.015g，充分溶解于1.0 mL去离子水中，制成浓度为15 mg/mL的植物糖原水溶液。将副猪嗜血杆菌病灭活疫苗抗原分散于无菌水中制成浓度为1mg/mL的副猪嗜血杆菌疫苗抗原水溶液。向1ml植物糖原水溶液中加入5 mL抗原水溶液，然后将混合液放置于空气浴恒温振荡箱中振荡平衡8小时，控制温度为20℃，振荡平衡速度为100 rpm，促使抗原充分吸附于植物糖原纳米颗粒上。当吸附完成后，将混合液放置于在冰浴下，向其中加入0.02 mL亚麻酸，并在冰浴下超声4小时以形成稳定乳液，使用截留分子量为100000的透析袋在水中透析16小时，除去游离的抗原，随后取出透析袋，并向透析袋覆盖聚乙二醇浓缩原液，直到原液体积浓缩到1 mL为止，即可得乳液状的猪口服接种疫苗（玉米）植物糖原纳米佐剂。

本实施例中抗原充分吸附于植物糖原纳米颗粒上的结果如图1和图2所示。将本实施例所制备的猪口服接种疫苗（玉米）植物糖原纳米佐剂放置于37℃下，三天未见明显变化，经3000 rpm离心3min未见明显沉淀或分层，说明该猪口服接种疫苗（玉米）植物糖原纳米佐剂稳定性良好。

实施例 2

参考文献方法（S.H. Yun and N.K. Matheson.Carbohydr. Res. 1993, 243,307-321）将水稻种子浸泡、粉碎并提取水稻植物糖原固体粉末。称取水稻植物糖原固体粉末0.01g，充分溶解于1.0 mL去离子水中，制成浓度为10 mg/mL的植物糖原水溶液。将猪链球菌双价灭活疫苗抗原分散于无菌水中制成浓度为1mg/mL的猪链球菌双价灭活疫苗水溶液。向1ml植物糖原水溶液中加入2.5 mL抗原水溶液，然后将混合液放置于空气浴恒温振荡箱中振荡平衡6小时，控制温度为20℃，振荡平衡速度为120 rpm，促使抗原充分吸附于植物糖原纳米颗粒上。当吸附完成后，将混合液放置于在冰浴下，向其中加入0.02 mL亚油酸，并在冰浴下超声5小时以形成稳定乳液，使用截留分子量为100000的透析袋在水中透析16小时除去游离的抗原，随后取出透析袋，并向透析袋覆盖聚乙二醇浓缩原液，直到原液体积浓缩到1 mL为止，即可得乳液状的猪口服接种疫苗（水稻）植物糖原纳米佐剂。

本实施例中抗原充分吸附于植物糖原纳米颗粒上的结果如图1和图3所示。

实施例 3 猪口服接种疫苗植物糖原纳米佐剂的稳定性

以实施例1~2制备得到的猪口服接种疫苗植物糖原纳米佐剂为例进行说明。将实施例1的猪口服接种疫苗（玉米）植物糖原纳米佐剂和实施例2的猪口服接种疫苗（水稻）植物糖原纳米佐剂分别放置于37℃三天未见明显变化，经3000 rpm离心3min未见明显沉淀或分层。采用硫代硫酸钠法测定放置不同条件一周后的猪口服接种疫苗植物糖原纳米佐剂的过氧化值（结果见表1）。通过测定过氧化物产物的量来评价该猪口服接种疫苗植物糖原纳米佐剂脂肪酸的氧化程度，也是评价变质程度的一个重要指标。同时将含0.05%抗原和1%脂肪酸的乳液作为对照组。如表1所示，猪口服接种疫苗植物糖原纳米佐剂在不同贮藏条件下其过氧化值都比对照组（与实施例几乎同等质量分数抗原和中间值质量分数的亚麻酸所形成的乳液组）低，说明植物糖原提高了亚麻酸的氧化稳定性，实施例1~2所制得的猪口服接种疫苗植物糖原纳米佐剂具有更强的抗氧化性。

表1 猪口服接种疫苗植物糖原纳米佐剂在不同贮藏条件下其氧化程度对比

将实施例1~2制备好的猪口服接种疫苗植物糖原纳米佐剂接种于胰酪胨大豆肉汤（TSB）培养基，37℃下观察24 h，未见胰酪胨大豆肉汤培养基中出现浑浊，镜检未发现细菌，说明该猪口服接种疫苗植物糖原纳米佐剂无细菌污染。

实施例 4 猪口服接种疫苗植物糖原纳米佐剂的安全性

以实施例1~2制备得到的猪口服接种疫苗植物糖原纳米佐剂为例进行说明。将实施例1和2制得的猪口服接种疫苗植物糖原纳米佐剂分别加水配制成浓度为0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1mg/mL、2 mg/mL的水乳液，分别将上述水乳液加入到24孔培养板中（每孔一种乳液），然后接种HEP2细胞（购买于Thermo Fisher公司），使用含15%胎牛血清的DMEM培养基并在5% CO₂温箱37℃下进行培养，对照组不加入猪口服接种疫苗植物糖原纳米佐剂水乳液，其他条件相同。使用MTT法检验猪口服接种疫苗植物糖原纳米佐剂的细胞毒性。四种浓度下，两种植物糖原纳米佐剂都没有引起大量细胞死亡（如图4所示），说明两种植物糖原纳米佐剂作为疫苗佐剂安全性较高。

将6~8周龄雌性Balb/c鼠随机分为四组，每组10只，实验组为：10只Balb/c鼠，每只灌服20μL实施例1制备得到的猪口服接种疫苗植物糖原纳米佐剂，10只Balb/c鼠，每只灌服20μL实施例2制备得到的猪口服接种疫苗植物糖原纳米佐剂；对照组为：10只Balb/c鼠，每只背部皮下注射20μL市售的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗；空白组为：10只Balb/c鼠，每只灌服20μL生理盐水。连续观察四周，结果如图2所示，所有Balb/c鼠存活，无任何临床表现。

表2 Balb/c鼠在免疫接种后的存活结果

以实施例1制备得到的猪口服接种疫苗（玉米）植物糖原纳米佐剂为例进行具体阐明其安全性。将6~8周龄雌性Balb/c鼠随机分为三组，每组5只，实验组为：5只Balb/c鼠，每只灌服20μL实施例1制备得到的猪口服接种疫苗（玉米）植物糖原纳米佐剂；对照组为：5只Balb/c鼠，每只背部皮下注射20μL市售的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗；空白组为：5只Balb/c鼠，每只灌服20μL生理盐水。免疫处理后，每隔30分钟使用动物测温计监测Balb/c鼠体温1次。在持续监控4小时内，Balb/c鼠在灌服实施例1制备得到的猪口服接种疫苗（玉米）植物糖原纳米佐剂后的体温变化在0.5℃以内（表3）。随后连续观察四周，在经口途径接种后的四周内，Balb/c鼠未见发热等副反应，无脱毛等状况，未见异常症状，所有的Balb/c鼠均健康存活，说明实施例1制备得到的猪口服接种疫苗（玉米）植物糖原纳米佐剂不会引起Balb/c鼠免疫后的强烈免疫应激反应，安全性良好。

表3 Balb/c鼠在免疫接种后体温监测结果

a口服免疫负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗抗原的玉米植物糖原疫苗纳米佐剂

b注射免疫市售的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗

实施例 5 猪口服接种疫苗植物糖原纳米佐剂的安全性

以实施例1制备得到的猪口服接种疫苗（玉米）植物糖原纳米佐剂为例进行说明。将约3周龄健康哺乳仔猪随机分为三组，每组5只，测定其体温后，进行免疫处理，实验组：每只仔猪灌服2 mL实施例1制备得到的猪口服接种疫苗（玉米）植物糖原纳米佐剂乳液；对照组：每只仔猪肌肉注射2 mL市售的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗；空白组：每只仔猪灌服2 mL生理盐水。免疫处理仔猪后，每隔30分钟使用动物测温计监测仔猪体温1次。在持续监控4小时内，仔猪在灌服实施例1制备得到的猪口服接种疫苗（玉米）植物糖原纳米佐剂后的体温变化在0.5℃以内（表4）。随后连续观察四周，在经口途径接种后的四周内，仔猪未见发热等副反应，未见异常症状，所有的仔猪均健康存活，说明实施例1制备得到的猪口服接种疫苗（玉米）植物糖原纳米佐剂没有引起仔猪免疫后的强烈免疫应激反应，安全性良好。

表4 仔猪在免疫接种后体温监测结果

a口服免疫负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗抗原的玉米植物糖原疫苗纳米佐剂

b注射免疫市售的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗

实施例 6 猪口服接种疫苗植物糖原纳米佐剂的免疫效果

以实施例1制备得到的猪口服接种疫苗（玉米）植物糖原纳米佐剂为例进行阐明。将实施例1中制备的猪口服接种疫苗（玉米）植物糖原纳米佐剂进行体内免疫效果试验。将6至8周龄的雌性Balb/c小鼠随机分为三组，每组5只，进行第一次免疫处理，实验组：每只Balb/c鼠灌服10μL实施例1制备得到的猪口服接种疫苗（玉米）植物糖原纳米佐剂；对照组：每只Balb/c鼠背部皮下注射10μL市售的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗；空白组：每只Balb/c鼠灌服10μL生理盐水。第一次免疫处理后的在第20天，对实验组小鼠进行第二次免疫，每只Balb/c鼠灌服10μL实施例1制备得到的猪口服接种疫苗（玉米）植物糖原纳米佐剂。从第一次免疫接种后，每周采集Balb/c鼠血液，分离血清，使用间接ELISA实验方法监测血清中副猪嗜血杆菌抗体效价。在灌服实施例1制备得到的猪口服接种疫苗（玉米）植物糖原纳米佐剂一周后即可检测出抗体，随后抗体的含量逐渐上升，实验组平均抗体效价基本与对照组相当，而且在监测的最后两个月内，抗体水平始终维持较高水平，在追加免疫后的六个月内，Balb/c鼠所产生抗体水平都在1:16以上（表5）。

表5 Balb/c鼠在免疫接种后血清中副猪嗜血杆菌抗体效价

a口服免疫负载副猪嗜血杆菌病灭活疫苗抗原的玉米植物糖原疫苗纳米佐剂

b注射免疫市售的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗

为了进一步验证免疫效果，分别在接种14天和28天采集Balb/c鼠血清，利用ELISA（酶联免疫吸附实验）法检测免疫小鼠中产生的抗体。在接种第14天，实验组Balb/c鼠肠道和气管中分泌型sIgA水平明显高于空白组（如图5所示）。在对血清样品分析的结果表明，实验组Balb/c鼠血清抗体IgG明显高于空白组。在接种第28天，实验组Balb/c鼠肠道和气管中分泌型sIgA水平明显高于空白组和对照组。在对血清样品分析的结果表明，实验组Balb/c鼠血清抗体IgG明显高于空白组和对照组。

对比例1

参考文献方法（S.H. Yun and N.K. Matheson.Carbohydr. Res. 1993, 243,307-321）将玉米种子粉碎并提取玉米植物糖原固体粉末。称取玉米植物糖原固体粉末0.15g，充分溶解于10 mL去离子水中，制成浓度为15 mg/mL的植物糖原水溶液。将副猪嗜血杆菌病灭活疫苗抗原分散于无菌水中制成浓度为1mg/mL的副猪嗜血杆菌疫苗抗原水溶液。向10 mL植物糖原水溶液中加入5 mL抗原水溶液，然后将混合液放置于空气浴恒温振荡箱中振荡平衡8小时，控制温度为20℃，振荡平衡速度为100 rpm，促使抗原充分吸附于植物糖原纳米颗粒上。当吸附完成后，将混合液放置于在冰浴下，向其中加入0.02 mL亚麻酸，并在冰浴下超声4小时以形成稳定乳液，使用截留分子量为100000的透析袋在水中透析16小时除去游离的抗原，随后取出透析袋，向透析袋覆盖聚乙二醇直到原液体积浓缩到1 mL为止，即可得乳液状的植物糖原（玉米）纳米佐剂A，其中植物糖原质量分数为15%，抗原的质量分数为0.5%。

对比例2

参考文献方法（S.H. Yun and N.K. Matheson.Carbohydr. Res. 1993, 243,307-321）将玉米种子粉碎并提取玉米植物糖原固体粉末。称取玉米植物糖原固体粉末0.015 g，充分溶解于1.0 mL去离子水中，制成浓度为15mg/mL的植物糖原水溶液。将副猪嗜血杆菌病灭活疫苗抗原分散于无菌水中制成浓度为1 mg/mL的副猪嗜血杆菌疫苗抗原水溶液。向1mL植物糖原水溶液中加入0.08mL抗原水溶液，然后将混合液放置于空气浴恒温振荡箱中振荡平衡8小时，控制温度为20℃，振荡平衡速度为100 rpm，促使抗原充分吸附于植物糖原纳米颗粒上。当吸附完成后，将混合液放置于在冰浴下，向其中加入0.02 mL亚麻酸，并在冰浴下超声4小时以形成稳定乳液，使用截留分子量为100000的透析袋在水中透析16小时除去游离的抗原，随后取出透析袋，向透析袋覆盖聚乙二醇直到原液体积浓缩到1 mL为止，即可得乳液状的植物糖原（玉米）纳米佐剂B，其中抗原质量分数为0.008%。

对比例3

参考文献方法（S.H. Yun and N.K. Matheson.Carbohydr. Res. 1993, 243,307-321）将玉米种子粉碎并提取玉米植物糖原固体粉末。称取玉米植物糖原固体粉末0.015g，充分溶解于1.0 mL去离子水中，制成浓度为15 mg/mL的植物糖原水溶液。将副猪嗜血杆菌病灭活疫苗抗原分散于无菌水中制成浓度为1 mg/mL的副猪嗜血杆菌疫苗抗原水溶液。向1 mL植物糖原水溶液中加入5 mL抗原水溶液，然后将混合液放置于空气浴恒温振荡箱中振荡平衡8小时，控制温度为20℃，振荡平衡速度为100 rpm，促使抗原充分吸附于植物糖原纳米颗粒上。当吸附完成后，将混合液放置于在冰浴下，向其中加入0.005 mL亚麻酸，并在冰浴下超声4小时以形成稳定乳液，使用截留分子量为100000的透析袋在水中透析16小时除去游离的抗原，随后取出透析袋，向透析袋覆盖聚乙二醇直到原液体积浓缩到1 mL为止，即可得乳液状的植物糖原（玉米）纳米佐剂B，其中抗原质量分数为0.4%。

对比例4

将6~8周龄雌性Balb/c鼠测定随机分为五组，每组5只，分别对每只Balb/c鼠进行免疫处理，具体如下：对比例1~3制备得到的纳米佐剂A、纳米佐剂B和纳米佐剂C为实验组，每只Balb/c鼠经口服给药接种上述纳米佐剂10μL；对应的市售的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗为对照组，每只Balb/c鼠经背部皮下注射上述市售灭活疫苗10μL；生理盐水组为空白组，每只Balb/c鼠经口服给药生理盐水10μL。Balb/c鼠在接种疫苗后无异常反应，接种后每周采血分离血清，监测血清中副猪嗜血杆菌抗体效价。

如表6所示，Balb/c鼠在分别服用对比例1~3制备得到的纳米佐剂A、纳米佐剂B和纳米佐剂C后的两个星期内，纳米佐剂A所产生抗体水平都在1：15以下，纳米佐剂B和纳米佐剂C所产生抗体水平都在1:10以下。而对照组一周后即可检测出抗体。实验组的结果几乎与空白组一样，抗体水平始终维持较低水平。过量比例下的植物糖原、抗原负载量较低、或脂肪酸助剂加入量较低的情况下，实验动物难以产生足够量的抗体来保护机体。

表6 Balb/c鼠在免疫接种后血清中副猪嗜血杆菌抗体效价

a口服免疫对比例1~3制备得到的疫苗佐剂

b注射免疫市售的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种植物糖原猪口服接种疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将抗原加入到植物糖原水溶液中，4~30℃振荡吸附0.5~12h，得到混合液；

（2）冰浴条件下，将脂肪酸加入到步骤（1）的混合液中，超声1~4h，得到乳液，透析，得到植物糖原猪口服接种疫苗；

其中，植物糖原的含量为0.5~10wt%，抗原的含量为0.01~2wt%，脂肪酸的含量为0.5~5wt%；

步骤（1）所述植物糖原水溶液中的植物糖原的分支密度占4~5%；

步骤（1）所述植物糖原水溶液中的植物糖原、抗原和步骤（2）所述脂肪酸的质量比为（0.5~10）：（0.01~2）：（0.5~5）；

步骤（1）所述植物糖原水溶液中的植物糖原提取于玉米种子和/或水稻种子；

步骤（1）所述抗原为副猪嗜血杆菌疫苗抗原；

步骤（1）所述抗原以抗原水溶液的形式加入，所述抗原水溶液的浓度为0.1~2 mg/mL；所述植物糖原水溶液的浓度为1~15 mg/mL；

步骤（2）所述脂肪酸为亚油酸和亚麻酸中的至少一种。

2.根据权利要求1所述一种植物糖原猪口服接种疫苗的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述振荡的速度为50~300 rpm；步骤（2）所述透析所使用的透析袋的截留分子量为100000，透析时间为10~20h；

步骤（2）所述透析后，还进行浓缩，得到植物糖原猪口服接种疫苗。

3.权利要求1~2任一项所述方法制得的一种植物糖原猪口服接种疫苗。