CN112592831A - 一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法，(1)将田间采集回来的三七圆斑病叶片在常温下风干；(2)在生物显微镜下观察病斑部位，寻找分生孢子密集处，用移液枪吸取10μL无菌水打到该部位并反复抽吸4‑5次，病斑上的分生孢子将进入到无菌水当中成为孢子悬浮液，然后把孢子悬浮液吸取到水琼脂培养基上并轻轻涂匀。(3)立即在显微镜下寻找水琼脂培养基表面的分生孢子，然后用灭菌挑针蘸取无菌水后移至孢子处吸附单个孢子；(4)将吸附有单个孢子的挑针在PDA培养基上进行多次划线，用封口膜封口后在恒温培养箱中培养。本发明直接利用挑针上无菌水的粘附作用获得单个分生孢子，分离效果更加精准，且不容易污染。
Description
技术领域
本发明涉及孢子分离技术领域，具体是指一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法。
背景技术
三七圆斑病病原菌为槭菌刺孢(Mycocentrospora acerina(Hartig)Deighton)，该菌属于半知菌门菌刺孢属真菌，该病于1993年云南省文山州首次被发现，是危害三七地上部分非常严重的一种病害。槭菌刺孢喜低温高湿，且传播迅速，在三七生长地区，每年雨季来临，如果防治不及时，发病率可达80％以上，在极端条件下，三七圆斑病可造成三七绝产，对七农造成严重的经济损失。槭菌刺孢于1880年首次在德国报道侵染槭树叶片，该菌主要分布于欧洲和北美洲，寄主范围广泛，寄生于槭树科、十字花科、茄科等16科植物上，在低温高湿的条件下引起胡萝卜、莴苣、报春花等多种蔬菜和观赏植物病害(傅俊范等，1995)。目前，槭菌刺孢在我国被报道可引起两种植物病害，一种是细辛叶枯病，另外一种是三七圆斑病，均可对寄主造成毁灭性伤害。(傅俊范等，1995；陈克等，1997).
槭菌刺孢以厚垣孢子在土壤或植物病残体中越冬，是翌年三七圆斑病的主要初侵染源，常在每年雨季发病和流行，发病初期叶片病斑较小，呈圆形或近圆形水渍状，病斑中心可见棕褐色侵染小点，随后病斑逐渐扩大，褐色或灰褐色，可在病斑表面观察到轮纹状白色、灰色或粉白色的分生孢子堆。这些分生孢子可借助风力或雨水飞溅传播，造成三七圆斑病的大面积发生。槭菌刺孢分生孢子梗短小粗壮，全壁芽生合轴式产孢，孢痕明显。分生孢子长(60-)150-200(-290)μm、宽的部分约8-15μm，分生孢子具(4-)8-11(-24)个隔膜；有时在基部细胞下方的侧面具有一个向下的刺状附属丝。
槭菌刺孢由于很难在人工培养基上产生分生孢子，目前还没有一种可靠的技术手段可以使槭菌刺孢在人工培养基上稳定的产生分生孢子，因此对于槭菌刺孢单孢菌株的获得，则需从田间三七圆斑病发病叶片病斑上直接分离。CN102140432A公开了一种真菌单个孢子的分离方法，主要步骤是将玻璃毛细管从尖端插入巴斯德吸管中，用解剖针挑取待分离的真菌材料，将毛细管管口中心正对并接近孢子，转移孢子至培养基上方，真孢分离完成。其关键步骤是用解剖针挑取部分待分离的真菌菌落或病斑组织，而对于病斑组织而言，上面不一定有分生孢子，且直接取病斑组织做孢子悬浮液，杂质较多，且不容易使孢子分散。另外其使用的工具包括巴斯德吸管和毛细管，将单个孢子吸到毛细管中，保持胶头不动，对操作人员的技术和经验要求很高，不适宜大批量的真菌单孢分离。CN 108587929 A公开了一种快速分离田间稻瘟病斑上稻瘟菌单孢的方法，该方法主要是将含典型稻瘟病单病斑的水稻叶片涂布在水琼脂培养基表面，培养所述带有稻瘟菌分生孢子的水琼脂板，再于体视显微镜下寻找单个且已萌发的稻瘟菌分生孢子，再分离该稻瘟菌单孢，得到含有稻瘟菌单孢的琼脂块。该方法直接用病斑涂布水琼脂培养基表面，对于分生孢子的定位不精准，其他杂质较多，并且需要切割含有单孢的琼脂块，操作步骤较多，相对麻烦。
因此对三七圆斑病病原的生物学特性以及致病机理等方面的研究中，迫切需要开发一种快速，稳定，效率高且适合大批量样品分离的单孢分离方法。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法，包括以下步骤：
(1)在田间采集具有典型三七圆斑病病斑的三七叶片，病斑处要有肉眼可以看到的明显白色霉层，然后放到纸质采样信封中，注意每个叶片要单独放置到一个信封中，不能叠加，运回实验室把病叶放入信封纸袋中，要在通风干燥处自然风干；
(2)将风干的病斑叶片病斑部位用剪刀剪下，放在载玻片上用10*10倍显微镜观察病斑上的分生孢子堆所在区域，锁定该区域后，用10μL量程移液枪吸取无菌水打在该区域并反复抽吸4-5次，分生孢子将进入到无菌水中，最后吸取该孢子液到水琼脂培养基上，并用灭过菌的涂布器轻轻涂匀；
(3)将涂有分生孢子的水琼脂培养皿放到显微镜下观察，当观察到单个分生孢子的时候，用预先烧红的挑针在无菌水中蘸取数秒后移到显微镜视野处，然后慢慢的移动到分生孢子附近，用挑针的一侧轻轻的触碰孢子使孢子粘附在挑针上，之后迅速用挑针针尖在PDA培养皿上轻轻的划几条线；
(4)将划完线的PDA培养皿放入恒温培养箱中培养，待单个分生孢子长成菌落即可。
进一步地，所述步骤(2)中水琼脂培养基的制备方法为：称取琼脂粉20g于1L蒸馏水或去离子水中，加热煮沸至完全溶解，分装，在121℃高压灭菌20分钟，倒平板备用。
进一步地，所述步骤(3)中需要在超净工作台中进行，在显微镜放入超净工作台前，需用75％酒精擦拭镜身，用紫外灯照射30分钟后方可使用。
进一步地，所述步骤(3)中用显微镜观察水琼脂表面的单个分生孢子是在10*10倍显微镜下观察。
进一步地，所述步骤(3)中挑针是用接种棒安装一个接种丝制成，在使用时，需要预先在酒精灯上烧红，然后用针尖部分在无菌水中蘸取数秒。
进一步地，所述步骤(3)在显微镜下观察到单个的分生孢子后，把分生孢子移到视野中央，同时把挑针针尖部分也移到视野中央，然后慢慢的移动针尖部分靠近分生孢子，用针尖部分吸附分生孢子，当在目镜下观察到分生孢子被吸附到挑针上，迅速转移挑针在PDA培养基轻轻的划几条线。
进一步地，所述步骤(4)中划过线的PDA平板放入光照培养箱中培养，温度设置为20℃，全光照培养，培养5-7天即可看到明显的单孢菌落。
本发明与现有技术相比的优点在于：本发明采用上述技术方案，具备以下优点：
(1)本发明针对三七圆斑病病原菌提出了一种新的单孢子分离方法，填补了以往没有针对此种病原真菌单孢子分离方法的空白。另外，本发明操作过程简单，周期短，成功率高，可适用于大批量样本的处理。
(2)本发明不需要单独配置分生孢子悬浮液，也不需要稀释，而是直接在病斑部位获取分生孢子，方便快捷，节约时间，提高效率。
(3)本发明不需要制作琼脂玻片，也不需要切割琼脂块，而是直接利用挑针上无菌水的粘附作用获得单个分生孢子，分离效果更加精准，且不容易污染。
(4)本发明所使用的工具，例如显微镜，纸信封，接种棒，接种丝，移液枪等都是实验室常备材料，无需购买特殊设备，一般实验室都可以满足该操作。另外，该发明操作简单，一般实验人员经过几次训练都可以熟练掌握，简单易学。
附图说明
图1为移液枪的操作示意图；
图2为风干后的三七圆斑病病叶和病斑上的分子孢子；
图3为用移液枪在病斑分生孢子堆部位反复抽吸；
图4为在水琼脂培养基表面挑取单个分生孢子；
图5为显微镜下水琼脂培养基表面的单个分生孢子；
图6为划线后的PDA培养皿；
图7为在培养箱培养5天后的单个分生孢子菌落形态。
其中，1、移液枪，2、枪头吸取的孢子液，3、三七圆斑病病斑，4、三七叶片。
具体实施方式
下面结合附图对本发明一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法做进一步的详细说明。
结合附图，对本发明进行详细介绍。
一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法，包括以下步骤：
(1)在田间采集具有典型三七圆斑病病斑3的三七叶片4，病斑处要有肉眼可以看到的明显白色霉层，然后放到纸质采样信封中，注意每个叶片要单独放置到一个信封中，不能叠加，运回实验室把病叶放入信封纸袋中，要在通风干燥处自然风干；
(2)将风干的病斑叶片病斑部位用剪刀剪下，放在载玻片上用10*10倍显微镜观察病斑上的分生孢子堆所在区域，锁定该区域后，用10μL量程移液枪1吸取无菌水打在该区域并反复抽吸4-5次，分生孢子将进入到无菌水中，最后吸取该孢子液2到水琼脂培养基上，并用灭过菌的涂布器轻轻涂匀；
(3)将涂有分生孢子的水琼脂培养皿放到显微镜下观察，当观察到单个分生孢子的时候，用预先烧红的挑针在无菌水中蘸取数秒后移到显微镜视野处，然后慢慢的移动到分生孢子附近，用挑针的一侧轻轻的触碰孢子使孢子粘附在挑针上，之后迅速用挑针针尖在PDA培养皿上轻轻的划几条线；
(4)将划完线的PDA培养皿放入恒温培养箱中培养，待单个分生孢子长成菌落即可。
实施例1：
a.笔者在2019年7月份在云南省文山州丘北县采集三七圆斑病病样，选择具有三七圆斑病典型特征并且在病斑上有白色或褐色霉层的三七叶片，用剪刀剪下后放入纸信封中，一个信封分装一个病叶，然后带回实验室放在通风干燥处自然风干。
b.分离孢子过程当中需要用的培养基：水琼脂培养基配置方法：称取琼脂粉20g于1L蒸馏水或去离子水中，加热煮沸至完全溶解，分装，在121℃高压灭菌20分钟，倒平板备用；PDA培养基的配置方法：称取200g洗净去皮的马铃薯切成小块放入锅中，加水800mL，煮沸20分钟左右，然后用多层纱布在烧杯上过滤。再把滤液放入锅中，加入20g琼脂粉和20g葡萄糖，小火加热，待琼脂完全溶解后，倒入烧杯中加水定容到1L，121℃高压灭菌20分钟后倒平板备用
c.将风干的叶片用剪刀剪取病斑部位，放在载玻片上用显微镜在10*10倍镜下观察病斑上的分生孢子堆所在区域，锁定孢子堆区域后(图2)，用10μL的移液枪1吸取10μL无菌水打在该区域并反复抽吸4-5次(图3)，分生孢子将进入到无菌水中，最后将含有分生孢子的无菌打到水琼脂培养基上，并用灭过菌的涂布器轻轻涂匀。
d.将显微镜用75％的酒精通体擦拭表面后放入超净工作台中，紫外灯照射30分钟后在10*10倍下观察水琼脂表面的单个分生孢子，当观察到单个分生孢子后(图4)，将单个的分生孢子移到显微镜视野中央，然后右手手持挑针，用酒精灯将针尖部分烧红，再放入无菌水中蘸取数秒后(一是可以冷却挑针，二是可以起到粘附孢子的作用)将挑针针尖部分移入视野中央，慢慢的移动到分生孢子附近，轻轻的蘸取单个分生孢子(图5)。
e.当接种针成功蘸取单个分生孢子后，迅速将接种针移出，用在PDA培养基上划线的方法将分生孢子接种到培养基上(图6)，之后放到恒温光照培养箱中，20℃恒温，全光照培养，5天后即可观察到单个分生孢子形成的菌落(图7)。
实施例2：
a.笔者在2019年9月份在普洱市澜沧县林下三七基地采集三七圆斑病病叶，选择具有三七圆斑病典型特征并且在病斑上有白色或褐色霉层的三七叶片，用剪刀剪下后放入纸信封中，一个信封分装一个病叶，然后带回实验室放在通风干燥处自然风干。
b.将风干的叶片用剪刀剪取病斑部位，放在载玻片上用显微镜在10*10倍镜下观察病斑上的分生孢子堆所在区域，锁定孢子堆区域后，用记号笔标记此位置，然后取下叶片和载玻片，在实验桌面上用10μL的移液枪1吸取10μL无菌水在标记位置反复抽吸4-5次，分生孢子将进入到无菌水中，最后将孢子液打到水琼脂培养基上，并用灭过菌的涂布器轻轻涂匀。
c.将显微镜用75％的酒精通体擦拭表面后放入超净工作台中，紫外灯照射30分钟后在10*10倍下观察水琼脂表面的单个分生孢子，当观察到单个分生孢子后，将单个的分生孢子移到显微镜视野中央，然后右手手持挑针，用酒精灯将针尖部分烧红，再放入无菌水中蘸取数秒后(一是可以冷却挑针，二是可以起到粘附孢子的作用)将挑针针尖部分移入视野中央，慢慢的移动到分生孢子附近，轻轻的蘸取单个分生孢子。
d.当接种针成功蘸取单个分生孢子后，迅速将接种针移出，用在PDA培养基上划线的方法将分生孢子接种到培养基上，之后放到恒温光照培养箱中，20℃恒温，全光照培养，5天后即可观察到单个分生孢子形成的菌落。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)在田间采集具有典型三七圆斑病病斑的三七叶片，病斑处要有肉眼可以看到的明显白色霉层，然后放到纸质采样信封中，注意每个叶片要单独放置到一个信封中，不能叠加，运回实验室把病叶放入信封纸袋中，要在通风干燥处自然风干；
(2)将风干的病斑叶片病斑部位用剪刀剪下，放在载玻片上用10*10倍显微镜观察病斑上的分生孢子堆所在区域，锁定该区域后，用10μL量程移液枪吸取无菌水打在该区域并反复抽吸4-5次，分生孢子将进入到无菌水中，最后吸取该孢子液到水琼脂培养基上，并用灭过菌的涂布器轻轻涂匀；
(3)将涂有分生孢子的水琼脂培养皿放到显微镜下观察，当观察到单个分生孢子的时候，用预先烧红的挑针在无菌水中蘸取数秒后移到显微镜视野处，然后慢慢的移动到分生孢子附近，用挑针的一侧轻轻的触碰孢子使孢子粘附在挑针上，之后迅速用挑针针尖在PDA培养皿上轻轻的划几条线；
(4)将划完线的PDA培养皿放入恒温培养箱中培养，待单个分生孢子长成菌落即可。
2.根据权利要求1所述的一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法，其特征在于：所述步骤(2)中水琼脂培养基的制备方法为：称取琼脂粉20g于1L蒸馏水或去离子水中，加热煮沸至完全溶解，分装，在121℃高压灭菌20分钟，倒平板备用。
3.根据权利要求1所述的一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法，其特征在于：所述步骤(3)中需要在超净工作台中进行，在显微镜放入超净工作台前，需用75％酒精擦拭镜身，用紫外灯照射30分钟后方可使用。
4.根据权利要求1所述的一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法，其特征在于：所述步骤(3)中用显微镜观察水琼脂表面的单个分生孢子是在10*10倍显微镜下观察。
5.根据权利要求1所述的一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法，其特征在于：所述步骤(3)中挑针是用接种棒安装一个接种丝制成，在使用时，需要预先在酒精灯上烧红，然后用针尖部分在无菌水中蘸取数秒。
6.根据权利要求1所述的一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法，其特征在于：所述步骤(3)在显微镜下观察到单个的分生孢子后，把分生孢子移到视野中央，同时把挑针针尖部分也移到视野中央，然后慢慢的移动针尖部分靠近分生孢子，用针尖部分吸附分生孢子，当在目镜下观察到分生孢子被吸附到挑针上，迅速转移挑针在PDA培养基轻轻的划几条线。
7.根据权利要求1所述的一种快速分离三七圆斑病菌单个分生孢子的方法，其特征在于：所述步骤(4)中划过线的PDA平板放入光照培养箱中培养，温度设置为20℃，全光照培养，培养5-7天即可看到明显的单孢菌落。
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